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CN116568278A - 获得茶叶的水性提取物的方法、包含此类提取物的组合物和它们的化妆品用途 - Google Patents

获得茶叶的水性提取物的方法、包含此类提取物的组合物和它们的化妆品用途 Download PDF

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CN116568278A CN202180078783.3A CN202180078783A CN116568278A CN 116568278 A CN116568278 A CN 116568278A CN 202180078783 A CN202180078783 A CN 202180078783A CN 116568278 A CN116568278 A CN 116568278A
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Abstract

本发明涉及获得茶叶(Camellia sinensis)，特别是新鲜茶叶、普洱茶、抹茶或绿茶的水性提取物的方法。本发明还涉及富含小RNA、糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸的茶提取物，以及涉及包含此类提取物的化妆品组合物和它们的化妆品用途，所述化妆品用途用于对皮肤、头皮和附属物(appendage)的护理，更特别是用于保护皮肤免受外部侵害和氧化、对抗皮肤衰老的迹象、增强光防护、增亮皮肤和改善皮肤水合。

Description

获得茶叶的水性提取物的方法、包含此类提取物的组合物和 它们的化妆品用途
技术领域
本发明涉及化妆品的领域，特别是涉及用于化妆品配制物的制备中以改善皮肤的外观或保护皮肤的天然来源的活性成分。
本发明涉及用于获得不同类型的茶，特别是新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶的水性提取物的方法，以及涉及富含小RNA，富含糖类，富含酚类化合物，富含有机酸，富含茶素(theine)和富含茶氨酸的茶提取物，包含此类提取物的化妆品组合物和它们的化妆品用途，所述化妆品用途用于对皮肤、头皮和附属物的护理，更特别是用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，对抗皮肤衰老的迹象，增强光保护，增亮皮肤和改善皮肤水合。
背景技术
山茶属(genus Camellia)的植物包括属于山茶科(Theaceae family)的大量不同物种。植物学家估计，有100至250种的植物属于该属。山茶属原产于亚洲东部和南部，从喜马拉雅山脉至日本和印度尼西亚。
其中最熟知和最多使用的物种是山茶属中国种(Camellia sinensis)，通常被称为茶树(tea plant)，它本身包括三个植物学变种：山茶属中国种阿萨姆变种(Camelliasinensis var.assamica)、山茶属中国种中国变种(云南)(Camellia sinensisvar.sinensis(Yunnan))和Camellia sinensis var.Cambodiensis。另一个物种山茶属阿萨姆种(Camellia assamica)，已知为茶树，但它的更精细的栽培限制它的使用。
山茶属中国种(species Camellia sinensis)用于食品工业中，以利用叶子(leaf)用于制备各种茶。与生长条件组合的山茶属中国种(Camellia sinensis)的叶子的加工，会给予茶独特的特点。茶特别是通过它们的颜色和它们的感官特征来区分。
一旦收获，叶子就经受特定于茶类型的处理，这决定对该叶子的氧化的最终程度。不同的关键步骤是萎凋(软化茶叶以便于干燥它们)、揉捻(以提取精油)、杀青(fixing)(通过加热以便于停止该叶子的氧化)、干燥(热空气流动以便于降低湿度水平)和发酵(将所述叶子置于缺氧环境中以便于加速微生物的增殖)。
在本申请中将绿茶限定为在采摘叶子后迅速停止自然氧化的茶(Camelliasinensis)。为了获得绿茶，将茶叶萎凋、揉捻以提取汁液，然后加热以阻止氧化过程。有两种可能的加热方法：中国方法，该方法使用放在火上的铜盆；或日本方法，所述方法将叶子通过蒸汽喷射(因此保持它们的性质)。阻止氧化使关注的分子例如儿茶素和茶氨酸的含量最大化。
在本申请中将抹茶限定为来自日本的绿茶，所述绿茶已经由茶叶(Camelliasinensis)变成粉末(抹茶是指“茶粉”)而获得。为了获得抹茶，生产商在阴凉处进行栽培，以便于减缓光合作用，因此减缓茶氨酸转化为单宁类。此类技术赋予抹茶独特的水果和蔬菜风味。将叶子蒸青(steam)以停止氧化，从而获得绿茶。一旦干燥，则用石头研磨机将该叶子压碎，以获得非常细的亮绿色粉末。抹茶非常富含多酚，具有公认的健康益处的抗氧化剂类。
在本申请中，将普洱茶限定为后发酵绿茶，在亚洲也称为生普洱或在西方称为原(raw)普洱。普洱茶原产于中国的云南地区。它是由山茶属中国种阿萨姆变种(speciesCamellia sinensis var.assamica)的叶子制成。在被压制成茶饼或茶砖之前，茶叶在生产地经受第一次氧化。然后，通过微生物的方式，该茶饼经受中度发酵，在潮湿的环境中可以加速该中度发酵。随后，该茶饼在自然陈化(ageing)过程期间被部分地氧化。
在文献中描述茶叶的许多提取物，部分由于它们富含酚类化合物，通常是儿茶素类多酚。另一方面，在市场上或在现有技术描述的提取物极少声称富含除多酚以外的不同类型的植物分子的组合物。事实上，在现有技术中的大多数茶叶提取方法描述使用有机溶剂的方法，是在于有机溶剂提取多酚主要是儿茶素型多酚的能力(WO2006/111666、KR2016021734A和KR2018125828A)。所描述的提取物富含多酚和类黄酮，但不含有酚酸类型的酚类分子，因为它们不是通过该类型的技术提取的。事实上，酚酸主要在极性溶剂中提取，最好是用水提取。而且，以有益效果而已知的其它植物化合物，例如氨基酸、有机酸、蛋白质、糖类和低聚核糖核苷酸例如小RNA，并不通过此类方法来最佳地提取。
化妆品的使用者现在希望使用这样的配方，该配方是尽可能天然并且就如同合成产品一样有效或甚至比合成产品更有效。在本发明中，制备的提取物是100％天然的，以便于符合消费者的需求。
此外，尽管在市场上已经有许多抗衰老化妆品，但对天然来源的新的有效化妆品成分的需求仍在增长。
本发明提出要解决的一个问题是提供新的水性茶提取物，该水性茶提取物在天然度标准方面符合当前化妆品市场的要求，并且仍然具有显著的生物功效以及不存在毒性。
事实上，酚类化合物例如儿茶素的过高浓度可导致光毒性现象，并随着时间的推移可限制该提取物的稳定性。在本发明中描述的提取物具有与良好功效一致的多酚和关注的其它植物分子的浓度。它们也具有显著的随着时间的稳定性并且没有毒性。
本发明提出要解决的另一个问题是提供新的水性茶提取物，所述水性茶提取物富含已知对皮肤有效的化合物例如糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸以及小RNA，所述水性茶提取物通过所述方法获得。
本发明人通过不存在现有技术方法的缺点的方法已经开发了特别富含小RNA、糖类、酚类和有机化合物、有机酸、茶素、茶氨酸的新的茶提取物，所述缺点例如在化妆品中的潜在毒性的洗涤剂和溶剂的使用。
由此获得的提取物可用于化妆品中，以用于对皮肤、头皮和附属物的护理，用于获得多种益处，特别是用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，用于对抗皮肤衰老的迹象，用于增强光防护，用于增亮皮肤，用于改善皮肤水合，用于增化屏障功能或甚至舒缓皮肤。
发明内容
首先，本发明涉及用于获得山茶属中国种(species Camellia sinensis)的茶叶的水性提取物的方法，所述茶叶选自新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶，所述方法包括以下步骤：
a)使所述茶叶或茶粉与水接触，然后任选地压碎它们；
b)加入植酸；
c)将pH调节至10至11之间的值；
d)在40至80℃之间的温度下，将混合物保持在搅拌下至少1小时；
e)将在c)中获得的混合物纯化，以消除残留的固体植物材料并收集滤液；
f)将pH调节至6至8之间的值；
g)用粉状活性炭处理所述混合物；
h)过滤以去除所述活性炭并收集滤液；
i)用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理所述滤液；
j)过滤以去除所述聚乙烯聚吡咯烷酮并收集滤液；
k)检查所述滤液的pH，并且如必要，则重新调节该pH至6至6.5之间的值。
其次，本发明涉及新鲜茶叶、普洱茶、抹茶或绿茶的水性粗提取物，所述水性粗提取物富含至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物和富含有机酸，不含DNA，所述水性粗提取物通过本发明的方法是可获得的，所述水性粗提取物具有5至30g/kg的干重，并包含0.5至10g/kg的糖类；0.050至2g/kg的有机酸；0.050至5g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至200mg/kg的儿茶素、0.020至2g/kg的茶素和0.020至2g/kg的茶氨酸；和50至350mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
本发明还涉及经稀释的新鲜茶叶、普洱茶、抹茶或绿茶的水性提取物，所述经稀释的水性提取物富含至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物和富含有机酸，不含DNA，所述经稀释的水性提取物通过本发明的方法是可获得的，所述经稀释的水性提取物具有4至20g/kg的干重之间的干重，所述经稀释的水性提取物包含以所述提取物总重量计的以下浓度：0.2至5g/kg的糖类；0.030至1g/kg的有机酸；0.030至3g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的茶素和0.010至1g/kg的茶氨酸；和10至250mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
第三，本发明涉及组合物，其包含有效量的至少一种经稀释的茶叶的水性提取物作为活性成分和生理上可接受的介质，所述茶叶的水性提取物选自根据本发明的新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶的提取物或它们的任意混合物。
第四，本发明涉及根据本发明的组合物的化妆品用途，其用于对皮肤、头皮和附属物的护理，更具体地用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，用于对抗皮肤衰老的迹象，用于增强光防护，用于增亮皮肤，和用于改善皮肤水合。
附图说明
通过阅读以下对附图说明的描述和非限制性实施方案，将更好地理解本发明和它的优点，其中：
图1示出通过比色法对根据实施例1和2获得的不同茶提取物中的总糖含量的评估。
图2示出通过比色法对根据实施例1和2获得的不同茶提取物中的多酚含量的评估。
图3示出通过HPLC-MS对根据实施例1和2获得的不同茶提取物中的有机酸含量的评估。
图4示出通过HPLC-UV对根据实施例1和2获得的不同茶提取物中的茶氨酸、茶素和儿茶素含量的评估。
图5示出通过测量浊度对根据实施例1和2获得的不同茶提取物的透明质酸酶抑制的评估。
图6示出对用谷氨酸一钠应激并用根据实施例1和2获得的不同普洱茶提取物处理的皮肤活检中的活性氧物质水平(reactive oxygen species level)的评估。
具体实施方式
限定
除非另有说明，否则本说明书中使用的所有术语具有最广为人知的含义。为了本发明的目的，以下术语限定如下：
术语“茶提取(tea extract)”是指对山茶属中国种(species Camelliasinensis)的叶子的所有类型的处理。
术语“茶”是指所有形式的山茶属中国种(species Camellia sinensis)的叶子；完整的或粉状的，干燥的或新鲜的。
术语“小RNA”或“低分子量RNA”，或“至多150个核苷酸的长度的小RNA”是指低分子量、至多150个核苷酸的长度的非编码RNA(核糖核酸)，例如所有类型的单链和/或双链的小非信使RNA，例如来自植物并通过本发明所述的方法提取的微RNA(microRNA)、干扰RNA、内含子、小核RNA(small nuclear RNA)或甚至RNA的任意片段。在根据本发明的提取物中，小RNA是以许多大小主要在25至150个核苷酸之间的RNA的复合混合物的形式。因此，合成产生的和因此非天然的RNA不在该限定中。
术语“有机酸”是指α-羟基酸(或AHA)，即衍生自在茶叶中含有的糖类的羧酸，例如乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和糖醛酸。
“酚类化合物”是指具有至少一个带有一个或多个羟基的酚类的芳环的植物来源的分子，例如酚酸类、类黄酮例如儿茶素或它的衍生物、单宁类或任何其它多酚。酚类化合物已知在植物中和用于化妆品用途二者都是强大的抗氧化分子。此类次生植物代谢产物也在植物受到生物或非生物应激的防御机制中产生。
术语“糖类”是指植物中存在的所有类型的糖，例如单糖例如葡萄糖、果糖以及低聚糖和多聚糖。通常，多聚糖含有10个以上的单糖单元，而低聚糖含有3至10个单糖单元。
术语“关注的植物分子”是指在本发明的茶提取物中存在的所有分子，特别是至多150个核苷酸的长度的小RNA、糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸。
当描述值的范围时，该范围的边界应被理解为明确包括在该范围中的所有中间值。例如，在1％至10％之间的值的范围应被理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，以及在1％至10％之间的所有十进制值(decimal value)。
除非另有规定，否则数值百分比是指重量百分比，即化合物相对于预期混合物的总重量的重量。
在本文中描述的组合物可以“包含”必需化合物或任选存在的成分，“由其组成”或“基本上由其组成”。
表述“基本上由…组成”是指所述组合物或组分可以包括额外的成分，但前提是所述额外的成分不改变在本申请中描述的组合物或用途的基本特征或新特征。
术语“局部施加”是指将本发明的提取物或含有它的组合物施加或涂抹在皮肤或粘膜的表面上。
术语“皮肤”是指面部特别是眼区和嘴、鼻子、前额、颈部、手的皮肤以及全身的皮肤。
术语“头皮”是指覆盖颅骨的皮肤，包括毛发毛囊和毛囊间皮肤间隙。
术语“附属物”是指在头部上的毛发和体毛(由毛发毛囊产生)以及富含角蛋白的指甲。
表述“增亮皮肤”是指通过作用于色素性疾病(pigmentary disorder)例如老年斑或老年性雀斑样痣，或者均匀地或者以局部的方式减小与表皮的黑色素含量有关的肤色的强度。
术语“有效量”是指获得至少一种需要的生物活性或保护皮肤免受外部侵害和氧化，对抗皮肤衰老的迹象，增强光防护，增亮皮肤和改善皮肤水合所需的本发明的提取物的最低量，而该量是无毒的。
术语“皮肤水合”是指在表皮的上层中的水含量和分布。
术语“皮肤水合的改善”是指对由脱水引起的皮肤的外部外观变化例如干燥、紧绷和不适的任何改善，无论所述变化与内部因素还是外部因素有关，例如不利的环境条件。
术语“皮肤衰老的迹象”是指由衰老引起的皮肤的外部外观的所有改变，例如皱纹和细纹，裂纹，眼袋，黑眼圈，枯萎，皮肤的弹性、紧实度和/或色调的丧失，但也包括皮肤的所有内部变化，此类变化不会系统性地导致改变的外部外观，例如皮肤变薄，或在环境应激例如污染和太阳辐射包括紫外线之后的皮肤的所有内部退化。
术语“皮肤衰老的迹象”也是指色素性疾病，例如老年性雀斑样痣或日光性雀斑样痣。
术语“外部侵害”是指太阳辐射，包括可见光、紫外光和红外光辐射、污染，所述污染可来自住宅外部或内部的环境大气，并包括不同大小的粒子(PM10为10μm，PM2.5为2.5μm，或超细颗粒小于100nm)以及若干化学元素(挥发性有机化合物、多环芳烃、重金属等)。
表述“改善皮肤的外观”是指皮肤纹理看起来更精细，亮度更强和肤色更均匀。
术语“生理上可接受的”是指这样的介质或溶剂，该介质或溶剂适合与皮肤或粘膜的外层接触的，没有毒性、刺激性、过度的过敏反应或类似的不耐受反应，并且与合理的益处/风险比成比例。
应当理解，本发明涉及哺乳动物，更特别是人。
提取方法
经典描述的核糖核酸(RNA)提取方案使用不适合用于化妆品用途的溶剂(Zumbo,P.2014“Phenol-chloroform Extraction”,2014)。此类方法旨在获得完全纯化的核酸(RNA或DNA或小RNA)，即不含任何其它关注的分子例如次级代谢产物、维生素、糖类、肽等，此类分子可具有对皮肤的有益效果，因此具有化妆品益处(cosmetic interest)。
还已知的是文献FR2831168，它描述用于获得富含核酸(DNA和RNA)的植物提取物的方法。该方法使用纤维素分解酶。
从现有技术中还已知的是专利文献EP1723958和WO03101376，它们描述用于局部施加的组合物，所述组合物包含具有12至40个核苷酸的长度的已知序列的合成双链RNA低聚核苷酸，具有siRNA(短干扰RNA)功能。
还已知的是文献FR 1502361(也以编号WO2017084958公布)，它描述用于获得富含低分子量核糖核酸(RNA)的植物的水性提取物的方法，以用于制备化妆品组合物。所述方法以2至15mM之间的浓度使用EDTA。
使用植酸代替EDTA具有以下优点：与EDTA不同，植酸是存在于种子例如谷物和豆科植物的外壳中的天然分子。因此，植酸的使用可获得100％天然来源的茶提取物，同时维持在植物中含有的植物分子的良好提取效率。在茶叶中存在的小RNA以及其它化合物，例如糖类、酚类化合物或有机酸例如酒石酸、苹果酸或柠檬酸的提取效率。
因此，本发明首先涉及用于获得叶子的水性提取物而实施的提取方法，所述叶子来自山茶属中国种(species Camellia sinensis)的所有类型的茶。
更特别地，本发明涉及用于获得新鲜茶叶、普洱茶、绿茶或抹茶的水性提取物的提取方法。
本发明的提取方法可获得富含化妆品益处的植物分子的提取物，例如至多150个核苷酸的长度的小RNA、糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸，同时避免使用不被认为是化妆品溶剂的溶剂。
本发明的方法对环境具有减小的影响。
本发明的方法可应用于新鲜茶叶，或应用于已经以各种方式加工以符合抹茶、绿茶或普洱茶的名称的茶叶。
在所述方法的第一步骤a)中，将茶叶与水混合。所使用的水是蒸馏水、去矿物质水或富含矿物盐和/或微量元素的水。优选的所使用的水是蒸馏水。
茶叶可以有不同的形式：新鲜的、干燥的、整片的或粉末状的。
优选地，在步骤a)中将新鲜或干燥的茶叶在水中研磨。研磨该茶叶是促使更好提取的机械动作。对于已经呈粉末形式的茶叶，例如直接与水混合的抹茶，研磨是不必要的。
在步骤a)中，植物材料与水的比率为3重量％至20重量％，更优选地3重量％至10重量％。
在步骤b)中，将植酸添加至步骤a)的茶-水混合物中。
在有利于完全破坏细胞膜以及核膜的植酸的存在下，提取过程继续碱性裂解。
植酸是优良的螯合剂，通过螯合经由络合二价离子例如钙离子在纤维素微纤维周围的果胶分子之间形成离子桥，它会导致植物细胞的果胶-纤维素膜的弱化和破坏。这具有在该提取期间促进细胞内容物的释放的结果。在碱性介质中的植酸处理步骤对于使提取物富集低分子量RNA以及确保其它关注的植物分子的更好提取产率是必不可少的；所述其它关注的植物分子即糖类、酚类化合物、有机酸以及茶素和茶氨酸。
植酸是天然存在于种子例如谷物和豆科作物的外壳中的分子。植酸以钙盐或有时以镁盐的形式存在，并且它对植物起着重要作用，例如它是磷的主要来源。
优选地，所使用的植酸是钠盐形式的植酸粉末。优选地，它以1至10mM之间，优选地1至5mM之间的浓度，甚至更优选地以3mM的浓度来使用。
3mM的浓度也是最佳的，以具有其它关注的化合物例如糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸的更好的产率。
在步骤c)中，通过加入氢氧化钠(NaOH)，将pH调节至10至11之间的碱性值。在步骤c)期间，必不可少的是pH是碱性的，在10至11之间。优选地，将该pH调节至10.3至10.8之间的值。事实上，该水平的pH与植酸的作用有关，该水平的pH导致细胞膜包括核膜的破坏，植物细胞的裂解，并导致DNA的变性(双螺旋的2条链被分离)。
对pH的监测表明，在步骤c)结束时，它保持碱性并稳定在9至11之间。
提取步骤d)优选地在40至80℃之间的温度下持续至少1小时。优选地，所述步骤持续1小时。有利的是，所述步骤在60℃至80℃之间的温度下进行。甚至更优选地，所述步骤在80℃进行。在该步骤期间，将混合物有利地置于中度搅拌下。
在步骤e)中，将在d)中获得的混合物纯化，以便消除残留的固体茶叶并回收构成本发明水性粗提取物的可溶性部分。本领域技术人员已知的任何方法都可以用于进行此类纯化步骤。优选地，在具有大于或等于30μm的孔隙度的过滤器上直接地过滤该混合物，以便于收集滤液。也可以将在c)中获得的混合物低速离心，例如在4000g下离心至少10分钟，以便沉积以粒状沉淀(pellet)的残留的植物材料并回收在上清液中的水性粗提取物。
在步骤f)中，将pH调节至6至8之间的值。
在步骤g)中，将粉末状活性炭加入至所述混合物中。优选地使用两种不同类型的活性炭的混合物，并且甚至更优选地，使用0.25重量％的每一种的该两种类型的活性炭，以便于对提取物的脱色产生协同作用。根据活性炭耗尽多酚提取物的能力来选择活性炭，该多酚主要决定所述提取物的颜色。该步骤优选地持续30分钟，在40至50℃之间的温度下搅拌以获得最佳结果。
在步骤h)中，通过使用具有大于或等于30μm的孔隙度的过滤器去除活性炭粒子，来纯化在步骤g)中获得的混合物，以便获得澄清的滤液。
在步骤i)中，使在步骤h)中获得的滤液与粉末状聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)接触，以便于最大限度地去除在所述混合物中含有的酚类化合物例如高分子量多酚、单宁类型，所述酚类化合物通过活性炭处理步骤将不被保留，并且所述酚类化合物导致所述提取物的颜色并会可能干扰所述提取物的稳定性。优选地，使用在5至30g/l之间的最终浓度的PVPP。甚至更优选地，使用10g/l的最终浓度的PVPP。
该步骤可以持续10至30分钟，优选地10分钟，在40至50℃之间的温度下伴随着搅拌以获得最佳结果。
根据本发明的方法，特别是步骤g)至i)中，使得可以获得含有很少或不含儿茶素、表儿茶素或表没食子儿茶素类的多酚的提取物。只有自普洱茶获得的提取物含有低浓度的儿茶素。薄层色谱分析表明了，本发明的茶提取物均不含有表儿茶素或表没食子儿茶素。
在步骤j)中，通过使用具有大于25μm的孔隙度的过滤器去除该PVPP粒子，接着使用具有0.8μm的孔隙度的过滤器过滤，来澄清在步骤i)中获得的混合物。
然后，在步骤k)中，将在步骤j)中获得的混合物的pH调节至6至6.5之间的值。然后，获得根据本发明的粗提取物。
通过加入盐酸(HCl)溶液或任何其它与化妆品用途相容的等效酸例如柠檬酸，可以调节pH。在本发明的方法的步骤k)中的pH调节步骤是必不可少的步骤以在不沉淀关注的植物化学物质的情况下获得稳定的提取物。事实上，该pH对于低分子量RNA以及其它关注的植物分子的悬浮液的维持是最佳的；所述其它关注的植物分子例如糖类、酚类化合物、有机酸、茶素和茶氨酸。
事实上，低于6的pH通常可以导致核酸的沉淀，从而导致至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA的沉淀，或甚至导致某些糖类、多酚和蛋白质的沉淀。在本发明的方法的步骤i)中的调节pH的步骤是必不可少的步骤以具有所述提取物的最佳稳定性。
用生理上可接受的用于化妆品用途的溶剂，可以将在步骤k)中获得的提取物稀释，以稳定产品并增强它的随着时间的保存性。然后，获得经稀释的提取物。
将该提取物稀释至4至20g/kg之间的干重，并将它的pH调节至5.8至6.5之间，优选地6.0至6.5之间。该步骤使得可以改善产品随着时间的稳定性。
其次，本发明涉及从新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶中获得的茶叶的水性提取物，所述水性提取物富含至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物，富含有机酸，富含茶素和富含茶氨酸，并且不含DNA，所述水性提取物通过上述方法是可获得的。此类提取物不含有DNA(脱氧核糖核酸)。
本发明还涉及从新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶中获得的茶叶的水性提取物，所述水性提取物富含至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物，富含有机酸，富含茶素和富含茶氨酸，所述水性提取物通过上述方法直接获得。该提取物不含DNA(脱氧核糖核酸)。
通过使用根据步骤a)至k)的本发明的方法，获得琥珀色至深琥珀色的茶的水性浓缩粗提取物，所述水性浓缩粗提取物具有5至30g/kg的干重，所述水性浓缩粗提取物含有0.5至10g/kg的糖类；0.050至2g/kg的有机酸；0.050至5g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至200mg/kg的儿茶素、0.020至2g/kg的茶素和0.020至2g/kg的茶氨酸；和50至350mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。然而，由于茶叶经过各种处理，因此所获得的提取物可以表现出显著的可变性，这取决于因素例如收获的地点或年份、季节、气候条件、生物应激等。
然后，可以将如此获得的提取物在生理上可接受的用于化妆品用途的溶剂中稀释，以便然后将该提取物的浓度调节至4至20g/kg之间的干重。
生理上可接受的溶剂包括水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇和它们的天然形式、二丙二醇、乙氧基化的或丙氧基化的二甘醇类、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。乙醇、丁二醇、丙二醇和甘油作为合成溶剂或植物衍生的溶剂存在，后者被描述为天然溶剂。
因此，可以将所获得的提取物与30％至50％的植物衍生的丁二醇或30％至50％的植物衍生的丙二醇或30％至70％的植物衍生的甘油混合。
优选地，将通过本发明的方法获得的提取物在丁二醇中稀释，使得经稀释的提取物包含30％或50％的最终丁二醇浓度。
此类所谓的经稀释的提取物具有4至20g/kg的干重，以下浓度：0.2至5g/kg的糖类；0.030至1g/kg的有机酸；0.030至3g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的茶素和0.010至1g/kg的茶氨酸；和10至250mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
非限制性实例是经稀释的绿茶提取物，该经稀释的绿茶提取物更特别地含有1.4g/kg的浓度的糖类、95.5mg/kg的含量的有机酸、32mg/kg的酚类化合物和77mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
因此，本发明的提取物包含广泛的植物分子，该植物分子可以表现出对皮肤的有益效果，而不存在皮肤刺激或其它健康损害的风险。
例如，糖类积极参与表皮上层的水合，并通过这样做来抵抗外部侵害，而不会产生任何不期望的影响。本发明的茶提取物更特别地含有单糖和多糖。
山茶属中国种(Camellia sinensis)是山茶科(Theaceae)的成员，它产生茶素，强效的天然杀虫剂。茶素也被称为咖啡因或1,3,7-三甲基黄嘌呤或甲基可可碱。除了它的公认的对神经和心血管系统的效果外，茶素还具有对皮肤、特别是对皮肤松弛的有益效果。
该植物还产生茶氨酸，常见于茶叶中的非蛋白质氨基酸。茶氨酸以它对大脑的放松活性而闻名，允许减轻精神和身体应激。
本发明的茶提取物也含有酚类化合物，例如多酚、酚酸、类黄酮例如儿茶素，然而，该家族的分子已通过活性炭和PVPP处理步骤被部分地去除。对酚类化合物的此类相对消耗增强产品随着时间的稳定性，并获得非光毒性提取物。
在本发明的一个特定的实施方案中，根据本发明的经稀释的水性提取物含有至多1.5g/kg的酚类化合物，包括至多120mg/kg的儿茶素。
在本发明的另一个特定的实施方案中，根据本发明的经稀释的水性提取物含有至多1.2g/kg的酚类化合物，包括至多30mg/kg的儿茶素。
在本发明的另一个特定的实施方案中，根据本发明的经稀释的水性提取物含有至多100mg/kg的酚类化合物，并且不含有儿茶素。
在本发明的还另一个特定的实施方案中，根据本发明的经稀释的水性提取物含有至多50mg/kg的酚类化合物，并且不含有儿茶素。
在本发明的一个特定的实施方案中，根据本发明的经稀释的水性提取物含有至多3g/kg的酚类化合物，并且不含有儿茶素。
第三，本发明涉及化妆品组合物，所述化妆品组合物包含有效量的至少一种水性茶提取物作为活性成分和生理上可接受的介质，所述至少一种水性茶提取物选自新鲜茶、普洱茶、抹茶、绿茶的提取物或它们的任何混合物，所述至少一种水性茶提取物根据本发明获得。
有利的是，在生理可接受的介质中以相对于所述组合物的总重量的0.05至5重量％的浓度，优选地以相对于所述组合物的总重量的0.1至2.5重量％的浓度，来加入本发明的茶提取物。
配制可用的本发明的组合物，以通过任何合适的途径，特别是口服或外部局部而施加，并且所述组合物的配制物会由本领域技术人员调整。
优选地，本发明的组合物为适合用于局部施加的形式。因此，此类组合物在它们的施加期间没有任何不适的风险的情况下必须含有生理上可接受的介质，即与皮肤和附属物相容的介质，并且覆盖所有合适的化妆品形式。
用于实施本发明的组合物可以特别是以水性、水醇性或油性溶液或凝胶、水包油、油包水或多重乳状液(emulsion)的形式；它们也可以是以适合用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或毛发的悬浮液或粉末的形式。
此类组合物可以或多或少是粘性的，并且还可以具有乳霜(cream)、乳液(lotion)、液体、乳剂(milk)、浆液(serum)、软膏(ointment)、凝胶、糊状物、膏剂(balm)或泡沫的外观。它们也可以是以固体形式例如条棒，或可以作为气雾剂被施加至皮肤上。
在所设想的应用领域中的常用的生理上可接受的介质的实例是配制物所需的佐剂，例如溶剂、增稠剂、胶凝剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、防晒霜、自助美黑剂(self-tanning agent)、颜料、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、酯类和植物油或黄油等。
在所有情况下，本领域技术人员会确保，以这样的方式选择此类佐剂和它们的比率，以不损害根据本发明的组合物所寻求的有利性质。例如，此类添加剂可以各自对应于所述组合物的总重量的0.01至20重量％。当本发明的组合物是乳状液时，相对于所述组合物的总重量，脂肪相可以为2至90重量％，优选地5至30重量％。在所述组合物中使用的乳化剂和助乳化剂选自在所考虑的领域中常规使用的那些。例如，相对于所述组合物的总重量，它们可以以0.3至30重量％的比例来使用。
根据本发明的另一个有利的实施方案，本发明的水性茶提取物可以被封装或被容纳在化妆品载体(vector)例如脂质体或在化妆品领域中使用的任何其它纳米胶囊或微胶囊中，或被吸附在粉状有机聚合物、矿物支撑物例如滑石和膨润土上。
有利地，除了本发明的活性成分之外，本发明的组合物还可以包含至少一种具有与本发明的那些相似和/或互补的化妆品效果的其它活性剂。
例如，额外的活性剂可选自：抗衰老剂、紧致剂、增亮剂、保湿剂、排水排油(draining)剂、微循环促进剂、去角质剂、剥脱(desquamating)剂、细胞外基质刺激剂、能量代谢激活剂、抗菌剂、抗真菌剂、舒缓剂、抗自由基剂、抗紫外线剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、温觉诱导剂、清凉感诱导剂和减肥剂。
此类额外的活性剂可选自以下：
-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯和视黄醇棕榈酸酯；
-维生素B3，更特别是烟酰胺、生育酚烟酸酯；
-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；
-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁和钠；
-维生素E、F、H、K、PP、辅酶Q10；
-金属蛋白酶抑制剂或TIMP激活剂；
-DHEA、它的前体和衍生物；
-氨基酸例如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟基赖氨酸、甲硫氨酸和它的衍生物、N-酰基化的氨基酸化合物；
-天然肽或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽和它们亲脂性衍生物、异构性衍生物和与其它物质例如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的复合的衍生物。实例包括以下名称的商业上已知的肽： CHRONOGENTM、LAMINIXYLISTM、PEPTIDE Q10TM、COLLAXYLTM(专利FR2827170，/>)、PEPTIDE VINCI 01TM(专利FR2837098，/>)、PEPTIDE VINCI 02TM(专利FR2841781，/>)、ATPeptideTM(专利FR2846883，/>)或通过/>以名称ATPeptideTM销售的序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽；
-盐卤虫(artemia salina)提取物，作为GP4GTM(FR2817748，)销售；
-植物肽提取物，例如亚麻提取物(LipigeninTM，专利FR2956818，)，大豆、斯佩耳特小麦、葡萄藤、油菜籽、亚麻、大米、玉米、豌豆的提取物；
-酵母提取物，例如DynagenTM(专利FR2951946，)或ActopontineTM(专利FR2944526，/>)；
-脱氢乙酸(DHA)；
-合成或天然来源的植物甾醇；
-水杨酸和它的衍生物，α-和β-羟基酸，硅烷醇；
-氨基糖类、葡萄糖胺、D-葡萄糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺；
-多酚、异黄酮、类黄酮的提取物，例如葡萄提取物、松木提取物、橄榄提取物；
-脂质，例如神经酰胺或磷脂，动物来源的油，例如角鲨烯或角鲨烷；植物油，例如甜杏仁、椰子仁干、蓖麻、霍霍巴、橄榄、油菜籽、花生、向日葵、小麦胚芽、玉米胚芽、大豆、棉花、苜蓿、罂粟、南瓜、月见草、小米、大麦、黑麦、红花、西番莲、榛子、棕榈、杏仁、鳄梨、金盏花；乙氧基化的植物油、乳木果油、可可脂、巴巴苏油；
-所有防紫外线剂和防晒剂；
-环状AMP和它的衍生物，腺苷酸环化酶激活剂和磷酸二酯酶抑制剂，积雪草提取物，积雪草苷和积雪草酸，甲基黄嘌呤类，茶叶碱，可可碱，毛喉素，七叶灵(esculin)和七叶苷(esculoside)，ACE抑制剂，Val-Trp肽，神经肽Y抑制剂，脑啡肽，银杏提取物，薯蓣提取物，芦丁，冬青茶提取物，瓜拉那提取物，低聚糖，多聚糖，肉碱，常春藤提取物，岩藻提取物，夏枯草的水解提取物，鸡冠花的水解提取物，光滑果榆绿木(Anogeissus leiocarpus)提取物，木薯的叶子的提取物，棕榈酰肉碱，肌肽，牛磺酸，接骨木提取物，藻类提取物例如掌形藻(Palmaria Palmata)提取物；
-透明质酸或透明质酸钠和所有它的片段(fraction)和促进剂；
-薄荷醇和薄荷醇乳酸酯和具有清新效果的其它活性成分；
-芦荟、没药醇、尿囊素和具有舒缓效果的其它活性成分；
-香兰基丁基醚和具有加热效果的其它活性成分；
-过氧化苯甲酰和其它抗痤疮活性成分。
第四，本发明涉及包含本发明的茶提取物的组合物的化妆品用途，所述茶提取物来源于新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶，或它们的任何混合物，所述用途用于对皮肤、头皮和附属物的护理，更特别地用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，用于对抗皮肤衰老的迹象，用于增强光防护，用于增亮皮肤，并用于改善皮肤水合。
在一个特定的实施方案中，本发明还涉及组合物的化妆品用途，所述组合物包含从新鲜茶、抹茶或绿茶或它们的任何混合物中获得的本发明的茶提取物，用于对皮肤、头皮和附属物的护理，更特别地用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，用于对抗皮肤衰老的迹象，用于增强光防护，用于增亮皮肤，并用于改善皮肤水合。
皮肤是一个由多层(真皮、表皮和角质层)组成的器官，该器官覆盖身体的整个表面并确保针对外部侵害、感官侵害、免疫侵害、代谢侵害和体温调节性侵害的保护性功能，或甚至限制脱水的屏障功能。
特别地，角质层起着保护性物理屏障的作用，通常被称为“皮肤屏障功能”。该功能在组织自稳态和免受外部环境影响的保护方面具有重要意义。
皮肤的外观可以通过内部改变(内在衰老、疾病和激素变化例如妊娠)或外部因素(环境因素，例如污染、阳光、病原体、温度变化等)而改变。所有此类改变不仅影响皮肤，还影响角蛋白附属物例如体毛、睫毛、眉毛、指甲和头发。
实施例
通过示例说明的方式，下面描述根据本发明的方法的实施方案的实施例。
实施例1：根据本发明的方法制备新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶(Camellia sinensis)的富含小RNA的提取物
在制备提取物的第一步骤a)中，使用抹茶(以粉末形式的日本绿茶)、普洱茶(以压缩完整叶子的形式的来源于云南的茶)、绿茶(来源于中国的以干燥叶子形式的茶)和新鲜茶(直接从树上采集的叶子)，所有所述茶均都来自山茶属中国种(species Camelliasinensis)。
称重该绿茶或普洱茶，以使它占所述方法中所涉及的原料的3％，或30g/kg。所添加的蒸馏水的量为968g。
称重该新鲜茶叶，以使它占所涉及的原料的6％，或60g/kg，因为该新鲜茶叶的水含量占叶子的新鲜重量的一半。所添加的蒸馏水的量为938g。
将茶叶和水的混合物在搅拌器中研磨，以允许对植物化合物的更好的提取，因为固体材料、茶和水提取溶液之间有更大的交换表面。
将干燥的叶子已经呈粉末形式的抹茶直接添加至具有968g的蒸馏水和预先均质的2g/l或3mM的植酸的混合物中。
在步骤b)中，将2g/l(即3mM的最终浓度)的植酸添加至水和磨细的茶叶混合物(抹茶除外)中。
在步骤c)中，将pH调节至10.5以用于最佳提取并以允许对具有低分子量RNA以及具有各种植物分子的提取物的富集。
在步骤d)中，在80℃下加热所述混合物1小时，伴随中度搅拌。
在步骤e)中，通过具有30μm的孔隙度的过滤器来过滤所述混合物，以将固体物质与滤液分离。然后，使用降低孔隙度的过滤器来进行三次顺序的过滤，以便于澄清所述植物提取物，直至在3μm的孔隙度下过滤。
步骤f)，在步骤e)中收集的滤液的pH平均值高于9，并且被调节至6-8之间，以实现用于后续活性炭处理的最佳pH。
步骤g)，用两种(a duo of)活性炭进行处理，以便于通过特别是去除多酚将该提取物脱色。每升的该提取物加入2.5g的每种类型的活性炭。在40至50℃之间的温度下，处理时间为30分钟。
步骤h)：通过将所述提取物通过具有30μm的孔隙度的过滤器，来去除所述活性炭。
在步骤i)中，通过添加粉末状聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，来进行对在g)中获得的滤液的第二次脱色处理。向所述提取物中加入10g/l的PVPP以去除在所述提取物中所含的单宁类中的一些。在40至50℃之间的温度下，处理时间为10分钟。
在步骤j)中，然后在降低孔隙度的过滤器上进行顺序的过滤，以从植物提取物中去除PVPP；第一次的30μm的过滤使得可保留PVPP，然后通过连续的不高于0.8μm的孔隙度过滤，以便于澄清所述提取物。
在步骤k)中，检查pH，然后用柠檬酸或盐酸溶液将该pH调节至6至6.5之间的值。
获得具有5至30g/kg之间的干重的水性粗提取物。
在步骤k)中获得的提取物用30％的丁二醇稀释。这些溶剂对于化妆品用途是生理上可接受的，使得可以稳定产品，增加它的随着时间的保存性。然后，获得经稀释的提取物，并将pH调节至6.0至6.5之间。
所得经稀释的提取物具有4至20g/kg之间的干重。
根据在本实施例中描述的方法如此获得的茶提取物在本发明中呈现的表或附图中被称为PSR(植物小RNA(Plant small RNA))茶。
实施例2：通过所谓的常规提取方法制备茶(Camellia sinensis)提取物：
出于比较的目的，制备了通过所谓的常规或经典提取获得的茶提取物。选择了此类提取方法，因为它对于提取不同类型的酚类化合物和其它极性分子例如糖类和氨基酸是最佳的，使它成为良好的参考方法以用于执行与在实施例1中应用的本发明的方法的比较。
在制备1kg的提取物的第一步骤中，使用了与实施例1相同的茶：抹茶(以粉末形式的日本绿茶)、普洱茶(以压缩完整叶子的形式的来源于云南的茶)、绿茶(来源于中国的以干燥叶子的形式的茶)和新鲜茶(直接从树上采集的叶子)，所有所述茶均来自山茶属中国种(species Camellia sinensis)。
称重干燥的或粉末状的茶的叶子例如抹茶、普洱茶和绿茶，以使它们占在该方法中使用的原材料的3％，即30g/kg，其中混合970g的蒸馏水。
将新鲜茶的叶子与940g的蒸馏水混合，所述新鲜茶的叶子由于它们的天然的水含量因此占所用原材料的6％，即60g/kg。对新鲜茶、绿茶和普洱茶应用了研磨步骤。提取pH未被调节，并且在5至7之间。
然后，伴随着搅拌，在45℃下加热所述混合物1小时。
然后，通过具有30μm的孔隙度的过滤器来过滤所述混合物，以将固体物质与滤液分离。然后，使用降低孔隙度的过滤器来进行顺序的过滤，以便于澄清所述植物提取物，直至在1μm的孔隙度过滤。
在该步骤结束时，进行活性炭处理，以便于通过特别是去除多酚将所述提取物脱色。每升的提取物加入2.5g的每种活性炭。处理时间为30分钟，温度在40至50℃之间，并且pH在6至8之间。进行30μm的过滤以从所述提取物中去除活性炭。
然后，通过添加粉末状的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)来执行第二次脱色处理。向所述提取物加入10g/l的PVPP以去除在所述提取物中所含的单宁类中的一些。在40至50℃之间的温度下，处理时间为10分钟。然后，在降低孔隙度的过滤器上进行顺序的过滤，以便于澄清所述植物提取物，直至在0.2μm的过滤。
检查pH，然后用柠檬酸或盐酸或苏打溶液将该pH调节至6至6.5之间。
获得具有1至5g/kg之间的干重的水性粗提取物。在本实施例2中实施的方法旨在制备对照提取物，以获得与通过本发明的方法获得的不同茶提取物有关的比较分析数据。在附图中和在申请文本中示出所获得的结果。
实施例3：根据实施例1获得的茶提取物的特征
由直接从树上收获的新鲜叶子制成的新鲜茶的粗提取物具有6.5g/kg的干重。理化分析表明，所获得的提取物具有以下浓度：2g/kg的总糖类、120g/kg的总有机酸、31mg/kg的总酚类化合物和120mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
然后，用生理上可接受的化妆品溶剂稀释所述提取物，并使它可以确保更好的所述提取物随着时间的稳定性和保存性；溶剂的量可以为30％至70％。
用植物衍生的丁二醇进行稀释，以获得30％的丁二醇和70％的茶提取物的最终浓度。如此稀释的提取物具有4.3g/kg的干重，并且具有以下浓度：1.4g/kg总糖类、83mg/kg的总有机酸、48mg/kg的总酚类化合物和74mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
由来源于中国的干燥叶子制成的绿茶的粗提取物具有10.2g/kg的干重。理化分析表明，所获得的提取物具有以下浓度：1.5g/kg的总糖类、137mg/kg的总有机酸、1.3g/kg的总酚类化合物和110mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
然后，用生理上可接受的化妆品溶剂稀释所述提取物，并使它可以确保更好的所述提取物随着时间的稳定性和保存性；溶剂的量可以为30％至70％。
用植物衍生的丁二醇进行稀释，以获得30％的丁二醇和70％的茶提取物的最终浓度。如此稀释的提取物具有7.1g/kg的干重，并具有以下浓度：1.1g/kg的总糖类、96mg/kg的总有机酸、931mg/kg的总酚类化合物和77mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
由来源于日本的压碎的叶子制备的抹茶的粗提取物具有14.2g/kg的干重。理化分析表明，所获得的提取物具有以下浓度：2.4g/kg的总糖类、179mg/kg的总有机酸、2g/kg的总酚类化合物和87mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA的浓度。
然后，用生理上可接受的化妆品溶剂稀释所述提取物，并使它可以确保更好的所述提取物随着时间的稳定性和保存性；溶剂的量可以是30％至70％。
用植物衍生的丁二醇进行稀释，以获得30％的丁二醇和70％的茶提取物的最终浓度。如此稀释的提取物具有10.2g/kg的干重，并具有以下浓度1.7g/kg的总糖类、125mg/kg的总有机酸、1420mg/kg的总酚类化合物、61mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
由来源于云南的压缩完整叶子制成的普洱茶的粗提取物具有13.8g/kg的干重。理化分析表明，所获得的提取物具有以下浓度：3.3g/kg的总糖类、137mg/kg的总有机酸、193mg/kg的总酚类化合物和250mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
然后，用生理上可接受的化妆品溶剂稀释所述提取物，并使它可以确保更好的所述提取物随着时间的稳定性和保存性；溶剂的量可以是30％至70％。
用植物衍生的丁二醇进行稀释，以获得30％的丁二醇和70％的茶提取物的最终浓度。如此稀释的提取物具有8g/kg的干重，并且具有以下浓度：1.1g/kg的总糖类、137mg/kg的总有机酸、1176mg/kg的总酚类化合物和177mg/kg的至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
实施例4：在实施例1和2中获得的经稀释的茶提取物的不同组分的定量
测量了根据本发明的方法或根据常规方法获得的每种类型的提取物的干重。所述干重表示，在12小时的在105℃下的蒸青(steam)后，水和挥发性化合物已经蒸发之后的提取物的重量。
相比于通过常规提取获得的茶提取物，通过本发明的方法获得的各种茶提取物的干燥提取物具有更高的干重。因此，当应用实施例1的方法以提取不同类型的茶时，提取产率更高；参见表1。
表1
通过分光光度测定法确定了通过本发明的方法获得的不同茶提取物中的总糖类含量相对于通过常规方法获得的提取物中的总糖类含量，所述分光光度测定法来自对由Dubois et al.(1956)(Dubois et al.,“Colorimetric method for the determinationof sugars and related substances”,Anal.Chem,1956,28(3),350-356)所述测定法的改编。此类分析包括将原料溶解在浓硫酸中，然后与苯酚反应以形成有色复合物。在分光光度计上在490nm处读取复合物物的吸光度。使用标准葡萄糖曲线来确定所述糖类含量。
分析显示，对所有类型的茶，新鲜茶、绿茶、抹茶、普洱茶，相比于常规提取方法，通过在本发明中所述的方法提取的糖类的浓度最高，参见图1。
通过Folin-Ciocalteu分光光度测定法(Singleton et al,Analysis of totalphenols and other oxidative and antioxidant substrates using the Folin-Ciocalteu reagent,1999,299:152)，确定了根据本发明的茶提取物的总多酚含量相对于常规茶提取物的总多酚含量。在样品中存在的多酚类化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应；试剂的氧化给出蓝色。在分光光度计上在760nm处读取该样品的吸光度。使用没食子酸标准曲线，将总多酚浓度表示为没食子酸当量。分析显示，对所有类型的茶，新鲜茶、绿茶、抹茶和普洱茶，相比于常规提取方法，通过在本发明中所述的方法提取的多酚浓度最高，参见图2。
进行了对在根据本发明的茶的提取物中所含的有机酸相对于常规茶的提取物中所含的有机酸的表征和定量。使用了与质量检测器结合的高效液相色谱分析。通过Agilent1260HPLC系统(Agilent Technologies)，在EC 150/4.6Nucleoshell RP 18plus-5μm柱(150×4.6mm)(Macherey Nagel:763236.46)上分离了所有样品。流速为0.3ml/分钟。流动相由0.01％的甲酸(HCOOH)(A)和乙腈(B)的溶液组成。梯度程序促进了洗脱，如在表2中所述。
表2
将柱温维持在25℃，并且进样体积为5μL。通过具有负模式电喷雾离子源的ACQUITY Qda质谱仪检测器(WATERS)，执行了检测。将该离子源设置在0.8kV的毛细管电压和600℃的探头温度。对于如在表3中所述的每种化合物，把M/z和锥孔电压(cone voltage)作为目标(target)。
表3
化合物 质量(m/z) 锥孔电压(V)
酒石酸 149.0 10
苹果酸 132.9 3
柠檬酸 191.0 10
乳酸 88.9 5
琥珀酸 116.95 15
糖醛酸 193 10
通过将所述样品的保留时间和质谱峰与标准物比较，执行了对有机酸的识别。在与标准物面积相比的色谱峰面积的基础上，执行了对有机酸的定量估算。
定量和识别在根据实施例1和2获得的不同茶提取物中所含的有机酸的HPLC-MS分析示出，PSR茶提取物和常规提取物含有不同类型的有机酸，主要是柠檬酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸，如在表4所示。在该PSR茶提取物中和在该常规提取物中均未检测到酒石酸和糖醛酸。
表4
该分析还示出，相比于通过常规提取方法，此类有机酸通过本发明的方法以更大的程度被提取，如在图3中所示。
测定了在根据本发明的茶提取物中所含的茶氨酸相对于常规茶提取物的特征。茶叶含有该独特的氨基酸，它占在茶中的氨基酸的总量的50％。它是非蛋白质氨基酸。采用了与紫外线检测器结合的高效液相色谱分析。通过Agilent 1200HPLC系统(AgilentTechnologies)，通过250mm×4.6mm×5μm Uptisphere C18-2柱(Interchim)分离了所有样品。流速为0.4ml/分钟。流动相由0.1％的磷酸(H3PO4)水溶液(A)和乙腈(ACN)(B)组成。通过如下梯度程序促进了洗脱，参见表5：
表5
将该柱的温度维持在30℃。进样体积为5μL，并且使用紫外线检测器将检测波长设置在196nm和210nm。茶氨酸标准物购自Sigma-Aldrich。通过将所述样品的保留时间和紫外光谱峰与标准物比较，来执行对茶氨酸的识别。在与该标准物的面积相比的色谱峰面积的基础上，执行了对茶氨酸的定量估算。
可以定量和识别在根据本发明的方法或根据所谓的常规方法获得的各种茶提取物中所含的茶氨酸的HPLC-UV分析表明，用本发明的方法获得的茶提取物含有茶氨酸。然而，如在图4中所示，相比于通过常规提取获得的提取物，在根据本发明获得的提取物中观测到更少的茶氨酸。
茶素与咖啡因是相同的分子，茶素的特征是在茶叶中大量存在的生物碱。还测定了根据本发明的茶提取物的茶素含量相对于常规茶提取物的茶素含量。通过Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies)，在100mm×4.6mm×2.6pm Uptisphere CSevolution C18-AQ柱(Interchim)上分离了所有样品。流速为0.8ml/分钟。流动相由0.1％的TFA(三氟乙酸)的水溶液(A)和甲醇(B)组成。通过如下梯度程序促进了洗脱，参见表6：
表6
将所述柱的温度维持在25℃。进样体积为5μL，并且使用紫外线检测器将检测波长设置在272nm。茶素标准物购自Sigma-Aldrich。通过所述样品的保留时间和紫外光谱峰与真实的标准物的比较，执行了对茶素的识别。在与该标准物的面积相比的色谱峰面积的基础上，执行了对茶素的定量估算。
可以定量和识别在根据本发明的方法或根据所谓的常规方法获得的各种茶提取物中所含的茶素的HPLC-UV分析表明，用本发明的方法或根据所谓常规提取方法获得的所有类型的茶提取物都含有茶素。结果表明，如在图5中所示，相比于通过常规提取方法获得的茶提取物，通过本发明的方法获得的提取物含有更少的茶素。
还执行了对儿茶素的定量。由于两个不对称碳的存在，因此儿茶素以若干立体异构体的形式存在。在自然界中，最常见的异构体是(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素。其它两种对映异构体少得多，并且它们的存在似乎与酶促反应或热处理有关。通过Agilent 1100HPLC系统(Agilent Technologies)，在100mm×4.6mm×2.6pm Uptisphere CS evolution C18-AQ柱(Interchim)上分离了所有样品。流速为0.8ml/分钟。流动相由0.1％的TFA(三氟乙酸)的水溶液(A)和甲醇(B)组成。通过如下梯度程序促进了洗脱，参见表7：
表7
将该柱的温度维持在25℃。进样体积为20μL，并且使用紫外检测器将检测波长设置为255nm、280nm、290nm和324nm。儿茶素标准物购自Sigma-Aldrich。通过将所述样品的保留时间和紫外光谱峰与真实的标准物比较，执行了儿茶素的识别。在相对于该标准物的面积的样品浓度的峰面积的基础上，执行了对儿茶素的定量估算。
可以定量和识别根据本发明的方法或根据所谓的常规方法获得的各种茶提取物中所含的儿茶素的HPLC-UV分析表明，或者通过本发明的方法或者通过常规提取方法所获得的茶提取物含有很少或不含儿茶素型多酚，如在图4中所示。只有从普洱茶中提取的提取物含有一些儿茶素。在所述提取物中的此类分子的该不存在或该低量特别地通过活性炭和通过PVPP的处理的阶段的实施来解释，所述处理去除了此类化合物。此类结果也得到了证实，并通过薄层色谱法的实施来完成，使得可以可视化各种分子例如儿茶素、表儿茶素和表没食子儿茶素。无论是通过本发明的方法还是通过常规方法获得的茶提取物均不含有此类分子。这证实活性炭和PVPP处理的效果。
在微流控芯片上通过小型化的电泳技术进行了低分子量RNA的定量和大小测量，所述微流控芯片专门用于对核酸例如低分子量RNA的分析(BioanalyserAgilent)。此类方法使得可以确定在提取物中所含的核酸的大小和浓度。
通过该Bioanalyser的定量的结果表明，通过在本发明中所述的方法获得的茶提取物允许从不同类型的茶中提取低分子量RNA，如在表8中所示。相比之下，在常规的茶提取物中没有检测到低分子量的RNA(nd)。
表8
实施例5：在体外测试中在对透明质酸酶抑制的活性方面评估实施例1和2的茶提 取物：
原理：
该测试的目的是通过测量浊度的试验证明来自实施例1和2的提取物对酶例如透明质酸酶的活性的抑制能力。透明质酸酶催化透明质酸(在皮肤真皮中高度存在的并具有保湿和抗衰老性质的葡萄糖胺聚糖)降解为单糖或二糖以及更小的透明质酸片段。透明质酸具有与酸性白蛋白溶液反应的能力，因此形成可以用分光光度计在600nm处测量的雾度。因此，通过分析在所述样品已经与所述酶和它的底物接触之后的所述样品的浊度水平，来测量对所述酶活性的抑制。
方案：
所述酶与根据实施例1和2获得的提取物一起温育，以便在反应混合物中表示1％的最终浓度，在37℃的温度下在pH 7的缓冲液中温育20分钟，这是酶平衡的理想条件。将所述酶的底物透明质酸以0.3mg/ml的浓度加入该混合物中。将该混合物缓慢地匀化，然后在37℃下温育精确地持续45分钟。然后，使在该混合物中残留的透明质酸与酸性白蛋白溶液接触并均化。允许反应的时间为10分钟，之后在分光光度计上在600nm处读取透射率。将数据与用阴性抑制对照获得的那些比较，该阴性抑制对照对应于酶已经降解100％的底物的条件，因此对应于100％的酶活性。
结果：
根据实施例1制备的茶提取物显示出67.9％(对于最弱的，新鲜茶)至约80％(对于最强的，抹茶和普洱茶)的透明质酸酶抑制的百分比。根据实施例2常规制备的茶提取物显示出1.7％(最弱的，绿茶)至57.7％(最强的，普洱茶)的抑制百分比。
结论：
用于评估提取物在体外对透明质酸酶活性的抑制效果的测试已经表明，相比于根据实施例2制备的提取物，根据实施例1制备的茶提取物表现出显著更强的对所述酶的抑制能力，如在图5中所示。
实施例6：与根据实施例2制备的常规普洱茶提取物相比，根据实施例1制备的普洱 茶提取物对在皮肤活检上施加谷氨酸一钠应激后的活性氧物质的评估。
原理：
本研究的目的是示出根据本发明制备的普洱茶提取物对减少由谷氨酸一钠应激产生的活性氧物质的效果。谷氨酸已知作为中枢神经系统的兴奋性神经递质。在皮肤中，在痛觉神经末梢和机械感受器纤维中发生谷氨酸信号传导。
硫氧还蛋白(TRX)是一类参与氧化还原现象的小蛋白，所述氧化还原现象已知存在于所有生物体中。TRX相互作用蛋白(TXNIP)的主要功能是结合和失活TRX，导致活性氧物质的增加积累和细胞凋亡。TXNIP表达与活性氧物质产生的水平密切相关。
方案：
离体人类皮肤活检用含有100mM的谷氨酸一钠的培养基来培养，并或者用PBS(磷酸盐缓冲盐水)处理48小时以用于应激对照，或者用以0.5％(体积/体积稀释)和1％(体积/体积稀释)的根据实施例1制备的普洱茶提取物处理48小时，或者用以相同浓度的根据实施例2制备的常规普洱茶提取物处理48小时。作为非应激对照，将皮肤活检用常规培养基培养并用PBS处理。处理后，将活检固定以用于组织学分析，并被包埋在石蜡中。在脱石蜡后，在pH＝6的柠檬酸盐缓冲液中通过微波加热，将抗原位点去屏蔽，并用5％的牛血清白蛋白饱和30分钟。然后，在湿室中以1:100施加兔单克隆抗TXNIP抗体1小时30分钟。将切片在磷酸盐缓冲液中冲洗，然后在避光的湿室中用Alexa抗兔二级抗体温育1小时。最后，将该切片在磷酸盐缓冲液中再次冲洗，然后安装载玻片以用于在Eclipse E600显微镜(Nikon)下检查。照片用QImaging Retiga 2000R Fast1394相机来拍摄，并通过Q-Capture Pro 7软件(QImaging)来分析。
结果：
相比于无应激的皮肤活检组织，谷氨酸一钠应激的施加导致了+65％的活性氧物质(ROS)的增加量。当用0.5％(体积/体积稀释)和1％(体积/体积稀释)的本发明的提取物处理了皮肤活检组织时，相比于未处理的应激外植体，ROS分别高度显著地降低了-28％和-29％。在相同条件下测试的常规普洱茶提取物得到更小的降低量，分别为-7％和-18％。结果在图6中示出。均值+/-sem；n＝10。用学生氏t检验的统计分析，ns：不显著；***：高度显著。
结论：
根据本发明制备的普洱茶提取物显示出了针对活性氧物质的抗氧化活性。发现了该活性高于用常规普洱茶提取物获得的活性。
实施例7：精华霜(rich cream)的配制
表9
制备方法：
1.使主容器中的相A均化，并在75-80℃下开始加热；
2.在30℃下，撒入相B，并在加热的同时均化；
3.在单独的烧杯中，制备相C，加热至75-80℃直至均匀；
4.在75℃下，将相C添加至该主容器，并均化10分钟；
5.允许温度降低，并在65℃下加入相D。充分混合至均化10分钟；
6.预混合相E，之后将它添加至所述主容器；
7.在60℃下加入相E。充分混合至均化10分钟；
8.在35℃下加入相F并充分混合；
9.预混合相G，之后将它添加至所述主容器；
10.在35℃下加入相G。充分混合至均化；
11.在单独的烧杯中，制备相H：将NatrosolTM撒入至在室温下的水中，并均化同时加热至60℃；
12.在30℃下加入相H。充分混合至均化；
13.在25℃下停止。
因此，所述组合物呈白色奶油状(buttercream)，具有4.90至5.40之间的pH和160,000至210,000cps(Brookfield RVT/轴D/5RPM/1分钟/25℃)的粘度(D0)。
实施例8：抗衰老面膜的配方
表10
制备方法：
1.在25℃下，将在主容器中的相A均化；
2.在25℃下，撒入相B，并充分混合直至均匀；
3.在25℃下，加入相C，充分混合直至均匀；
4.在单独的烧杯中预混合相D，并在25℃下加入该主容器；
5.在25℃下，向该主容器中加入相E，并充分混合；
6.预混合相F，并将它缓慢加入。充分混合直至均匀；
7.在单独的烧杯中预混合相G，并将它添加至该主容器直至均匀；
8.在25℃下停止。
因此，所述组合物呈奶油状凝胶的形式，具有闪烁的绿色效果，具有5.30至5.80之间的pH和70,000至100,000cps(Brookfield RVT/轴C/5RPM/1分钟/25℃)的粘度(D0)。
实施例9：浆液的配方
表11
制备方法：
1.向主容器中加入水，并用hi-lo螺旋桨叶子(blade)开始混合；
2.加入剩余的成分，每次加入一种，每次加入之间进行搅拌。
因此，所述组合物以光滑、半透明浆液的形式存在，具有5.75至6.25之间pH和1,100至1,400cps(Brookfield RVT/轴3/20rpm/25℃/1分钟)的粘度(D0)。

Claims (13)

1.用于获得茶叶(Camellia sinensis)的水性提取物的方法，所述茶叶选自新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶，所述方法包括以下步骤：
a)使所述茶叶或茶粉与水接触，然后任选地压碎它们；
b)加入植酸；
c)将pH调节至10至11之间的值；
d)在40℃至80℃之间的温度下，将混合物保持在搅拌下至少1个小时；
e)将在c)中获得的混合物纯化，以消除残留的固体植物材料并收集滤液；
f)将pH调节至6至8之间的值；
g)用粉状活性炭处理所述混合物；
h)过滤以去除所述活性炭并收集滤液；
i)用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理所述滤液；
j)过滤以去除所述聚乙烯聚吡咯烷酮并收集滤液；
k)检查所述滤液的pH，并且如必要，则重新调节该pH至6至6.5之间的值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，以3重量％至20重量％的植物材料/水的比率，优选地以3重量％至10重量％之间的比率，使所述茶叶与水接触。
3.根据权利要求1或2中的任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，用在1至10mM之间，优选地在1至5mM之间的浓度的植酸，来进行处理。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，在具有大于或等于30μm的孔隙度的过滤器上，执行至少一次过滤。
5.根据权利要求1至4中的任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤j)中，用大于25μm的孔隙度的过滤器，接着用0.8μm的孔隙度的过滤器过滤，来进行顺序的过滤。
6.根据权利要求1至5中的任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤k)之后，随后将所述提取物在生理上可接受的溶剂中稀释，然后将它的pH调节至5.8至6.5之间，优选地6.0至6.5之间的值，以便于获得具有4至20g/kg之间的干重的经稀释的提取物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生理上可接受的溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化的或丙氧基化的二甘醇类、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。
8.茶叶的水性粗提取物，所述茶叶获自新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶，所述水性粗提取物富含具有至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物和富含有机酸，不含DNA，所述水性粗提取物通过根据权利要求1至5中的任意一项所述的方法是可获得的，其特征在于，所述水性粗提取物具有5至30g/kg的干重，包含0.5至10g/kg的糖类；0.050至2g/kg的有机酸；0.050至5g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至200mg/kg的儿茶素、0.020至2g/kg的茶素和0.020至2g/kg的茶氨酸；和50至350mg/kg的具有至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
9.经稀释的茶叶的水性提取物，所述茶叶获自新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶，所述经稀释的水性提取物富含具有至多150个核苷酸的长度的小RNA，富含糖类，富含酚类化合物和富含有机酸，不含DNA，所述经稀释的水性提取物通过根据权利要求6或7中的任意一项所述的方法是可获得的，其特征在于，它具有在4至20g/kg的干重之间的干重，并且按所述提取物的总重量计，包含0.2至5g/kg的糖类；0.030至1g/kg的有机酸；0.030至3g/kg的酚类化合物，所述酚类化合物包括0至120mg/kg的儿茶素、0.010至1g/kg的茶素和0.010至1g/kg的茶氨酸；和10至250mg/kg的具有至多150个核苷酸的长度的低分子量RNA。
10.组合物，其包含有效量的至少一种经稀释的根据权利要求8所述的提取物作为活性成分和生理上可接受的介质，所述提取物选自新鲜茶、普洱茶、抹茶或绿茶的提取物或它们的任意混合物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述活性成分以按所述组合物的总重量计的0.05重量％至5重量％之间的浓度存在，优选地以按所述组合物的总重量计的0.1重量％至2.5重量％之间的浓度存在，和生理上可接受的介质。
12.根据权利要求10或11中的任意一项所述的组合物，其特征在于所述组合物被配制以被局部施加至皮肤、附属物和头皮。
13.根据权利要求10至12中的任意一项所述的组合物的化妆品用途，其用于对皮肤、头皮和附属物的护理，更特别是用于保护皮肤免受外部侵害和氧化，用于对抗皮肤衰老的迹象，用于增强光防护，用于增亮皮肤，和用于改善皮肤水合。
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