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CN116554327A - 特异性结合c-Met的抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

特异性结合c-Met的抗体、嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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CN116554327A
CN116554327A CN202310422271.5A CN202310422271A CN116554327A CN 116554327 A CN116554327 A CN 116554327A CN 202310422271 A CN202310422271 A CN 202310422271A CN 116554327 A CN116554327 A CN 116554327A
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car
amino acid
antibody
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CN202310422271.5A
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李玉民
张正潮
滕牧洲
周文策
赵阳
唐富天
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Lanzhou University Second Hospital
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Lanzhou University Second Hospital
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Abstract

本发明涉及生物与医药技术领域，特别涉及一种特异性结合c‑Met的抗体、嵌合抗原受体及其应用。所述特异性结合c‑Met的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。本发明还涉及所述特异性结合c‑Met的抗体和嵌合抗原受体用于治疗癌症的用途。

Description

特异性结合c-Met的抗体、嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物与医药技术领域，特别涉及特异性结合c-Met的抗体、嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，我国每年胃癌新发病例超过60余万，高居恶性肿瘤发病率第二位，严重危害人类生命健康。由于胃癌组织的异质性较高，手术、化疗及放疗等传统治疗手段效果不够理想，进展期胃癌五年生存率不足30％，徐瑞华报道了中国748例D2胃癌根术后患者的疗效，结果显示Lauren分型为弥漫型的胃癌患者临床预后最差，比肠型胃癌患者5年总体生存率低8％左右。因而，胃癌传统治疗方法效果欠佳，亟待研发新的治疗模式来提高其疗效。
使用表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的自体T细胞进行肿瘤细胞免疫治疗是一种很有前途的策略，靶向CD19的CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤证明了这一点。CAR是一种合成的受体，由抗原结合结构域组成，该抗原结合结构域通常是来自单克隆抗体的单链可变片段(single-chain fragment variable,scFv)，通过铰链或间隔子连接到跨膜结构域和来自T细胞受体复合体的胞内信号传导结构域，其中包含CD3 zeta(CD3ζ)和共刺激信号结构域。CAR-T细胞通过CAR-T的单链抗体与癌细胞表面的特定靶抗原结合来介导肿瘤细胞的杀伤，而无需在主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)呈递抗原。直接与特定的靶抗原结合后，CAR-T细胞通过胞内信号传导结构域的功能被激活。scFv作为抗原识别结构域，启动并决定T细胞激活的强度，以独立于MHC的方式提供特异性。一般来说，具有高亲和性scFv的CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性。因此，制备高亲和力的scFv是构建CAR-T的基础。
c-Met又称为肝细胞生长因子(HGF)受体，属于受体酪氨酸激酶家族(RTKs)。HGF与c-Met结合可以调控下游的多种信号通路参与多种生理过程，包括细胞的增殖和存活、细胞凋亡和血管生成等；当HGF/c-Met信号通路发生异常时就会导致肿瘤的发生。因此c-Met可能是肿瘤治疗的一个潜在靶点。
目前，c-Met作为靶点在胃癌治疗中的研究和应用仍然较少，尤其是结合嵌合抗原受体的应用以及其是否能够以及如何有效应用于更高效地治疗肿瘤和癌症仍待进一步开发。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合c-Met的抗体、包含c-Met抗原结合结构域的嵌合抗原受体及其应用。
在一个方面，本发明提供了一种特异性结合c-Met的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：4所示的重链可变区和如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或di-scFv。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为scFv。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头。进一步地，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，其包含c-Met抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
进一步地，所述c-Met抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。进一步地，所述c-Met抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：4所示的重链可变区和如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区。进一步地，所述c-Met抗原结合结构域还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头。进一步地，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。进一步地，所述c-Met抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。进一步地，所述跨膜结构域具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。进一步地，所述胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激信号分子和人CD3ζ信号传导结构域。进一步地，所述4-1BB共刺激信号分子具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。进一步地，所述人CD3ζ信号传导结构域具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体还包含连接所述c-Met抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区。进一步地，所述铰链区具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体在其N端还包含信号肽。进一步地，所述信号肽具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体在其C端还包含hIL7和hIL21的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体。
在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如本文所述的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如本文所述的表达载体。进一步地，所述宿主细胞包括免疫细胞，进一步地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞或其任意组合。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体或宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了如本文所述的抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体、核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或试剂盒在制备用于预防和/或治疗过表达c-MET的癌症的药物中的用途。进一步地，所述过表达c-MET的癌症包括胃癌。
定义
如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体，而且包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、单链(例如scFv，di-scFv，(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。
如本文中所使用的，“抗原结合片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等，优选地为scFv。
术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子，其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。如本文中所使用的，在scFv中使用的接头不受限制，其可以是本领域熟知用于在scFv中连接VH和VL的任何接头。作为一个实例，跨膜结构域可以具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。
如本文中所使用的，在嵌合抗原受体中使用的跨膜结构域不受限制，其可以是本领域熟知用于构建嵌合抗原受体的任何跨膜结构域。作为一个实例，跨膜结构域可以具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。如本文中所使用的，在嵌合抗原受体中使用的胞内信号传导结构域不受限制，其可以是本领域熟知用于构建嵌合抗原受体的任何胞内信号传导结构域。作为一个实例，胞内信号传导结构域可以包含4-1BB共刺激信号分子和人CD3ζ信号传导结构域。进一步地，所述4-1BB共刺激信号分子可以具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。进一步地，所述人CD3ζ信号传导结构域可以具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体还可以包含连接胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区。如本文中所使用的，在嵌合抗原受体中使用的所述铰链区不受限制，其可以是本领域熟知用于在嵌合抗原受体中连接胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的任何铰链区。作为一个实例，铰链区可以具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。进一步地，所述嵌合抗原受体在其N端还包含信号肽。如本文中所使用的，在嵌合抗原受体中使用的所述信号肽不受限制，其可以是本领域熟知用于嵌合抗原受体的任何信号肽。作为一个实例，所述信号肽可以具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的c-MET特异性抗体的变体，其与如本文所述的c-MET特异性抗体的氨基酸序列的具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的抗体的生物学功能(例如特异性结合c-MET的生物活性)。
更具体地，所述变体与如本文所述的c-MET特异性抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。宿主细胞可以包括免疫细胞。免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞或其任意组合。
将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与c-Met高表达有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与c-Met高表达有关的疾病。
如本文中使用的，术语“过表达c-MET的癌症”和“c-Met高表达有关的疾病”意指受试者的患病细胞例如癌细胞中c-MET的表达量高于同一受试者的正常健康细胞中c-MET的表达量。在一些情况下，“过表达c-MET的癌症”和“c-Met高表达有关的疾病”可以互换使用。在具体的实施方案中，例如，过表达c-MET的癌症可以包括胃癌。
附图说明
图1显示了c-Met scFv序列调取研发流程的示意图。
图2显示了流式细胞术筛选c-Met(scFv)单克隆抗体序列的结果。将抗体scFv序列瞬时转染293T细胞，24h后收取细胞，分别孵育1ug c-Met抗原,所用二抗为APC抗人IgG。图A-I分别为2-2e-5、2-2b-7、2-2b-11、2-2a-11、1-1e-11、2-2a-7、1-1e-2、2-2e-2、2-2e-11序列流式筛选。图J为流式分析验证筛选出的c-Met scFv序列识别不同标签的重组蛋白。筛选出的scFv抗体序列瞬时转染293T细胞，24h后收取细胞，孵育1ug c-Met-hFc抗原，二抗为PE抗人IgG。
图3显示了靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)的质粒构建模式图。
图4显示了靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)质粒的验证。图A-D分别为通过流式细胞检测验证c-Met-CAR、IL7-c-Met-CAR、IL21-c-Met-CAR和IL7-IL21-c-Met-CAR的c-Met嵌合抗原受体(CAR)质粒。将CAR质粒瞬时转染293T细胞，24h后收集1×106个细胞，使用c-Met流式抗体进行检测。
图5显示了慢病毒包装24小时荧光显微镜下效率检测。A为c-MET-CAR质粒包装的慢病毒；B为IL7-c-MET-CAR质粒包装的慢病毒；C为IL21-c-MET-CAR质粒包装的慢病毒；D为IL7-IL21-c-MET-CAR质粒包装的慢病毒。标尺为100μm。
图6显示了CAR-T细胞感染效率蛋白L流式检测。A-E分别为普通-T、c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T细胞的蛋白L流式检测FCM直方图。F为上述细胞感染效率(蛋白L表达)柱状统计图。数据以平均值±SD表示，试验均重复大于等于3次。
图7显示了CAR-T细胞对胃癌细胞杀伤试验的结果。图A-C分别是普通-T、c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T以不同的效靶比对MKN45、HGC-27及HGC-27-OE等靶细胞的杀伤效率。D-H分别为普通-T、c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T细胞以不同的效靶比对HGC-27与HGC-27-OE靶细胞的杀伤效率对比。上述统计图数据以平均值±SD表示，试验均重复大于等于3次(**表示p＜0.01；***表示p＜0.001；****表示p＜0.0001)，采用多重t检验进行统计分析。
图8显示了CAR-T细胞与MKN45胃癌细胞株共培养的细胞因子检测的结果。普通-T、c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T以10:1效靶比与MKN45靶细胞共培养24小时后上清液细胞因子水平对比。图A-E分别为INF-γ、TNF-β、IL-7、IL-21、IL-6。上述统计图数据以平均值±SD表示，试验均重复大于等于3次(**表示p＜0.01；***表示p＜0.001；****表示p＜0.0001)，采用多重t检验进行统计分析。
图9显示了PDX-1、PDX-2移植瘤组织和患者组织c-MET免疫组化染色。图A-C为PDX-1P0、P1、P2代小鼠移植瘤组织c-Met免疫组化染色；图D为PDX-2P0代小鼠移植瘤组织进行c-Met免疫组化染色；图E为患者-1的肿瘤组织免疫组化结果；图F为患者-2的肿瘤组织免疫组化结果。比例尺均分别为100um和20um。
图10显示了PDX-1P2代瘤体c-Met流式检测。图A为同型对照，图B为PDX-1P2代瘤体c-Met流式检测。
图11显示了c-Met-CAR-T以及共表达IL7/IL21的c-Met-CAR-T在胃癌体内的抗肿瘤活性。A.体内实验流程图；B.成瘤后第42天收获的小鼠肿瘤图片；C.成瘤后不同时间点肿瘤体积的折线图；D.成瘤后不同时间点小鼠体重的折线图；E.成瘤后42天摘取的肿瘤体积对比分析；F.成瘤后42天小鼠体重对比分析。折线图为平均值±SD(n≥3，*:p＜0.05，**:p＜0.01，***:p＜0.001，统计学分析采用学生t检验)。
图12显示了IL7-IL21-CAR-T细胞治疗后小鼠的心、肝、肺、肾进行HE染色。比例尺均分别为100μm和20μm。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中构建质粒所用到的引物如下表所示：
hIL7序列如SEQ ID NO：19所示。
hIL21序列如SEQ ID NO：20所示。
实施例1：特异性结合c-Met的抗体的制备
c-Met scFv序列调取研发流程如图1所示。
1.制备c-Met高表达细胞株及天然构象抗原
首先在基因人c-Met模板质粒(北京义翘神州科技股份有限公司；Cat:c-MET cDNAORF Clone in Cloning Vector,Human(HG10692-M))基础上将c-Met基因胞外段序列(hc-met)进行扩增，对抗原表达载体(华帜天成；Cat:hfc，mfc)进行酶切。而后通过Gibson组装体系(华帜天成；Cat:HZGB15-1)将扩增的hc-met基因分别与hfc和mfc载体连接，构建出hc-met抗原表达质粒(hc-met-hfc、hc-met-mfc)。在293T细胞中，应用hc-met抗原表达质粒通过三质粒慢病毒包装体系进行慢病毒包装，48h后收集、浓缩病毒；感染293T细胞，24h后用嘌呤霉素浓度为1ug/ml的完全培养基进行筛选，获得高表达细胞株，并用4％的多聚甲醛固定；将固定后的高表达细胞株冻存于-80℃，用于小鼠免疫。构建抗原表达质粒，将表达质粒瞬时转染至293F细胞，悬浮培养7天；收集细胞上清高速离心，利用蛋白A/G柱纯化上清，获得c-Met天然构象抗原，对其进行浓缩，AKATA纯化，BCA定量分装存储于-80℃，用于筛选抗体序列。
2.免疫小鼠阳性B细胞的富集及分离
采用腹腔注射方式，利用已制备的c-Met高表达细胞株免疫Balb/C小鼠(5-7周龄，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司)三次，免疫间隔为10天；免疫20天后，尾静脉取血，利用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中抗体效价；免疫30天后取小鼠脾脏，利用磁珠分选技术富集分离B淋巴细胞，基于微流体技术富集及分离表达高亲和力抗体的单个阳性B淋巴细胞。
3.筛选高亲和力和高特异性c-Met scFv
基于自主优化的单细胞反转录技术对单个阳性B细胞的mRNA进行反转录，结合巢式PCR、温度梯度PCR及降落PCR技术扩增B细胞的抗体可变区序列，并将抗体序列克隆至质粒，完成scFv文库的制备。采用慢病毒包装体系将上述c-Met抗体序列质粒包装进293T细胞中，从而获得c-Met单链抗体细胞展示库。基于流式细胞术检测手段及酶联免疫吸附测定法，分别筛选出c-Met的高亲和力、高特异性抗体序列9个，根据亲和力从大到小依次克隆号为2-2e-5、2-2b-7、2-2b-11、2-2a-11、1-1e-11、2-2a-7、1-1e-2、2-2e-2、2-2e-11(图2)。其中c-Met序列(克隆号：2-2e-5)的亲和力最高，为74.5％。其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
实施例2：靶向c-Met的CAR质粒的构建
嵌合抗原受体(CAR)由scFv抗体、人CD8的跨膜结构域、4-1BB共刺激信号分子和人CD3ζ信号传导结构域组成。在HZ-WQ012CAR质粒(pCDH-EF1α-hCAR-T2A-GFP)(华帜天成)基础上进行构建。采用c-Met scFv序列(克隆号：2-2e-5)、hIL7及hIL21序列，通过Gibson组装体系根据CAR构建模式图(图3)成功构建了c-Met-CAR、IL7-c-Met-CAR、IL21-c-Met-CAR、IL7-IL21-c-Met-CAR质粒。
首先，在HZ-WQ012质粒基础上，利用Gibson连接体系，分别构建pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL7-T2A-GFP、pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL21-T2A-GFP和pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL7-P2A-hIL21-T2A-GFP载体质粒。
其次，在pCDH-EF1α-hCAR-T2A-GFP质粒基础上，构建c-Met(scFv)-hCAR-T2A-GFP；在pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL7-T2A-GFP质粒基础上，构建c-Met(scFv)-hCAR-hIL7-T2A-GFP；在pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL21-T2A-GFP质粒基础上，构建c-Met(scFv)-hCAR-hIL21-T2A-GFP；在pCDH-EF1α-hCAR-F2A-hIL7-P2A-hIL21-T2A-GFP质粒基础上，构建c-Met(scFv)-hCAR-F2A-hIL7-P2A-hIL21-T2A-GFP。
实施例3：靶向c-Met的CAR质粒的验证
为了检验所构建CAR质粒的基因序列精确性。首先，我们根据c-Met-CAR、IL7-c-Met-CAR、IL21-c-Met-CAR、IL7-IL21-c-Met-CAR质粒结构设计测序引物，将鉴定成功的CAR质粒送北京擎科生物测序公司进行Sanger测序。获得测序序列后进行比对，挑选序列正确的克隆号。测序结果显示质粒编号1：c-Met-CAR、编号2：IL7-c-Met-CAR、编号3：IL21-c-Met-CAR、编号4:IL7-IL21-c-Met-CAR均完全正确。此外，将测序正确的c-Met-CAR质粒通过瞬时转染的方式转进293T细胞中，24小时后收集细胞，基于流式细胞术检测方法，验证c-Met-CAR质粒的表达(图4)。结果显示c-Met-CAR、IL7-c-Met-CAR、IL21-c-Met-CAR、IL7-IL21-c-Met-CAR质粒转染的293T细胞c-Met表达率达分别为73.1％、75.7％、64.5％、80.3％。
为了检测c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T的包装效率，将质粒与助转剂PEI(助转剂PEI如下制备：先配置A液和B液(根据每皿的量进行配置)，A:500ul OPTI-MEM混合10ug lentii-car,7.5ug PSPAX2,5ug PMD2.G；B:OPTI-MEM 500ul与PEI 60ul混合，RT 5min。将B加入A中，用吸管轻轻混合)加入到6x106个293FT细胞中进行包毒。包毒后48-60小时期间定情观察细胞状态，细胞状态变差时收集细胞培养的上清液，时间不超过60小时。收集的上清液置于1500g,4℃离心10min，使细胞碎片成球。将上清液转移至新的离心管中，加入上清液体积的1/3病毒浓缩液，混匀，而后置于4℃过夜；5)次日将混合液置于1500g,4℃离心，弃去上清液，而后用预冷PBS重悬沉淀，用1.5ml的离心管以100ul/管分装后置于-80℃保存备用。
将包装慢病毒的293FT细胞在培养48小时后进行荧光显微镜下观察，结果发现GFP在高倍镜下满视野表达(图5)。说明慢病毒包装效率尚可，质粒转染效率较高。
用滴度在5×107左右含CAR的慢病毒进行感染CAR-T细胞，具体步骤如下：1)设置慢病毒感染MOI值为10，所需要的病毒体积(ul)＝细胞数量×MOI÷病毒滴度(TU/ul)，把所需要的病毒和终浓度为1ul/ml的Polybrene混合到含IL-2的1640完全培养基中，室温静置5min；2)把激活后的T细胞按照1×106/ml的密度重悬到含慢病毒和Polybrene的培养基中。最后移至24孔板每孔500ul，置于1000g、32℃离心90分钟后置于细胞培养箱进行培养。
为了检测c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T细胞的感染效率，研究对上述CAR-T细胞通过流式细胞术检测蛋白L的表达来评估感染效率。结果发现上述CAR-T的感染效率稳定，均保持在80％左右(图6)。
实施例4：CAR-T细胞对胃癌细胞杀伤试验
为了检测c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T对胃癌细胞杀伤的c-Met靶向性，采用MET过表达慢病毒感染HGC-27细胞株，并采用嘌呤霉素对其进行了多次筛选，筛选的MET过表达的HGC-27细胞(HGC-27-OE)进行了c-Met流式检测，结果发现HGC-27-OE相较于HGC-27细胞胞外c-Met表达显著增高(1.59％VS84.8％)。研究结果表明HGC-27-OE可应用于上述CAR-T细胞肿瘤杀伤靶向性的验证。
CAR-T细胞(c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T)在感染后第10-12天分别与c-Met高表达的胃癌细胞株MKN45进行共培养以通过LDH试验检测其肿瘤杀伤活性。结果显示4种CAR-T细胞随着效靶比的升高肿瘤杀伤活性也随之升高，在10:1、20:1的效靶比情况下杀伤活性显著高于Normal-T细胞(p＜0.001)。其中在10：1、20:1的效靶比下IL7-c-Met-CAR-T肿瘤杀伤活性明显优于c-Met-CAR-T(p＝0.004,p＝0.021)；IL7-IL21-c-Met-CAR-T在20:1的效靶比下肿瘤杀伤活性显著优于c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T及IL21-c-Met-CAR-T细胞(p＜0.001,p＝0.021,p＝0.001)(图7A)。
为了验证上述CAR-T细胞对肿瘤c-Met抗原的靶向性，研究将上述CAR-T细胞与c-Met低表达的胃癌细胞株HGC-27共培养进行LDH细胞杀伤检测。结果显示普通-T细胞和上述CAR-T对HGC-27细胞的杀伤活性无统计学差异(p＞0.05)(图7B)。而后将上述CAR-T细胞与c-Met过表达的HGC-27细胞(HGC-27-OE)共培养检测细胞杀伤活性，结果发现上述CAR-T细胞杀伤活性与MKN45基本一致(图7C)。最后对HGC-27与HGC-27-OE采用不同的T细胞的杀伤活性进行对比，结果发现c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T对HGC-27-OE的杀伤活性在10:1、20:1的效靶比下均显著优于HGC-27细胞(p＜0.001)(图7D-H)。研究表明研究所构建的靶向c-Met的CAR-T细胞对于胃癌肿瘤的杀伤是依赖于c-Met的靶向性。
实施例5：CAR-T细胞与MKN45胃癌细胞株共培养的细胞因子检测
为了进一步探讨CAR-T细胞(c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T)杀伤肿瘤细胞的机制及作用，本研究对于上述CAR-T细胞与MKN45以10：1的效靶比共培养24小时后对上清液进行了细胞因子检测。结果显示四种CAR-T细胞INF-γ水平均显著高于普通-T细胞(p＜0.0001)。其次，IL7-IL21-c-Met-CAR-T分泌INF-γ水平高于c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T(p＜0.01)。最后还发现IL7-c-Met-CAR-T分泌INF-γ水平高于c-Met-CAR-T(p＜0.01)。IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T分泌TNF-β水平显著高于普通-T细胞(p＜0.0001)。其次，IL7-IL21-c-Met-CAR-T分泌TNF-β水平显著高于c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T(p＜0.0001)。研究还发现IL7-c-Met-CAR-T分泌INF-γ水平高于IL21-c-Met-CAR-T(p＜0.01)(图8A、B)。
为了检测共表达IL7/IL21 c-Met-CAR-T细胞白介素分泌水平，对上述共培养的上清液进行了IL-7、IL-21及IL-6检测。研究发现4种CAR-T分泌IL-7水平均显著高于普通-T细胞(p＜0.01)；IL7-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T分泌IL-7水平显著高于c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T(p＜0.01)。类似的发现也发生在IL-21的检测上，所有CAR-T细胞分泌IL-21水平显著高于普通-T细胞(p＜0.001)；IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T分泌IL-21水平显著高于c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T(p＜0.0001)。其次，研究发现c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T细胞IL-6的分泌水平均高于普通-T细胞的(p＜0.01)，然而CAR-T细胞间对比差异无统计学意义(p＞0.05)(图8C-E)。
实施例4和5的研究表明c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T对于肿瘤的杀伤是依赖c-Met靶向性的，随着效靶比的增高上述CAR-T细胞对肿瘤的杀伤活性也逐渐增高。IL7-IL21-c-Met-CAR-T有了IL7和IL21的协同调节作用使得肿瘤杀伤活性最强，然而并未增加细胞因子释放综合征的风险。对于实体瘤杀伤的持久性及浸润能力需要下一步体内试验来验证。
实施例6：c-MET高表达的胃癌PDX模型的构建
一般资料：
本研究纳入了兰州大学第二医院2021年8月－2022年6月行胃癌手术患者13例为PDX模型构建的胃癌组织供体。所纳入研究的男性患者12例，女性患者1例；平均年龄为60.5±2.1岁。所有患者均执行胃癌手术切除和淋巴结清扫术；所有患者术前病检均为低分化胃腺癌。
一般材料：
研究所用4周龄NCG小鼠，基因型：(Prkdc)ko/ko,(IL2rg雌)ko/ko,购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。饲养于兰州大学医学部GLP实验楼SPF级动物房。该研究得到了兰州大学第二临床医学院伦理委员会的批准。
试验方法：
(1)PDX F0模型的构建
1)患者的胃癌组织离体后放入盛有含抗生素的1640培养液的离心管中，置于冰盒中快速送达动物房(尽量缩短离体到移植的时间)；2)首先切2块直径约0.5cm的患者胃癌组织置于离心管中，一管加入甲醛固定以备病检；另一管组织切碎加入5倍体积的RNA later液4度过夜后移至-80度冰箱(组织任何一边厚度不能超过0.5cm)。对其余瘤体进行切割，切割成直径约1-2mm的组织块置于基质胶中；3)依次对NCG小鼠进行麻醉(0.3％戊巴比妥钠以0.1-0.2ml/10g剂量腹腔注射)，而后进行瘤体移植。两块组织移植1个部位，1只小鼠移植1个部位，移植部位为双侧腋下及双下肢内侧皮下。
(2)PDX模型的传代及保种
1)对荷瘤小鼠进行拍照；2)分别测量瘤体直径并记录；3)依次对荷瘤小鼠进行麻醉(0.3％戊巴比妥钠以0.1-0.2ml/10g剂量腹腔注射)，而后摘除瘤体。摘除的瘤体置于盛有含抗生素培养液的无菌培养皿中(底部放置冰袋)；4)留取3块直径约0.5cm的组织置于离心管中，一管加入甲醛固定以备病检；另一管加入RNA later液(组织切碎加入5倍体积的RNA later液4度过夜后移至-80度冰箱)，组织任何一边厚度不能超过0.5cm；还有一管置于离心管直接冻存；5)对无菌培养皿中摘除的瘤体进行切割，切割成直径约1-2mm的组织块；6)每两块组织移植1只小鼠一个部位，移植部位为双侧腋下及双下肢内侧皮下；7)剩余组织块每两块置入1.8ml冻存管(方便后期移植使用，一管恰好移植一只小鼠)，而后加入5倍体积的组织冻存液，最后置于-80度冰箱冻存备用。
构建成功的PDX模型c-Met表达的检测：
对患者胃癌PDX-1-P0-P2、PDX-2-P0代的小鼠移植瘤组织进行c-MET免疫组化染色，而后评估其表达。结果发现c-Met在PDX-1-P0代移植瘤为高表达(图9A)，而PDX-2-P0代为低表达(图9D)。而后对PDX-1-P1、PDX-1-P2代的移植瘤进行c-MET免疫组化检测，结果发现c-MET在PDX-1-P1、PDX-1-P2均为高表达(图9B、C)。这一结果也与两例患者肿瘤组织中c-Met的免疫组化检测结果一致(图9E、F)，患者1的肿瘤组织中c-Met为高表达，而患者2的肿瘤组织中c-Met低表达。
PDX-1P2代肿瘤模型c-Met流式细胞检测：
流式细胞术检测发现PDX-1P2代肿瘤表现为c-Met高表达，表达率为83.2％(图10)，表明PDX-1P2代肿瘤可用于靶向c-Met的CAR-T在体内进行肿瘤杀伤试验。
实施例7：c-Met-CAR-T以及共表达IL7/IL21的c-Met-CAR-T的体内肿瘤杀伤活性
实验方法
1)选用构建的c-Met高表达PDX-1P3代模型进行体内抗肿瘤实验。选择PDX-1P3代小鼠瘤体移植瘤对实验小鼠进行成瘤，选择一侧腋下进行肿瘤移植。切下的瘤体在1640培养基内浸泡并剪切为直径约2mm的组织块，每块组织移植一只小鼠。详细过程见第6张PDX模型的传代；2)测量肿瘤体积：在成瘤后的第7天开始记为d0开始称量小鼠体重。用游标卡尺对肿瘤长宽进行测量，肿瘤体积计算公式：V＝1/2×L×W2；3)实验分组：把小鼠分为5组(普通-T、c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T)。分别于d0、d7连续两次静脉注射5×106个效应细胞；4)观测流程：成瘤小鼠分别于d0、d7、d14、d21、d28、d35进行体重及肿瘤体积测量，于d35对小鼠进行拍照、处死后取下瘤体进行重量测量及拍照；5)手术取出小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃用4％的多聚甲醛固定，而后进行HE染色。
研究发现随着时间的延长，普通-T组的小鼠肿瘤增长速度最快，其他组依次是c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T(图11C)。此外，研究还发现随着时间延长只有普通-T组的小鼠体重是逐渐减轻的，c-Met-CAR-T组的小鼠体重趋于稳定，其他三组的小鼠体重均是增加的，以IL7-IL21-c-Met-CAR-T组最明显(图11D)。
此外，研究已成瘤后第42天的肿瘤体积和小鼠体重为参数，进行了组间对比分析。研究发现以IL7-IL21-c-Met-CAR-T组的肿瘤体积最小，与其他各组对比差异均存在统计学意义(p＜0.001)；所有CAR-T组的肿瘤体积均明显小于普通-T组，差异均有统计学意义(p＜0.001)；IL7-IL21-c-Met-CAR-T组肿瘤体积明显小于其他三组CAR-T细胞，差异均有统计学意义(p＜0.001)；IL7-c-Met-CAR-T组肿瘤体积明显小于c-Met-CAR-T和IL21-c-Met-CAR-T组，差异均有统计学意义(p＜0.001)；IL21-c-Met-CAR-T组肿瘤体积小于c-Met-CAR-T和，差异均有统计学意义(p＜0.05)(图11E)。体重对比后发现以IL7-IL21-c-Met-CAR-T组的小鼠体重最大，与其他各组对比差异均存在统计学意义(p＜0.01)；所有CAR-T组的小鼠体重均大于普通-T组，差异均有统计学意义(p＜0.05)；IL7-IL21-c-Met-CAR-T组小鼠体重明显大于其他三组CAR-T细胞，差异均有统计学意义(p＜0.01)；c-Met-CAR-T组、IL7-c-Met-CAR-T组及IL21-c-Met-CAR-T组小鼠体重对比差异无统计学意义(p＞0.05)(图11F)。
实施例8：靶向肿瘤外重要脏器的细胞毒性
IL7-IL21-c-Met-CAR-T在对荷瘤小鼠进行治疗后重要脏器(心、肝、肺、肾)的组织形态学对比发现上述CAR-T细胞在肿瘤杀伤过程中并未对正常重要脏器产生严重的靶向肿瘤外的细胞毒性(图12)。
综上所述，实施例6-8通过移植患者胃癌组织标本，构建了c-MET高表达的胃癌PDX模型，并从组织形态及分子特征对构建的PDX模型进行了溯源，结果表明构建成功的PDX模型可以应用于靶向c-MET抗肿瘤药物在胃癌的临床前研究。构建的c-Met-CAR-T、IL7-c-Met-CAR-T、IL21-c-Met-CAR-T、IL7-IL21-c-Met-CAR-T在胃癌PDX模型均产生了明显的肿瘤杀伤疗效。其中以IL7-IL21-c-Met-CAR-T的肿瘤杀伤疗效为最优。说明基因构建的IL-7和IL-21对促进CAR-T细胞增殖具有协同作用。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施方案做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种特异性结合c-Met的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：4所示的重链可变区和如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区，
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或di-scFv，
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为scFv，
优选地，所述抗体或其抗原结合片段还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头，
优选地，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
3.一种嵌合抗原受体，其包含c-Met抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，
其中所述c-Met抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中所述c-Met抗原结合结构域包含如SEQ IDNO：4所示的重链可变区和如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区，
优选地，所述c-Met抗原结合结构域还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头，
优选地，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，
优选地，所述c-Met抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，
优选地，所述跨膜结构域具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，
优选地，所述胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激信号分子和人CD3ζ信号传导结构域，
优选地，所述4-1BB共刺激信号分子具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，
优选地，所述人CD3ζ信号传导结构域具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，
优选地，所述嵌合抗原受体还包含连接所述c-Met抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区，
优选地，所述铰链区具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，
优选地，所述嵌合抗原受体在其N端还包含信号肽，
优选地，所述信号肽具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，
优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，
优选地，所述嵌合抗原受体在其C端还包含hIL7和hIL21的氨基酸序列，
优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。
5.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求3-4中任一项所述的嵌合抗原受体。
6.一种表达载体，其包含根据权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的表达载体，
优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞，
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞或其任意组合。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的表达载体或根据权利要求7所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的表达载体或根据权利要求7所述的宿主细胞。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求3-4中任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的表达载体、根据权利要求7中任一项所述的宿主细胞、根据权利要求8所述的药物组合物或根据权利要求9所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗过表达c-MET的癌症的药物中的用途，
优选地，所述癌症包括胃癌。
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