[go: up one dir, main page]

CN116555258A - 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用 - Google Patents

增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116555258A
CN116555258A CN202310394423.5A CN202310394423A CN116555258A CN 116555258 A CN116555258 A CN 116555258A CN 202310394423 A CN202310394423 A CN 202310394423A CN 116555258 A CN116555258 A CN 116555258A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirpa
erna
inflammatory bowel
bowel disease
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310394423.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王青青
熊佳
晋凯风
邹霭萱
来利华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202310394423.5A priority Critical patent/CN116555258A/zh
Priority to PCT/CN2023/099638 priority patent/WO2024207619A1/zh
Publication of CN116555258A publication Critical patent/CN116555258A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了增强子RNA作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明鉴定了一种与炎症性肠病疾病状态相关的从Sirpa基因位点转录的增强子RNA，通过DSS诱导小鼠肠炎模型，发现所述增强子RNA序列的反义寡核苷酸可以显著降低小鼠肠道巨噬细胞表面SIRPα蛋白的表达，促进巨噬细胞的吞噬能力，进而促进小鼠肠道炎症的消退进程。因此，本发明的发现预示着所述增强子RNA序列作为靶点在研发诊断炎症性肠病的方法或试剂盒以及制备防治炎症性肠病的药物中的应用潜能。

Description

增强子RNA作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种增强子RNA作为靶点在制备炎症性肠病的诊断剂或试剂盒以及制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因不明的慢性、非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，临床表现为腹泻、腹痛、血便、体质量减轻等，甚至伴有严重的并发症，如肠出血、肠梗阻、癌变等。IBD终身复发倾向严重影响了患者的身心健康与生存质量，对公共医疗系统与社会经济发展造成了巨大的压力。
虽然IBD的病因尚未明确，但目前普遍认为遗传因素、环境因素和患者的免疫状态是起始IBD发病的重要导火索。大量研究表明，IBD发生的第一阶段是由遗传因素或环境因素引起肠道上皮屏障功能损坏，导致肠腔内的微生物抗原移位进入肠道黏膜固有层，随后进入第二阶段，即肠道固有层的免疫细胞对抗原进行强烈的免疫应答，并产生大量的细胞因子，如CCL2、TNF-α、IL-2、IL-12IFN-γ等引起黏膜炎症反应，若此时由于调节性T细胞的功能发生障碍等造成急性肠道炎症不能够被有效地控制，黏膜免疫细胞持续对抗原产生免疫应答并分泌细胞因子而逐渐地发展成慢性肠炎。
目前对IBD的治疗着眼于控制活动性炎症和调节免疫紊乱，常用的药物主要有有氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、甲氨喋呤等以及生物制剂，包括TNF-α单抗，如英夫利昔单抗、阿达木单抗等、α4β7整合素单抗，如维得利珠单抗、那他珠单抗等。但由于当前对IBD的认识较为局限，以上治疗手段中的最佳缓解方案也仅能使炎症性肠病的复发率降低50％左右，其治疗效果不佳，且副作用较大。因此，需要继续深入研究IBD的发病机制，开发疗效好、副作用小的新型治疗方案。
在人类基因组中，仅有1.5％的DNA序列具有编码蛋白质的功能，而其余的非蛋白编码序列中绝大多数被转录成长度大于200个碱基的长链非编码RNA(Long non-codingRNA，lncRNA)，在多个层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程的调控，并与人类的重大疾病密切相关。研究发现，一类由基因组上的增强子(Enhancer)元件转录产生的约200-500bp长度的非编码RNA被称为增强子RNA(Enhancer RNA，eRNA)，通过调控染色质空间结构、改变组蛋白修饰状态等方式参与调控相关基因的时空表达，eRNA异常引起靶基因的表达调控异常可能是导致肠道急性炎症消退异常，进而引发IBD的原因。相较于传统药物，靶向eRNA药物的高效性、高特异性与低毒副作用使得eRNA有望成为诊断、治疗IBD的新靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供增强子RNA作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，以解决上述本领域存在的问题。本发明的另一目的在于提供以上eRNA在诊断炎症性肠病中的应用以及相关产品的制备。
具体地，本发明提供了SIRPA-eRNA作为靶点在制备用于防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了检测SIRPA-eRNA的试剂在制备炎症性肠病的诊断剂或试剂盒中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。
具体的，其中所述试剂为SIRPA-eRNA特异性探针或PCR引物。
本发明还提供了用于降低或抑制SIRPA-eRNA表达的化合物在制备用于防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于防治或治疗炎症性肠病的药物，成分包含降低或抑制SIRPA-eRNA表达的化合物；所述SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
具体的，所述化合物为靶向SIRPA-eRNA序列的反义寡核苷酸ASO。
优选的，靶向如SEQ ID NO.1所示的SIRPA-eRNA序列的反义寡核苷酸ASO序列为5’-AAAUCAGGTGCCAGGUGUCC-3’，
靶向如SEQ ID NO.2所示的SIRPA-eRNA序列的反义寡核苷酸ASO序列为5’-ACCAUAGCAACAGTCAGAG-3’。
优选的，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
本发明利用ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等技术从葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎小鼠模型中鉴定出一种从Sirpa基因位点转录的增强子RNA(序列如SEQ ID NO.2所示)，可以参与调控肠炎小鼠炎症消退期肠道巨噬细胞的SIRPα蛋白表达从而调控巨噬细胞的吞噬能力，吞噬功能增强的巨噬细胞有助于清除炎症条件下肠道的凋亡中性粒细胞，促进炎症消退；进一步通过RNA荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、荧光定量PCR等技术分析了炎症性肠病患者的肠道组织，结果显示患者肠道组织中eRNA含量显著上升。通过DSS诱导小鼠肠炎模型，给予针对所述RNA序列的反义寡核苷酸(ASO)处理后，小鼠肠道巨噬细胞的SIRPα蛋白表达降低，吞噬能力增强，同时小鼠的结肠长度显著增加，肠道调节性T细胞浸润增加，体重显著升高，肠炎症状显著减轻。因此，本发明的发现提示了在研发诊断炎症性肠病的方法或试剂盒以及制备防治炎症性肠病的药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为分析SIRPA mRNA在IBD患者活检结肠组织中表达升高。A：分析数据库GSE36807、GSE73661和GSE9452健康对照和IBD患者的结肠组织SIRPA mRNA表达水平；B：分析数据库GSE14580、GSE12251对英夫里昔单抗响应及不响应的IBD患者结肠组织SIRPAmRNA表达水平；C：分析数据库GSE73661对维多利珠单抗响应及不响应的IBD患者结肠组织SIRPA mRNA表达水平。统计学方法为t检验，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns表示p＞0.05。
图2为分析SIRPA eRNA在IBD患者中表达升高。A：分析数据库GSE172116中H3K27乙酰化的修饰位点鉴定人单核细胞来源的巨噬细胞中在SIRPA的增强子序列，其中，untreated(UT)表示未处理，high-dose(HD)表示高剂量炎症诱导物脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，low-doseand high-dose(LDHD)表示低剂量LPS和后续高剂量LPS；B：荧光定量PCR检测健康肠组织和IBD患者肠组织中SIRPA的eRNA表达；C：RNAFISH探针检测健康肠组织和IBD患者肠组织中SIRPA的eRNA表达，比例尺：100μm。统计学方法为t检验，ns表示p＞0.05，**p＜0.01。
图3为分析小鼠Sirpa eRNA的表达及功能。A：利用DSS诱导小鼠肠炎模型，分选肠道巨噬细胞进行ATAC-seq，结合数据库GSE136070，GSE50944鉴定小鼠Sirpa的eRNA；B：利用ASO敲低小鼠巨噬细胞中Sirpa的eRNA水平，将有效降低mRNA水平；C：利用ASO敲低人源巨噬细胞THP-1中SIRPA的eRNA水平，将有效降低mRNA水平；D：利用ASO敲低小鼠巨噬细胞中Sirpa的eRNA水平，将有效增加巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬。统计学方法为t检验，**p＜0.01，****p＜0.0001。
图4为分析体内ASO靶向eRNA对小鼠肠炎消退具有促进作用。A：对照组与实验组小鼠的体重变化图；B：对照组与实验组小鼠第14天的结肠长度比较。统计学方法为t检验，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
实施例1
选自GEO数据库GSE36807、GSE73661和GSE9452检测健康对照和IBD患者的结肠组织SIRPA mRNA表达水平；选自GEO数据库GSE14580、GSE12251和GSE73661检测对英夫里昔单抗响应及不响应、对维多利珠单抗响应及不响应的IBD患者结肠组织SIRPA mRNA表达水平。
如图1所示，临床数据库分析结果表明IBD患者结肠组织中SIRPA mRNA表达水平明显升高，其中对英夫里昔单抗与维多利珠单抗治疗无反应的IBD患者结肠组织SIRPA mRNA表达水平显著高于有反应的患者。
实施例2
选自GEO数据库GSE172116的ATAC-seq与ChIP-seq数据鉴定人单核细胞来源巨噬细胞的基因组增强子与eRNA。
(1)制备IBD患者结肠组织样本
经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会审批同意，在获得患者知情同意的前提下，获取浙江大学附属第二医院炎症性肠病诊治中心的患者活检组织，其中常规方法取患者正常结肠组织与炎症结肠组织置于生理盐水中，样本当天处理，部分制备病理切片，部分液氮速冻。
(2)荧光定量PCR检测IBD患者结肠组织SIRPA eRNA表达水平
获取液氮速冻的IBD患者正常结肠组织与炎症结肠组织，加入TRIzol匀浆裂解，提取结肠组织RNA，检测SIRPA eRNA表达水平。
TRIzol法按试剂说明书进行总RNA提取，按TOYOBO逆转录试剂盒说明书步骤逆转录成cDNA。
逆转录体系：
cDNA用RNase-free water稀释10倍后进行实时荧光定量PCR，扩增体系为：
扩增程序为：95℃、10s；95℃、15s，60℃、40s，共40个循环；95℃、15s，60℃、1min，95℃、15s。
所用的所有扩增引物如表1所示：
人引物序列：
表1
基因 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)
β-actin TGGCACCCAGCACAATGAA CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SIRPA eRNA GGACACCTGGCACCTGATTT CAGAGGTCTCAAGGCCTACC
SIRPA mRNA GGCCTCAACCGTTACAGAGAA GTTCCGTTCATTAGATCCAGTGT
(3)IBD患者结肠组织RNA荧光原位杂交
获取IBD患者正常结肠组织与炎症结肠组织，10％福尔马林中固定，一周内石蜡包埋，切片。石蜡切片脱蜡后，每张切片滴加100μL蛋白酶K，在37℃孵育20分钟后用pH＝7.0的2×柠檬酸钠缓冲液冲洗三次，每次1分钟。将切片依次浸入含有70％、80％、90％、100％梯度酒精的染缸中，静置2分钟进行脱水，在空气中干燥后每张切片滴加100μL变性液(甲酰胺-柠檬酸钠缓冲液)于78℃孵育8分钟，依次浸入70％、80％、90％、100％梯度酒精2分钟进行脱水，在空气中室温干燥。用杂交缓冲液稀释探针500nM，73℃变性5分钟，将切片水平放置于湿盒中，每张切片滴加10μL变性后的探针混合液，盖上盖玻片后用封片胶封片。将湿盒放置于原位杂交仪中，37℃孵育12-14小时。轻轻去掉盖玻片，吸弃探针混合液，每张切片滴加43℃预热的杂交后水洗液100μL，室温静置15分钟后用pH＝7.0的2×柠檬酸钠缓冲液清洗2次，每次10分钟，用PBS清洗10分钟。除去PBS，DAPI染核，烘干，封片后在荧光显微镜下观察。
上述实验所用为Cy5标记探针，序列如表2所示：
表2
名称 序列
NC_000020_probe1 5‘-CCTGATTTTGTGTCAGCAGGGCCTGA-3’
结果如图2所示，临床数据库分析结果显示人单核细胞来源的巨噬细胞中存在序列如SEQ ID NO.1所示的SIRPA eRNA。IBD患者结肠组织炎症部位的SIRPA eRNA明显高于正常结肠组织。
实施例3
(1)C57BL/6J野生型雄性小鼠(8周龄)来自浙江大学实验动物中心。将动物饲养在适宜恒定温度和湿度下，12小时的光-暗循环饲养室内，饲料和水可用自由采食。所有动物的程序，按照动物福利伦理委批准的程序进行。采用国际通用的急性结肠炎小鼠模型：给予6-8周龄C57BL/6小鼠2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用，连续饲喂5天后更换普通饮用水。以6-8周龄C57BL/6小鼠作为对照。
(2)获取DSS饲喂5天并更换饲喂饮用水一定天数的小鼠肠道组织，冰上去除淋巴结、脂肪和结缔组织，用PBS洗净肠道粪便和黏液，置于5％胎牛血清(FBS)、5mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)和1mM二硫苏糖醇(DTT)的无钙镁HBSS缓冲液中，37℃、150rpm摇床消化30分钟。消化后的组织通过70μm尼龙网过滤去除组织碎片，用PBS清洗出去残留的分离液后，将消化后的组织剪碎成1mm左右的碎片，置于5％FBS和300U/mL IV型胶原酶的无钙镁HBSS缓冲液中，37℃、150rpm摇床消化45-60分钟。将消化完成的组织通过70μm尼龙网过滤，收集滤液在新的离心管中，500×g离心10分钟后用含3％FBS的PBS清洗两次。
然后使用流式抗体BUC395-CD45，APC-CD11b，BV421-CX3CR1，AF700-MHC-II，FITC-Ly6C和细胞死活染料Zombie AquaTM FixableViability Kit避光染色15分钟，采用Beckmanmoflo Astrios EQ流式细胞分选仪对肠道巨噬细胞进行分选。分选出的细胞委托康测科技有限公司进行ATAC-seq与ChIP-seq分析。
选自GEO数据库GSE136070和GSE50944的ChIP-seq与GRO-seq数据鉴定小鼠巨噬细胞的基因组eRNA图谱。
(3)取5-8周C57BL/6J野生型雄性小鼠的后腿骨，用1mL注射器吸取无血清的PRMI1640培养基将骨髓细胞吹出，300×g离心5分钟，弃上清，加入红细胞裂解液破除红细胞，静置3-5分钟后加入等体积的无血清PRMI1640培养基中和，300×g离心5分钟，弃上清，用10ng/mL M-CSF、10％FBS、100×青霉素和链霉素的PRMI 1640培养基重悬。将细胞悬液进行计数，以2×106cell/mL均匀铺在细胞板中进行培养。培养至第3天，吸去未贴壁的细胞，用上述培养基进行半换液。培养至第5天，吸去未贴壁的细胞，用上述培养基进行全换液，获得贴壁的骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages，BMDM)。
选用生长状态良好的BMDM，按lipo3000说明书将ASO-eRNA(吉玛基因)和对照ASO-NC加入细胞，转染24h。
针对mouse-Sirpa eRNA的ASO和对照ASO-NC序列如表3所示。
表3
名称 序列(划线部分表示RNA碱基，其余为DNA碱基)
ASO-m-eRNA 5’-ACCAUAGCAACAGTCAGAG-3’
ASO-m-NC 5’-GCGUATTATAGCCGAUUAAC-3’
选用生长状态良好的人THP-1细胞系，利用佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)诱导为巨噬细胞，按lipo3000说明书将ASO-eRNA(吉玛基因)和对照ASO-NC加入细胞，转染24h。
针对human-SIRPA eRNA的ASO和对照ASO-NC序列如表4所示。
表4
名称 序列(划线部分表示RNA碱基，其余为DNA碱基)
ASO-h-eRNA 5’-AAAUCAGGTGCCAGGUGUCC-3’
ASO-h-NC 5’-GCGUATTATAGCCGAUUAAC-3’
收集细胞并加入TRIzol匀浆裂解，提取BMDM的RNA，按试剂说明书进行总RNA提取，按TOYOBO逆转录试剂盒说明书步骤逆转录成cDNA。
逆转录体系：
cDNA用RNase-free water稀释10倍后进行实时荧光定量PCR，扩增体系为：
扩增程序为：95℃、10s；95℃、15s，60℃、40s，共40个循环；95℃、15s，60℃、1min，95℃、15s。
所用的所有扩增引物如表5所示：
鼠引物序列：
表5
基因 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)
β-actin CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG
Sirpa eRNA TGGCTAGGGAGGGGGTA CTCACCCTCAGCACAGC
Sirpa mRNA CCACGGGGAAGGAACTGAAG ACGTATTCTCCTGCGAAACTGTA
(4)收集步骤(3)中转染ASO-eRNA和ASO-NC的细胞并用含3％FBS的PBS清洗两次，APC-CD11b，BV421-F4/80，和PE-Annexin-V染色15分钟，采用BD Fortessa进行免疫细胞分析。
如图3所示，小鼠肠道巨噬细胞的ATAC-seq与ChIP-seq结果与数据库分析结果显示小鼠巨噬细胞中同样存在Sirpa eRNA(序列如SEQ ID NO.2所示)。使用ASO-eRNA敲低巨噬细胞的Sirpa eRNA水平可以显著下调Sirpa mRNA和SIRPα蛋白的表达水平，同时显著增加巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬能力。
实施例4
DSS诱导小鼠结肠炎模型步骤同实施例3中的步骤(1)，采用双盲方式在造模的第8天与第11天对小鼠进行腹腔内注射ASO-eRNA(吉玛基因)和对照ASO-NC，每天称量小鼠体重，造模14天后取小鼠结肠进行长度测量。
针对mouse-Sirpa eRNA的ASO序列如实施例3的表3所示。
如图4所示，在DSS造模后注射ASO-eRNA的小鼠体重与结肠长度显著高于对照组，抑制小鼠肠道的Sirpa eRNA可以显著加快炎症恢复进程。
综合上述实验检测表明，Sirpa eRNA的表达促进IBD的发展，巨噬细胞中干扰Sirpa eRNA的表达水平可以显著治疗DSS诱导的小鼠结肠炎模型，能够促进肠道炎症消退，通过降低Sirpa mRNA和SIRPα蛋白的表达水平，促进巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬，来达到抑制IBD发展。
Sirpa eRNA可以作为靶点在研发诊断炎症性肠病的方法或试剂盒以及制备防治炎症性肠病的药物中的应用。而且可以在基因水平和/或组织水平以Sirpa eRNA作为检测靶点，在基因水平和/或表观遗传修饰水平以Sirpa eRNA作为药物靶点。比如通过荧光定量PCR、RNA FISH检测肠道组织Sirpa eRNA研发诊断炎症性肠病的方法或试剂盒，或者是通过阻碍Sirpa eRNA的siRNA和/或ASO，或者是促进Sirpa eRNA降解的抑制剂试剂以及表达siRNA和/或ASO的载体均可以在制备防治IBD的药物中进行应用。

Claims (9)

1.SIRPA-eRNA作为靶点在制备用于防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.检测SIRPA-eRNA的试剂在制备炎症性肠病的诊断剂或试剂盒中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中所述试剂为SIRPA-eRNA特异性探针或PCR引物。
5.用于降低或抑制SIRPA-eRNA表达的化合物在制备用于防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用，SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
6.一种用于防治或治疗炎症性肠病的药物，其特征在于，成分包含降低或抑制SIRPA-eRNA表达的化合物；所述SIRPA-eRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求6所述用于防治或治疗炎症性肠病的药物，其特征在于，所述化合物为靶向SIRPA-eRNA序列的siRNA或反义寡核苷酸ASO。
8.如权利要求7所述用于防治或治疗炎症性肠病的药物，其特征在于，靶向如SEQ IDNO.1所示的SIRPA-eRNA序列的反义寡核苷酸ASO序列为5’-AAAUCAGGTGCCAGGUGUCC-3’，
靶向如SEQ ID NO.2所示的SIRPA-eRNA序列的反义寡核苷酸ASO序列为5’-ACCAUAGCAACAGTCAGAG-3’。
9.如权利要求6～8任一项所述用于防治或治疗炎症性肠病的药物，其特征在于，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
CN202310394423.5A 2023-04-07 2023-04-07 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用 Pending CN116555258A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310394423.5A CN116555258A (zh) 2023-04-07 2023-04-07 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用
PCT/CN2023/099638 WO2024207619A1 (zh) 2023-04-07 2023-06-12 增强子rna作为靶点在制备防治炎症性肠病的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310394423.5A CN116555258A (zh) 2023-04-07 2023-04-07 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116555258A true CN116555258A (zh) 2023-08-08

Family

ID=87500926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310394423.5A Pending CN116555258A (zh) 2023-04-07 2023-04-07 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116555258A (zh)
WO (1) WO2024207619A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117379392A (zh) * 2023-10-11 2024-01-12 谈高 特异性靶向Treg表达FUT7基因的纳米颗粒及其制备方法和应用
CN119061137A (zh) * 2024-11-06 2024-12-03 宁波大学附属第一医院 一种用于辅助诊断克罗恩病的eRNA分子标记物及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201100947A1 (ru) * 2008-12-19 2012-02-28 Новартис Аг Растворимые полипептиды, предназначенные для применения при лечении аутоиммунных и воспалительных нарушений
US12105089B2 (en) * 2017-07-17 2024-10-01 The Broad Institute, Inc. Cell atlas of the healthy and ulcerative colitis human colon

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117379392A (zh) * 2023-10-11 2024-01-12 谈高 特异性靶向Treg表达FUT7基因的纳米颗粒及其制备方法和应用
CN119061137A (zh) * 2024-11-06 2024-12-03 宁波大学附属第一医院 一种用于辅助诊断克罗恩病的eRNA分子标记物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024207619A1 (zh) 2024-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marmai et al. Alveolar epithelial cells express mesenchymal proteins in patients with idiopathic pulmonary fibrosis
Fu et al. Systemic inflammation is associated with differential gene expression and airway neutrophilia in asthma
Chu et al. Overexpression of microRNA-495 improves the intestinal mucosal barrier function by targeting STAT3 via inhibition of the JAK/STAT3 signaling pathway in a mouse model of ulcerative colitis
Harries et al. Advancing age is associated with gene expression changes resembling mTOR inhibition: evidence from two human populations
Baek et al. The cholesterol metabolite 27HC increases secretion of extracellular vesicles which promote breast cancer progression
Zhao et al. Gene expression profiles analyzed using integrating RNA sequencing, and microarray reveals increased inflammatory response, proliferation, and osteoclastogenesis in pigmented villonodular synovitis
CN116555258A (zh) 增强子rna作为靶点在制备防治或治疗炎症性肠病的药物中的应用
Abey et al. Lysozyme association with circulating RNA, extracellular vesicles, and chronic stress
Wang et al. Regulation of pancreatic fibrosis by acinar cell-derived exosomal miR-130a-3p via targeting of stellate cell PPAR-γ
Gavriilidis et al. Neutrophil-fibroblast crosstalk drives immunofibrosis in Crohn’s disease through IFNα pathway
Feng et al. RNA-Seq approach to investigate the effects of melatonin on bone marrow-derived dendritic cells from dextran sodium sulfate-induced colitis mice
Huang et al. B cell subsets contribute to myocardial protection by inducing neutrophil apoptosis after ischemia and reperfusion
WO2018025923A1 (ja) 抗ｈｔｌｖ－１剤、ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ／ｔｓｐ）治療薬
Weber et al. NLRP3 inhibition leads to impaired mucosal fibroblast function in patients with inflammatory bowel diseases
Rodríguez et al. MyD88-dependent changes in the pulmonary transcriptome after infection with Chlamydia pneumoniae
De Lorenzo et al. KLF11 deficiency enhances chemokine generation and fibrosis in murine unilateral ureteral obstruction
Li et al. Glucocorticoid resistance of allogeneic T cells alters the gene expression profile in the inflamed small intestine of mice suffering from acute graft-versus-host disease
Hour et al. Downregulation of ABCD1 in human renal cell carcinoma
Cui et al. IL-17A and TNF-α-induced Dectin-1 expression may promote keratinocyte proliferation in psoriatic lesions
Sangaletti et al. SPARC regulation of PMN clearance protects from pristane-induced lupus and rheumatoid arthritis
Gautam et al. The distinct transcriptomic signature of the resolution phase fibroblast-like synoviocytes supports endothelial cell dysfunction
Martinez et al. The Single Cell Landscape of the Human Vein After Arteriovenous Fistula Creation and Implications for Maturation Failure
CN113549690B (zh) 一种长链非编码rna及其作为多发性骨髓瘤细胞分子标志物的应用
CN114794016A (zh) 一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法
US20210355538A1 (en) Use of mucosal transcriptomes for assessing severity of ulcerative colitis and responsiveness to treatment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination