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CN116606361B - 一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用 - Google Patents

一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用 Download PDF

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CN116606361B
CN116606361B CN202310453884.5A CN202310453884A CN116606361B CN 116606361 B CN116606361 B CN 116606361B CN 202310453884 A CN202310453884 A CN 202310453884A CN 116606361 B CN116606361 B CN 116606361B
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CN
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ljprp1
gene
nitrogen fixation
regulating
plant
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李豪
欧雅娟
朱辉
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Huazhong Agricultural University
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Huazhong Agricultural University
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用。本发明通过实验证明了与野生型相比，LjPRP1基因突变体植株根瘤固氮酶的活性显著提高，说明LjPRP1基因编码的LjPRP1蛋白调控了根瘤的固氮效率；在此基础上，本发明运用稳定转化技术超表达LjPRP1基因，获得超表达材料，与野生型相比，超表达材料根瘤固氮酶活性显著降低，说明LjPRP1基因及其表达的LjPRP1蛋白调控了根瘤的固氮效率，抑制该基因的表达，可以提高豆科植物的固氮效率，从而增加植物的生物量和产量，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有应用前景。

Description

一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋 白及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用。
背景技术
氮素是植物生长发育必不可少的元素之一。在传统农业中，通过施加工业氮肥能够有效地提高植物的产量。然而，工业固氮虽然有效的解决了农业生产中的氮肥限制，促进了第一次农业绿色革命，但是却引发了一系列的环境污染问题。植物对氮肥的利用效率较低，过量施加的氮肥会使大量未被利用的氮肥随着雨水的冲刷流入到江河湖海，导致严重的氮污染。与此同时，在工业生产氮肥的过程中会产生大量工业污染物，严重污染了地球生态环境。因此，如何减少化肥施用的同时，不影响甚至提高作物的产量，是作物遗传改良的一个重要方向。
在自然界中，一些土壤微生物能够与豆科植物形成根瘤，在常温常压下将空气中的氮气转化为氨，这一过程称为生物固氮。豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮是一种高效的生物固氮体系，为豆科植物提供了充足的氮源，是自然界土壤中最为重要的绿色氮源。百脉根(Lotusjaponicas)是豆科模式植物之一，提高百脉根的固氮效率，有助于遗传改良全国各地适宜栽培的豆科作物，如粮食、油料作物大豆、花生、红豆、绿豆等；牧草作物紫花首蓓、斜茎黄蔑等；紫云英、苔子等绿肥；甘草、黄蔑等中草；防风固沙植物和豆科树。因此，提高作物根瘤固氮效率，不仅具有重要的科学意义，也能为人类改善生态环境和实现农业可持续发展提供重要的保障。
目前关于PRP1基因在提高水稻耐盐性的方面有许多报道，但是在百脉根中目前尚未有关于LjPRP1蛋白在调控植物根瘤固氮和/或调控产量的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用。本发明所述LjPRP1蛋白可以调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白，所述LjPRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码上述技术方案所述LjPRP1蛋白的LjPRP1基因，所述LjPRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的LjPRP1蛋白或上述技术方案所述的LjPRP1基因在调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量中的应用。
优选的，所述调控植物根瘤固氮效率包括：调控植物根瘤发育和/或调控植物根瘤中固氮酶活性。
优选的，所述调控植物根瘤固氮效率包括：通过负调控LjPRP1基因的表达来提高植物根瘤固氮效率，或通过正调控LjPRP1基因的表达来降低植物根瘤固氮效率。
优选的，所述调控植物产量包括：通过负调控LjPRP1基因的表达来提高植物产量，或通过正调控LjPRP1基因的表达来降低植物产量。
本发明还提供了上述技术方案所述的LjPRP1蛋白或上述技术方案所述的LjPRP1基因在培育固氮效率提高和/或产量提高的转基因植物中的应用。
优选的，所述固氮效率提高包括：促进植物根瘤发育和/或提高植物根瘤中固氮酶活性。
优选的，所述植物包括豆科植物。
优选的，所述豆科植物包括大豆、苜蓿和百脉根中的一种或多种。
有益效果：
本发明提供了一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白，所述LjPRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过实验证明了百脉根LjPRP1基因突变体植株中几乎检测不到LjPRP1基因的表达，与野生型相比，LjPRP1基因突变体植株根瘤固氮酶的活性显著提高，说明LjPRP1基因编码的LjPRP1蛋白调控了根瘤的固氮效率，预示LjPRP1蛋白在调控植物根瘤固氮效率中具有重要功能；在此基础上，本发明运用稳定转化技术超表达LjPRP1基因，获得超表达材料，与野生型相比，超表达材料根瘤固氮酶活性显著降低，说明LjPRP1基因及其表达的LjPRP1蛋白调控了根瘤的固氮效率，抑制该基因的表达，可以提高豆科植物的固氮效率，从而增加植物的生物量和产量，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为LjPRP1突变体植株和野生型的LjPRP1基因的相对表达量结果；
图2为LjPRP1突变体植株和野生型的侵染线数目图；
图3为乙烯标准曲线图；
图4为LjPRP1突变体植株单株苗固氮酶的活性图；
图5为LjPRP1超表达植株和野生型的侵染线数目；
图6为LjPRP1超表达植株单株苗固氮酶的活性图；
图7为植株根瘤石蜡切片图，其中，A为野生型和突变体根瘤切片，B为野生型和超表达植株根瘤切片；
其中，Ljprp1-1为突变体植株；LjPRP1-OX-7为超表达植株；
*表示在WT和突变体或超表达植株直接的差异性比较(t-检验)，其中，*表示显著水平0.01＜p≤0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001＜p≤0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间。
具体实施方式
本发明提供了一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白，所述LjPRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：MASQVASVEEVAGDKYRSFIHEEADTTHWRHGGPPTYDVVNHLFEQGRTKEWPKGSLEETVQNAIKSWEMEVSHKTRLQDFRTINPEKFKLFVNGREGLSAEETLSIGSYNALLKSSLPEEFKYYKSEEETFESSHEAFRSAFPRGFAWEVIKVYTGPPEIAYKFRHWGFFEGPFKGHAPTGKMVEFYGLGTLKVDNARKGEEVEIYYDPEEWRGDLLPASGTATEDPTKTTPTSQACPFSK。
本发明通过抑制LjPRP1蛋白编码基因的表达和促进LjPRP1蛋白编码基因的表达，证明了LjPRP1基因及其表达的LjPRP1蛋白调控了根瘤的固氮效率，抑制LjPRP1基因的表达，可以提高豆科植物的固氮效率，从而增加植物的生物量和产量。
本发明还提供了编码上述技术方案所述LjPRP1蛋白的LjPRP1基因，所述LjPRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：5’-ATGGCCAGCCAAGTAGCCTCCGTTGAAGAAGTTGCAGGAGACAAATAC AGATCTTTCATTCATGAAGAGGCTGACACAACCCACTGGAGACATGGTGGACCACCCACCTATGATGTTGTGAACCACCTTTTTGAACAAGGTCGAACCAAGGAATGGCCTAAAGGTTCATTAGAGGAGACAGTGCAAAACGCCATAAAATCATGGGAGATGGAGGTTTCTCACAAAACCCGCTTGCAGGATTTCAGAACCATAAATCCTGAAAAGTTCAAGCTCTTTGTTAATGGGAGGGAGGGGTTATCTGCAGAGGAAACTCTGAGCATAGGAAGTTATAATGCTTTGCTAAAAAGCTCTCTACCAGAAGAATTCAAGTATTACAAATCTGAAGAAGAGACTTTTGAATCATCTCATGAAGCTTTCAGATCAGCTTTTCCTCGTGGATTTGCATGGGAAGTGATCAAAGTTTATACCGGACCCCCTGAAATTGCTTACAAGTTTAGGCACTGGGGATTCTTTGAAGGTCCTTTCAAGGGACATGCCCCTACTGGGAAGATGGTTGAGTTCTATGGCTTGGGAACTCTCAAGGTTGACAACGCGCGGAAAGGGGAGGAGGTGGAGATCTACTACGACCCAGAAGAGTGGCGGGGTGATCTTCTACCTGCGAGTGGGACCGCCACAGAGGACCCCACTAAAACTACACCAACTTCTCAAGCATGTCCTTTCTCCAAATAA-3’。
本发明还提供了上述技术方案所述的LjPRP1蛋白或上述技术方案所述的LjPRP1基因在调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量中的应用。
在本发明中，所述调控植物根瘤固氮效率优选包括：调控植物根瘤发育和/或调控植物根瘤中固氮酶活性；所述调控植物根瘤发育优选包括调控侵染线的形成和/或侵染细胞的形成来调控植物根瘤发育。
在本发明中，所述调控植物根瘤固氮效率优选包括：通过负调控LjPRP1基因的表达来提高植物根瘤固氮效率，或通过正调控LjPRP1基因的表达来降低植物根瘤固氮效率；更优选包括通过负调控LjPRP1基因的表达来促进植物根瘤发育和/或增强植物根瘤中固氮酶活性，或通过正调控LjPRP1基因的表达来抑制植物根瘤发育和/或抑制植物根瘤中固氮酶活性。
在本发明中，所述调控植物产量优选包括：通过负调控LjPRP1基因的表达来提高植物产量，或通过正调控LjPRP1基因的表达来降低植物产量。
在本发明中，所述负调控的方式优选包括突变LjPRP1基因。
在本发明中，所述正调控的方式优选包括超表达LjPRP1基因。
本发明还提供了上述技术方案所述的LjPRP1蛋白或上述技术方案所述的LjPRP1基因在培育固氮效率提高和/或产量提高的转基因植物中的应用。
在本发明中，所述固氮效率提高优选包括：促进植物根瘤发育和/或提高植物根瘤中固氮酶活性。本发明通过负调控LjPRP1基因的表达，能够促进植物根瘤发育和提高植物根瘤中固氮酶活性，从而提高根瘤固氮效率，使根瘤固定更多的氮素提供给植物，达到提高产量的效果。
在本发明中，所述产量提高优选包括通过提高植物的固氮效率，从而增加植物的生物量和产量。
在本发明中，所述植物优选包括豆科植物；所述豆科植物优选包括大豆、苜蓿和百脉根中的一种或多种。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种调控植物根瘤固氮效率和/或调控植物产量的LjPRP1蛋白及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
百脉根LjPRP1基因的突变体的表达量检测
1.种子萌发
百脉根LjPRP1基因突变体种子Ljprp1-1购买自LotusBase(https://lotus.au.dk/lore1/search)，plantID：30037066，此突变体种子的LORE1的插入位点在LjPRP1的第一个外显子上，于起始密码子ATG之后168bp处，LjPRP1基因在百脉根基因组数据库miyakogusa中的基因编号为Lj0g3v0096089.1。本发明购买种子后，通过PCR鉴定了杂合和纯合突变体，使用纯合的突变体进行后续实验，百脉根野生型种子公开于【FengY,WuP,LiuC,PengL,WangT,WangC,TanQ,LiB,OuY,ZhuH,YuanS,HuangR,StaceyG,ZhangZ,CaoY.SuppressionofLjBAK1-mediatedimmunitybySymRKpromotes rhizobialinfectioninLotusjaponicus.MolecularPlant,2021,14:1935-1950】。将所述百脉根LjPRP1基因突变体种子Ljprp1-1和百脉根野生型种子分别进行萌发，具体方法如下：
在100mL无菌三角瓶中加入20mL浓硫酸，再倒入种子，轻轻晃动使种子与浓硫酸充分接触，处理10min，种子颜色稍变浅，浓H2SO4颜色变黄。小心吸取浓硫酸至装有少量水的玻璃器皿中，向三角瓶中加入大量MiliQ-H2O迅速漂洗种子，弃废液。再用少量的MiliQ-H2O重复漂洗4次。加入2％次氯酸钠溶液覆盖种子，轻轻晃动，处理10min，此时种子种脐处掉落透明的小圈，会有个别种子胀开，液体会有些许浅黄色。弃废液，用MiliQ-H2O漂洗种子，重复漂洗4次。用20mL的MiliQ-H2O浸没种子，4℃春化1d。将吸胀的种子移至MS培养基，光照培养箱23℃暗培养2d，光照培养4d，得到萌发的幼苗。
MS培养基按以下方法配制得到：4.43gMS盐(Sigma，M5519-1L)，20g蔗糖，pH调节至6.0，MiliQ-H2O定容至1L，固体添加1.5wt.％琼脂粉，115℃灭菌20min。
2.移栽幼苗和接种根瘤菌
将蛭石润湿于121℃灭菌30min，待温度冷却至室温，将步骤1中萌发的幼苗移到土里，盖上透明塑料盖，于温室中光照培养。
培养7d后，子叶完全展开。用TY液体培养基28℃震荡培养根瘤菌Mesorhizobiumloti MAFF303099，待OD600值为0.8，4000r/min离心5min收集菌体，用B&D无氮培养基重悬将其稀释至OD600＝0.01，接种于百脉根幼苗根部，每棵接种量为3ml。
TY培养基按以下方法配制得到：3g酵母提取物，5g胰蛋白胨，0.69gCaCl2，pH调节至7.0，MiliQ-H2O定容至1L，121℃灭菌30min。
B&D无氮液体培养基由以下浓度的组分组成：1mmol/L CaCl2、0.5mmol/L KH2PO4、10μmol/L Fe(C6H5O7)、0.25mmol/L MgSO4、0.25mmol/L K2SO4、1.0μmol/L MnSO4、2.0μmol/LH3BO3、0.5μmol/L ZnSO4、0.2μmol/L CuSO4、0.1μmol/L CoSO4和0.1μmol/L Na2MoO4；121℃灭菌30min制备得到。
Mesorhizobium loti MAFF303099公开于【Feng Y,Wu P,Liu C,Peng L,Wang T,Wang C,Tan Q,Li B,Ou Y,Zhu H,Yuan S,Huang R,Stacey G,Zhang Z,CaoY.Suppression of LjBAK1-mediated immunity by SymRK promotes rhizobialinfection in Lotus japonicus.Molecular Plant,2021,14:1935-1950】。
接种根瘤菌21d后，取植株地下部分组织抽提RNA，反转录为cDNA，其中，RNA提取方法为：用RNA抽提试剂盒(Aidlab,RN3302)提取百脉根根瘤的总RNA，具体方法参照试剂盒操作手册；RNA洗脱后，用NanoDrop2000(Thermo)检测RNA的浓度和纯度，样品可于-80℃保存。反转录方法为：用反转录试剂盒(ABcloanl,RK20403)将RNA反转录为cDNA，具体方法参照试剂盒操作手册。
反转录为cDNA后，通过荧光定量PCR检测LjPRP1的转录水平，荧光定量PCR采用的是莫纳生物的SYBR Green qPCR Mix试剂盒。使用美国ABI公司的Applied BiosystemsViiATM 7 Real-Time PCR System仪器，PCR反应程序：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。采用相对定量ΔΔCt法，以百脉根Ubiquitin(Genbank ID:AW720576)和ATPase(Genbank ID:AW719841)作为内参来标准化基因表达水平；
所述荧光定量PCR中扩增LjPRP1基因、Ubiquitin和ATPase的引物分别为：
LjPRP1-F：5’-GCCAGCCAAGTAGCCTCCGTTG-3’，SEQ ID NO.3；
LjPRP1-R：5’-TGCACTGTCTCCTCTAATGAACC-3’，SEQ ID NO.4；
Ubiquitin-F：5’-TTCACCTTGTGCTCCGTCTTC-3’，SEQ ID NO.5；
Ubiquitin-R：5’-AACAACCAGCACACACAGACAATC-3’，SEQ ID NO.6；
ATPase-F：5’-CAATGTCGCCAAGGCCCATGGTG-3’，SEQ ID NO.7；
ATPase-R：5’-AACACCACTCTCGATCATTTCTCTG-3’，SEQ ID NO.8。
结果发现，相对于野生型植株，LjPRP1-1纯合突变体植株中几乎检测不到LjPRP1的表达(图1)。这一结果表明百脉根LjPRP1基因突变体种子中LORE1的插入引起了LjPRP1基因的缺失突变，导致LjPRP1基因无法表达。
实施例2
百脉根LjPRP1基因的突变对侵染线数目的影响
1.种子萌发同实施例1。
2.移栽幼苗和接种根瘤菌
将蛭石润湿于121℃灭菌30min，待温度冷却至室温，将步骤1中萌发的幼苗移到土里，盖上透明塑料盖，于温室中光照培养。
培养7d后，子叶完全展开。用TY液体培养基28℃震荡培养根瘤菌MesorhizobiumlotiMAFF303099/pHC60，待OD600值为0.8，4000r/min离心5min收集菌体，用B&D无氮培养基重悬将其稀释至OD600＝0.01，接种于百脉根幼苗根部，每棵接种量为3ml。
TY培养基：3g酵母提取物，5g胰蛋白胨，0.69gCaCl2，pH调节至7.0，MiliQ-H2O定容至1L，121℃灭菌30min。
B&D无氮液体培养基由以下浓度的组分组成：1mmol/LCaCl2，0.5mmol/LKH2PO4，10μmol/LFe(C6H5O7)，0.25mmol/LMgSO4，0.25mmol/LK2SO4，1.0μmol/LMnSO4，2.0μmol/LH3BO3，0.5μmol/LZnSO4，0.2μmol/LCuSO4，0.1μmol/LCoSO4和0.1μmol/LNa2MoO4，121℃灭菌30min。
MesorhizobiumlotiMAFF303099/pHC60来源于文献【FengY,WuP,LiuC,PengL,WangT,WangC,TanQ,LiB,OuY,ZhuH,YuanS,HuangR,StaceyG,ZhangZ,CaoY.SuppressionofLjBAK1-mediatedimmunitybySymRKpromotes rhizobialinfectioninLotusjaponicus.MolecularPlant,2021,14:1935-1950】，即文献中的“M.lotiMAFF303099expressingGFP”。
3.统计侵染线数目
接种根瘤菌5d后，从蛭石中挖出植株，洗净植株的根，在NikonSMZ18荧光体视显微镜下分别统计野生型(WT)和LjPRP1突变体植株的侵染线数量，其中野生型和LjPRP1突变体植株的数量均为15株。结果如图2和表1所示。
表1野生型和LjPRP1突变体植株的侵染线数量
由图2和表1可知，与野生型相比，LjPRP1突变体植株的侵染线显著增加，可见负调控LjPRP1基因表达将促进侵染线的形成。
实施例3
百脉根LjPRP1基因的突变对固氮酶的活性的影响
1.种子萌发同实施例1。
2.移栽幼苗和接种根瘤菌同实施例1。
3.百脉根根瘤固氮酶的活性测定。
接种根瘤菌3周后，从蛭石中挖出植株，洗净植株的根，将百脉根地下部分放入40mL玻璃瓶中，先用注射器从玻璃瓶中抽出3mL的空气，再用注射器往玻璃瓶中注入2mL的乙炔气体。将玻璃瓶置于装有水的塑料盒中，28℃反应2小时后取出，用气相色谱仪检测，其中野生型和LjPRP1突变体植株的数量均为24株。
4.乙烯标准曲线制作
用微量进样器往玻璃瓶中注入一定体积的乙烯标准气体，每个浓度设置3个重复，用气相色谱仪检测乙烯峰。在excel表格上绘制乙烯体积与乙烯峰面积的标准曲线。具体方法如下：
选取了10个体积梯度的乙烯气体(4μL、6μL、8μL、10μL、20μL、40μL、50μL、100μL、200μL、500μL)，用微量进样器分别注入到10个相同大小的用橡皮塞密封过的玻璃瓶中。放置一段时间待其完全混匀后，再用微量进样器分别从10个玻璃瓶中抽出100μL气体注入到气象色谱仪中，并记录下每个体积梯度下的乙烯色谱峰面积值，乙烯体积梯度的选择根据根瘤样品的乙烯还原能力而定。再以乙烯的体积梯度为横坐标，以记录的乙烯色谱峰面积值为纵坐标绘制标准曲线。如果忽略各样品玻璃瓶之间的容积差别以及操作上的误差，在一定条件范围内，瓶中乙烯体积与测定的乙烯色谱峰面积应成线性关系。本发明测定的乙烯标准曲线为y＝2362.5x+5600(R2＝0.9993)，见图3。其中R2代表线性回归决定系数，反应了两个变量之间的相关性。一般认为R2值越接近于1相关性就越强，对于结果分析就越准确。而本发明的R2值达到了0.9993，完全符合线性回归的描述，因此参照以上乙烯标准曲线可以进行接下来的根瘤固氮酶活力测定。
5.固氮酶的活性计算
根瘤固氮酶的活性即为乙炔还原活性(Acetylene Reduction Activity,ARA)，可表示为单位重量的根瘤在单位时间内还原乙炔的摩尔数，计算公式为：乙炔还原活性＝乙烯的摩尔数/反应时间(酶活的单位通常是：nmolC2H4/h/plant)。
根据气体的摩尔数与体积、温度，压力的关系，摩尔数可由乙烯体积求得：
C2H4(μmol)＝C2H4体积(μL)×1/22.4×273/(273+t℃)×P/760；
式中：t℃：反应温度(摄氏气温，28)，P：气压，通常取760毫米汞柱，22.4：1mol气体在标准状态下的体积是22.4升；273：绝对温度。
结果如图4和表2所示。
表2野生型和LjPRP1突变体植株的固氮酶活性
由图4和表2可知，与野生型相比，LjPRP1突变体单株苗的固氮酶的活性显著增加，说明LjPRP1的突变(即负调控LjPRP1基因的表达)提高了植株的固氮效率。
实施例4
LjPRP1超表达对侵染线数目的影响
1、获得百脉根根瘤cDNA
收取实施例3中，接种根瘤菌MAFF3030993周的根瘤样品，提取RNA，反转录为cDNA。
RNA提取方法和反转录方法同实施例1。
2、载体构建
根据LjPRP1全长cDNA设计引物，以百脉根根瘤cDNA为模板，分别用引物LjPRP1-cDNA-F和LjPRP1-cDNA-R扩增出LjPRP1全长cDNA片段；再以LjPRP1全长cDNA片段为模板，用引物LjPRP1-pub-F和LjPRP1-pub-R进行第二轮扩增，得到最终的LjPRP1片段。
扩增相应的基因。引物如下：
LjPRP1-cDNA-F:5’-ATGGCCAGCCAAGTAGCCTCCGTTG-3’，SEQ ID NO.9；
LjPRP1-cDNA-R:5’-TTTGGAGAAAGGACATGCTTGAGAA-3’，SEQ ID NO.10；
LjPRP1-pub-F:5’-TCTAGACTGTAATCACATCAAATGGCCAGCCAAGTAG CCTCCGTTGA-3’，SEQ ID NO.11；
LjPRP1-pub-R:5’-ACCGGATCCACTAGTAGGCCTTTTGGAGAAAGGACA TGCTTGAGAAG-3’，SEQ ID NO.12；
两次PCR扩增均使用Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme)，两次PCR扩增体系均为(20μL)：2×Phanta Max Buffer 10μL、dNTP(10mM earch)0.5μL、F-primer(10μM)0.5μL、R-primer(10μM)0.5μL、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 0.5μL、模板DNA 1μL和MiliQ-H2O 7μL；
两次PCR扩增程序均为：95℃变性预2min；95℃变性5s，57℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃，3min；18℃，5s。
载体pUB-GFP C-3xFLAG来源于(Yu,H.,et al.,Suppression of innateimmunity mediated by the CDPK-Rboh complex is required for rhizobialcolonization in Medicago truncatula nodules.New Phytol,2018.220(2):p.425-434.)，用限制性内切酶Stu Ⅰ(Thermo，ER0421)和Xba Ⅰ(Thermo，FD0684)酶切，通过Ginson反应分别与LjPRP1片段连接；将得到的重组载体，转化根癌农杆菌AgrobacteriumRhizogenes EHA105。
酶切体系为50μL：载体2μg、Xba Ⅰ1.5μL、Stu Ⅰ1.5μL、10×缓冲液0.5μL和余量的MiliQ-H2O；
载体分别与LjPRP1连接，采用Gibson反应方法(Yeasen，10911ES20)，反应体系为5μL：2×HieffEnzyme Premix 2.5μL、基因片段0.2μL、载体0.5μL和MiliQ-H2O 1.8μL；
Gibsion反应条件为：50℃反应20min。
3.百脉根稳定转化
(1)植物材料：在100mL无菌三角瓶中加入20mL浓硫酸，再倒入种子，轻轻晃动使种子与浓硫酸充分接触，处理10min，种子颜色稍变浅，浓H2SO4颜色变黄。小心吸取浓硫酸至装有少量水的玻璃器皿中，向三角瓶中加入60mL的MiliQ-H2O迅速漂洗种子，弃废液。再用40mL的MiliQ-H2O重复漂洗4次，至MiliQ-H2O颜色无变化。加入2％次氯酸钠溶液覆盖种子，轻轻晃动，处理10min，此时种子种脐处掉落透明的小圈，会有个别种子胀开，液体会有些许浅黄色。弃废液，用MiliQ-H2O漂洗种子，至无菌水颜色无变化。用20mL的MiliQ-H2O浸没种子，4℃春化1d。将吸胀的种子移至MS培养基，光照培养箱23℃暗培养2d，光照培养4d。
(2)菌株：待幼苗子叶长大，且真叶未长出时，将农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105接种于的LB中，28℃培养，使OD600＝0.6。4000r/m离心10min收集菌体，用共培养培养基重悬菌体，将菌液移至100mL无菌三角瓶中，28℃孵育30min。
(3)侵染与培养：向菌液中加入终浓度20μg/mL乙酰丁香酮(上海生工，A601111)，将幼苗子叶剪去，绿色的茎剪成0.3cm的小段，将剪好的茎段放入菌液中侵染30min。用10mL共培养培养基润湿含有10层无菌的滤纸的平板，将外植体捞出放置于平板上，23℃暗培养培养7d。共培养7d后，把外植体转入再生培养基上培养7d。然后置于筛选培养基上筛选，7d继代一次直至长出绿色愈伤。将绿色愈伤移至芽诱导培养基，7d继代一次直至长出小芽。再移至芽生长培养基上生长，7d继代一次，生长14d。再移至芽伸长培养基上使芽伸长，7d继代一次，生长14d。将小芽切下移至根诱导培养基上培养，7d继代一次，直至基部肿大。再将小芽移至根伸长培养基，7d继代一次，直至根长出，得到LjPRP1超表达植株，记为LjPRP1-OX-7。
共培养培养基：0.387gB5盐，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭菌20min。使用前加入5mL1mol/LMES(pH5.2)，1mL0.5mg/mL6-BA，0.1mL0.5mg/mLNAA和0.1mL1000×B5维生素。
再生培养基：3.87gB5盐，20g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入1mL0.5mg/mL6-BA，0.1mL0.5mg/mL NAA，1mL1000×B5维生素和1mL300mg/mL头孢噻肟。
筛选培养基：3.87gB5盐，20g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入1mL0.5mg/mL6-BA，0.1mL0.5mg/mL NAA，1mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.3mL50mg/mL潮霉素。
芽诱导培养基：3.87gB5盐，20g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入1mL0.5mg/mL6-BA，2.5mL2mol/L(NH4)2SO4，0.1mL0.5mg/mLNAA，1mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.15mL50mg/mL潮霉素。
芽生长培养基：3.87gB5盐，20g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入0.4mL0.5mg/mL6-BA，1mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.15mL50mg/mL潮霉素。
芽伸长培养基：3.87gB5盐，20g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入80μL0.5mg/mL6-BA，1mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.15mL50mg/mL潮霉素。
根诱导培养基：1.94gB5盐，10g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入1mL0.5mg/mLNAA，0.5mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.1mL50mg/mL潮霉素。
根伸长培养基：1.94gB5盐，10g蔗糖，4g植物凝胶，MiliQ-H2O定容至1L，pH调节至5.5，115℃灭20min。使用前加入0.5mL1000×B5维生素，1mL300mg/mL头孢噻肟和0.1mL50mg/mL潮霉素。
LB培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10gNaCl，pH调节至7.0，MiliQ-H2O定容至1L，固体添加1.8％琼脂粉，121℃灭菌30min。
MS培养基：4.43gMS盐(Sigma,M5519-1L)，20g蔗糖，pH调节至6.0，MiliQ-H2O定容至1L，固体添加1.5％琼脂粉，115℃灭菌20min。
植物凝胶(Thermo，VG0100B)，B5盐(Phytotech，G768-50L)，B5维生素(Mkbio,MS0620-500G)，头孢噻肟(Yeasan，60226ES08)，潮霉素(Yeasan，60225ES10)，6-BA(Sigma，B3408-25G)，NAA(Sigma，N0640-25G)。
4.利用上述获得的LjPRP1超表达植株种子和实施例1中的野生型种子，种子萌发同实施例1。
5.移栽幼苗和接种根瘤菌同实施例2。
6.统计侵染线数目。
接种根瘤菌5d后，从蛭石中挖出植株，洗净植株的根，在NikonSMZ18荧光体视显微镜下分别统计野生型和LjPRP1超表达植株的侵染线数量，其中野生型植株的数量均为15株，LjPRP1超表达植株的数量均为16株。结果如图5和表3所示。
表3野生型和LjPRP1超表达植株的侵染线数量
由图5和表3可知，与野生型相比LjPRP1超表达的侵染线显著减少，可见正调控LjPRP1基因表达将抑制侵染线的形成。
实施例5
LjPRP1超表达对固氮酶的活性的影响
1.LjPRP1超表达种子来自于实施例4中的稳定转化。
2.种子萌发同实施例1。
3.移栽幼苗和接种根瘤菌同实施例1。
4.百脉根根瘤固氮酶的活性测定同实施例3。
5.乙烯标准曲线制作同实施例3。
6.固氮酶的活性计算同实施例3。
结果如图6和表4所示，其中野生型植株的数量均为36株，LjPRP1超表达植株的数量均为40株。
表4野生型和LjPRP1超表达植株的固氮酶活性
由图6和表4可知，与对照相比，LjPRP1超表达固氮酶的活性显著降低，说明LjPRP1超表达降低了根瘤固氮效率。
实施例6
LjPRP1的表达对植株根瘤的影响
收取实施例3和实施例5中，接种根瘤菌MAFF3030993周的根瘤样品，FAA固定液(Servicebio，G1103-500mL)固定，由武汉赛维尔生物科技有限公司进行石蜡包埋、切片后，用甲苯胺蓝染色，再用体视显微镜观察，结果如图7所示。根据图7可以看出，与野生型相比，LjPRP1突变体中侵染细胞更多，LjPRP1超表达植株中的侵染细胞更少，LjPRP1的表达抑制了根瘤的发育。
综上所述，百脉根LjPRP1基因在调控固氮效率中具有重要的功能。LjPRP1基因的突变使侵染线的数目显著增加，单株苗的固氮酶的活性显著增加，LjPRP1基因的超表达使侵染线的数目显著降低，单株苗的固氮酶的活性显著降低，表明LjPRP1基因在应用于提高百脉根固氮效率以及产量方面有重要的意义。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.LjPRP1蛋白或LjPRP1基因在调控百脉根根瘤固氮效率中的应用，所述LjPRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LjPRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控百脉根根瘤固氮效率为：调控百脉根根瘤发育和/或调控百脉根根瘤中固氮酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控百脉根根瘤固氮效率为：通过负调控LjPRP1基因的表达来提高百脉根根瘤固氮效率，或通过正调控LjPRP1基因的表达来降低百脉根根瘤固氮效率。
4.LjPRP1蛋白或LjPRP1基因在培育固氮效率提高的转基因百脉根中的应用，所述LjPRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LjPRP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固氮效率提高为：促进百脉根根瘤发育和/或提高百脉根根瘤中固氮酶活性。
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