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CN116574706B - 羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体合成中的应用 - Google Patents

羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体合成中的应用

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CN116574706B
CN116574706B CN202310623945.8A CN202310623945A CN116574706B CN 116574706 B CN116574706 B CN 116574706B CN 202310623945 A CN202310623945 A CN 202310623945A CN 116574706 B CN116574706 B CN 116574706B
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amino acid
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许建和
潘江
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Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体(S)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶合成中的应用。主要涉及羰基还原酶热稳定性显著提高的突变体及其编码核酸、重组表达载体、重组表达转化体，并利用该羰基还原酶突变体或羰基还原酶催化剂催化N‑Boc‑3‑哌啶酮的不对称还原，生成依鲁替尼药物关键中间体(S)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶的应用。与现有技术相比，本发明的羰基还原酶突变体具有催化活性高、热稳定性好等优势，在制备依鲁替尼等药物中间体中具有很好的工业应用前景。

Description

羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体合成中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体(S)-N-Boc-3-羟基哌啶合成中的应用。
背景技术
许多生物活性分子和药物都具有哌啶环结构，手性羟基哌啶作为许多药物合成的关键前体，在制药业中引起了越来越大的兴趣。依鲁替尼(Ibrutinib)是一种布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，于2013年被美国食品和药物管理局批准用于治疗特定的淋巴瘤和白血病癌症。由于其良好的安全性和强大的活性，依鲁替尼在2019年全球小分子药品销售中排名第三。而(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)作为合成依鲁替尼(Ibrutinib)的关键药物中间体和手性来源，其市场不断扩大。
手性N-Boc-3-羟基哌啶的制备方法主要分为化学法跟生物转化法。化学法中的非对映异构体分离法，是将外消旋的哌啶醇溶解于单一构型的手性酸中，特定构型的哌啶醇与手性酸形成盐而沉淀，从而达到与另一构型的哌啶醇分离的目的，该方法拆分效率低、成本较高；化学不对称合成法使用金属催化剂，该方法催化效率低且反应条件苛刻。而由生物催化剂介导的酮底物不对称还原生产手性醇是一种更环保和可持续的工艺，具有高立体选择性、适中的反应条件、不需要昂贵的辅助底物且反应步骤简单等优点。
在早期的研究中，Romain Lacheretz等人用胡萝卜的组织作为生物催化剂来还原N-Boc-3-哌啶酮，获得了ee值95％和较低产量的(S)-NBHP(73％)(Organic Letters,2009,11:1245-1248)。Ju等人通过分批补料的策略，利用醛酮还原酶KRED实现克级规模(S)-NBHP(100g/L，99％ee)的酶法合成(Organic Process Research&Development,2014,18:827-830)。Chen等人发现一种热稳定的醛酮还原酶AKR对(S)-NBHP的制备显示出良好的工业价值(200g/L，99％ee)，但需反应16h获得99％的转化率(Applied biochemistry andBiotechnology,2017,181:1304-1313)。Xu等人利用醇脱氢酶TbADH与葡萄糖脱氢酶共表达，在50g/L的湿细胞量下，可催化100g/L的N-Boc-3-哌啶酮转化，转化率达到96％，但该反应催化剂用量较多(RSC Advances,2019,9:2325-2331)。Wei等人发现FsADH对N-Boc-3-哌啶酮有较高的催化活力，反应24h后能够催化597g/L的底物获得99％的转化率和99％ee的(S)-NBHP，但最终产物得率较低(58％)(Biochemical Engineering Journal,2022,178,108300)。在YGL039 W催化反应中，可以容忍高达400g/L的底物负载，但立体选择性会被逆转(Catalysis Communications,2017,97:5-9)。
酶作为生物催化剂，在生物经济中发挥着关键作用，其应用范围不断扩大，包括可持续的、绿色生产的精细化学品和生物燃料。然而，与传统的化学催化剂相比，酶的应用容易受到稳定性差的限制，大部分的自然酶只能在温和的条件下催化反应，反应温度过高容易导致酶的结构功能改变，从而影响反应性能，酶用量大，反应转化率低。因此探索具有优异催化活性、热稳定性，以及严格立体选择性和高底物/产物耐受性的还原酶对于(S)-NBHP的工业生物不对称合成至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，通过蛋白质工程改造，提供一种羰基还原酶突变体及在依鲁替尼关键中间体合成中的应用。
本发明通过对蛋白质结构进行理性设计，提供了几种热稳定性显著提高的羰基还原酶突变体，解决了其热稳定性差不能实际应用的问题，拓展了其在合成手性醇的方面的实际应用价值。
具体而言，本发明提供一种具有高催化活性且热稳定性显著提高的羰基还原酶突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，并使用该重组羰基还原酶作为催化剂，高效催化N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一：提供一种热稳定性显著提高且保持高催化活性的羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体是在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸形成的热稳定性提高的衍生蛋白质，选择如下氨基酸序列对应的蛋白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸，第30位谷氨酰胺替换为亮氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第48位赖氨酸替换为半胱氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位的丙氨酸替换为精氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第96位苏氨酸替换为脯氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸。
本发明以实验室酶库中羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W为基础，借助计算机的理性设计策略对CgKR1-F92C/F94W进行热稳定性的改造，获得热稳定性显著提高且对N-Boc-3-哌啶酮保持高催化活性的羰基还原酶突变体。其中，羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，能够有效催化N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原获得目标产物(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
其中，羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W在文章“PreparationofStructurallyDiverseChiralAlcoholsbyEngineeringKetoreductaseCgKR1”(ACSCatal.2017,DOI:10.1021/acscatal.7b01933)中有报道过。
在本发明的一个实施方式中，羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W来源于光滑念珠菌(Candida glabrata)。
本发明的技术方案二：提供一种分离的核酸，所述核酸是编码所述羰基还原酶突变体的核酸分子。
本发明的技术方案三：提供一种包含所述羰基还原酶突变体核酸的重组表达载体。
所述重组表达载体为通过本领域常规的方法将所述羰基还原酶突变体核酸克隆到各种表达载体上而获得。所述的表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或是病毒载体等，优选质粒pET-28a(+)。
本发明的技术方案四：还提供了一种包含所述羰基还原酶突变体基因的重组表达转化体。
所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的本发明的羰基还原酶突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，即可获得本发明优选的重组表达转化体。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法、电转法等，更优选的为热激法。
本发明的技术方案五：提供一种所述重组羰基还原酶或其突变体的制备方法。
本发明所述重组羰基还原酶或其突变体的制备方法较优为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的羰基还原酶。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明所述重组羰基还原酶的培养基。所述培养基优选LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件等可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述的重组羰基还原酶即可。
重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选本发明所述的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的OD600达到0.5～1.0时，加入终浓度为0.1～0.5mmol/L的β-D异丙基-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的羰基还原酶。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将所得细胞悬浮于磷酸钠缓冲液(PBS,100mmol/L,pH 6.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上淸液，即可获得所述重组羰基还原酶的粗酶液。
本发明的技术方案六：提供一种羰基还原酶催化剂，是以下形式中的任意一种：
(1)培养所述重组表达转化体，分离含有羰基还原酶的转化体细胞；
(2)对含有所述羰基还原酶的转化体细胞进行破碎，获得含有所述羰基还原酶的细胞破碎液即粗酶液；
(3)将含有所述羰基还原酶的细胞破碎液进行纯化得到纯酶液。
本发明中提供了酶的比活检测：利用紫外-可见分光光度计测定羰基还原酶的活力，通过检测NADPH在340nm处吸光值的变化来计算。测活体系为1mL，包括970μL的PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)，10μL的底物N-Boc-3-哌啶酮(200mM，利用乙醇助溶)，10μL的NADPH(17.5mM)，10μL的酶液(稀释到合适浓度)。体系中所有物质依次加入到比色皿中，混合均匀后放入紫外分光光度计中，在30℃下测定吸光值变化。酶活力的单位定义为，每分钟内氧化1μmol的NADPH所需要的酶量。酶活计算公式如下：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol.cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟催化lμmol NADPH氧化所需的酶量。
本发明采用的技术方案七：使用如上所述的重组羰基还原酶突变体或羰基还原酶催化剂催化N-Boc-3-哌啶酮不对称还原合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的方法。
其中所述的N-Boc-羰基氮杂环的结构如下所示：
以N-Boc-哌啶酮为底物不对称还原合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，以羰基还原酶CgKR1与葡萄糖脱氢酶BmGDH偶联从而实现NADPH的辅酶循环，示意式如下：
所述的不对称还原反应的条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳的，所述的应用包括下述步骤：将表达重组羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌整细胞加入反应缓冲液中，加入底物、葡萄糖以及NADP+，在一定温度下混合反应。所述工程化羰基还原酶与N-Boc-3-哌啶酮的用量比较佳的为80kU/mol～240kU/mol底物，葡萄糖与N-Boc-3-哌啶酮的比较佳用量为200g/mol～300g/mol。反应缓冲液为实验室常规缓冲液，pH范围在5.5～7.0，优选为磷酸钠缓冲液，浓度较佳的为0.1～0.2mol/L，额外添加的NADP+的用量以0～0.1mmol/L较佳。反应温度较佳的为35～45℃，反应过程以在搅拌条件下进行较佳。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1～24h。反应转化率采用气相色谱法进行分析。
待不对称反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或甲基叔丁基醚等进行萃取，再用无水硫酸镁进行干燥。
其中，(S)-N-Boc-3-羟基哌啶是合成依鲁替尼药物的关键中间体。
与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：
本发明的工程化羰基还原酶突变体具有高催化活性、显著提升的热稳定性以及选择性好的优势。最优突变体可在4h内转化100g/L的底物，转化率达到99％，所得产物均为S-构型且光学纯度大于99％ee，酶的上载量减少至5g/L。因此本发明的羰基还原酶在催化N-Boc-3-哌啶酮还原时，不仅酶用量少、光学纯度高，且反应时间短，在依鲁替尼等药物中间体的生产中具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。
下列实施例中的材料来源为：
重组CgKR1-F92C/F94W质粒由实验室前期构建(本领域技术人员根据CgKR1-F92C/F94W的序列可以采用生物技术领域常规手段制备得到)。大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Prime Star均购自北京天根生化科技有限公司。
实施例1羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W及其突变体质粒的构建
以重组质粒CgKR1-F92C/F94W为模板，对拟突变位点设计上下游引物。
表1.CgKR1-F92C/F94W为出发母本构建突变体时所用引物
羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W的基因序列如SEQ ID No.1所示。
PCR体系为：10μL的PrimeSTAR(HS)，6μL的ddH2O，1μL的DMSO，上游引物和下游引物各1μL，以及1μL的模板质粒。PCR扩增程序为：98℃预变性3min后进行15次如下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸7min，最后72℃保温10min。PCR产物消化：PCR扩增结束后，加入2μL的DPnⅠ和2μL的Cutsmart并置于37℃培养箱中2～3h，得到突变体质粒。
实施例2突变羰基还原酶重组表达转化体的制备
将实施例1中扩增得到的突变体质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中，挑取阳性克隆即可获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CgKR1-F92C/F94WM1-M12。
实施例3羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W及其突变体的制备
将实施例2中所得的重组表达转化体接种到含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB试管中，于37℃摇床培养8～12h，后以1％(v/v)的接种量将菌液加入到含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的TB摇瓶中，37℃摇床培养3h左右至菌液的OD600达到0.6-0.8。随后加入IPTG(终浓度为0.2mM)，并在16℃摇床中培养20～24h左右。培养结束后，用4℃离心机8000rpm，10min收集菌体，并用生理盐水洗涤得到静息细胞，用10mL的PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)进行重悬，得到突变体湿细胞。
对细胞重悬液进行超声处理：400W功率，工作2s，间歇3s，共15min。将破碎液离心(4℃，12000rpm，30min)，取上清，此时上清液即为粗酶液。利用镍柱对粗酶液进行纯化，得到突变体纯酶。
所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列是如下序列中的一种：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，并将该突变体命名为M1；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸，并将该突变体命名为M2；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，并将该突变体命名为M3；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸，第30位谷氨酰胺替换为亮氨酸，并将该突变体命名为M4；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，并将该突变体命名为M5；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，并将该突变体命名为M6；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸，并将该突变体命名为M7；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸，并将该突变体命名为M8；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第48位赖氨酸替换为半胱氨酸，并将该突变体命名为M9；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸，并将该突变体命名为M10；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第96位苏氨酸替换为脯氨酸，并将该突变体命名为M11；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸，并将该突变体命名为M12。
实施例4重组羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W及其突变体的半衰期测定
将实施例3中所得的纯酶利用PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)进行稀释后，在50℃的水浴锅中进行孵育，间隔时间取出一定量的酶液，于冰上静置5min后测定其活力，并通过一级失活方程计算半衰期。一级失活方程ln(V/V0)＝-kDt，半衰期(t1/2)＝0.693/kD。kD为失活速率常数；V为残余活力，V0为初始活力。
表2提供本发明具有相关活性且稳定性提高的羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W突变体的列表。在稳定性(特指50℃下突变体的半衰期)列表中，与母本CgKR1-F92C/F94W相比，一个加号“+”表示突变体蛋白稳定性提高了1-10倍；两个加号“++”表示突变体蛋白稳定性提高10-50倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白稳定性提高50-100倍。
表2.热稳定性提高的羰基还原酶CgKR1-F92C/F94W M1-M12突变体
实施例5-6羰基还原酶母本M0及突变体M12催化N-Boc-3-哌啶酮的还原
在40℃下利用磁力搅拌器进行10mL的反应，反应混合液中包含0.996g的底物N-Boc-哌啶酮(500mM)，1.35g的葡萄糖(750mM)，0.787mg的NADP+(0.1mM)，0.05g母本或突变体的大肠杆菌湿细胞(5g/L)，0.166g的BmGDH冻干酶粉(500U)，9.5mL的PBS缓冲液(100mM,pH 6.0)，以及底物助溶剂0.5mL的乙醇。反应过程中通过滴加2M的Na2CO3来控制反应的pH，将其保持在6.0左右，同时在反应过程中按时取样，直到反应结束。每次取样100μL，并加入500μL的乙酸乙酯进行震荡萃取，离心后取上清并用无水MgSO4干燥。通过气相色谱分析，计算转化率，所得产物均为S-构型，光学纯度大于99％ee。
表3.羰基还原酶及突变体催化N-Boc-3-哌啶酮还原反应结果
对于其他的突变体M1-M11，其催化N-Boc-3-哌啶酮还原反应的转化率也都在90％以上。
本发明中涉及到的序列表如下：
SEQ ID NO.1
ATGGCTTCTGATAACAGCAACACAACTGTCTTTGTCTCTGGTGCTACTGGTTTCATTGCTCAGCACGTAGTTAGACAATTGCTTGACCAGAACTACAAGGTCATTGGCTCTGTTAGATCTGCTGAGAAGGGTGACCACTTGAAGAATGTTATCTTCAAAGGTGGTGACTTCAACTATGAGATTGTCAAAGACATCTCTGATCCAACCGCATTTGACCACGTCTTCGAGAAGCATGGCAAGGATATCAAGGTTGTCTTACACACCGCCTCTCCATGTCACTGGAACACCACTGACATTGAAAAGGATCTATTGATCCCAGCTGTCAACGGTACCAAGGGTATCTTAGAATCCATCAAGAAGTACGCTGCTCAAACAGTTGAGAGAGTTGTTGTTACTTCCTCCTTTGCTGCCGACTCCTCCACAGTTGACATGTTCTACGCTAAGGATTCTTCCAAGACAATTACTGAAGAATCTTGGAACCAAGACACTTGGGAAAGTTGTCAATCCGATCCAATCAGAGGTTACTGTGGTTCAAAGAAGTTTGCCGAAAAGGCGGCTTGGGACTTCTACAACGCCAACAAGGACTCTGTCAAATTTAAGTTGTCTATCATCAACCCAGTATACGTCTTCGGTCCACAAAACTATGTGGAACCAGGTAAGAAGATTCTAAACACTTCTTCTGAAGTCATCAACAGCTTGGTCCACTTGAAGAAGGATGACCCATTGCCAGAGTTTGCAGGTGGTCACATCGACGTCCGTGATGTTGCCAAGGCTCATATCCTAGCGTTCCAAAAGGACGAGTTGATCGAGCAAAGATTGATGCTTCATGCTGGTCTATTCACTACCCAAACCCTGCTAGATATCATTAATGAACAATTCCCAGAACTGAAAGGTAAGATTCCAGCTGGTAAGCCAGGTACCGGTAACCCAGATGATGCATTGACTCCAGTTGACAACTCCAAGACCAAGAAATTGCTGGGCTTCGAGTTTATTGATTTGAAGAAGGACCTTTACGACACCATCTCTCAAATTTTGGAAGCCGAGAAGAACTCTAATTAA
SEQ ID NO.2
MASDNSNTTVFVSGATGFIAQHVVRQLLDQNYKVIGSVRSAEKGDHLKNVIFKGGDFNYEIVKDISDPTAFDHVFEKHGKDIKVVLHTASPCHWNTTDIEKDLLIPAVNGTKGILESIKKYAAQTVERVVVTSSFAADSSTVDMFYAKDSSKTITEESWNQDTWESCQSDPIRGYCGSKKFAEKAAWDFYNANKDSVKFKLSIINPVYVFGPQNYVEPGKKILNTSSEVINSLVHLKKDDPLPEFAGGHIDVRDVAKAHILAFQKDELIEQRLMLHAGLFTTQTLLDIINEQFPELKGKIPAGKPGTGNPDDALTPVDNSKTKKLLGFEFIDLKKDLYDTISQILEAEKNSN
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，选择如下氨基酸序列对应的蛋白质：
(1) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺；
(2) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸；
(3) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸；
(4) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为亮氨酸，第30位谷氨酰胺替换为亮氨酸；
(5) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸；
(6) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸；
(7) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸；
(8) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸；
(9) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第48位赖氨酸替换为半胱氨酸；
(10) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位的丙氨酸替换为精氨酸，第302位丙氨酸替换为精氨酸；
(11) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第96位苏氨酸替换为脯氨酸；
(12) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第138位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，第276位组氨酸替换为半胱氨酸，第30位谷氨酰胺替换为甲硫氨酸，第313位丙氨酸替换为精氨酸，第334位赖氨酸替换为精氨酸。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述羰基还原酶突变体的核酸分子。
3.一种包含权利要求2所述羰基还原酶突变体核酸的重组表达载体。
4.一种包含权利要求2所述羰基还原酶突变体基因的重组表达转化体。
5.一种羰基还原酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
(1) 培养权利要求4所述重组表达转化体，分离含有权利要求1所述羰基还原酶突变体的转化体细胞；
(2) 对(1)所述转化体细胞进行破碎，获得含有权利要求1所述羰基还原酶突变体的细胞破碎液，即粗酶液；
(3) 将含有所述羰基还原酶突变体的细胞破碎液进行纯化得到的纯酶液。
6.权利要求1所述重组羰基还原酶突变体或权利要求5所述羰基还原酶催化剂催化N-Boc-3-哌啶酮不对称还原合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的应用；
所述的N-Boc-3-哌啶酮的结构如下所示：
。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用权利要求1所述重组羰基还原酶突变体或权利要求5所述羰基还原酶催化剂催化N-Boc-3-哌啶酮不对称还原的反应在辅酶NADPH的存在下进行。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，NADPH可以通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖和NADP+转化反应生成。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求1所述重组羰基还原酶突变体或权利要求5所述羰基还原酶催化剂与N-Boc-3-哌啶酮的用量比为80 kU/mol~240 kU/mol底物，葡萄糖与N-Boc-3-哌啶酮的比较为200 g/mol~300 g/mol； pH范围在5.5~7.0，反应温度为35~45 ℃。
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