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CN116519936B - 用于前列腺癌早期检测的肿瘤自身抗原/抗体组合及应用 - Google Patents

用于前列腺癌早期检测的肿瘤自身抗原/抗体组合及应用

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CN116519936B
CN116519936B CN202310211860.9A CN202310211860A CN116519936B CN 116519936 B CN116519936 B CN 116519936B CN 202310211860 A CN202310211860 A CN 202310211860A CN 116519936 B CN116519936 B CN 116519936B
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Abstract

本发明涉及用于前列腺癌早期检测的肿瘤自身抗原/抗体组合及应用。具体地，本发明提供了针对靶抗原的自身抗体的诊断试剂的用途。本发明的研究证实，本发明的自身抗体组合可用于前列腺癌的早期筛查或鉴别诊断，以及前列腺癌患者干预治疗后疗效评估。本发明的检测方法简单快捷，患者依从性高，具有高灵敏度和高特异性，从而有助于更准确、更早期地进行前列腺癌的诊断和预后评估。

Description

用于前列腺癌早期检测的肿瘤自身抗原/抗体组合及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体而言，本发明涉及用于前列腺癌早期检测的肿瘤自身抗原/抗体组合及应用。
背景技术
根据世界卫生组织国际癌症研究机构的数据，每年全球有110万男性被诊断出患有前列腺癌，占男性诊断出的所有癌症的15％。全世界每年估计有307,000人死于前列腺癌，使其成为男性癌症死亡的第五大原因。全国前列腺癌估计新发病例约7.20万例，中国标准人口发病率6.59/10万，这与世界标准人口发病率近似，居男性恶性肿瘤发病谱第6位；估计死亡病例约3.07万例，中国标准人口死亡率为2.61/10万，位居男性恶性肿瘤死亡谱第10位。
虽然前列腺癌的确切疾病原因尚不清楚，但前列腺癌的主要危险因素是高龄。大约75％的前列腺癌在65岁以上的男性中被诊断出来。前列腺癌在50岁之前很少见。除了高龄外，种族被认为是前列腺癌的危险因素，尽管确切的关联性并不十分清楚。家族史与前列腺癌患病风险之间存在密切关联。有一级亲属(例如，父亲、兄弟、儿子)患有前列腺癌的男性被诊断出患有前列腺癌的风险要高出两到三倍，并且这种风险会随着被诊断出患有前列腺癌的亲属数量增加而增加。
前列腺特异性抗原(PSA)是最常见的前列腺癌检查指标。鉴于有多种因素会导致PSA升高，因此很多情况下难以解释PSA升高的明确原因。前列腺癌PSA筛查也引发了人们的忧虑，这由于担心引发不必要的活检风险、筛查检测到的惰性肿瘤的过度诊断和过度治疗、以及可能的不良副作用。因此，PSA难以成为一种普遍适用的、稳定的、高特异性的前列腺癌标志物。
前列腺健康指数(PHI)是一种血液测试，可估计患前列腺癌的风险。PHI测试是游离PSA、总PSA和游离PSA的[-2]proPSA同种型的组合。这三个测试分子在一个计算PHI分数的公式中。PHI评分比单独的总PSA测试或单独的游离PSA测试更好地预测前列腺癌。尽管如此，PHI还是无法摆脱PSA作为前列腺癌标志物固有的不足之处。
另一类前列腺癌早诊检查是触诊，即直肠指检(digital rectal exam，DRE)。DRE侧重于前列腺大小和一致性。许多癌症发生在前列腺外围区域，所以可以通过DRE触诊发现。癌的特征是硬的、结节的和不规则的。在DRE检查期间，临床医生的手指会触诊前列腺的后部和侧面。DRE的局限性包括无法触诊前部和中线部位的肿瘤。总体而言，大约25％患有DRE异常的男性患有癌症，所以DRE特异性也不理想。另外，DRE会引起多数患者的疼痛或不适，难以广泛使用。
前列腺癌抗原3(PCA3)是在前列腺癌组织中过度表达的非编码RNA。该标志物是通过在剧烈的前列腺按摩后通过尿液样本分析前列腺细胞中的表达情况来测量的。目前，没有足够的数据支持使用尿液PCA3检测进行前列腺癌筛查，但它可能有助于确定是否需要重复活检。
前列腺的多参数磁共振成像已被证明为检测和进一步临床表征前列腺肿瘤的一种手段。该技术可以使用于需要监测PSA持续升高的男性，以及PSA升高且活检为良性病变的患者。虽然多参数磁共振成像可用于识别监测前列腺病变目标，但它不能替代操作简单、易于推广的筛查或病理活检进行诊断，并且缺乏大型随机试验，同时检测成本较高。
筛查前列腺癌的最终目标应该是减少发病率和晚期疾病的痛苦，并且不会对不需要治疗低风险疾病的男性造成伤害。基于血清分析诊断癌症是一个特别有吸引力的概念。识别癌症的一种潜在生物标志物策略是利用人体自身的免疫系统。癌症血清含有与一组独特的与自体细胞抗原反应的抗体，称为肿瘤相关自身抗体(TAAB)。正常细胞中不存在的和异常的蛋白质可能会引发宿主免疫反应，相对于抗原较微小的量，TAAB抗体的形式往往被显著放大。由于肿瘤免疫反应是局部产生的，即使是少量的抗原，它们可能无法通过任何其他方式被检测到，也可能被免疫反应识别和放大，尤其是在癌症形成的早期阶段。因此，自身抗体分析可以作为识别癌症的有效方法。目前已经提出的抗体分子组合检测前列腺癌的策略，仍存在特异性不够高的问题，如TARDBP、TLN1、PARK7、LEDGF/PSIP1和CALD1组合对健康人的的检测特异性为80％。这样的问题会给患者带来对前列腺癌的误导，难以向临床转化。
因此，当前本领域缺乏一种针对前列腺癌的分子组合检测，来辅助诊断该疾病的方法，仍有必要发现新的自身抗体生物标志物组合。
因此，本发明的目的是提供一种简单、高效、高敏感性和特异性的生物标志物组合，用于前列腺癌的检测。
发明内容
本发明提供了一种用来进行前列腺癌早期检测的针对血清/血浆样本中肿瘤自身抗原/抗体组合的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种针对靶抗原的自身抗体的诊断试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于(a)诊断前列腺癌的发生风险；和/或(b)前列腺癌的预后评估；
其中，所述的针对靶抗原的自身抗体选自下组：
(A)选自A1至A8的任一抗体、或其组合：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体还包括(B)选自下组B的任一标志物、或其组合：(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体包括选自A1至A8中的至少2种。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体包括选自A1至A8中的3、4、5、6、7或8种。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体包括选自A1至A8中一个或多个标志物与B1至B2中一个或多个标志物所构成的组合。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；和(A4)Anti-MAGEA4。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110和(B1)Anti-P53。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A4)Anti-MAGEA4、(A5)Anti-HNRPA1和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A6)Anti-HMGB3、(A7)Anti-C1D和(A8)Anti-BRCA2。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1和(A2)Anti-EIF3E。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E和(B1)Anti-P53。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(B1)Anti-P53和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(A4)Anti-MAGEA4和(B1)Anti-P53。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(A4)Anti-MAGEA4、(B1)Anti-P53和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A4)Anti-MAGEA4、(A5)Anti-HNRPA1、(A6)Anti-HMGB3、(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(A4)Anti-MAGEA4、(A6)Anti-HMGB3、(B1)Anti-P53和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(A4)Anti-MAGEA4、(A7)Anti-C1D、(B1)Anti-P53和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(B1)Anti-P53、(A3)Anti-CCDC110、(B2)Anti-BRCA1、(A4)Anti-MAGEA4和(A8)Anti-BRCA2。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(A3)Anti-CCDC110、(A4)Anti-MAGEA4、(A5)Anti-HNRPA1、(B1)Anti-P53和(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(B1)Anti-P53、(A3)Anti-CCDC110、(A6)Anti-HMGB3、(A7)Anti-C1D、(A8)Anti-BRCA2和(A5)Anti-HNRPA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体组合为：(A1)Anti-COPB1、(A2)Anti-EIF3E、(B1)Anti-P53、(A3)Anti-CCDC110、(B2)Anti-BRCA1、(A4)Anti-MAGEA4、(A6)Anti-HMGB3、(A7)Anti-C1D、(A8)Anti-BRCA2和(A5)Anti-HNRPA1。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体的诊断试剂为抗原蛋白(作为阳性对照品)。
在另一优选例中，所述抗原蛋白选自下组：
(C)选自组C1-C10的任一抗原、或其组合：(C1)COPB1；(C2)EIF3E；(C3)CCDC110；(C4)MAGEA4；(C5)HNRPA1；(C6)HMGB3；(C7)C1D；(C8)BRCA2；(C9)P53；(C10)BRCA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53和(C3)CCDC110。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4和(C5)HNRPA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C6)HMGB3、(C7)C1D和(C8)BRCA2。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1和(C2)EIF3E。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E和(C9)P53。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110和(C10)BRCA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110和(C4)MAGEA4。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1和(C4)MAGEA4。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4、(C6)HMGB3、(C7)C1D、(C8)BRCA2和(C5)HNRPA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4和(C6)HMGB3。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4和(C7)C1D。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4和(C8)BRCA2。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4和(C5)HNRPA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C6)HMGB3、(C7)C1D、(C8)BRCA2和(C5)HNRPA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C6)HMGB3、(C7)C1D、(C8)BRCA2和(C5)HNRPA1。
在另一优选例中，所述抗原蛋白为：(C1)COPB1、(C2)EIF3E、(C9)P53、(C3)CCDC110、(C10)BRCA1、(C4)MAGEA4、(C6)HMGB3、(C7)C1D、(C8)BRCA2和(C5)HNRPA1。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测针对靶抗原的自身抗体，
其中，所述针对靶抗原的自身抗体选自下组：
(A)选自A1至A8中两个或两个以上自身抗体的组合：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体还包括：
(B)选自A1至A8中一个或多个自身抗体与B1至B2中一个或多个自身抗体所构成的组合；
其中，所述B1至B2的自身抗体为：(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述试剂盒通过抗原抗体反应对针对靶抗原的自身抗体进行检测。
在另一优选例中，所述试剂盒是采用以下方法进行检测：酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫、或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种检测方法，包括步骤：
(a)提供一检测样本；
(b)检测所述检测样本中针对靶抗原的自身抗体水平，记为Y1；和
(c)将所述针对靶抗原的自身抗体水平与对照参比值Y0进行比较；
其中，所述的针对靶抗原的自身抗体选自：
(A)选自A1至A8的任一抗体、或其组合：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2；
如果检测对象的针对靶抗原的自身抗体的检测结果满足以下条件时，则提示所述对象的前列腺癌发生风险高：
当某一自身抗体的水平高于参考值或标准值Y0时，则提示所述检测对象的前列腺癌发生风险高。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体还包括：
(B)选自A1至A8中一个或多个自身抗体与B1至B2中一个或多个自身抗体所构成的组合；
其中，所述B1至B2的自身抗体为：(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述检测样本选自下组：全血、血清、血浆、组织、细胞、细胞间隙液、脑脊液、尿液、或其组合。
在另一优选例中，所述检测样本选自下组：全血、血清、血浆。
在本发明的第四方面，提供了一种前列腺癌风险判断设备，所述设备包括：
(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一对象的针对靶抗原的自身抗体数据；
其中所述的针对靶抗原的自身抗体选自：
(A)选自A1至A8的任一抗体、或其组合：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2；
(b)处理模块：将所述处理模块对输入的自身抗体水平Y1与对照参考值Y0进行比较，从而获得判别结果，其中，当比较结果符合判定条件时，则提示该对象前列腺癌风险高；反之，则提示该对象前列腺癌风险不高；
(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的判断结果。
在另一优选例中，所述针对靶抗原的自身抗体还包括：
(B)选自A1至A8中一个或多个自身抗体与B1至B2中一个或多个自身抗体所构成的组合；
其中，所述B1至B2的自身抗体为：(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
在本发明的第五方面，提供了一种自身抗体-抗原组合的诊断试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于联合诊断前列腺癌的发生风险；
其中，所述自身抗体-抗原组合包括：自身抗原PSA；和
选自下组的自身抗体：
(A)选自A1至A8的任一抗体、或其组合：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2。
在另一优选例中，所述自身抗体还包括：
(B)选自A1至A8中一个或多个自身抗体与B1至B2中一个或多个自身抗体所构成的组合；
其中，所述B1至B2的自身抗体为：(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
在另一优选例中，所述自身抗原PSA的诊断试剂为：Anti-PSA。
在另一优选例中，所述的抗体-抗原组合为：自身抗原PSA和以下七种自身抗体组成的组合：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了每个自身抗体在前列腺癌组、良性疾病组和健康对照组的水平分布散点图。
图2显示了本发明的优选自身抗体组合(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)区分本研究中的健康对照和前列腺癌患者的ROC曲线图。
图3显示了本发明的优选自身抗体组合(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)区分本研究中的良性疾病和前列腺癌患者的能力。
图4显示了本发明的检测模型(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)对不同病理分级(Gleason评分)前列腺癌的检测能力。
图5显示了本发明的检测模型(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)对不同病理分级前列腺癌的检测能力。
图6显示了本发明的自身抗体组合(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)对低PSA前列腺癌的ROC曲线图。
图7显示了在约登指数最大值时，本发明的自身抗体组合(Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1)对高PSA前列腺癌的ROC曲线图。
图8显示了以PSA独立作为前列腺癌标志物在辨别健康人群与前列腺癌患者方面的ROC曲线。
图9显示了以PSA独立作为前列腺癌标志物在辨别良性疾病患者与前列腺癌患者方面的ROC曲线。
图10显示了本发明的优选自身抗体组合联合PSA后(即分子组合为Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1和PSA)，区分本研究中的健康对照和前列腺癌患者的能力ROC曲线。
图11显示了本发明本发明的优选自身抗体组合联合PSA之后(即分子组合为Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1和PSA)，区分本研究中的良性疾病和前列腺癌患者的能力的ROC曲线。
图12显示了本发明不同自身抗体组合的敏感性比较。
图13显示了本发明不同自身抗体组合的特异性比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现一种高灵敏度和高特异性的前列腺癌的诊断和预后针对靶抗原的自身抗体。所述前列腺癌诊断和预后的针对靶抗原的自身抗体包括选自组A和组B的共计10种自身抗体，并相应开发了用于对前列腺癌发生风险和预后评估的方法和试剂盒。所述自身抗体还可与自身抗原PSA联合，对前列腺癌发生风险和预后效果进行判断，可以高灵敏和特异性检出低PSA(≤4ng/mL)前列腺癌患者。在此基础上完成了本发明。
术语
在本发明中，术语“抗原”或术语“抗原蛋白”可互换使用。
术语“抗体”、“自身抗体”、“本发明自身抗体”和“本发明针对靶抗原的自身抗体”在本发明中可以互换。
此外，本发明中涉及以下实验操作或定义。应注意，本发明还可采用本领域其他常规技术进行实施，并不仅限于以下实验操作。
(一)重组抗原蛋白的制备
将肿瘤抗原的cDNA片段克隆到含6XHis标记的PET28(a)表达载体上。在抗原的N端或C端，引入链霉亲和素蛋白或类似物(结合生物素的标签蛋白)。获得的重组表达载体转化大肠杆菌进行表达。上清表达的蛋白通过Ni-NTA亲和柱和离子柱进行纯化。当蛋白表达在包涵体内，用6M盐酸胍对蛋白进行变性处理，并在体外按照标准方法进行复性折叠，然后通过6XHis标签进行Ni-NTA亲和柱纯化，获得抗原蛋白。
(二)血清或血浆的制备和保存
前列腺癌患者血清或血浆在患者最初诊断为前列腺癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集。血浆或血清按标准临床程序制备，置于-80℃冰箱中长期保存。
(三)ELISA检测
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量样本中自身抗体标志物的浓度。纯化的肿瘤抗原通过其标签链霉亲和素或类似物固定到微孔表面。微孔预包被生物素标记的牛血清白蛋白(BSA)。血清或血浆样本用磷酸盐缓冲稀释1:110倍，加入微孔进行反应(50毫升/孔)。用洗液冲洗未结合的血清或血浆成分后，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-人IgG进行反应。然后加入反应底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色。加入终止溶液(1NHCl)，吸亮度为450nm单光谱进行酶标仪进行读值(OD)。用标准曲线定量血清自身抗体浓度。
通过夹心法酶联免疫吸附测定定量样本中抗原标志物的浓度。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质；加受检标本，即血清或血浆样本用磷酸盐缓冲稀释1:110倍，加入微孔进行反应(50毫升/孔)，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。加辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-人IgG进行反应。然后加入反应底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色。加入终止溶液(1N HCl)，吸亮度为450nm单光谱进行酶标仪进行读值(OD)。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
(四)自身抗体和/或抗原蛋白的临界值(cutoff值)
自身抗体和/或抗原水平的cutoff值被定义为等于对照组(所述对照组为经身体检查确认未患有癌症的人群)中健康对照队列的平均值加2个标准偏差(SD)。
(五)单个自身抗体和抗原蛋白的阳性、阴性判断
对于每种自身抗体和/或抗原蛋白测定，阳性反应定义为对样本中自身抗体和/或抗原蛋白的水平进行定量后，将其与cutoff值进行比较，≥cutoff值为阳性；相应地，阴性反应定义为＜cutoff值为阴性。
(六)自身抗体和/或抗原蛋白组合的阳性判断
由于单个自身抗体和/或单个抗原蛋白的阳性率低，为了增加自身抗体和/或抗原蛋白检出的阳性率，分析结果时联合多个自身抗体和/或联合多个抗原蛋白的结果来判断预测效果。
规则是：
(1)在样本中检测多个自身抗体，只要有其中一个或者多个自身抗体显示阳性，则判断抗体组合结果为阳性；而如果所有的自身抗体均为阴性，则判断结果为阴性。
(2)在样本中检测多个抗原蛋白，只要有其中一个或多个抗原蛋白显示为阳性，则判断结果为阳性；而如果所有的抗原蛋白为阴性，则判断结果为阴性。
(3)在样本中同时检测多个自身抗体和多个抗原蛋白，只要其中有一个或多个自身抗体和/或抗原蛋白为阳性，则判断结果为阳性；而如果所有的抗体和抗原蛋白为阴性，则判断结果为阴性。
(七)统计分析方法
使用GraphPad Prism v.6(Graphpad Prism软件，加利福尼亚州圣地亚哥)和针对Windows的IBM SPSS Statistics 23(IBM，纽约，纽约)，使用Mann–Whitney U检验对两组进行了统计学分析。在分析每个参数之间的关系时，执行了Spearman的相关分析。
(八)敏感性和特异性判断
敏感性：金标准诊断全部前列腺癌病例中，自身抗体、自身抗体组合、抗原蛋白、抗原蛋白组合和自身抗体与抗原蛋白组合检测结果为阳性的病例占全部有病病例的比例。
特异性：金标准诊断全部无病的受试者中，自身抗体、自身抗体组合、抗原蛋白、抗原蛋白组合和自身抗体与抗原蛋白组合检测结果为阴性的受试者占全部无病受试者的比例。
前列腺特异性抗原(PSA)
前列腺特异性抗原(PSA)是最常见的前列腺癌检查指标。PSA是一种丝氨酸蛋白酶，是编码在13号染色体上的激肽释放酶家族的成员，存在于前列腺管腔上皮细胞中。破坏前列腺导管天然组织层的任何事情都可能导致PSA升高。血清中引起PSA升高的非恶性原因包括良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎、尿潴留或器械检查(例如，导尿、经尿道超声和前列腺活检)。鉴于有多种因素会导致PSA升高，因此很多情况下难以解释PSA升高的明确原因。此外，引起血清PSA水平的混淆解释的另一个原因是有争议的“正常”值。PSA以纳克/毫升(ng/mL)为单位测量，公认的正常参考范围为0至4ng/mL，这时使用PSA为前列腺癌标志物的特异性仅为60％。
由于PSA水平会随着年龄和前列腺体积(即BPH)而上升，因此建议使用年龄调整值。此外，种族的差异也使PSA“正常”范围产生变化。前列腺癌PSA筛查也引发了人们的忧虑，这由于担心引发不必要的活检风险、筛查检测到的惰性肿瘤的过度诊断和过度治疗、以及可能的不良副作用。因此，PSA难以成为一种普遍适用的、稳定的、高特异性的前列腺癌标志物。
检测方法
基于前列腺患者的针对靶抗原的自身抗体在血液、血浆或血清等中水平升高，本发明还提供了相应的诊断前列腺发病风险和方法。
本发明提供的针对靶抗原的自身抗体包括选自组A和选自组B的共计10种自身抗体：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2；(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
本发明涉及定量和定位检测人针对靶抗原的自身抗体水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的针对靶抗原的自身抗体水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)前列腺癌发生的风险，和/或前列腺癌的预后评价。
一种优选的方法是对针对靶抗原的自身抗体进行定量检测。
优选地，一种检测样本中是否存在针对靶抗原的自身抗体的方法是利用特异性抗原进行检测，它包括：将样本与抗原蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样本中存在针对靶抗原的自身抗体。
本发明针对靶抗原的自身抗体可用于前列腺癌的诊断。针对靶抗原的自身抗体的抗原蛋白可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样本中的针对靶抗原的自身抗体白。
基于本发明的研究，本发明针对靶抗原的自身抗体水平，在前列腺癌患者中存在显著上升。因此，本发明针对靶抗原的自身抗体可用作检测或诊断(尤其是辅助性诊断和/或早期诊断)前列腺癌发生风险的标志物。在检测时，如果自身抗体水平Y1与正常人群中的相应水平Y0的比值(Y1/Y0)≥1.5，较佳地≥2更佳地≥3，则均可视为前列腺癌发生的风险上升。
此外，本发明人还意外地发现，本发明针对靶抗原的优选自身抗体组合本发明的抗体组合对病理分级(Gleason评分)较高的前列腺癌患者具有更好的检测能力，且对中、低PSA水平的前列腺癌患者具有更好的检出率。
检测试剂盒
基于本发明针对靶抗原的自身抗体与前列腺癌风险和预后的相关性，因此本发明针对靶抗原的自身抗体可以作为前列腺癌发生的诊断标志物，和/或前列腺癌预后评估标志物。
本发明提供的针对靶抗原的自身抗体包括选自组A和选自组B的共计10种自身抗体：(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(A6)Anti-HMGB3；(A7)Anti-C1D；(A8)Anti-BRCA2；(B1)Anti-P53；(B2)Anti-BRCA1。
本发明还提供了一种诊断前列腺癌发生的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测本发明针对靶抗原的自身抗体。优选地，所述试剂盒含有本发明的针对靶抗原的自身抗体的抗原，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断前列腺癌发生风险和/或评价前列腺癌预后情况。
本发明的主要优点：
(1)通过本发明所述的自身抗体进行前列腺癌的诊断或检测，仅需要通过血清或血浆样本进行，无需取组织样品进行检测，避免了患者对该类检测的抗拒性，有助于发现早期前列腺癌患者，延长患者生存周期和提升生活质量，具有很高的临床应用前景。
(2)本发明所述的自身抗体组合对前列腺癌患者和前列腺良性疾病具有良好的区分能力。
(3)相较于传统的肿瘤标志物或者单个本发明所述的自身抗体对前列腺癌的检测或诊断，本发明所述的自身抗体或自身抗体联合PSA的灵敏性均明显提升。
(4)本发明的自身抗体组合对现有技术中无法有效检测的低、中PSA水平的前列腺癌患者，具有优良的检出能力，可进一步降低前列腺癌所带来的危害。
(5)与恶性程度较低的前列腺癌，本发明的自身抗体组合对于恶性程度高的前列腺癌具有更好的检出能力，有助于尽早确诊和治疗，延长患者生存期。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
实施例1.患者血清样本中单一自身抗体敏感性和特异性检测
本实施例包括健康体检人群29例、良性前列腺疾病患者46例和前列腺癌患者105例，进行自身抗体标志物的筛选。受试者来自不少于3个不同医疗中心。所有的前列腺癌患者血清都是在患者诊断为前列腺癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的，并在-80℃冰箱保存。受试人群信息如表1所示。
表1
将前列腺癌抗原经过表达纯化后包被到96孔板表面，封闭后和稀释1:110倍的前列腺癌血清、良性疾病患者或体检对照人群血清反应，接着和抗人IgG抗体-HRP辣根过氧化氢酶反应，然后进行显色反应，并用酶标仪OD450nm波长检测。表2示出检测敏感性和特异性。
表2.血清样本中单个自身抗体作为标志物的敏感性和特异性
以上10个自身抗体在前列腺癌组、良性疾病组和健康对照组的水平分布散点图见图1和表3。由于肿瘤患者免疫系统的差异，加上肿瘤产生机理多样性，单个肿瘤自身抗体在肿瘤患者的分布敏感性低。
表3.10个自身抗体在前列腺癌组、良性疾病组和健康对照组的水平分布数据表(单位：U/mL)
注：U/mL(unit/ml)，抗体滴度用来衡量某种抗体(antibody)识别特定抗原决定部位(epitope)所需要的最低浓度(也即最大稀释度)。一般表示为：仍能产生阳性结果的最大稀释度。通常通过ELISA方法来检测抗体滴度。
使用kruskal-wallis test进行自身抗体在前列腺癌组、良性疾病组和健康对照组的水平分布的统计分析，发现抗COPB1、EIF3E、P53、HMGB3、C1D、BRCA2和HNRPA1的抗体在前列腺癌组中，显著高于良性疾病组和对照组的水平(p<0.05)，其余分子也存在前列腺患者中升高的趋势。
实施例2.筛选建立用于前列腺癌检测的自身抗体组合
针对上述的肿瘤相关自身抗体分子，本发明综合考虑候选分子在前列腺癌患者中的阳性检出率和特异性，同时剔除重叠阳性检出较高(即单独阳性贡献率低)的分子。从前述的自身抗体中选择不同的分子，形成不同的自身抗体组合，并使用对应的检测试剂对其进行检测，结果见表4和图12-13。
表4.自身抗体组合作为前列腺癌标志物的敏感性和特异性
确定一组优选的自身抗体组合，包括以下抗体：Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1，该组合的敏感性和特异性分别是54.29％和89.66％。
实施例3本发明的抗体组合对前列腺癌患者和健康人的区分能力
利用受试者工作特征曲线(ROC)分析，本发明的优选自身抗体组合区分本研究中的健康对照和前列腺癌患者的能力。此ROC曲线如图2所示，在约登指数达到最大值时，敏感性和特异性分别为53.16％和96.15％，曲线下面积为0.8598。
实施例4本发明的抗体组合对前列腺癌患者和良性疾病患者的区分能力
利用受试者工作特征曲线(ROC)分析，本发明的优选自身抗体组合区分本研究中的良性疾病和前列腺癌患者的能力。此ROC曲线如图3所示，在约登指数达到最大值时，敏感性和特异性分别为59.21％和80.95％，曲线下面积为0.8111。
实施例5本发明的抗体组合对病理分级(Gleason评分)较高的前列腺癌患者具有更好的检测能力
本发明根据Gleason评分标准，对受试患者的病理分级进行分类，将大于等于8分的病例列为高级别前列腺癌；对小于等于7分的病例列为低级别前列腺癌。对不同类型的患者，分析他们的血清检测数据，本发明的检测模型对不同病理分级前列腺癌的检测能力。
如图4和5所示，本发明的自身抗体组合对低级别前列腺癌的敏感性为57.14％、特异性为86.36％、曲线下面积为0.7955；对高级别前列腺癌的敏感性为62.50％、特异性为95.45％、曲线下面积为0.8523。该检测模型对病理分级较高(即恶性程度较高)的前列腺癌患者具有更好的检测能力。
实施例6.本发明的抗体组合对低PSA水平的前列腺癌患者具有更好的检测能力
本发明以10ng/mL为标准对受试患者的进行分类，将大于等于10ng/mL的病例列为高PSA前列腺癌；对小于10ng/mL的病例列为中低PSA前列腺癌。对不同类型的患者，分析他们的血清检测数据，分析本发明的抗体组合对不同PSA水平前列腺癌的检测能力。本发明发现在高PSA患者中，抗体的阳性检出率为51.43％；在低PSA患者中，抗体组合的阳性检出率为55.71％。这说明本抗体组合对于低PSA水平的前列腺癌患者具有更高的敏感性。
如图6和7所示，在约登指数最大值时，本发明的自身抗体组合对低PSA前列腺癌的敏感性为61.11％、特异性为91.30％、曲线下面积为0.8945；对高PSA前列腺癌的敏感性为53.13％、特异性为90.91％、曲线下面积为0.8196。该检测模型对低PSA水平的前列腺癌患者具有更好的检测能力。
实施例7.PSA独立作为前列腺癌标志物区分良性和恶性前列腺疾病的能力较弱
本实施例针对本发明的受试人群，以PSA独立作为前列腺癌标志物，分析其在辨别健康人群或良性疾病患者，与前列腺癌患者方面的能力。
本发明以10ng/mL作为阈值时，根据PSA的检测结果，其检测特异性为100％，敏感性为33.33％。
如图8所示，当以健康人群作为对照时，根据roc分析，在约登指数最大值时，PSA的敏感性和特异性分别为67.35％和89.66％，曲线下面积为0.8033。
如图9所示，当以良性疾病患者作为对照时，在约登指数最大值时，PSA的作为标志物的敏感性和特异性分别为40.00％和93.48％，曲线下面积仅为0.6253，可见PSA区分良性和恶性前列腺疾病的能力较弱。
实施例8.本发明抗体组合对中、低PSA前列腺癌患者中具有更高的癌症检出率
本发明将前列腺癌人群划分为0-4ng/mL的低PSA患者(4ng/mL是临床界定PSA异常升高的阈值)，4-10ng/mL的中PSA患者(PSA值异常的灰色状态)和10ng/mL以上的高PSA患者(通常把10ng/mL作为筛选前列腺癌的临界值)。
在前列腺癌人群中，中、低PSA患者抗体阳性检出率较高，这两部分人的合计抗体阳性率为55.71％[(14+25)/(31+39)]，呈现与PSA检测良好的互补性，能够对中、低PSA患者有更好的癌症检出率。
不同PSA水平的前列腺癌患者的优选自身抗体组合阳性率如表5所示。
表5
Thompson IM等人在美国开展的一项前列腺癌筛查临床研究，其结果研究发现，每年对受试人群使用PSA进行前列腺癌筛查，在研究历时七年的结束之际，在七年间从未出现PSA异常升高的人群中，仍旧有15.2％的前列腺癌发生率，并且这些患者中14.9％是Gleason评分大于或等于7的较恶性的前列腺癌病例。
由此可见，PSA对于相当一部分前列腺癌是没有预警能力的，而本发明的分子组合在低PSA前列腺癌患者中的敏感度较PSA有明显改善。若将本发明加入前列腺癌的筛查之中，可进一步降低前列腺癌所带来的危害。
实施例9.本发明的抗体组合的假阳性率低于PSA分子的假阳性率
在良性前列腺疾病患者中，抗体组合的假阳性率和PSA的相比更低(以4ng/mL为阈值)。
对于优选自身抗体而言，46例良性前列腺疾病患者中有9例抗体组合检测呈阳性；对于PSA而言，同样的46例良性患者中有29例的PSA高于临床标准阈值，所以抗体组合的假阳性率显著低于临床常用的PSA分子(19.57％vs.63.04％)，这样减少了过度诊断的情况。
由此可见，本发明的优选自身抗体组合作为前列腺癌标志物的准确性优于当前临床常用的PSA分子。
良性疾病患者中自身抗体组合和PSA(以4ng/mL为阈值)假阳性率统计如表6所示。
表6
假阳性率
优选的自身抗体组合 19.57％
PSA(以4ng/mL为阈值) 63.04％
实施例10本发明的抗体组合联合PSA对前列腺癌患者和健康人的区分能力进一步提升
如上所述，本发明的抗体组合检测与PSA检测结果存在良好的互补性，因此我们将这两类检测联合应用。利用受试者工作特征曲线(ROC)分析，本发明的优选自身抗体组合联合PSA之后(即分子组合为Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1和PSA)，区分本研究中的健康对照和前列腺癌患者的能力。
联合后的分子组合在前列腺癌患者中的阳性检出率提升至70.48％，明显高于仅使用抗体组合。此ROC曲线如图10所示，在约登指数达到最大值时，敏感性和特异性分别为66.67％和86.36％，曲线下面积为0.8793。相比较仅用抗体组合，联合后的检测模型性能进一步被提升。
实施例11.本发明的抗体组合联合PSA对前列腺癌患者和良性疾病患者的区分能力也得到优化
利用受试者工作特征曲线(ROC)分析，本发明的优选自身抗体组合联合PSA之后(即分子组合为Anti-COPB1、Anti-EIF3E、Anti-P53、Anti-CCDC110、Anti-BRCA1、Anti-MAGEA4、Anti-HNRPA1和PSA)，区分本研究中的良性疾病和前列腺癌患者的能力。
此ROC曲线如图11所示，在约登指数达到最大值时，敏感性和特异性分别为65.22％和80.95％，曲线下面积为0.8413。此较单纯使用自身抗体进行检测，灵敏性和曲线下面积有明显提升。
本发明的抗体组合联合PSA对前列腺癌患者和健康人，和前列腺癌患者和良性疾病患者的区分能力情况如表7所示。
表7
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种针对靶抗原的自身抗体的诊断试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于诊断前列腺癌的发生风险；
其中，所述的针对靶抗原的自身抗体包括：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；和(B2)Anti-BRCA1。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述针对靶抗原的自身抗体的诊断试剂为抗原蛋白。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗原蛋白包括：(C1)COPB1；(C2)EIF3E；(C3)CCDC110；(C4)MAGEA4；(C5)HNRPA1；(C9)P53；和(C10)BRCA1。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测针对靶抗原的自身抗体，
其中，所述针对靶抗原的自身抗体包括：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；和(B2)Anti-BRCA1。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过抗原抗体反应对针对靶抗原的自身抗体进行检测。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是采用以下方法进行检测：酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫、或其组合。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还记载以下检测方法，包括步骤：
(a)提供一检测样本；
(b)检测所述检测样本中针对靶抗原的自身抗体水平，记为Y1；和
(c)将所述针对靶抗原的自身抗体水平与对照参比值Y0进行比较；
其中，所述的针对靶抗原的自身抗体包括：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；和(B2)Anti-BRCA1；
如果检测对象的针对靶抗原的自身抗体的检测结果满足以下条件时，则提示所述对象的前列腺癌发生风险高：
当某一自身抗体的水平高于参考值或标准值Y0时，则提示所述检测对象的前列腺癌发生风险高。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测样本选自下组：全血、血清、血浆、组织、细胞、细胞间隙液、脑脊液、尿液、或其组合。
9.一种前列腺癌风险判断设备，其特征在于，所述设备包括：
(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一对象的针对靶抗原的自身抗体数据；
其中所述的针对靶抗原的自身抗体包括：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；和(B2)Anti-BRCA1；
(b)处理模块：将所述处理模块对输入的自身抗体水平Y1与对照参考值Y0进行比较，从而获得判别结果，其中，当比较结果符合判定条件时，则提示该对象前列腺癌风险高；反之，则提示该对象前列腺癌风险不高；
(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的判断结果。
10.一种自身抗体-抗原组合的诊断试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于联合诊断前列腺癌的发生风险；
其中，所述自身抗体-抗原组合包括：自身抗原PSA；和
以下自身抗体：
(A1)Anti-COPB1；(A2)Anti-EIF3E；(A3)Anti-CCDC110；(A4)Anti-MAGEA4；(A5)Anti-HNRPA1；(B1)Anti-P53；和(B2)Anti-BRCA1。
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