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CN116554126B - 一种靶向降解cdk6的化合物及应用 - Google Patents

一种靶向降解cdk6的化合物及应用 Download PDF

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CN116554126B CN202310415281.6A CN202310415281A CN116554126B CN 116554126 B CN116554126 B CN 116554126B CN 202310415281 A CN202310415281 A CN 202310415281A CN 116554126 B CN116554126 B CN 116554126B
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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种靶向降解CDK6的化合物及应用。本发明首先提供了式(I)所示的靶向降解CDK6的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物抑制CDK6下游蛋白的表达，阻断细胞周期在G0/G1期，诱导细胞凋亡，可作为CDK6的抑制剂，用于抗肿瘤药物的制备；其次，本发明还对上述化合物进行了PROTAC修饰改性，获得了一种PROTAC化合物，作为CDK6的降解剂，进一步提高了CDK6的降解活性，进而促进肿瘤细胞的凋亡，有潜力成为治疗肿瘤的有效治疗方式。

Description

一种靶向降解CDK6的化合物及应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种靶向降解CDK6的化合物及应用。
背景技术
目前，临床上广泛使用的抗癌药物大多是各种类型的小分子抑制剂类化合物。临床上使用的小分子抑制剂主要包括铂类药物、氟尿嘧啶、伊立替康、紫杉醇和其他药物。然而，小分子抑制剂的作用机制大多是占据或阻断蛋白质的“活性位点”(如对蛋白激酶ATP结合位点的竞争性抑制和代谢性抑制)，通常只有当90％以上的靶蛋白与抑制剂结合时才能达到药物相关的抑制作用，因此必须大剂量给药才能达到疗效。而在这期间，小分子抑制剂很难区分肿瘤细胞和快速分裂的非恶性细胞，导致严重的毒副作用。此外，尽管人类蛋白质组中已经确定了许多治疗目标，但仍有80％以上的蛋白质无法作为小分子靶点(如转录因子、支架蛋白等)，被称为“不可药用”的蛋白质。最常见的原因是许多蛋白质没有“活性位点”，所以小分子药物更不可能发挥抑制作用，这也是小分子抑制剂的开发越来越受限制的原因之一。然而，以蛋白酶为靶点的嵌合体(PROTACs)可以较好地避免这些问题。
PROTACs由三部分组成，①靶蛋白(Protein of interest，POI)结合配体、②E3泛素连酶的招募配体、③连接前两者的Linker，将E3连接酶招募到目标蛋白表面，利用生物体固有的泛素化过程将蛋白靶向降解。由于PROTACs招募E3泛素连接酶，而E3泛素连接酶又对靶蛋白进行泛素化，所以靶蛋白的降解是一个“瞬时过程”，因此可以作为催化剂，在低浓度下对靶蛋白进行不间断的重复降解，从而实现低浓度下靶蛋白的循环和高效降解。而且PROTACs可以大大扩展目标蛋白的范围，不需要像过去小分子抑制剂那样有“活性位点”，只要小分子能与目标蛋白中合适的“裂隙”或特定结构结合，无论它是否是“活性位点”。小分子可以招募E3泛素配体，不管它是否是“活性位点”。E3泛素配体可以被招募，利用泛素-蛋白体系统降解目标蛋白。由于PROTACs技术具有针对非药物形成的蛋白质、低剂量催化和高性能的独特优势，它已成为越来越受欢迎的研究活动。然而，现有PROTACs的发现主要是通过对现有靶向抑制剂的修改来实现的。对大量的“不可药用”的蛋白质和没有明确靶向抑制剂的蛋白质的探索是有限的，所以需要一个合适的方法来尝试探索它们。利用虚拟组合化学数据库对目标蛋白进行虚拟筛选是值得考虑的方法之一。
利用虚拟组合化学建立“REAL”数据库来发现靶向小分子抑制剂是一种新兴的、有前途的方法，它利用计算机建立一个非常大的、现实的虚拟组合化学数据库，对靶向蛋白进行虚拟筛选。这种方法已经导致发现了pM级别的活性小分子。这种方法比使用公共数据库的虚拟筛选方法更加真实合理，因为：第一，数据库中的分子往往是由现有的小分子块通过固定的化学反应线构建而成。其次，可以虚拟组合成新的分子组合的不同分子块的数量非常大，这比现有的数据库具有更广泛的潜力。因此，将这种方法应用于PROTACs的发现可能是有价值的。
本发明提供了一种潜在的环蛋白依赖性激酶6(CDK6)靶向抑制剂，所述化合物抑制CDK6下游蛋白的表达，阻断细胞周期在G0/G1期，诱导细胞凋亡；并且用PROTAC对化合物10进行修饰，获得了一种靶向CDK6降解剂PROTAC化合物，进一步提高了CDK6的降解活性，进而促进肿瘤细胞的凋亡，有潜力成为治疗肿瘤的有效治疗方式。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种潜在的环蛋白依赖性激酶6(CDK6)靶向抑制剂及应用，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种靶向抑制CDK6的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物的结构式如下式(I)所示：
其中，所述R1选自
所述R2选自
所述R3选自-CH2CCH、-CH2CHCH2、-CH2CH2CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)2，或R3表示-CH2CH2-与式(I)中R3取代处的C形成三元环。
优选地，所述化合物的结构式如下任一所示：
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备CDK6抑制剂中的应用。
第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种靶向降解CDK6的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，所述PROTAC化合物由上述第一方面所述的化合物经E3连接酶的配体分子修饰获得。
优选地，所述E3连接酶的配体分子与上述第一方面所述的化合物经过Linker连接获得。
优选地，所述E3连接酶的配体分子包括如下结构：
优选地，所述PROTAC化合物的结构式如下式(Ⅱ)所示：
其中，所R4为-CH2CCH或-CH2CH2CH(CH3)2；
所述Linker Rn包括如下结构：
优选地，所述PROTAC化合物的结构式如下任一所示：
第五方面，本发明提供了一种上述第四方面所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备CDK6降解剂中的应用。
第六方面，本发明提供了一种上述第四方面所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括上述第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，和/或上述第三方面所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或其组合。
本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种潜在的环蛋白依赖性激酶6(CDK6)靶向抑制剂化合物，所述化合物抑制CDK6下游蛋白的表达，阻断细胞周期在G0/G1期，诱导细胞凋亡，可作为CDK6的抑制剂，用于抗肿瘤药物的制备；其次，本发明用PROTAC对上述化合物进行修饰，获得了一种PROTAC化合物，所述PROTAC化合物靶向降解CDK6，作为CDK6的降解剂，进一步提高了CDK6的降解活性，进而促进肿瘤细胞的凋亡，有潜力成为治疗肿瘤的有效治疗方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1实验研究过程；其中A为CCSMD的主要构建过程；B为利用CCSMD对CDK6进行虚拟筛选并获得待合成的分子的过程；C为在虚拟筛选结果中的最佳活性化合物10的基础上进行结构优化以及PROTAC修饰的过程；
图2化合物10的生物活性评估；其中A为细胞周期检测结果；B蛋白水平检测结果；C用Hoechst/PI双染色来检测细胞凋亡或坏死结果；D为用FITC-Annexin V和PI双染色检测细胞凋亡结果；
图3基于化合物10的结构优化；其中A为该化合物被分为三个部分I，II和III，用于结构优化；B为每个化合物的结构和合成过程；
图4化合物2f的生物活性评估；其中A为化合物2f对胃癌AGS以及正常细胞GES-1的细胞毒性试验；B为细胞周期检测结果；C蛋白水平检测结果；D为细胞凋亡或坏死检测结果；E为用FITC-Annexin V和PI双染色来检测凋亡结果；
图5化合物10的PROTAC修饰；其中A为化合物10与CDK6蛋白的对接结；B为化合物10的PROTAC修饰过程；
图6 10-PROTAC的生物活性评估；其中A为10-PROTAC对胃癌AGS以及正常细胞GES-1的细胞毒性实验；B为细胞周期检测结果；C为蛋白水平检测结果；
图7化合物2f的PROTAC修饰和生物活性评估；其中A为用PROTAC修饰2f，并用不同长度的连接子代替，并检测每个化合物对AGS细胞的IC50s；B为2f-PROTAC对胃癌AGS以及正常细胞GES-1的细胞毒性检测；C为细胞周期检测结果；D为蛋白水平检测结果；
图8 2f-PROTAC的小鼠急性毒性实验；其中A为KM小鼠试验期间体重增量变化；B为KM小鼠的心肝脾肺肾的HE染色切片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中所述的实验方法如下：
(1)细胞培养
AGS胃癌细胞购自ATCC(LOT:70012225，Manassas，VA)，GES-1正常胃粘膜细胞为实验室拥有的细胞。AGS和GES-1在HyClone公司的RPMI培养基1640中生长。所有培养基都补充了10％的热灭活胎牛血清(Biological Industries，美国)和100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素(Solarbio，中国)。
(2)细胞抗增殖试验
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)来确定筛选分子对AGS细胞的生长抑制作用。细胞被安置在96孔板中，细胞数为10,000个/100μL/孔。24H后，用新鲜培养基中的化合物处理细胞。48小时后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，除去培养基，加入100μL DMSO作为裂解液，然后在摇晃孔后在490nm处测量吸收率。
(3)Hoechst/PI荧光染色实验
将培养的AGS细胞接种在12孔板中，每孔5万个细胞。培养24h后，吸出原培养基，加入含有适当浓度化合物的培养基进行48h培养，用胰蛋白酶消化，离心收集。在每个样品中加入5μL Hoechst染色液和5μL PI染色液，混合均匀后在冰浴中孵育30min，调整流式细胞仪(NovoCyte Quanteon)的相应参数，收集10000个细胞并结束检测，记录数据并使用NovoExpress软件进行分析。
(4)细胞凋亡实验
将AGS细胞接种于六孔板，每孔3×105个细胞，培养24h。吸出原始培养基，加入含有相应浓度化合物的培养基进行48h的培养。培养结束后，每孔加入1mL不含EDTA的胰蛋白酶来消化细胞。将细胞收集在PBS缓冲液中，以1200rpm离心5分钟，弃去上清液。用细胞凋亡检测试剂盒中的Binding缓冲液重悬细胞(200μL)，然后吸出100μL细胞悬液到流管中，加入5μLFITC-Annexin V染色液，室温下避光孵育10min，加载前每管加入10μL PI染色液以及400μL的PBS缓冲液。调整流式细胞仪(NovoCyte Quanteon)的相应参数，收集10000个细胞并结束检测，记录数据并使用NovoExpress软件进行分析。
(5)细胞周期分析
将AGS细胞接种在六孔板中，每孔6×105个细胞，培养24h。吸出原始培养基，加入含有相应浓度化合物的培养基，培养48h。通过胰蛋白酶消化收集AGS细胞，用预先冷却的PBS溶液清洗，并将其留在离心管中，加入300μL的PBS，与350μL的无水乙醇分两次混合，在4℃下固定过夜。固定后，以2000rpm离心8min，弃去上清液，将细胞重新悬浮在预冷的PBS溶液中，并清洗以除去残留的固定剂。将细胞重新悬浮在100μL的RNase中，并在37℃下孵育30min。将悬浮液转移到离心管中，用400μL的碘化丙啶染色液进行染色。最后，调整流式细胞仪(NovoCyte Quanteon)的相应参数，收集20000个细胞并结束检测，记录数据并使用NovoExpress软件进行分析。
(6)免疫印迹检测
细胞培养：取对数生长期的AGS细胞，以6×105个细胞/孔的细胞密度播种在六孔板中，有阴性对照组(DMSO)和给药组(本申请所述的化合物，包括了2μM化合物10组、1μM化合物2f组等)。细胞在培养箱中培养24h，让其粘附在壁上。
给药：根据实验计划，在RPMI培养基中制备适当浓度的药物(本申请所述的化合物，例如化合物10)，继续培养48h。
蛋白质提取：用胰蛋白酶消化的孔中的细胞用预先冷却的培养基收集，以1500rpm离心5min，弃去上清液。将细胞与含有1％蛋白磷酸酶和1％PMSF的预冷RIPA裂解液混合并悬浮，以分散细胞并使其与裂解液充分接触。将细胞悬液转移到1.5mL的离心管中，在冰上裂解40min，每隔十分钟翻动离心管以重新悬浮细胞。裂解后，以12,000rpm离心15min，用移液器吸头小心地除去管中的单宁，并吸出2μL十倍稀释的PBS中的总蛋白悬浮液，按照BCA定量试剂盒的程序加入96孔板中进行蛋白定量检测。在剩余的总蛋白悬浮液中加入适量的蛋白加载缓冲液，在金属浴中使蛋白变性(100℃，10分钟)。变性后的蛋白质样品保存在-80℃的冰箱中，用于后续实验。
每个泳道加入30μg的总蛋白，用稀释的蛋白加载缓冲液将每组的体积调整到相同水平，用彩虹245广谱蛋白标记物表示蛋白分布。在60V的恒定压力下进行45min的电泳，使前缘指示剂运行到浓缩凝胶和分离凝胶的边界，然后在12V的恒定压力下进行90min的电泳，用湿法转移膜，300mA，120min。在恒定电流下转移膜120min，转移过程中保持冰浴。将清洗过的PVDF膜按照目标蛋白的大小进行切割，并浸泡在通过抗体稀释(稀释比例1:1000)制备的初级抗体中。在4℃的冰箱中孵育过夜。孵化后，用TBST清洗PVDF膜(3×10min)，然后用抗体稀释液制备的二抗(稀释比1：5000)孵化120min。孵化后，用TBST清洗PVDF膜表面残留的第二抗体(3×10min)。沥干PVDF表面的TBST溶液后，滴加制备的ECL发光液，使其全面覆盖膜，将膜放入曝光仪进行曝光并导出拍照，用Image J软件对目标条带进行灰度分析。
(7)虚拟筛选和对接
以人环蛋白依赖性激酶6(CDK6)和Palbociclib(PDB：5L2I)的晶体结构作为目标蛋白结构，选择完全包裹配体的方框作为对接部位。选择开源的分子对接软件Autodockvina进行对接。对接结果由Chimera 1.14可视化工具进行直观检查。
(8)统计学分析
所有结果以平均值±标准差表示，数据由SPSS22.0分析。
(9)急性毒性实验
选择小鼠标准体重范围内的KM小鼠雌鼠12只，将其分为两组，每组六只。将所有小鼠禁食不禁水24h后称重并记录体重，按照体重以1000mg/kg的剂量通过灌胃的方式给药。给药后，恢复供食，每天观察所有的小鼠的活动状态、称重以及外观性状并记录，14天后，将所有的小鼠进行处死，并取心肝脾肺肾，用无菌生理盐水清洗过后，放入4％的多聚甲醛中，处理48h。之后进行HE染色切片，并使用显微镜进行拍照，观察小鼠器官是否存在明显的损伤。
本申请实施例中所涉及的化合物具体结构如下所示：
实施例1化合物10的活性研究
化合物10是通过使用自建数据库进行虚拟筛选得到的，并作为靶向CDK6降解的基础。在早前的研究中(http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.4239455)，我们通过搜索各种类型的分子块，使用Rkit进行基于简单化学反应的虚拟组合，并去除不靠谱的分子，得到了一个组合化学小分子数据库(CCSMD)(图1中A所示)。之后，在Linux平台上使用Autodock vina对CCSMD和CDK6进行了虚拟筛选，并对所有得分的分子进行了排名，选择了得分最高的100个分子进行人工验证，最终选择了13个分子进行合成(图1中B所示)，其中化合物10是最活跃的分子。在此基础上，我们对化合物10进行了PROTAC修改、结构优化和结构优化后的PROTAC(图1中C所示)。
1.化合物10的合成
将原料(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊-4-炔酸(50.0毫克，0.149毫摩尔)加入5毫升氯化亚砜中，在75℃搅拌2小时。然后减压浓缩体系，直到产生白色固体，得到中间体(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-氯-1-氧代-4-炔-2-基)氨基甲酸酯，将其加入到THF中，然后将原料4-氯-2,5-二甲基苯胺(23.1毫克，0.148毫摩尔)和DIPEA(77.0毫克，0.596毫摩尔)加入到THF，在冰浴条件下搅拌3小时。之后，减压浓缩体系，残余物通过硅胶柱色谱法提纯，产品用石油醚/乙酸乙酯(4:1)提纯，得到白色固体化合物10(46.5毫克，产率66％)。
化合物10：产量，66％；白色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),7.85(d,J＝7.5Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝7.4Hz,2H),7.37(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(s,1H),7.30–7.24(m,2H),7.23(s,1H),4.36(q,J＝7.4Hz,1H),4.28(t,J＝7.1Hz,2H),4.20(t,J＝6.9Hz,1H),2.90(s,1H),2.58(qd,J＝17.6,16.4,7.0Hz,2H),2.22(s,3H),2.10(s,3H)。
2.化合物10诱导细胞凋亡，阻止细胞处于G0/G1期，并引起Phospho-Rb的下调
用上述合成的化合物10对AGS处理48小时后进行细胞周期检测以及CDK6和CDK6下游蛋白的检测。结果发现，化合物10阻断了G0/G1期的AGS，下调了S期(图2中A所示)；并且对CDK6蛋白的表达没有明显影响，但可以使CDK6介导的下游蛋白Rb的磷酸化明显受阻(图2中B所示)，这都与CDK6抑制剂的性能相一致；除此之外化合物10还可以诱导细胞凋亡，并且主要表现在细胞凋亡的晚期阶段(图2中C和D所示)。
根据上述实验结果，上述合成的化合物10可能是一种有效的CDK6抑制剂。
实施例2化合物10的结构优化及活性检测
将化合物10根据结构分为三个部分，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(图3中A所示)；通过用不同的结构替换这三部分，进行结构优化；合成过程如图3中B所示。
化合物1a-1e和2a-2f合成过程类似(区别在于Ⅰ、Ⅱ部分结构不同，参见图3中B所示)，本实施例以化合物2f为例，进行合成，具体如下：
将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-5-甲基-L-正亮氨酸(135.2mg，0.368mmol)与HATU(154.0mg，0.405mmol)置于50mL圆底烧瓶，加入15mL的二氯甲烷以及1mL的DIPEA，搅拌一个小时后体系澄清，再加入6-溴-2-氨基萘(85.9mg，0.405mmol)，搅拌过夜，随着反应的完成，产品会慢慢析出，等待反应完成后，使用旋转蒸发仪蒸干体系，加入30mL乙酸乙酯溶解体系，使用饱和氯化铵溶液萃取有机相三次，之后再以饱和氯化钠溶液萃取有机相三次。之后用无水硫酸钠干燥有机相，将乙酸乙酯蒸干后收集粗品，使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，将所有的纯品收集后称重，得到淡黄色固体140.8mg，产率为63.8％，将产品放置4℃保存。
化合物2f；产率63.8％；白色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.31(s,1H),8.31(d,J＝2.0Hz,1H),8.07(d,J＝2.0Hz,1H),7.83(t,J＝8.8Hz,3H),7.76(d,J＝8.9Hz,1H),7.74–7.67(m,2H),7.62(dd,J＝8.9,2.1Hz,1H),7.53(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),7.37(tdd,J＝7.5,3.4,1.2Hz,2H),7.28(tt,J＝7.4,1.4Hz,2H),4.23(tq,J＝14.1,7.2Hz,3H),4.12(td,J＝8.6,8.1,4.0Hz,1H),2.64(s,1H),1.17(d,J＝6.7Hz,5H),0.82(dd,J＝6.6,1.7Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ172.21,156.68,144.42,144.32,141.25,137.64,132.50,131.39,130.11,129.87,128.19,127.59,125.89,121.58,120.66,118.02,115.69,66.18,56.31,47.17,35.27,30.32,27.90,23.10,22.90.MS-ESI m/z:calcd for C32H31BrN2O3[M+Na]+:593.1416；found:593.1387.
化合物3a-3c的合成过程类似(区别在于Ⅲ部分结构不同，参见图3中B所示)，本实施例以化合物3a为例，进行合成，具体如下：
3-(9H-咔唑-9-基)丙酸的合成：将咔唑(1.3264g，7.939mmol)、氢氧化钠(0.6351g，15.878mmol)、3-溴丙酸乙酯(1.6416g，8.733mmol)与10mLDMF置于50mL烧杯内，使用格式兰微波炉，高火反应5min，反应后加100mL水，溶解反应体系，使用盐酸将pH调节为pH＝1，产品逐渐析出，过滤体系，获得产品1.3534g，产率71.3％。
(S)-2-氨基-N-(6-溴萘-2-基)戊-4-炔酰胺的合成：将化合物10(129.1mg，0.240mmol)溶于10mL四氢呋喃中，加入1mL二乙胺，室温搅拌3小时后，将反应体系蒸干，使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝1：2，将所有的纯品收集后称重，得到淡黄色固体44.8mg，产率为59.1％，将产品放置4℃冰箱保存。
化合物3a的合成：将3-(9H-咔唑-9-基)丙酸(33.9mg，0.142mmol)与HATU(59.3mg，0.155mmol)置于50mL圆底烧瓶，加入15mL的二氯甲烷以及1mL的DIPEA，搅拌一个小时后体系澄清，再加入(S)-2-氨基-N-(6-溴萘-2-基)戊-4-炔酰胺(44.8mg，0.142mmol)，搅拌过夜，待反应完成后，使用旋转蒸发仪蒸干体系，加入30mL乙酸乙酯溶解体系，使用饱和氯化铵溶液萃取有机相三次，再使用饱和氯化钠溶液萃取有机相三次。之后用无水硫酸钠干燥有机相，将乙酸乙酯蒸干后收集粗品，使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝2：1，将所有的纯品收集后称重，得到淡黄色固体55.4mg，产率为72.7％，将产品放置4℃冰箱保存。
化合物3a；最终产率42.9％；淡黄色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.25(d,J＝2.0Hz,1H),8.13–8.05(m,3H),7.83(d,J＝8.9Hz,1H),7.76(d,J＝8.8Hz,1H),7.56(qd,J＝8.8,8.0,2.0Hz,4H),7.38(ddd,J＝8.3,7.1,1.2Hz,2H),7.13(t,J＝7.4Hz,2H),4.58(td,J＝7.2,3.3Hz,3H),3.28(s,1H),2.81–2.76(m,1H),2.73–2.59(m,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ170.82,169.54,140.24,137.30,132.40,131.51,130.15,129.91,129.88,128.25,126.18,122.68,121.66,120.75,119.33,118.17,116.01,109.89,80.62,73.85,53.03,40.68,35.12,22.29.MS-ESI m/z:calcd forC30H24BrN3O2[M+Na]+:560.0590；found:560.0924.
本实施虽然以化合物2f和化合物3a为例进行了合成，但是本申请所述的化合物1a-1e、2a-2f以及3a-3c合成化合物的结构都得到了验证，并研究了所有化合物对AGS的抑制作用，验证结果见表1。
表1所有化合物对AGS的IC50
化合物 IC50(μM) 化合物 IC50(μM) 化合物 IC50(μM)
10 1.16±0.14 1a 13.62±0.48 1b 9.12±1.65
1c 19.21±1.67 1d 2.03±0.18 1e 16.51±0.46
2a 1.46±0.47 2b 0.73±0.01 2c 3.83±0.01
2d 0.57±0.08 2e 1.37±0.19 2f 0.56±0.06
3a 0.76±0.12 3b 0.92±0.29 3c 1.85±0.03
总结上述实验结果，发现在Ⅰ区由小到大的基团取代显示，过大的基团可能会降低活性，加入N原子不会明显增加活性，加入卤素有较高的活性增加，而非极性基团则导致活性降低。在Ⅱ区加入较大的非极性基团，活性有较明显的增加，而极性基团则显示活性降低；对于Ⅲ区基团的修饰，发现较大的基团更有活性。而本申请实施所述的化合物1a-1e、2a-2f以及3a-3c对AGS均具有良好的抑制活性，其中化合物2f的抗肿瘤活性最佳。
实施例3化合物2f下调磷酸化的Rb，将细胞组织在G0/G1期，并在晚期凋亡期诱导细胞凋亡
对实施例2中获得化合物2f的细胞毒性抑制进行了评估，发现在相同浓度下，化合物2f对AGS有明显的抑制作用，但对GES-1没有抑制作用(图4中A所示)；浓度为8μM的化合物2f能抑制细胞周期在G0/G1期的停滞(图4中B所示)；在蛋白质水平上检测，发现浓度为1μM的化合物2f能明显下调CDK6下游蛋白Rb的磷酸化，但对Rb的蛋白质浓度和CDK6浓度没有明显影响(图4中C所示)，这些结果都与CDK6抑制剂的性能一致。另外，还发现化合物2f可以诱导细胞凋亡，而且凋亡主要表现在细胞凋亡的晚期阶段(图4中D和E所示)。
通过以上实验发现，本申请所述的化合物2f的生物活性表现与CDK6抑制剂一致，为CDK6抑制剂。
实施例4化合物10的PROTACs修饰
从化合物10与CDK6的对接结果可以看出(图5中A所示)，化合物10的萘环部分暴露在蛋白袋的外侧。因此，通过用羧基取代溴原子来修饰这部分，然后在这个羧基上进行酰胺缩合来连接E3泛素配体，修饰后的主要合成路线见图5中B所示。合成路线完成后，进行生物活性评价，发现其具有一定的活性，因此这个分子被用来进行下一步的生物活性评估。
1.10-PROTAC的合成
10-酸的合成：将原料(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊-4-炔酸(167.2mg，0.499mmol)倒入50mL圆底烧瓶内，加入5mL氯化亚砜再加入20μL的DMF(催化量)，于室温条件下搅拌一小时，使用旋蒸除去氯化亚砜，得到淡黄色固体，然后加入溶解6-氨基-2-萘酸(88.6mg，0.474mmol)的10mLTHF，冰浴搅拌两个小时后，加入1mL甲醇，猝灭反应，再将体系蒸干，加入50ml乙酸乙酯溶解体系，使用饱和氯化铵溶液萃取有机相三次，再使用饱和氯化钠溶液萃取有机相三次。之后用无水硫酸钠干燥有机相，将乙酸乙酯蒸干后收集粗品，使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝1000：200，每100mL的展开剂中添加0.1mL的乙酸，将所有的纯品收集后称重，得到淡黄色固体134.3mg，产率为50.1％，将产品放置4℃冰箱保存。
ELB8的合成：将N-Boc-1,6-己二胺(375.0mg，1.528mmoL)、2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮(383.8mg，1.389mmoL)以及1mL的DIPEA混合于50mL圆底烧瓶，加入15mL的1，4-二氧六环溶解，在90摄氏度的条件下搅拌12小时，体系在搅拌过程中逐渐产生黄绿色荧光的产品。反应结束后，使用旋转蒸发仪将体系蒸干，加入乙酸乙酯50mL溶解，使用饱和氯化铵溶液以及饱和氯化钠溶液分别萃取有机相三次，之后使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝1:1，将所有纯品收集后，使用旋转蒸发仪蒸干，获得纯品434.3mg，产率为66.2％。纯品为黄绿色油状液体，365nm波长处显黄绿色荧光。
ELN8的合成：将ELB8(434.3mg，0.919mmoL)溶于10mL二氯甲烷以及1mL三氟乙酸中，室温搅拌两个小时，使用旋转蒸发仪将体系蒸干，之后直接使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为二氯甲烷：甲醇＝10:1，每100mL的展开剂加入1mL的三乙胺，将所有的纯品收集浓缩后，获得纯品253.7mg，产率为66.2％。纯品为粘稠液体，将纯品放置4℃保存。
化合物10PL8的合成：将10-酸(80.3mg，0.159mmoL)、ELN8(65.2mg，0.175mmoL)、HATU(66.6mg，0.175mmoL)以及1mL的DIPEA混合于50mL圆底烧瓶，并加入2mL的DMF以及15mLTHF的，于室温条件下搅拌过夜，反应结束后，使用旋转蒸发仪蒸去THF，之后再加入50ml乙酸乙酯溶解体系，分别使用饱和氯化铵溶液萃取以及饱和氯化钠溶液萃取体系三次。之后用无水硫酸钠干燥有机相，将乙酸乙酯蒸干后收集粗品，使用柱层析色谱纯化粗品，使用的展开剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝1:3，将所有的纯品收集后称重，得到黄绿色固体55.9mg，产率为39.4％，将产品放置4℃保存。
化合物10PL8；最终产率为19.73％；黄绿色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),10.43(s,1H),8.50(q,J＝5.1,4.6Hz,1H),8.32(d,J＝2.8Hz,2H),7.92(d,J＝8.8Hz,1H),7.86(d,J＝3.6Hz,2H),7.84(s,3H),7.71(d,J＝7.4Hz,2H),7.64(td,J＝9.6,8.9,7.3Hz,2H),7.52(dd,J＝8.5,7.0Hz,1H),7.37(td,J＝7.5,2.5Hz,2H),7.29(td,J＝7.4,3.6Hz,2H),6.97(d,J＝7.1Hz,1H),6.49(t,J＝5.9Hz,1H),5.00(dd,J＝13.0,5.3Hz,2H),4.43–4.31(m,1H),4.31–4.17(m,3H),3.49(t,J＝7.1Hz,1H),3.27–3.22(m,4H),2.89(d,J＝2.8Hz,1H),1.72(s,1H),1.56–1.51(m,3H),1.37–1.33(m,4H),1.23(d,J＝5.6Hz,2H),1.19(d,J＝4.4Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ173.35,170.65,170.09,169.49,167.85,166.66,156.45,146.97,144.32,141.26,136.81,135.11,132.74,131.37,130.08,129.41,128.19,127.82,127.64,127.60,125.87,125.84,125.27,120.66,117.71,115.64,110.90,109.56,103.58,73.76,73.74,66.57,66.36,55.02,49.07,47.15,42.34,32.37,31.52,29.66,29.20,26.80,26.64,22.69.MS-ESI m/z:calcd for C50H46N6O8[M+Na]+:811.3275；found:811.3251.
对于化合物10的PROTAC修饰，由于羰基和溴原子都属于极性较强的基团，所以使用羧酸基团进行取代，这不会对极性产生太大的改变。化合物10PL8是最好的活性PROTAC分子，它的Linker最佳长度接近于以前研究的最佳长度。化合物10PL8可以降解CDK6，下调磷酸化的Rb，将细胞阻断在G0/G1期。
对化合物10PL8化合物进行了细胞周期试验，发现该化合物在WB中的浓度为50μM时能明显阻断G0/G1期的AGS细胞，但对GES-1的抑制作用较弱(图6中A所示)，其对AGS细胞的IC50为35.30±1.84μM；化合物10PL8能明显降解CDK6，并对磷酸化的Rb有明显的下调作用，化合物10PL8对CDK6的DC50为26.67±5.09μM(图6中B所示)；为了验证化合物10PL8对CDK6的下调是否受是化合物10PL8的影响，而不是化合物10或E3泛素配体的干扰。结果发现，无论是单独的化合物10还是单独的E3泛素连接酶配体都没有引起CDK6的下调，进一步证实了化合物10PL8降解了CDK6(图6中C所示)；化合物10PL8将细胞阻断在G0/G1期，而且化合物10PL8明显下调了CDK6，上述结果与CDK6降解剂的性能一致。因此，可以判断本申请所述的化合物10PL8是一种CDK6的降解剂。
实施例5化合物2f的PROTACs修饰
1.2f-PROTAC的合成
使用与10-PROTAC相同的合成路线，合成了三个PROTAC分子(化合物2fPL6、2fPL8以及2fPL10)，并测量了上述三个PROTAC分子对AGS的IC50(如图7中A所示)，结果表明，本申请所述的化合物2fPL6、2fPL8以及2fPL10对AGS均具有良好的抑制活性。
其中，化合物2fPL6、2fPL8以及2fPL10的合成过程类似于化合物10-PROTAC的合成过程，因此部分合成过程主要参考10-PROTAC的合成。
化合物2fPL6；产率33.8％；黄绿色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),10.32(s,1H),8.57(d,J＝5.6Hz,1H),8.31(d,J＝5.0Hz,1H),7.99–7.78(m,5H),7.68(dt,J＝23.1,8.0Hz,4H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.36(td,J＝7.5,4.2Hz,2H),7.29(d,J＝7.7Hz,2H),7.07(d,J＝8.6Hz,1H),6.96(d,J＝6.9Hz,1H),6.53(s,1H),5.00(dd,J＝12.8,5.2Hz,1H),4.37–4.04(m,4H),3.50(t,J＝6.9Hz,2H),3.05–2.69(m,2H),2.52(d,J＝25.7Hz,2H),2.07–1.90(m,1H),1.72(s,1H),1.61(s,5H),1.51(dt,J＝13.1,6.6Hz,2H),1.18(s,3H),0.83(d,J＝6.5Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ173.35,172.26,170.65,169.47,167.84,166.75,156.68,146.96,144.43,144.33,141.27,138.48,136.79,135.20,132.76,131.20,130.07,129.30,128.18,127.79,127.59,125.88,125.23,121.11,120.65,117.78,115.41,110.92,109.57,66.19,56.36,49.07,47.20,42.11,35.26,31.51,30.35,27.90,27.12,26.82,23.10,22.90,22.69.MS-ESI m/z:calcd for C50H50N6O8[M+Na]+:885.3588；found:885.3526.
化合物2fPL8；产率37.4％；黄绿色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),10.29(s,1H),8.50(t,J＝5.4Hz,1H),8.31(d,J＝3.5Hz,2H),7.91(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(s,1H),7.84(d,J＝4.6Hz,3H),7.74–7.66(m,3H),7.64(d,J＝8.9Hz,1H),7.55–7.49(m,1H),7.37(td,J＝7.5,3.7Hz,2H),7.28(t,J＝7.5Hz,2H),7.05(d,J＝8.6Hz,1H),6.97(d,J＝7.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.0Hz,1H),5.00(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.30–4.06(m,3H),3.25(t,J＝6.6Hz,3H),2.89–2.78(m,1H),2.59–2.47(m,1H),2.02–1.90(m,2H),1.51(dt,J＝13.2,6.6Hz,4H),1.39–1.32(m,4H),1.19(s,5H),0.83(d,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ173.36,172.26,170.65,169.50,167.85,166.68,156.68,146.96,144.41,144.32,141.26,138.47,135.18,132.73,131.26,129.31,127.98,127.79,127.39,125.86,125.31,121.11,120.71,117.96,117.41,115.56,115.26,111.18,109.55,55.44,48.80,47.31,42.33,40.57,38.91,38.61,35.22,29.66,29.20,28.01,27.82,26.79,26.64,23.13,22.89.MS-ESI m/z:calcd for C52H54N6O8[M+Na]+:913.3901；found:913.3827.
化合物2fPL10；产率30.1％；黄绿色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),10.33(s,1H),8.56(t,J＝5.6Hz,1H),8.32(d,J＝2.4Hz,2H),7.91(d,J＝8.9Hz,1H),7.88–7.79(m,4H),7.74–7.67(m,3H),7.64(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H),7.49(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.37(td,J＝7.4,4.1Hz,2H),7.31–7.25(m,2H),7.02(d,J＝8.6Hz,1H),6.97(d,J＝7.0Hz,1H),6.54(s,1H),5.01(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.36–4.09(m,5H),3.58(d,J＝5.5Hz,2H),3.52(s,2H),3.43(t,J＝5.7Hz,2H),3.37(t,J＝5.5Hz,2H),2.94(s,1H),2.83(ddd,J＝17.3,14.0,5.4Hz,1H),2.58–2.48(m,2H),1.97(ddd,J＝11.8,6.1,3.8Hz,1H),1.78–1.57(m,2H),1.51(dq,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.24–1.09(m,2H),0.83(dd,J＝6.7,1.6Hz,6H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ173.35,172.27,170.65,169.47,167.82,166.83,156.68,146.88,144.43,144.32,141.26,138.53,135.24,132.60,130.92,130.23,129.27,128.36,127.86,127.56,127.39,125.89,121.11,120.71,120.57,111.49,110.92,109.77,70.20,69.51,69.40,56.39,55.45,49.36,48.79,42.20,40.58,35.41,35.23,27.97,23.13,23.05,22.95,22.86.MS-ESI m/z:calcd for C52H54N6O10[M+Na]+:945.3799；found:945.3741.
2.2f-PROTAC明显降解CDK6下调磷酸化的Rb，并将细胞阻断在G0/G1期
本实施活性检测结果显示，化合物2fPL8对AGS有更明显的抑制作用，对GES-1的抑制作用较弱(图7中B所示)；化合物2fPL8在8μM的浓度下可以阻断G0/G1期的AGS(图7中C所示)；化合物2fPL8还能引起CDK6的明显降解，对磷酸化的Rb也能明显下调，而对Rb没有明显影响(图7中D所示)；
从以上实验可以看出，化合物2fPL8可以明显下调CDK6，并且都可以明显下调磷酸化Rb，阻断细胞在G0/G1期，与CDK6降解剂的性能一致，由此判断化合物2fPL8可以CDK6降解剂，靶向降解CDK6，其DC50为4.80±0.79μM。
3.化合物2fPL8的小鼠急性毒性实验
使用两组体重相近的KM小鼠雌鼠进行急性毒性实验，在禁食24h后，对于其中一组以1000mg/kg的剂量灌胃化合物2fPL8，并进行两周的观察，每天对其体重进行记录(图8中A所示)，发现给药组在前四天的体重增速明显低于对照组，而在第五天后，两组的体重增速开始接近，并且在第十天以后，两组的体重增量开始一致，在实验期间所有小鼠均未死亡。实验组的小鼠在灌胃后的一到两天，明显萎靡不振，减少走动以及紧缩成团，在第三天以后明显正常。
在14天后对于所有的小鼠进行处理，取心肝脾肺肾进行组织切片以及HE染色，之后对于对照组与给药组的小鼠器官切片进行拍照。对于两组照片进行分析(图8中B所示)。判断化合物2fPL8在1000mg/kg的剂量下，对于小鼠具有一定的生物安全性。
本发明利用Python的RDKit包通过简易合成的反应条件对小分子砌块进行智能组合，形成了一个具有简易合成特征的在线虚拟数据库。分子总数达到12，904个。并利用该数据库对CDK6作为靶蛋白进行了虚拟筛选，共筛选出13个化合物并进行了合成。其中，76.92％的分子在10μM时具有活性。其中活性最高的分子10的IC50分别为1.16±0.14μM，在细胞水平上优于CIS。上述实验证明了利用各种小分子砌块通过组合化学建立虚拟数据库的可行性，并从中筛选进而发现潜在的CDK6抑制剂。这项工作探索了由虚拟酰胺反应构建的分子库在虚拟筛选中的应用，并验证了酰胺反应在实际虚拟筛选中具有现实的命中率。
针对已发现的潜在抑制剂的活性化合物进行进一步的研究，发现了可以有效抑制CDK6的化合物10，该化合物对于CDK6异常高表达的胃癌细胞系AGS有着明显的抑制作用，并且该化合物对于正常胃上皮细胞GES-1抑制效果不明显，这个结果说明该化合物具有进一步改造的潜力，使用Hoechst/PI荧光染料对于化合物10处理的细胞进行染色再使用流式细胞仪进行检测，发现该化合物可以诱导细胞凋亡而非坏死，使用FITC/PI染料染色后进行检测，发现该化合物导致细胞凋亡并表现在细胞凋亡晚期。同时对于该化合物处理的细胞进行细胞周期检测，发现化合物10可以阻滞细胞在G0/G1期，这同样是符合CDK6抑制剂的表现，使用WB在蛋白水平进行检测，化合物10处理后的细胞可以明显下调CDK6的下游蛋白磷酸化Rb，而对于CDK6以及Rb的表达没有明显的影响。
在验证化合物10为CDK6抑制剂以后，对化合物10进行PROTAC改造，在相关研究中，降解CDK6的PROTAC分子表现最好的Linker长度约为9个原子长度，以此为基础，对化合物10进行PROTAC改造，获得Linker长度约为9个原子的PROTAC分子10-PROTAC，对于10-PROTAC进行AGS的抗增殖检测，发现该化合物对于AGS的抑制效果有限，对其进行细胞周期检测，发现该化合物在50μM的浓度下可以有效地使细胞阻滞在G0/G1期，并且使用WB发现在蛋白水平上可以有效的降解CDK6蛋白。实验证明10-PROTAC为新型的CDK6降解剂，但是其降解效果有限，因此需要通过进一步的结构优化，以期望发现活性更好的PROTAC分子。
以化合物10为结构骨架进行拆分，将化合物10分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，对于每一个部分都进行结构替换，对于替换后的所有分子进行细胞抗增殖检查，发现了活性更优的化合物2f，同样对于化合物2f进行胃癌细胞AGS与正常胃上皮细胞GES-1的抗增殖检测，发现化合物2f可以有效抑制AGS但是对于GES-1没有明显的抑制效果，使用Hoechst/PI荧光染料以及FITC/PI染料染色后进行检测，发现该化合物导致细胞凋亡并表现在细胞凋亡晚期。对于该化合物处理的细胞进行细胞周期检测，发现化合物2f同样使AGS可以阻滞细胞在G0/G1期，而在蛋白水平，化合物2f同样可以使得CDK6的下游蛋白磷酸化Rb下调，对于Rb以及CDK6则无明显影响，为CDK6抑制剂。
因此进一步对于CDK6抑制剂2f进行PROTAC改造，对于改造过后的PROTAC分子进行AGS的抗增殖检测，发现2f-PROTAC相对于10-PROTAC有着明显的活性提高，对于活性提高的2f-PROTAC进行进一步的检测，发现2f-PROTAC对于GES-1抑制效果较差，在最大浓度的抑制效果也不高，这有利于进一步的研究。对2f-PROTAC处理的AGS进行细胞周期检测，发现在较大浓度处理下，该化合物可以使得细胞阻滞在G0/G1期。使用WB在蛋白水平进行检测，发现2f-PROTAC可以明显的下调CDK6表达，并使得CDK6的下游蛋白磷酸化Rb下调明显，这证明2f-PROTAC为CDK6降解剂。
对于2f-PROTAC进行小鼠急性毒性实验，发现2f-PROTAC对于小鼠的毒性较小，在1000mg/kg的剂量下，无小鼠死亡，在急性毒性实验后对于小鼠取材并将心肝脾肺肾进行HE染色切片，发现喂养2f-PROTAC的小鼠器官也无明显的受损情况，这说明2f-PROTAC有着较好的生物安全性。

Claims (13)

1.一种靶向抑制CDK6的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的结构式如下式(I)所示：
其中，所述R1选自
所述R2选自
所述R3选自-CH2CCH、-CH2CHCH2、-CH2CH2CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2 CH(CH3)2，或R3表示-CH2CH2-与式(I)中R3取代处的C形成三元环。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的结构式如下任一所示：
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备CDK6抑制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CDK6抑制剂为抗胃癌药物。
5.一种靶向降解CDK6的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述PROTAC化合物由权利要求1或2所述的化合物经E3连接酶的配体分子修饰获得。
6.如权利要求5所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述E3连接酶的配体分子与权利要求1或2所述的化合物经过Linker连接后修饰获得。
7.如权利要求6所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述E3连接酶的配体分子包括如下结构：
8.如权利要求7所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述PROTAC化合物的结构式如下式(Ⅱ)所示：
其中，所R4为-CH2CCH或-CH2CH2 CH(CH3)2；
所述Linker Rn包括如下结构：
9.如权利要求8所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述PROTAC化合物的结构式如下任一所示：
10.如权利要求5-9任一所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备CDK6降解剂中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述CDK6降解剂为抗胃癌药物。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，和/或权利要求5-9任一所述的PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述辅剂为载体、稀释剂、媒介物或其组合。
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