CN116536357A - 构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法，包括如下步骤：(1)构建能同时表达Cas12a蛋白和sgRNA的基因编辑单质粒；(2)构建基于SSA检测sgRNA剪切活性的双荧光报告单质粒；(3)将步骤(1)得到的基因编辑单质粒和步骤(2)得到的双荧光报告单质粒共转入细胞中，通过检测萤火虫荧光素酶的活性高低来判断sgRNA的剪切活性。本发明可以在只转两个载体的情况下，完成多个sgRNA的剪切能力评估，其效率远高于常规现有做法。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法。
背景技术
当前，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12在内的基因编辑技术已经显示巨大的应用价值，但是其在编辑效率、精确度及脱靶效应等方面，以及其走向临床应用等尚有很多问题需要解决。CRISPR/Cas系列基因编辑系统主要由Cas蛋白和sgRNA组成，针对不同靶点进行高效的基因编辑主要取决于Cas9的靶向切割效率，而这个靶向切割效率很大程度上依赖于sgRNA对目的DNA靶位的识别能力和亲和力。在CRISPR/Cas技术应用中，sgRNA对靶标的识别能力差、与目的DNA的靶标亲和力低或Cas9的切割效率低下都会降低CRISPR/Cas的工作效率，并且可能提高sgRNA介导的脱靶，严重限制了CRISPR/Cas的实际应用。因此，建立快速，高效，简便的评估sgRNA介导的Cas蛋白的靶向切割效率的方法至关重要。
现有的采用实验方式评估sgRNA介导Cas蛋白靶向切割活性的方法主要包括3种，单链复性(Single-strand annealing，SSA)检测，体外切割活性验证和内源活性检测。SSA活性检测方法中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)编码片段通过插入两段重复序列而分隔开，在两段重复序列之间嵌入靶序列片段以评估sgRNA介导的基因切割效率。当CRISPR/Cas系统能对靶序列进行有效切割形成DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，细胞通过SSA机制利用两边的重复序列完成单链退火SSA修复，从而重新形成有活性的萤火虫荧光素酶基因，之后通过荧光检测就可以评估CRISPR-Cas的切割活性。体外切割活性是使用Ca s/sgRNA复合物体外酶切靶点DNA序列，获得的两条DNA片段。通过琼脂糖电泳分析，观察sgRNA介导的DNA被切割的百分比，从而判断gRNA的活性和切割效率。内源活性检测是采用T7E1内切酶，在靶点两侧设计合适的引物，PCR扩增出含有错配突变位点的D NA条带，再通过T7E1内切酶识别并切割错配的杂合DNA双链。将酶切产物通过琼脂糖电泳分析可以初度估计切割条带与未切割条带的比例，从而反应出CRISPR-Cas系统的活性。体外切割活性验证和内源活性检测均需要通过电泳等繁琐的操作进行。与之相反，SSA活性检测可以通过收集细胞，检测荧光素酶活性恢复能力，以此评估CRISPR/Cas系统的剪切活性，具有简单，高效的特点。然而，SSA活性检测是一种单荧光素酶报告基因系统，往往会受到各种实验条件的影响，所以需要共转染“对照”荧光素酶作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。故以萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶构成的双荧光素酶SSA报告基因系统在评估基因编辑系统效率方面得到广泛的应用。
市售的双荧光素酶SSA报告基因系统包括两个单独的载体，一个含有海肾荧光素酶基因，另一个含有萤火虫荧光素酶基因。通过双荧光素酶报告系统评估sgRNA的活性还需要含有Cas蛋白和sgRNA转录框的质粒。因此，通过双荧光素酶SSA报告系统评估sgRNA的活性将制备和转染三个或者四个载体，这使转染步骤变得繁琐，容易造成结果的偏差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法，减少质粒数量，提高sgRNA筛选效率。
本发明的技术方案为：构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法，包括如下步骤：
(1)构建能同时表达Cas12a蛋白和sgRNA的基因编辑单质粒；
(2)构建基于SSA检测sgRNA剪切活性的双荧光报告单质粒；
(3)将步骤(1)得到的基因编辑单质粒和步骤(2)得到的双荧光报告单质粒共转入细胞中，通过检测萤火虫荧光素酶的活性高低来判断sgRNA的剪切活性。
进一步地，所述基因编辑单质粒具有一个或多个启动子转录框以转录sgRNA，和一个Cas12a蛋白表达框。
进一步地，所述启动子为U6启动子。
进一步地，所述双荧光报告单质粒同时含有萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因和sgRNA靶序列片段；萤火虫荧光素酶基因编码片段中具有两个重复片段，重复片段之间插入sgRNA靶序列片段。
进一步地，所述sgRNA靶序列片段由一个或多个sgRNA靶标序列通过GG连接子连接组成。
进一步地，所述双荧光报告单质粒中，海肾荧光素酶基因和萤火虫荧光素酶基因各自具有独立的启动子和终止子。优选地，所述萤火虫荧光素酶基因的启动子为CMV，所述海肾荧光素酶基因的启动子为HSV。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明自主设计并构建了可以插入3个sgRNA片段的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体作为被评估的CRISPR/Cas12a系统，并且该系统的容量还可以扩大。自主设计并构建了pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc双荧光素酶空载载体作为切割靶标插入的载体，将萤火虫荧光素酶基因(报告基因)和海肾荧光素酶基因(内参基因)置于同一个载体上，各自含有独立的启动子和终止子，活性稳定，线性范围宽广，完全满足sgRNA剪切评估需要。通过以上两个载体，将需要筛选的sgRNA通过同源重组克隆技术构建到Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体，将sgRNA对应的靶标通过同源重组克隆技术构建到pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc双荧光素酶空载载体中，可以在只转两个载体的情况下，完成多个sgRNA的剪切能力评估，其效率远高于常规现有做法。
附图说明
图1 Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体构建；
图2 Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体构建；
图3 pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体构建和表达优化；
图4 pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载载体构建；
图5 Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体构建；
图6 pMCS-CMV-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体构建；
图7 pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc载体构建；
图8 sgRNA-CRISPR/Cas12a体外组装核糖核蛋白复合物体外剪切靶点活性评估；
图9 双荧光素酶评估Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体的剪切活性；
图10 Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体在瞬转HBV表达载体细胞中的剪切活性评估。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例一：Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体构建
以从Addgene购买的能表达Cas12a蛋白的pTE4398载体(9441bp)为骨架，通过双酶切添加两个U6启动子转录框，构建出含有三个U6启动子转录框的Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体。同时，通过双酶切将pTE4398载体中的G418抗性元件替换为Zeo抗性元件，以下称为Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体。
1.1双酶切构建Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体
委托生工合成双U6启动子转录框，交付pUC57-Dual-U6质粒。通过PCR扩增，使Dual-U6序列带上酶切位点Not I和Xho I，扩增后回收目的片段进行酶切，并回收酶切后的产物。同时，使用Not I、Xho I和Hind III对pTE4398载体进行三酶切，并回收酶切后的线性产物。将酶切并回收后的目的片段和线性载体进行连接，转化，平板涂布，阳性克隆鉴定，质粒提取。
1.2双酶切构建Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体
以构建好的Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体为骨架，将骨架中G418抗性元件通过双酶切替换为Zeo。以pcDNA3.1/Zeo(-)载体为模板，通过PCR扩增，为Zeo片段添加AvrII和BstBI酶切位点。同时对构建好的Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体进行AvrII和BstBI双酶切。将带上AvrII和BstBI酶切位点的Zeo片段与AvrII和BstBI双酶切后的Tri-U6-CRISPR/Cas12a线性载体通过同源重组连接，转化，筛选，鉴定，最后得到含有Zeo抗性的Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo质粒工程菌，并提取质粒。
实施例二：pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体构建
委托生工合成HBV-D型全长，交付pUC57-HBV-D质粒。以pUC57-HBV-D质粒为模板，通过单酶切同源重组将HBV-D头尾串联，构建pUC-2Fold-HBV-D质粒。将2Fold-HBV-D片段通过双酶切构建到pcDNA3.1(+)表达载体，构建pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体。
2.1制备同源臂产物Bsu36I-HBV-D
以Bsu36I-HBV-F/R引物进行PCR扩增，获取带Bsu36I酶切位点的同源臂产物Bsu36I-HBV-D。
2.2同源重组
通过Bsu36I单酶切获得线性化pUC57-HBV-D载体，酶切体系见下表。将同源臂产物Bsu36I-HBV-D和线性化pUC57-HBV-D载体进行同源重组、转化、涂板、阳性克隆鉴定、质粒提取，得到pUC57-2Fold-HBV-D载体。
2.3双酶切构建pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体
将pUC-2fold-HBV-D中的2fold-HBVD区域用Kpn-2FHBV-F和Not-2FHBV-R扩增出来，添加KpnI和NotI酶切位点，与pcDNA3.1(+)载体通过KpnI和NotI双酶切，构建pcDNA3.1-2Fold-HBVD载体，并用两组跨接头引物测序。
实施例三：pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载载体
通过合成带单链退火修复(SSA)结构的萤火虫荧光素酶表达框质粒和海肾荧光素酶表达框质粒，并将SSA萤火虫荧光素酶表达框和和海肾荧光素酶表达框通过同源重组构建在一个质粒上。以pMCS-hRLuc-TK-Luc质粒为骨架，通过双酶切用SSA双荧光素酶编码框区域替换骨架质粒上的hRLuc-TK-Luc区域，得到萤火虫荧光素酶表达改良和海肾荧光素酶启动子改良的pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载载体。
3.1pUC-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体构建
委托生工合成pUC57-CMV-SSA-Luc和pUC57-HSV-Rluc质粒，用HS-Rlu-Xho-F/R引物扩增出HSV-Rluc片段，与经过Xho I单酶切后的pUC-CMV-Luc载体进行同源重组，单酶切同时加入碱性磷酸酶去磷酸化。再进行转化、涂板、阳性克隆鉴定、质粒提取，得到pUC-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体。
3.2pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体构建
将pUC-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体作为模板，用CMV-Luc-F和HSV-Rluc-NR进行扩增，使CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc片段带上Kpn I和BamH I酶切位点，并进行酶切。与经过KpnI，BamHI双酶切后的pMCS-hRLuc-TK-Luc空载质粒进行连接和克隆。
实施例四：crRNA的设计和筛选
从NCBI基因组数据库下载HBV A-H八种亚型参考基因组序列，通过MegAlign进行多序列比对，得到保守序列文件。通过CRISPR在线设计网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计Cas12a(Cpf1)对应的crRNA。随后，以ayw3血清型的HBV基因组序列为参考，寻找靶向HBV不同区域的保守的crRNA。经过综合评估，选出如下表所示的crRNA用于后续载体构建实验。
靶向HBV基因组的28条crRNA
实施例五：Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体构建
将靶向HBV基因组的28条crRNA按照Cas12a scaffold-crRNA-TTTTTTT格式合成反向互补的寡核苷酸链，再进行退火和通过PCR扩增添加同源重组所需要的同源臂，得到sgRNA。通过PshAI单酶切同源重组，将sgRNA构建到Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体中，得到针对HBV基因组的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体。
5.1体外制备sgRNA转录模板
合成sgRNA的双链，将合成的长链DNA用水溶解至浓度10μM进行体外退火。将退火后的产物稀释100倍，进行PCR扩增添加PshAI酶切位点。
5.2同源重组构建Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体
通过PshAI单酶切Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体，将带有同源臂的sgRNA片段构建到Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体中，转化、涂板、阳性克隆鉴定、质粒提取，得到针对HBV基因组的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体。
实施例六：pMCS-CMV-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体构建
6.1pMCS-CMV-Double-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体
由于同源重组需要50bp以上的序列，故将靶标序列两两组合(T1T2-F/R)，中间加GG作为连接子(TTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCGGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA GTGCCA)。合成后，用同源臂引物(TYB-T1T2-F/R)进行扩增并回收。与经过AscI酶切的pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体通过同源重组构建pMCS-CMV-Double-Target-SSA-L uc-HSV-Rluc质粒。
6.2pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc载体
以pUC57-HBVD载体为模板，通过设计无缝克隆用的引物(靶向PAM-靶标，并含AscI酶切位点)CMV-Luc-HBV-F/R，进行扩增。将pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载通过AscI酶切位点进行单酶切，将线性载体产物回收后，与含有PAM-靶标的PCR产物进行无缝克隆。通过转化，阳性克隆筛选，双酶切鉴定(KpnI,NotI)，测序(测序引物为CMV-F和CMV-Luc-R)等，构建含有全长HBVD型基因组的pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc质粒，用于检测不同的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒活性。
实施例七：sgRNA-CRISPR/Cas12a体外组装核糖核蛋白复合物体外剪切靶点活性评估
体外转录制备28条sgRNA，和Cas12a蛋白组装成具有剪切活性的核糖核蛋白(RNP)复合物后，对HBV全长序列中的靶点进行剪切，分析剪切后的片段大小，评估体外剪切活性。
7.1体外转录制备sgRNA
以含有不同sgRNA序列的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo质粒为模板，合成带有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR制备用于体外转录的带有T7启动子的DNA片段，引物序列(TC-sgRNA-F，TC-sgRNA(1-28)-R)。按照全式金T7转录试剂盒说明书配置转录反应溶液。纯化过程按照全式金RNA Purification Kit操作说明进行。
7.2体外剪切靶标序列
7.2.1制备HBV全长序列
以pUC57-HBV-D质粒为模板，用pUC-5518-F/R引物，通过PCR扩增出含有全长HBV-D区域的片段(为了有利于观察剪切效果，两端各自延长1000bp左右)作为体外剪切的底物DNA，回收并保存备用。
7.2.2体外剪切
将纯化后的RNA和Cas12a蛋白按照以下反应体系表制备反应体系，并按照下述步骤进行反应。
1)将反应混合液置于25℃孵育10分钟。
2)加入3μL 30nM的底物DNA(30μL的终末体积)，并混匀。
3)将反应混合液置于37℃孵育10分钟。
4)加入1μL蛋白酶K，室温孵育10分钟。
5)通过琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。
RNP组装反应体系表
实施例八：双荧光素酶评估Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体的外源剪切活性
将下表中已经制备好的28个Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo质粒和14个pMCS-CMV-Double-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc质粒以及pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc质粒按照单独使用，联合使用组合，转入293T细胞中，培养48小时后，收样检测细胞裂解物中荧光素酶的活性。以此作为依据判断2种质粒之间是否发生了相互作用。
剪刀质粒和靶标质粒配对表
8.1质粒转染293T细胞
将293T细胞按照105cells/mL密度铺于24孔细胞培养板，每孔500μL，晃动培养板使细胞均匀分布，置于37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。待细胞汇合度70％左右，更换细胞培养基(DMEM，10％FBS，双抗)，并按照PEI MAX 40K-DNA转染试剂说明书准备转染体系，进行转染，48小时后收样。
8.2双荧光素酶检测
1)将Luciferase Reaction Buffer与Luciferase Reaction Buffer II从-20℃取出，恢复至室温，保证各组分完全溶解。
2)制备Luciferase Reaction Reagent
用Luciferase Reaction Buffer充分溶解冻干状态的Luciferase ReactionSubstrate(5mL Buffer+1Vial Substrate)，分装后避光保存。避免反复冻融。
3)制备Luciferase Reaction Reagent II
按1:50的比例将Luciferase Reaction Substrate同Luciferase ReactionBuffer II混合，分装后避光保存。避免反复冻融。
4)制备1×Cell Lysis Buffer
按1：4的比例将5×Cell Lysis Buffer同Nuclease-free Water混合备用。
5)裂解细胞
去除细胞培养基，用1×PBS小心润洗两次，加入适量1×Cell Lysis Buffer(24孔，100μL)，室温(摇床)充分裂解10分钟后，刮取细胞于1.5mL离心管中，2-8℃，12000×g离心10min，取上清(细胞裂解物)备用。
6)荧光检测
将30μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent加入不透明96孔板中，小心吸取30μL细胞裂解物至96孔板，水平混匀，于化学发光仪(Luminometer)中检测萤火虫荧光素酶活性。之后吸取30μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent II加入上述96孔板，水平混匀，于化学发光仪中检测海肾荧光素酶活性。
7)相对表达倍数计算公式如下：
归一化值＝萤火虫萤光素酶读值(主报告基因)/海肾萤光素酶读值(内参基因)
相对表达倍数＝实验组归一化值/对照组归一化值
实施例九：Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体在瞬转HBV表达载体细胞中的内源剪切活性评估
将HepG2细胞按照1×105cells/mL密度铺于12孔细胞培养板，每孔1mL，晃动培养板使细胞均匀分布，置于37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。待细胞汇合度70％左右，更换细胞培养基(DMEM，10％FBS，双抗)，并按照PEI MAX 40K-DNA转染试剂说明书准备转染体系，将pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体按照不同转染剂量(300ng-20ng)进行转染，48小时后收样，以评估最加转染剂量。
将Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a，pcDNA3.1-2Fold-HBVD载体按照对应组合(单独使用，2联用及3联用Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a)进行转染，48小时后收样，采用ELISA检测HBsAg蛋白和HBeAg蛋白表达水平。
下面结合具体实施方式对发明作出进一步的说明
1.Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体
CRISPR/Cas12a系统常采用双质粒系统，一个质粒表达Cas12a蛋白，一个质粒转录产生sgRNA，通过改变sgRNA即可针对不同的基因位置进行剪切。也有部分CRISPR/Cas12a系统采用单质粒系统，将Cas12a蛋白表达和sgRNA转录整合到一个质粒上，减少了质粒转染的复杂性，更有利于高效转染。为了增强pTE4398载体(9441bp)的功能性，通过酶切克隆和同源重组等技术添加U6启动子转录框，构建出含有三个U6启动子转录框的Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体。首先通过化学合成，得到含有双U6启动子转录框的pUC57-Dual-U6质粒。通过对pTE4398载体进行限制性内切酶分析，选择Not I和Xho I内切酶作为酶切位点。通过PCR扩增，使Dual-U6序列带上酶切位点Not I和Xho I并进行酶切。由于对pTE4398载体进行NotI和Xho I双酶切时不易和未进行酶切的质粒区分，影响切胶回收。所以额外添加Hind III内切酶进行酶切，回收5568bp和3867bp大小的产物(图1中A)。将酶切后的Dual-U6序列(图1中B)和pTE4398载体进行连接，转化，平板涂布，阳性克隆鉴定，质粒提取，得到Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体(图1中D)。其中，对Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体进行测序和酶切鉴定，酶切鉴定采用的内切酶为Not I和Xho I(图1中C)。
2.Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体
在乙肝研究的模式细胞中，HepAD38细胞，HepG2.2.15细胞使用频率很高，在本研究中也采用了以上两种细胞。所以，为了和采用细胞系的抗性区分，需要将Tri-U6-CRISPR/Cas12a载体中的G418抗性元件替换为Zeo抗性元件，构建出Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体。首先，根据限制性内切酶分析，将Tri-U6-CRISPR/Cas12a用AvrII和BstBI进行双酶切，回收大片段(图2中A)。同时，按照同源重组构建载体设计原则，以pcDNA3.1/Zeo(-)载体为模板，通过PCR扩增，获得带有AvrII和BstBI酶切位点的同源臂Zeo片段(图2中B)。将酶切后的线性载体和同源臂Zeo片段进行同源重组，转化，平板涂布，阳性克隆鉴定，质粒提取，得到Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体(图2中C)。
3.pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体
迄今为止，尚无理想的乙型肝炎病毒(HBV)体外感染的动物及细胞模型，目前多通过HBV DNA的转染细胞模型来研究HBV的增殖、致病机理及筛选抗HBV的药物。由于HBV基因组呈双链闭合环状，且其开放读框分布于全长DNA，基因结构紧凑，因此需含头-尾串联HBVDNA的载体才有可能在转染细胞内建立HBV的复制模型。基于此，我们将D型HBV基因组从NCBI下载，通过化学合成得到pUC57-HBV-D质粒，并以之为模板，通过PCR扩增获取带Bsu36I酶切位点的同源臂产物Bsu36I-HBV-D(图3中A)。同时，用Bsu36I酶切pUC57-HBV-D(图3中B)，并与Bsu36I-HBV-D通过同源重组构建pUC-2Fold-HBV-D载体(图3中C)。再将pUC-2fold-HBVD与pcDNA3.1(+)载体通过KpnI和NotI双酶切，构建pcDNA3.1-2Fold-HBVD载体(图3中D)。最后，通过MluI和NotI双酶切pcDNA3.1-2Fold-HBVD载体进行鉴定(图3中E)，质粒简谱如图2中F所示。
在获得pcDNA3.1-2Fold-HBVD质粒后，对其表达能力进行分析。将pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体按照不同剂量(300ng-20ng)进行转染，48小时后收集上清样本进行HBsAg、HBeAg蛋白的ELISA检测。结果表明，本研究构建的pcDNA3.1-2Fold-HBVD质粒能正常表达HBsAg和HBeAg蛋白(图3中G)，其中HBsAg蛋白的表达能力优于HBeAg蛋白。
4.pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载载体
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫(Photinus pyralis)中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)则是从海肾(Renilla reniformis)中分离，分子量为36kDa。荧光素酶报告基因检测是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。单荧光报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双荧光报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值(Firefly Luciferase/Renilla Luciferase)，这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。同时，从细胞转染的角度来看，两种荧光素酶位于同一个载体上更有利于细胞转染。
基于CRISPR-Cas蛋白的基因编辑技术，可以针对靶基因设计很多条sgRNA，不同的sgRNA介导Cas蛋白对靶基因的剪切效率不一致，因此在使用CRISPR-Cas系统前需要先对sgRNA进行剪切活性验证，选取能够介导更高切割效率的sgRNA。常用的sgRNA剪切活性检测方法包括单链复性(Single-strand annealing，SSA)检测、体外剪切活性验证和内源性活性剪切。SSA活性检测可以验证sgRNA质粒是否具有切割裸露DNA的能力，是初步评估CRISPR-Cas系统有活性的一种常用的方法。在SSA报道质粒中含有两个不具有活性的荧光素酶(luciferase)编码片段，在两者中间含有一个终止密码子和一段sgRNA的靶序列。当CRISPR-Cas能对靶序列进行有效切割形成DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，细胞通过SSA机制对DNA序列进行同源重组修复，从而重新形成有活性的荧光素酶基因，之后通过荧光检测就可以预测CRISPR-Cas的切割活性。
在本方案中，合成了带SSA结构的萤火虫荧光素酶质粒pUC57-CMV-SSA-Luc和海肾荧光素酶质粒pUC57-HSV-Rluc，通过PCR获得HSV-Rluc片段(图4中A)并构建到pUC-CMV-SSA-Luc载体中(图4中B)。再以pUC-CMV-SSA-Luc载体为模板，通过PCR获得CMV-Luc-HSV-Rluc片段(图4中C)，与pMCS-hRLuc-TK-Luc质粒经过双酶切后进行同源重组，获得pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载载体(图4中D)，其载体图谱如图4中E所示。
5.Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体
通过PshAI单酶切Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体，得到线性化的载体片段(图5中A)。同时根据所设计的28条crRNA，按照Cas12a scaffold-crRNA-TTTTTTT格式合成全长的sgRNA，并通过PCR扩增添加同源臂(图5中B)，构建到Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo载体中。经过测序(图5中C)分析，得到如图5中D质粒简谱所示的针对HBV基因组的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a-Zeo载体。
6.pMCS-CMV-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体
通过AscI单酶切pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体，得到线性化的载体片段(图6中A)。同时，将靶标序列两两组合(T1T2-F/R)，中间加GG作为连接子进行合成(图6中B)，通过PCR扩增添加同源臂(图6中B)，构建到pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc载体中。载体进行KpnI和NotI双酶切验证并进行测序验证(图6中C-D)，得到如图6中E质粒图谱质粒示意图所示的含有双靶标的pMCS-CMV-Double-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体。
以pUC57-HBVD载体为模板，通过设计无缝克隆用的引物(靶向PAM-靶标，并含AscI酶切位点)，进行扩增。将pMCS-CMV-SSA-Luc-HSV-Rluc空载通过AscI酶切位点进行单酶切(图7中A)，回收线性载体产物后，与含有PAM-靶标的PCR产物(图7中B)进行无缝克隆。通过转化，阳性克隆筛选，双酶切鉴定(KpnI,NotI)(图7中C)，测序等，构建含有所有靶标的pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc质粒(图7中D)。
7.sgRNA-CRISPR/Cas12a体外组装核糖核蛋白复合物体外剪切靶点活性评估
通过PCR扩增制备28条带有T7转录启动子的DNA片段(图8中A)，用于体外转录sgRNA。同时以pUC57-HBV-D质粒为模板，扩增出含有全长HBV-D区域的片段作为体外剪切的底物DNA。将纯化后的RNA和Cas12a蛋白在PCR管中进行孵育制备具有剪切活性的核糖核蛋白(RNP)复合物，并对HBV全长序列中的靶点进行剪切，剪切结果如图8中B所示。28组sgRNA均能有效的对靶点进行切割，得到预计大小的两段产物。
8.双荧光素酶评估Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体的剪切活性
为了评估所筛选到的sgRNA是否能高效发挥作用，我们将sgRNA的转录框构建到Tri-U6-CRISPR/Cas12a-Zeo质粒中，并分别与含有sgRNA对应靶标的pMCS-CMV-Double-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体，或含有所有靶标的pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc载体转入293T细胞中，48小时候后收样进行萤火虫荧光素酶活性恢复检测。如图9中A-B所示，所有的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒单独或者两两联合使用均能促进pMCS-CMV-Double-Target-SSA-Luc-HSV-Rluc载体的萤火虫荧光素酶活性恢复。这表明，我们构建的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒能正常表达出Cas12a蛋白，能和正常转录出的sgRNA组合形成具有剪切活性的RNP复合物，对萤火虫荧光素酶编码区中的靶标进行切割。同时，Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒单独或者两两联合也能使含有HBVD全长插入序列的pMCS-CMV-HBVD-SSA-Luc-HSV-Rluc载体的萤火虫荧光素酶活性恢复，如图9中C-D所示。同时，我们将其中的四个sgRNA选出，进行联用，发现同时使用更多的sgRNA能更好的恢复pMCS-CMV-HBVD-Luc-HSV-Rluc萤火虫荧光素酶活性(图9中E)。
9.Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a载体在瞬转HBV表达载体细胞中的剪切活性评估
在确定Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a能正常有效发挥工作后，我们将不同的Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒与pcDNA3.1-2Fold-HBVD表达载体共同转入HepG2细胞中，评估sgRNA介导的剪切活性是否会抑制pcDNA3.1-2Fold-HBVD质粒表达。如图10中A所示，所设计的28个Tri-U6-sgRNA-CRISPR/Cas12a质粒单独使用时候，部分质粒是可以抑制pcDNA3.1-2Fold-HBVD质粒表达HBsAg和HBeAg蛋白。将图9中A中剪切活性最好的9个质粒按照两联用和三联用进行组合，均能抑制pcDNA3.1-2Fold-HBVD质粒表达HBsAg和HBeAg蛋白(图10中B-C)，进一步验证了通过双荧光素酶单质粒SSA报告系统筛选出的高剪切活性sgRNA的剪切活性。
Claims (7)
1.构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建能同时表达Cas12a蛋白和sgRNA的基因编辑单质粒；
(2)构建基于SSA检测sgRNA剪切活性的双荧光报告单质粒；
(3)将步骤(1)得到的基因编辑单质粒和步骤(2)得到的双荧光报告单质粒共转入细胞中，通过检测萤火虫荧光素酶的活性高低来判断sgRNA的剪切活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑单质粒具有一个或多个启动子调控的sgRNA表达框。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述启动子为U6启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双荧光报告单质粒同时含有萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因和sgRNA靶序列片段；萤火虫荧光素酶基因编码片段中具有两个重复片段，重复片段之间插入sgRNA靶序列片段。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sgRNA靶序列片段由一个或多个sgRNA靶标序列通过GG连接子连接组成。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双荧光报告单质粒中，萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因各自具有独立的启动子和终止子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶基因的启动子为CMV，所述海肾荧光素酶基因的启动子为HSV。
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