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CN116606752A - 一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116606752A
CN116606752A CN202310570768.1A CN202310570768A CN116606752A CN 116606752 A CN116606752 A CN 116606752A CN 202310570768 A CN202310570768 A CN 202310570768A CN 116606752 A CN116606752 A CN 116606752A
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Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株及其制备方法和应用，其包括：毕赤酵母中包含一个缺失fh和/或gd的质粒。本发明提供的菌株能够在甲酸代谢中，基于K.phaffii.GS115内源甲酸同化途径的关键蛋白进行改进，针对K.phaffii.GS115菌株的甲酸代谢进行了改进。本发明提供的菌株能够实现甲酸盐营养缺陷型菌株的制备，表明了相应极影在甲酸同化途径中的重要作用。

Description

一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的构建和应用。
背景技术
K.phaffii.GS115菌株是一种甲基营养型微生物，能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常生长，最终的OD值可以达到10左右；然而甲酸相对于甲醇来说成本更低，因此以甲酸为碳源具有更高的研究价值和生产效益。
中国专利文献CN 115058376 A(申请号202210687506.9)公开了一种大肠杆菌经过改造后能够以甲酸或甲酸盐作为碳源进行生长，其所用到的关键酶包括含醛脱氢酶(BmFaldDH)(来源于多噬伯克霍尔德氏菌)、3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)(来源于鞭毛甲基小杆菌)、6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI)(来源于鞭毛甲基小杆菌)。然而在K.phaffii.GS115菌株中甲酸代谢同化途径的关键酶还没有报道，本领域中缺少针对于K.phaffii.GS115菌株的甲酸同化途径以及构建一株甲酸盐营养缺陷型菌株。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株，其包括：毕赤酵母中包含一个缺失fh和/或gd的质粒。。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的一种优选方案，其中：还包括所述毕赤酵母中包含一个缺失fh和gd的质粒，所述质粒为SX1628-71sg-gd质粒，SX1628-71sg-gd质粒的序列如seq ID.1所示。
本发明的另一个目的是提供一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其包括如下步骤，
构建质粒：将gd基因的20bp sg序列导入质粒中，制得缺失gd基因的单基因质粒；将fh基因的20bp sg序列导入质粒中，制得缺失fh基因的单缺失质粒；
构建单缺失菌株：将单缺失质粒导入到菌株中得到单缺失菌株；
构建双缺失菌株：将双缺失质粒导入到菌株汇总得到双缺失菌株。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法的一种优选方案，其中：构建质粒中，构建得到的单缺失质粒包括SX1628-71sg-gd质粒和SX1628-71sg-fh质粒中的一种或两种。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法的一种优选方案，其中：构建质粒中，构建得到的缺失质粒为SX1628-71sg-gd质粒，SX1628-71sg-gd质粒的序列如seq ID.1所示，构建的缺失质粒SX1628-71sg-fh的序列如seq ID.2所示。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法的一种优选方案，其中：构建质粒中，准备gd-sg1片段的前6个碱基的互补序列、HH序列、gd-sg1片段，使用SX1628-71sgXG质粒为模板，使用引物SX1628-71sgXG-F和SX1628-71sgXG-R进行PCR，结束后消除模板，电泳分离提纯，制得片段SX1628-71sg-gd-1和片段SX1628-71sg-gd-2；将片段SX1628-71sg-gd-1和SX1628-71sg-gd-2进行同源重组构建SX1628-71sg-gd质粒；准备fh-sg1片段前6个碱基的互补序列、HH序列、fh-sg1片段进行PCR，使用SX1628-71sgXG质粒为模板，参照SX1628-71sg-gd质粒的构建过程，制得片段SX1628-71sg-fh-1和片段SX1628-7171sg-fh-2；将片段SX1628-7171sg-fh-1和SX1628-7171sg-fh-2进行同源重组构建SX1628-7171sg-fh质粒。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法的一种优选方案，其中：制备单缺失菌株中，以GS115基因组为模板构建敲除gd同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-71sg-gd质粒和gd基因敲除同源臂转化入感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δgd菌株；以GS115基因组为模板构建敲除fh同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-71sg-fh质粒和fh基因敲除同源臂转化入感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δfh菌株。
作为本发明所述毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法的一种优选方案，其中：构建双缺失菌株中，以GS115基因组为模板构建敲除fh同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-7171sg-fh质粒和fh基因敲除同源臂转化入GS115-Δgd感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δgd-Δfh菌株。
本发明的另一个目的是提供一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其包括，毕赤酵母用于检测外源检测通话途径能够在菌株内正常代谢。
本发明有益效果：
本发明基于K.phaffii.GS115内源甲酸同化途径的关键蛋白进行改进，针对K.phaffii.GS115菌株的甲酸代谢进行了改进。
已有的文献中报道S羟甲基谷胱甘肽脱氢酶基因gd(EC:1.1.1.284)和S甲酰基谷胱甘肽水解酶基因fh(EC:3.1.2.12)可以催化甲醛到甲酸。本发明敲除的基因能够显著降低菌株在以甲酸盐为唯一碳源培养基中的OD值。本发明构建的工程菌株无法在甲酸盐培养基上生长，是一种完全的甲酸盐营养缺陷型菌株，充分说明了关键基因在甲酸同化途径中的重要作用。此营养缺陷型菌株可以检测外源甲酸同化途径能否在K.phaffii.GS115菌株内正常代谢。并且可以在后续的诸如甲酸盐为唯一碳源的菌株生产和使用领域中有较大的使用前景。
本发明基于CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术，通过构建甲酸盐营养缺陷型菌株来验证了K.phaffii.GS115的内源甲酸同化途径的关键蛋白，弥补了K.phaffii.GS115菌株一碳有机物代谢的研究空白。本发明敲除了S羟甲基谷胱甘肽脱氢酶基因gd(EC:1.1.1.284)和S甲酰基谷胱甘肽水解酶基因fh(EC:3.1.2.12)后得到了一株完全的甲酸盐营养缺陷型菌株，充分说明了关键基因在甲酸同化途径中的重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是人工改造的质粒SX1628-71sg-gd的结构示意图；
图2是人工改造的质粒SX1628-71sg-fh的结构示意图；
图3是片段SX1628-71sg-gd-2以及片段SX1628-71sg-fh-2的核酸电泳图；
图4是质粒SX1628-71sg-gd的测序结果；
图5是质粒SX1628-71sg-fh的测序结果；
图6是基因gd和基因fh敲除同源臂构建电泳图；
其中(a)是gd基因敲除同源臂和fh基因敲除同源臂构建过程中上游、下游同源臂核酸电泳图，(b)是完整的gd基因敲除同源臂和fh基因敲除同源臂核酸电泳图；
图7是质粒SX1628-71sg-gd和质粒SX1628-71sg-fh介导的gd基因和fh基因敲除电泳图；
其中：泳道1、6：GS115-Δgd菌株验证gd基因；泳道2、7：GS115-Δfh菌株验证fh基因；泳道3、8：GS115-Δgd-Δfh菌株验证gd基因，泳道4、9，泳道5、10：GS115-Δgd-Δfh菌株验证fh基因；
图8是GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株、GS115-Δgd-Δfh菌株与GS115菌株的生长曲线图。
图9是GS115-Δgd-Δfh菌株迭代培养菌株和GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株与GS115菌株在以甲酸盐为唯一碳源培养基中的生长曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例中使用的生物材料来源和培养基具体组成如下所示：
生物材料来源
培养基具体组成：
(1)LLBZ液体培养基(g/L)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠5，博来霉素终浓度为25μg/ml，pH为7.0；
(2)LLBZ固体培养基(g/L)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，博来霉素终浓度为25μg/ml，pH为7.0；
(3)YPDSZ液体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，博来霉素终浓度为100μg/ml，pH为7.0；
(4)YPDSZ固体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，琼脂20，博来霉素终浓度为100μg/ml，pH为7.0。
(5)YPDS液体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，pH为7.0；
(6)YPDS固体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，琼脂20，pH为7.0；
(7)MFH液体培养基(g/L)：YNB(酵母氮源碱含硫酸铵不含氨基酸)13.4，组氨酸0.04，甲酸钠20mM；
实施例1
本实施例构建SX1628-71sg-gd质粒，其具体步骤如下：
1)使用引物71-gd-sg1-F和71-gd-sg1-R进行PCR获得SX1628-71sg-gd-1片段，此片段由gd-sg1片段(acgtcccttgatacctccaa)的前6个碱基(acgtcc)的互补序列(ggacgt)、HH序列、gd-sg1片段组成，PCR体系如表1所示，PCR程序如表2所示；以SX1628-71sgXG质粒为模板，引物SX1628-71sgXG-F和SX1628-71sgXG-R进行PCR获得SX1628-71sg-gd-2片段(5751bp)，PCR体系如表3所示，PCR程序如表2所示，PCR完毕后使用Dpn I消除模板，Dpn I消除模板的体系如表4所示，程序如表5所示。随后将片段SX1628-71sg-gd-2(5751bp)进行核酸电泳，电泳图如图3所示，将正确分子量的琼脂糖凝胶条带切割后进行胶回收，测定浓度后置于低温备用。本实施例中使用引物序列如表15对应部分所示。
表1 SX1628-71sg-gd-1片段构建PCR反应体系
表2 SX1628-71sg-gd-1片段构建PCR反应程序
注：变性和退火进行30个循环；
表3 SX1628-71sg-gd-2片段构建PCR体系
表4 Dpn I反应体系
表5 Dpn I反应程序
2)片段SX1628-71sg-gd-1的PCR产物和片段SX1628-71sg-gd-2胶回收产物进行同源重组构建SX1628-71sg-gd质粒，重组体系如表6所示，重组程序如表7所示。随后将重组产物转化JM109感受态，置于摇床37℃，200rpm培养1h后涂布于LLBZ平板，将平板置于37℃过夜。
表6同源重组体系
表7同源重组程序
3)挑取平板单菌落培养于3mL LLBZ液体培养基，置于摇床37℃，200rpm培养16h后提取质粒测序，测序结果如图4所示，保存测序正确的质粒于-20℃，SX1628-71sg-gd质粒的序列如seq ID.1所示。
实施例2
本实施例构建SX1628-71sg-fh质粒；
本实施例使用的SX1628-71sg-fh质粒的构建步骤如下：
1)使用引物71-fh-sg1-F和71-fh-sg1-R进行PCR获得SX1628-71sg-fh-1片段，此片段由fh-sg1片段(aaccccactaaagccccatg)前6个碱基的互补序列(ggggtt)、HH序列、fh-sg1片段组成，PCR体系如表8所示，PCR程序如表2所示；SX1628-71sg-fh-2片段的制备参照实施例1中实施例1中SX1628-71sg-gd-2片段构建过程，SX1628-71sg-fh-2片段(5751bp)的核酸电泳图如图3所示。
表8 SX1628-71sg-fh-1片段构建PCR反应体系
2)片段SX1628-71sg-fh-1的PCR产物和片段SX1628-71sg-fh-2胶回收产物进行同源重组构建SX1628-71sg-fh质粒，重组过程、单克隆筛选参照实施例1中步骤(1)质粒SX1628-71sg-gd的构建过程；SX1628-71sg-fh质粒测序正确的结果如图5所示，保存测序正确的质粒于-20℃，构建的缺失质粒SX1628-71sg-fh的序列如seq ID.2所示。
实施例3
本实施例用以构建GS115-Δgd菌株
本实施例中构建GS115-Δgd菌株的步骤如下：
1)gd基因敲除同源臂的构建。以GS115基因组为模板构建gd-敲除同源臂片段。使用引物gd-TY-F1和gd-TY-R1进行PCR获得gd-敲除同源臂片段1，PCR体系如表9所示，使用引物gd-TY-F2和gd-TY-R2进行PCR获得gd-敲除同源臂片段2，PCR体系如表10所示，PCR程序如表2所示；PCR完毕后进行核酸电泳，电泳结果如图6(a)所示，将正确分子量条带切割后进行胶回收，测定浓度后通过融合PCR程序构建同源臂片段，融合PCR程序如表11和表12所示，PCR结束后进行核酸电泳，电泳结果如图6(b)所示，将正确分子量条带切割后进行胶回收，测定浓度后置于-20℃备用。
表9 gd-敲除同源臂片段1的PCR体系
表10 gd-敲除同源臂片段2的PCR体系
表11 gd-敲除同源臂片段1和片段2的融合体系
表12 gd-敲除同源臂片段PCR体系
2)SX1628-71sg-gd质粒和gd基因敲除同源臂转化GS115感受态。将GS115感受态置于冰上5min，随后分别吸取2μg的gd基因敲除同源臂片段和SX1628-71sg-gd质粒转化进入进入GS115感受态，30℃培养1.5h后涂布于YPDSZ培养基培养2d。
3)挑取实施例3步骤(2)中的平板单菌落于YPDSZ液体培养基中培养2d后提取基因组，通过PCR验证gd基因是否缺失，使用引物gd-QCTYBYZ-F和gd-QCTYBYZ-R验证gd基因敲除同源臂的条带大小，使用引物gd-NBYZ-F和gd-NBYZ-R作为gd基因缺失内部验证引物，PCR体系如表13所示，程序如表14所示，核酸电泳图如图7所示。将验证正确的菌株保藏于-80℃。
表13 gd基因缺失验证PCR体系
表14 PCR反应程序
注：变性、退火和延伸进行30个循环；
4)将实施例3步骤(3)中验证正确的GS115-Δgd菌株接种YPDS液体培养基中传代3次丢失SX1628-71sg-gd质粒。具体操作如下：将50微升菌液接种于含有5mL YPDS液体培养基的50mL离心管中，置于30℃，200rpm的摇床中培养24h，整个流程重复
3次；随后吸取第三次培养的菌液划线于YPDS固体培养基置于30℃培养箱中培养2d。
5)挑取步骤(4)中的平板单菌落，分别溶于YPDS和YPDSZ液体培养基中，随后将菌液置于30℃，200rpm的摇床中培养2d。
6)将步骤(5)中的菌液置于无菌环境下观察，丢失SX1628-71sg-gd质粒的单菌落在YPDS液体培养基中浑浊，在YPDSZ液体培养基中澄清，将正确的GS115-Δgd菌株保藏于-80℃。
实施例4
本实施例构建GS115-Δfh菌株和GS115-Δgd-Δfh菌株：
本实施例中构建GS115-Δfh菌株和GS115-Δgd-Δfh菌株的步骤如下：
1)fh基因敲除同源臂片段的构建。使用引物fh-TY-F1和fh-TY-R1进行PCR获得fh-敲除同源臂片段1，使用引物fh-TY-F2和fh-TY-R2进行PCR获得fh-敲除同源臂片段2；详细操作参照实施例3步骤(1)，电泳结果如图6(a)和(b)。
2)将实施例2步骤(2)中构建的SX1628-71sg-fh质粒和上述fh基因敲除同源臂片段转化菌株GS115感受态和GS115-Δgd感受态。其余步骤参照实施例4，现将主要结果做如下说明：使用引物fh-QCTYBYZ-F和fh-QCTYBYZ-R验证fh基因敲除同源臂的条带大小，使用引物fh-NBYZ-F和fh-NBYZ-R作为fh基因缺失内部验证引物，fh基因缺失核酸电泳图如图7所示；构建成功的GS115-Δfh菌株和GS115-Δgd-Δfh菌株保藏于-80℃。
实施例5
本实施例用以对于GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株、GS115-Δgd-Δfh菌株与GS115菌株进行生长曲线绘制，其具体步骤如下：
1)将GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株、GS115-Δgd-Δfh菌株与GS115菌株从-80℃冰箱中取出置于室温解冻，分别取100μL菌液接种于含有25mL YTDS液体培养基的三角瓶中培养1-2d，30℃，200rpm。
2)分别吸取上述步骤(1)中的菌液5mL置于灭菌50mL离心管中离心(6000rpm，10min)后于无菌环境下弃掉上清，用5mL MFH培养基重悬后再次离心，此步骤重复3次后取500μL菌液检测OD600值。
3)分别取25mL灭菌的MFH培养基分装于12个灭菌的100mL三角摇瓶中，每种菌株做3个平行实验，根据实施例5步骤(2)中检测的菌液OD600值将其加入25mL MFH培养基中，使其初始OD600值为0.1；将12个摇瓶置于摇床中培养(30℃，200rpm)，培养期间隔2-3d取样检测OD600值。GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株、GS115-Δgd-Δfh菌株与GS115菌株在以甲酸盐为唯一碳源培养基中的生长状况如图8所示。
由图8可得，制得的GS115-Δgd-Δfh菌株在以甲酸盐为唯一碳源的情况下菌株的重量相较其他菌株较少，并且随着时间有着菌株的重量减少的趋势。
按照上述方式进行GS115-Δgd-Δfh菌株迭代培养菌株和GS115-Δgd菌株、GS115-Δfh菌株与GS115菌株在以甲酸盐为唯一碳源培养基中的生长状况观察，将得到的图像记录在图9中。
由图9可得，在迭代培养的情况下，GS115-Δgd-Δfh菌株对于甲酸盐为唯一碳源的情况有着菌体自重显著小于对比菌株的情况，依然表现出对于甲酸盐作为唯一碳源的敏感。
表15本发明各实施例中使用的引物序列表
序列表：
SEQ ID NO.1：SX1628-71sg-gd质粒序列
5’AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGACCCTTGTGACTGACACTTTGGGAGTCCCTATTCTACTTAGTCTCATATCGCATGAAACTTTTGATAAATTATTTTCTGATAGGAATTTTTCATCAGATATTATCATCGCGGCTTACGTAATAACAAAAAAAATTGATGGAGTCTATACTAGGCTAACATAAACTAAGTTATTAATTAAACAAAACAAAACGTACTAGCATTACTGTCATATATAAGGGCTCCTAACTAAAACTGTAAAGACTTCCCGTCTCGAGTGTTGTAGTTTTAATATAGTTTGAGTATGAGATGGAACTCAGAACGAAGGAATTATCACCAGTTTATATATTCTGAGGAAAGGGTGTGTCCTAAATTGGACAGTCACGATGGCAATAAACGCTCAGCCAATCAGAATGCAGGAGCCATAAATTGTTGTATTATTGCTGCAAGATTTATGTGGGTTCACATTCCACTGAATGGTTTTCACTGTAGAATTGGTGTCCTAGTTGTTATGTTTCGAGATGTTTTCAAGAAAAACTAAAATGCACAAACTGACCAATAATGTGCCGTCGCGCTTGGTACAAACGTCAGGATTGCCACCACTTTTTTCGCACTCTGGTACAAAAGTTCGCACTTCCCACTCGTATGTAACGAAAAACAGAGCAGTCTATCCAGAACGAGACAAATTAGCGCGTACTGTCCCATTCCATAAGGTATCATAGGAAACGAGAGTCCTCCCCCCATCACGTATATATAAACACACTGATATCCCACATCCGCTTGTCACCAAACTAATACATCCAGTTCAAGTTACCTAAACAAATCAAAGGATCCGGGGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCAACCCCACTAAAGCCCCATGCACGTCCCTTGATACCTCCAAGGATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGACAAAGGAAAAGGGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTGCCGGCCGGGTCGCGCAGGGCGAACTCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCATGGCCGGCCCGGAGGCGTCCCGGAAGTTCGTGGACACGACCTCCGACCACTCGGCGTACAGCTCGTCCAGGCCGCGCACCCACACCCAGGCCAGGGTGTTGTCCGGCACCACCTGGTCCTGGACCGCGCTGATGAACAGGGTCACGTCGTCCCGGACCACACCGGCGAAGTCGTCCTCCACGAAGTCCCGGGAGAACCCGAGCCGGTCGGTCCAGAACTCGACCGCTCCGGCGACGTCGCGCGCGGTGAGCACCGGAACGGCACTGGTCAACTTGGCCATGGTTTAGTTTGTCGTATTATACTATGCCGATATACTATGCCGATGATTAATTGTCAACACCGCCCCTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAACAAGAAGTAAAAAAAGTTGTAATAGAACAAGAAAAATGAAACTGAAACTTGAGAAATTGAAGACCGTTTATTAACTTAAATATCAATGGAGGTCACTGAAAGAGAAAAAAACTAAAAAAAAAAATTTCAAGAAAAAGAAACGTGATAAAAATTTTTATTGCCTTTTTCGACGAAGAAAAAGAAACGAGGCCCTCTCTTTTTTCTTTTCCAAACCTTTAGTACGGGTAATTAACGACACCCTAGAGGAAGAAAGAGGGAAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGGTGTTTTGAAGTGGTACGGCGATGCGCGGAGTCCGAGAAAATCTGGAAGAGTAAAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGTGTGGGGGATCCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAATGGTGATACCCGCATTCTTCAGTGTCTTGAGGTCTCCTATCAGATTATGCCCAACTAAAGCAACCGGAGGAGGAGATTTCATGGTAAATTTCTCTGACTTTTGGTCATCAGTAGACTCGAACTGTGAGACTATCTCGGTTATGACAGCAGAAATGTCCTTCTTGGAGACAGTAAATGAAGTCCCACCAATAAAGAAATCCTTGTTATCAGGAACAAACTTCTTGTTTCGAACTTTTTCGGTGCCTTGAACTATAAAATGTAGAGTGGATATGTCGGGTAGGAATGGAGCGGGCAAATGCTTACCTTCTGGACCTTCAAGAGGTATGTAGGGTTTGTAGATACTGATGCCAACTTCAGTGACAACGTTGCTATTTCGTTCAAACCATTCCGAATCCAGAGAAATCAAAGTTGTTTGTCTACTATTGATCCAAGCCAGTGCGGTCTTGAAACTGACAATAGTGTGCTCGTGTTTTGAGGTCATCTTTGTATGAATAAATCTAGTCTTTGATCTAAATAATCTTGACGAGCCAAGGCGATAAATACCCAAATCTAAAACTCTTTTAAAACGTTAAAAGGACAAGTATGTCTGCCTGTATTAAACCCCAAATCAGCTCGTAGTCTGATCCTCATCAACTTGAGGGGCACTATCTTGTTTTAGAGAAATTTGCGGAGATGCGATATCGAGAAAAAGGTACGCTGATTTTAAACGTGAAATTTATCTCAAGATCTCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTGACTCATGTTGGTATTGTGAAATAGACGCAGATCGGGAACACTGAAAAATAACAGTTATTATTCG-3’
SEQ ID NO.2:质粒SX1628-71sg-fh序列说明：
将质粒SX1628-71sg-gd序列中的5’GGACGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCACGTCCCTTGATACCTCCAA3’替换为序列5’GGGGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCAACCCCACTAAAGCCCCATG3’即为质粒SX1628-71sg-fh的序列。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株，其特征在于：所述毕赤酵母中包含一个缺失fh和/或gd的质粒。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株，其特征在于：还包括所述毕赤酵母中包含一个缺失fh或gd的质粒，所述质粒为SX1628-71sg-gd质粒或SX1628-71sg-fh质粒，SX1628-71sg-gd质粒的序列如seqID.1所示；SX1628-71sg-fh质粒的序列如seq ID.2所示。
3.一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
构建质粒：将gd基因的20bp sg序列导入质粒中，制得缺失gd基因的单基因质粒；将fh基因的20bp sg序列导入质粒中，制得缺失fh基因的单缺失质粒；
构建单缺失菌株：将单缺失质粒导入到菌株中得到单缺失菌株；
构建双缺失菌株：在单缺失基因菌株的基础上将另一失单缺失质粒导入得到双缺失菌株。
4.根据权利要求3所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：所述构建质粒中，构建得到的单缺失质粒包括SX1628-71sg-gd质粒和SX1628-71sg-fh质粒中的一种或两种。
5.根据权利要求3所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：所述构建质粒中，构建得到的缺失质粒为SX1628-71sg-gd质粒，SX1628-71sg-gd质粒的序列如seq ID.1所示；构建的缺失质粒SX1628-71sg-fh的序列如seq ID.2所示。
6.根据权利要求3所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：所述构建质粒，准备gd-sg1片段的前6个碱基的互补序列、HH序列、gd-sg1片段，使用SX1628-71sgXG质粒为模板，使用引物SX1628-71sgXG-F和SX1628-71sgXG-R进行PCR，结束后消除模板，电泳分离提纯，制得片段SX1628-71sg-gd-1和片段SX1628-71sg-gd-2；将片段SX1628-71sg-gd-1和SX1628-71sg-gd-2进行同源重组构建SX1628-71sg-gd质粒；准备fh-sg1片段前6个碱基的互补序列、HH序列、fh-sg1片段进行PCR，使用SX1628-71sgXG质粒为模板，参照SX1628-71sg-gd质粒的构建过程，制得片段SX1628-71sg-fh-1和片段SX1628-71sg-fh-2；将片段SX1628-71sg-fh-1和SX1628-71sg-fh-2进行同源重组构建SX1628-71sg-fh质粒。
7.根据权利要求3所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：所述制备单缺失菌株中，以GS115基因组为模板构建敲除gd同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-71sg-gd质粒和gd基因敲除同源臂转化入感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δgd菌株；以GS115基因组为模板构建敲除fh同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-71sg-fh质粒和fh基因敲除同源臂转化入感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δfh菌株。
8.根据权利要求3所述的毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的制备方法，其特征在于：所述构建双缺失菌株中，以GS115基因组为模板构建敲除fh同源臂片段，分别敲除5’和3’端，PCR扩增后回收获得正确分子量条带；将获得的SX1628-71sg-fh质粒和fh基因敲除同源臂转化入GS115-Δgd感受态细胞中，验证后获得正确的GS115-Δgd-Δfh菌株。
9.一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株的应用，其特征在于：所述毕赤酵母用于检测外源同化途径能够在菌株内正常代谢。
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