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CN116507723A - 用于covid-19和广谱抗病毒疗法和预防的核酸酶-树枝状大分子调配物 - Google Patents

用于covid-19和广谱抗病毒疗法和预防的核酸酶-树枝状大分子调配物 Download PDF

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CN116507723A
CN116507723A CN202180068571.7A CN202180068571A CN116507723A CN 116507723 A CN116507723 A CN 116507723A CN 202180068571 A CN202180068571 A CN 202180068571A CN 116507723 A CN116507723 A CN 116507723A
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rnase
cationized
nuclease
dendrimer
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Fulu Laboratory Co
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Abstract

在各个实施例中，核酸酶与树枝状大分子一起调配的组合物以药学上有效的剂量用作用于如HCoV‑OC43、SARS‑CoV‑2(covid‑19)等冠状病毒和广谱病毒的治疗剂。当阳离子化的核酸酶与树枝状大分子混合和/或复合时，显现出乎意料的正树枝状大分子效应。此正树枝状大分子效应显示对于催化抗病毒RNA酶特性是高度有效的。在各个实施例中，阳离子化的核酸酶与树枝状大分子组合的组合物证明了抗病毒有效性的这种协同放大，并且以药学上有效的剂量用作针对冠状病毒HCoV‑OC43、SARS‑CoV‑2和广谱病毒的治疗剂。表现出正树枝状大分子效应的示例调配物为与第2代PAMAM树枝状大分子混合和/或复合的阳离子化的RNA酶A。

Description

用于COVID-19和广谱抗病毒疗法和预防的核酸酶-树枝状大 分子调配物
技术领域
发明领域为抗病毒治疗组合物，包含在治疗人类冠状病毒时在药学上有效的组合物，所述人类冠状病毒包含HCoV-OC43和SARS-CoV-2(Covid-19)病毒感染。
背景技术
人类基因组的分解证明了地方性病毒与人相互作用的深度。基因组中所谓的“病毒遗产”部分是编码DNA的组合蛋白的相对比例的五倍至六倍。这种古病毒学仍然是一种明显且现实的公共健康危险，其表现为SARS-CoV-2(Covid-19)冠状病毒大流行。病毒大流行对公共健康构成的危险不仅是长期存在的，其还与现代人一样长久。
医学对于预防和治疗病毒感染的有效解决方案有限。以当前的大流行为例，由于病毒在世界一些地区几乎不受控制地传播，目前没有疫苗，并且只有支持性护理以限制器官损害。还没有能够完全破坏这种病毒的抗病毒疗法。
大多数公共健康专业人员认为开发疫苗将是缓解病毒大流行的最有可能的手段，然而，疫苗开发的局限性比广泛向公众报道的要多。针对所有病毒变体的疫苗有效性至少面临三个重大障碍：
●聚糖屏障覆盖病毒表面，从而将抗体隔绝以至于无法识别屏障下的抗原或以其它方式防止抗体识别屏蔽下的抗原；
●遗传变异，如病毒RNA的突变，所述突变产生经修饰的蛋白质，使得所述经修饰的蛋白质无法被抗体识别；
●构象掩蔽或病毒能够改变其三维结构，如最后一列的底部所示，表位(可以被抗体识别)被掩蔽，并且病毒仅在需要表位与宿主细胞结合时才暴露那些表位。
发明内容
提供了用于治疗和预防病毒感染以及与活宿主的病毒感染相关的疾病的化合物和组合物和/或方法。具体地，提供了用于治疗和预防冠状病毒，如SARS-CoV-2(covid-19)的化合物和组合物和/或方法。这些化合物和组合物包含阳离子化的核糖核酸酶以及包含阳离子化的核糖核酸酶A(RNA酶A)的树枝状大分子和第2代聚PAMAM树枝状大分子。
附图说明
图1是示出病毒复制的示例过程的图。
图2是示出用于阳离子化的核酸酶破坏病毒RNA复制的示例过程的图。
图3A-C示出了covid-19病毒如何破坏人体组织的各个阶段和机制。
图4是示出了负面地影响RNA酶的递送有效性([r]/[R])的许多示例因素的图。
图5是示出阳离子化的核酸酶的有效性提高的示例机制的图。
图6是示出带正电荷的相应核酸酶化合物的DNA和RNA碱基与其固有负电荷电化学归属的图。
图7是示出了从噬菌体中喷射核物质的过程的图。
图8A-B是示出了内吞期间从病毒中喷射核物质的类似过程的图。
图9示出了具有示出的固有阳离子“条带”并且在图中与所公开的阳离子化基团叠加的示例核酸酶的GRASP模型。
图10图解地示出了病毒核物质与所公开的阳离子化的核酸酶之间的增强的相互作用的示例机制。
图11示出了用于使所选核酸酶阳离子化的示例化学反应过程。
图12示出了使用HEK293T细胞对DNA酶和RNA酶影响病毒复制的时间过程测定。
图13示出了非阳离子化的核酸酶的实验组。
图14示出了阳离子化的核酸酶的实验组。
图15示出了替代性实验方案的时间过程测定。
图16示出了聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子的化学结构。
图17示出了论证地描绘了示例所公开的核酸酶的经优化的有效阳离子化的图，与先前发布的结果相比，所述所公开的核酸酶平衡了阳离子化电荷对核酸酶的内吞和酶促效率的影响。
图18示出了使用所描述的方案的实验结果的图，所述实验结果表明RNA酶/DNA酶相对于对照样品的有效性。
图19示出了与树枝状大分子复合的非阳离子化的核酸酶的实验组。
图20示出了使用所描述的方案的实验结果的图，所述实验结果表明RNA酶/DNA酶和与树枝状大分子复合的RNA酶/DNA酶相对于对照样品的有效性。
图21示出了低浓度和高浓度阳离子化的核酸酶的实验组。
图22示出了使用所描述的方案的实验结果的图，所述实验结果表明各种浓度的阳离子化的RNA酶的有效性。
图23示出了使用所描述的方案的实验结果的图，所述实验结果表明各种浓度的阳离子化的RNA酶随时间推移的有效性。
图24示出了使用所描述的方案的实验结果的条形图，所述实验结果示出RNA酶/DNA酶和树枝状大分子调配物的对比有效性。
图25示出了阳离子化的核酸酶-树枝状大分子调配物的实验组。
图26示出了使用所描述的方案的实验结果的图，所述实验结果表明各种浓度的轻度阳离子化的RNA酶、树枝状大分子和两者的调配物的有效性。
图27示出了逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的结果，所述结果示出了3天后所公开的核酸酶/树枝状大分子调配物的有效性。
图28示出了逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的结果，所述结果示出了5天后所公开的核酸酶/树枝状大分子调配物的有效性。
图29是比较地汇总了在减少病毒负载方面的抗病毒有效性的所有实验结果的表。
图30描绘了示出所描述的实验的组成的表。
图31描绘了所描述的实验中使用的基础组合物的组分的表。
图32是所描述的实验中测试的调配物的表。
图33是示出所描述的实验的结果的条形图。
图34是示出树枝状大分子/核酸酶组合物的所描述的意外有效性的运输/动力学模型的图。提供了对机制的解释的对应速率方程在下面的描述中呈现。
具体实施方式
以下关于阳离子化的核酸酶的制备的出版物通过引用并入：二见纯一郎(Futami,Junichiro)等人“通过阳离子化制备有效的细胞毒性核糖核酸酶：通过化学修饰羧基增强细胞摄取并减少与核糖核酸酶抑制剂的相互作用(Preparation of potent cytotoxicribonucleases by cationization:enhanced cellular uptake and decreasedinteraction with ribonuclease inhibitor by chemical modification of carboxylgroups.)”生物化学(Biochemistry)40.25(2001):7518-7524；二见纯一郎等人“对阳离子化的核糖核酸酶的最高细胞毒性的最佳修饰(Optimum modification for the highestcytotoxicity of cationized ribonuclease.)”生物化学杂志(The Journal ofBiochemistry),132.2(2002):223-228。
提供了可用于治疗和预防病毒感染，具体地冠状病毒感染，包含与活宿主的冠状病毒感染相关的疾病的化合物。具体地，提供了用于治疗和预防冠状病毒，如covid-19的化合物和组合物和/或方法。然而，在提供另外的细节之前，将首先定义以下术语。
定义
根据本说明书，以下缩写和定义适用。必须注意，如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确规定。
本文讨论的任何出版物仅出于其公开的目的提供。本文的任何内容都不应被解释为承认提前出版。进一步地，提供的发布日期可能与实际发布日期不同，所述实际发布日期可能需要独立确认。
在提供值的范围的情况下，应当理解，涵盖了每个中间值。这些更小范围的上限和下限可以独立地包含在更小范围之内，这受制于所陈述的范围中的任何具体排除的限制。在表述的范围包含这些限制中的一个或两个的情况下，排除那些包含的限制中的任一个或两个的范围也包含在本发明中。还设想了落入所阐述的范围内的任何值。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可以用于实践或测试。本文所提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与出版物所引用的方法和/或材料结合的方法和/或材料。
“患者”或受试者旨在包含任何哺乳动物。出于治疗目的，“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包含但不限于人、实验动物(包含大鼠、小鼠和豚鼠)、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物(如狗、马、猫、牛等)。
术语“功效”，如本文在慢性剂量方案的上下文中所使用的，是指特定治疗方案的有效性。功效可以基于响应于药剂的疾病过程的变化来测量。
术语“成功”，如本文在慢性治疗方案的上下文中所使用的，是指特定治疗方案的有效性。其包含功效、毒性(例如，副作用和患者对调配物或剂量单位的耐受性)、患者依从性等的平衡。对于被视为是“成功的”慢性施用方案来说，其必须平衡患者护理和功效的不同方面，以产生有利的患者结果。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中用于指获得期望的药理和/或生理作用。就预防或部分预防疾病、其症状或病状而言，所述作用可以是预防性的和/或就疾病、病状、症状或归因于疾病的副作用的部分或完全治愈而言可以是治疗性的。
如本文所用，术语“治疗”涵盖对哺乳动物，如人的疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防可能易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者出现疾病，即使疾病的临床症状不会在可能易患疾病但尚未经历或显示出疾病的症状的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止或减少疾病或其临床症状的发展；以及(c)缓解疾病，即使疾病和/或其症状或病状消退。设想了治疗患有与病理性炎症相关的疾病的患者。还设想了预防、抑制或缓解归因于长时间段的病理性炎症和/或由对长时间段存在于生物系统中的不适当的炎症的生理应答如此引起的不良作用。
“任选地取代的”意指所引用的基团可以是未经取代的或者所引用的基团可以是经取代的。
“药学上可接受的载体”意指可用于制备通常安全、无毒的并且既不是生物学上也不是其它方面不期望的药物组合物或调配物的载体并且包含对于兽医用途以及人类药物用途可接受的载体。药学上可接受的载体或赋形剂包含一种或多于一种此类载体。
“药学上可接受的阳离子”是指药学上可接受的盐的阳离子。
“药学上可接受的盐”是指保留化合物的生物有效性和性质的盐，所述生物有效性和特性不是生物学上或其它方面不希望的。药学上可接受的盐是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域熟知的多种有机和无机抗衡离子并且仅举例来说包含钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵等，并且当分子含有碱性官能团时，包含有机酸或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”疾病包含：
●预防疾病，即使疾病的临床症状不会在可能暴露于或易患疾病但尚未经历或显示出疾病的症状的哺乳动物中发生；
●抑制疾病，即阻止或减少疾病或其临床症状的发展；或者
●缓解疾病，即使疾病或其临床症状消退。
“治疗有效量”意指在向哺乳动物施用以治疗疾病时，足以实现对疾病的这种治疗的化合物或抗体的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病和其严重程度以及要治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。
化合物可以充当前药。前药意指当这种前药被施用于哺乳动物受试者时，在体内释放活性母体药物的任何化合物。前药是通过以这样的方式修饰存在的官能团制备的，即所述修饰可以在体内切割以释放母体化合物。前药包含其中羟基、氨基或巯基与可以在体内切割以分别再生游离的羟基、氨基或巯基的任何基团键合的化合物。前药的实例包含但不限于酯(例如，乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、羟基官能团的氨基甲酸酯(例如，N,N-二甲氨基-羰基)等。
在一实施例中，提供了一种用于治疗或预防病毒感染或与病毒感染相关的疾病的方法，所述方法包括以治疗有效量向有需要的哺乳动物施用阳离子化的核酸酶的化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施例中，提供了一种药物组合物，其包括药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。另外，提供了阳离子化的核酸酶的化合物以及其药学上可接受的盐。测量了某些阳离子化的核酸酶与树枝状大分子的混合物和/或复合物的意想不到的实质性抗病毒有效性。提出树枝状大分子与阳离子化的核酸酶混合的意想不到的抗病毒作用是正树枝状大分子效应的结果，而先前在树枝状大分子-RNA酶组合物的情况下未显示出这种作用。如以下示出且详述的，将所公开的树枝状大分子添加到阳离子化的RNA酶中以指数方式以至少4log10至5log10影响RNA酶的催化活性有效性。
为了证实正树枝状大分子效应机制对RNA酶的酶促作用为催化作用，进行了实验，以确定组合物对来自从啤酒酵母中纯化的酵母tRNA的转移RNA或tRNA的直接作用。通过测量组合物对tRNA的直接影响，实验结果能够证实正树枝状大分子效应的细胞内机制。
本公开部分涉及治疗和/或预防病毒感染的方法，所述方法包括向受试者，如哺乳动物施用治疗有效量的单独的或组合的阳离子化的核酸酶或其衍生物、阳离子化的核酸酶的异构体或产物或其药学上等效的化合物。还公开了用于发现治疗和/或预防病毒感染的治疗有效的和/或治疗上安全的阳离子化的核酸酶的调配物的方法。
作为对病毒复制的过程的说明，图1呈现了示例病毒感染的几个阶段。在第一阶段21，流感病毒35附着到目标上皮细胞37。还示出了细胞核33，所述细胞核含有在病毒复制的后期阶段使用的核物质。在第二阶段23，细胞通过内吞吞噬病毒。第三阶段25显示病毒内容物被释放。病毒RNA进入细胞核，在细胞核中其被RNA聚合酶复制。第四阶段27显示病毒信使RNA(mRNA)用来制备病毒蛋白。最后，在第五阶段31，制备了新的病毒颗粒并且所述病毒颗粒被释放到胞外液中。在所述过程中没有被杀死的细胞继续制备新的病毒。因此，通过病毒内吞和RNA复制的过程，单个宿主细胞可以复制病毒的一百万个拷贝。
图2图解地示出了示例所公开的治疗剂或方法通过其中断病毒复制的机制。图2的机制被呈现为五个阶段，最后2个阶段被所公开的治疗剂或方法中断。在第一阶段41，病毒35附着到靶上皮细胞37(具有细胞核33)上，此处是在存在所公开的阳离子化的核酸酶51的情况下附着到靶上皮细胞上。在第二阶段43，细胞通过内吞57吞噬病毒和阳离子化的(具有标有“+”的额外电荷)核酸酶51。第三阶段45显示病毒内容物在存在阳离子化的核酸酶的情况下被释放。在此阶段，阳离子化的核酸酶51在电化学上归属于病毒RNA 53并且切割病毒RNA55，从而有效地破坏病毒复制。因此，在阳离子化的核酸酶中断的病毒复制过程中，第四阶段47和第五阶段49被阻止。
上面介绍的，核糖核酸酶(通常缩写为RNA酶)是一种蛋白质酶，即催化RNA降解为更小的组分的类型的核酸酶。类似地，脱氧核糖核酸酶(简称DNA酶)是催化磷酸二酯键在DNA主链中水解切割，由此使DNA降解的酶。RNA酶A是通常用于研究的RNA酶(例如，牛胰腺核糖核酸酶A)，并且是常见实验室使用的稳健的酶之一。本文鉴定的针对治疗和方法公开的示例有效核酸酶在下面进一步讨论。
虽然作为抗病毒剂的核酸酶有效性先前已在实验上显示是有效的抗病毒治疗剂，并且阳离子化的核酸酶先前已在实验上显示作为抗癌治疗剂是有效的，但阳离子化的核酸酶作为抗病毒剂的有效性是意想不到的结果或解决方案，尤其针对如covid-19病毒等冠状病毒传染性的治疗。在先前的工作中，在实验上显示核酸酶对于犬针对副粘病毒和细小病毒以及在人类患者中对于某些呼吸道疾病的有效性有限。然而，针对冠状病毒所指示的因素指示出乎意料的治疗复杂性，如图3A-C所示。图3A示出了气体交换正常的示例健康的哺乳动物肺泡。图3B示出了冠状病毒感染的几种示例有害影响，包含肺损伤，即对上皮细胞的损害；肺部中流体累积；肺部小血管内由于凝固增加导致之血液凝结。某些本文公开的阳离子化的核酸酶的治疗调配物通过使病毒RNA降解停止或减缓病毒复制来提供对covid-19的有效治疗或预防；与天然原始DNA酶类似，阳离子化的DNA酶I用于降低流体的粘弹性，以及与天然DNA酶类似，阳离子化的DNA酶用于防止通过中性粒细胞胞外诱捕网形成凝块，如图3C所示。各种本文公开的核酸酶的阳离子化的调配物的有效性表现出作为治疗剂超过已知的实验结果的显著增加的有效性，所述已知的实验结果例如限于患有淋巴白血病的动物模型(小鼠)。
所公开的阳离子化的核酸酶的调配物的治疗有效性的一种机制被认为是通过这种阳离子化改进进入细胞以避开RNA酶抑制剂的能力而超过先前已知的核酸酶机制。
有效性通过体内和体外测试以实验方式确定。体外(细胞模型)是使用人胚胎肾细胞(HEK293T)进行，以证明阳离子化的DNA酶和RNA酶的治疗调配物用于减少冠状病毒OC43复制，由此提供用于冠状病毒covid-19的初步类似有效性。在感染冠状病毒OC43的黑鼠B6上进行体内测试，以证明阳离子化的DNA酶和RNA酶的治疗调配物用于减少冠状病毒OC43复制。用以上细胞模型和动物模型的体外和体内测试证实，与用未经修饰的核酸酶调配物或用高度阳离子化的核酸酶进行的相同实验相比，最佳阳离子化的核酸酶调配物的有效性意想不到地显著提高。
图4详述了几种抑制或负面地影响旨在作为抗病毒剂的RNA酶有效性的示例机制。图的第一部分61(A)示出了RNA酶抑制剂(RI)52如何与RNA酶结合以形成惰性复合物54——RNA酶无法逃避抑制剂。第二部分63(B)示出了RNA酶如何可以在内吞期间降解，而从未到达细胞质。第三机制65(C)示出了RNA酶可以如何采取细胞内途径而不到达细胞质。其它机制可能以其它方式影响RNA酶的摄取或有效性。在示出的第四机制67(D)中，RNA酶的效率允许其逃避RI并且有效地破坏病毒RNA复制。在示出的第五机制69(E)中，RNA酶的浓度超过RNA酶抑制剂的饱和点，这允许一定数量的RNA酶破坏病毒复制。在示出的第六机制71(F)中，RNA酶可以到达细胞核的内部，从而避免RNA酶抑制剂。除了通过破坏宿主细胞外，后一种机制对增强定向到病毒复制中断的RNA酶的有效性没有帮助。需要用于改进细胞内摄取和核酸酶的有效性的经改进的且安全的机制以减轻前三种机制。
在替代性实施例中，策略按两组考虑：允许阳离子化的RNA酶避免由RNA酶抑制剂进行的抑制的那些策略(图5，75)以及改进阳离子化的RNA酶递送到细胞中的那些策略(图5，77)。所公开的核酸酶调配物的各个实施例在两种机制下起作用。避免由RNA酶抑制剂进行抑制的实施例机制包含：包封、免疫RNA酶和其它配体融合、RNA酶基因疗法、PEG化和白蛋白结合以及阳离子化。改进RNA酶递送到细胞中的实施例机制包含：二聚化、引入RI-RNA酶障碍和修饰细胞内通路。
在各个实施例中，阳离子化的RNA酶A是根据本文所公开的实验和测定的结果选择的优选的核酸酶治疗剂。在替代性实施例核酸酶中，所公开的治疗剂为阳离子化的豹蛙酶或onconase(ONC)，即存在于北方豹蛙(北美豹蛙(rana pipiens))的卵母细胞中的核糖核酸酶的改良调配物。豹蛙酶是胰腺核糖核酸酶(RNA酶A)蛋白超家族的成员，并且已知使RNA底物降解。在已发表的研究中，豹蛙酶显示出对HIV的抗病毒活性。在比较豹蛙酶对HIV的抗病毒作用与RNA酶I的抗病毒作用的研究中，RNA酶I对HIV病毒没有抗病毒作用。
在利用阳离子化的豹蛙酶的实施例中，抗病毒有效性将通过豹蛙酶附到受感染的细胞的表面上的能力而进一步增强，其中阳离子化的豹蛙酶能够通过电化学相互作用有效地靶向细胞内部的阴离子病毒基因组。
一些RNA酶已经达到用于治疗癌症的临床试验，但其作用机制尚不清楚。豹蛙酶是存在于北方豹蛙(北美豹蛙)的卵母细胞中的核糖核酸酶。豹蛙酶是胰腺核糖核酸酶(RNA酶A)蛋白超家族的成员。基于已发表的一期临床研究，最大耐受剂量(MTD)为960μg/m2皮肤面积。
图6通过图论证地示出了DNA81和RNA83链碱基85 87和相应的阳离子化的核酸酶91 51治疗剂的阴离子性质，所述治疗剂通过电化学亲和力与病毒核酸的碱基以增强的效率相互作用。
图7和图8A-B展示了复制期间噬菌体DNA喷射和病毒DNA/RNA喷射的类似过程，两个过程都具有阴离子(负)电化学特性。如以上解释的，核物质的阴离子特性是所公开的治疗性阳离子化的核酸酶调配物的一种机制，其通过电化学亲和力提高相互作用效率。
图9的GRASP图中示出的核酸酶示出了核酸酶的固有带正电荷的“条带”部分101，在本公开中，所述部分的治疗效率通过核酸酶的阳离子化，在此示出为通过添加R1+基团103而进一步增强。
图10示出了用于通过电化学亲和力增强阳离子化的核酸酶与病毒RNA或DNA之间的相互作用的了所公开的机制的另一图解表示。
图11提供了在存在替代浓度的1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的情况下，用替代性阳离子化R官能团对几种经鉴定的核酸酶进行的示例阳离子化的一系列反应过程。如所示出的，阳离子化可以用于DNA酶或RNA酶核酸酶，其中为RNA酶A，例如豹蛙酶onconase，以及cSBL(来自牛蛙美洲牛蛙卵母细胞(bullfrog Rana catesbeianaoocyte)的唾液酸结合凝集素)和jSBL(来自日本蛙卵母细胞的唾液酸结合凝集素)；RNA酶I(n＝13)；HEL(n＝10)；RNA酶T、T1、T2(n＝v、w、x)；DNA酶I(n＝y)；DNA酶A(n＝z)。在图14和上图中，n表示经鉴定的核酸酶的可用阳离子结合位点(在RNA酶A的情况下为羧基)的数量，并且v、w、x、y和z表示所命名的核酸酶的可用阳离子结合位点的具体数量。进一步地，在此方程的右侧，m表示实际通过反应阳离子化的位点的数量。
在各个所选方法实施例中，利用了用于测试所公开的组合物的所发布方案的一个版本来确定针对当前靶向的疾病家族，即冠状病毒或具体地covid-19的治疗上合适的核酸酶调配物和组合物。在此示例方案中，将汇合3T3-SV-40细胞与阳离子化的和非阳离子化的RITC标记的RNA酶A(见图14)一起在37℃下温育120分钟，并且在共聚焦显微术下检查细胞。在一测定实施例中，非阳离子化的核酸酶的测试版本为：VRITC标记的RNA酶A，并且阳离子化的核酸酶的测试版本为：RNA酶A-SO3 -、RNA酶A-OH和RNA酶A-NH3 +。请注意，使用了RITC标记的RNA酶，因为其红色荧光可用作激活的度量。在各个实施例中，替代性R基团或具有可用的R基团的化合物选自化学上操作性的替代品，例如通过与甘氨酸甲酯(C3H7NO2)反应。
在替代性实施例中，治疗组合物是非阳离子化的核酸酶和/或阳离子化的核酸酶的组合，如上文和下文所述，所述组合可以作为抗病毒治疗剂通过不同的机制进行操作。
核酸酶的离子化或阳离子化增加已被鉴定为降低高离子化水平下的酶促效率。相反地，核酸酶的离子化水平增加已被鉴定为增加核酸酶的细胞内吞。在各个实施例中，通过优化带正电荷的或阳离子化的核酸酶的浓度来确定治疗剂量，所述核酸酶替代性地促进内吞或促进定向到受感染的细胞的靶病毒的破坏性酶促活性。
在替代性实施例中，在组合治疗组合物中使用了已在文献中被鉴定为降低细胞内粘弹性的核酸酶DNA酶I以减轻充满流体的间质中的过度肺泡流体粘度，如图3B所示。这种治疗机制是适于covid-19冠状病毒的特定致病问题的意想不到的应用。在替代性实施例中，选择以上所述的合适的组合物以用于其它病毒感染，如季节性流感。
在各个实施例中，治疗性酶组合物的RNA酶和DNA酶元件被修饰成通过共处理或将相应的核酸酶与不同大小/传代的高度阳离子(净分子电荷Z＝+16至+30)树枝状大分子聚(酰胺-胺)(PAMAM)混合来增加递送有效性(被定义为[r]/[R]并在下文描述)和抗病毒功效。第2代PAMAM树枝状大分子的化学结构在图16中示出。替代性实施例利用第0代至第10代PAMAM树枝状大分子。此机制与共价阳离子化协同工作，以促进酶组合物运输到病毒感染的细胞的细胞质中。
在与已知机制不同的所公开的实施例中，利用两种运输机制之间的协同作用，而不排除其中一种或另一种。这种协同作用可能是由于在增强转位到细胞质中，由此被强烈吸引到受感染的细胞内部的病毒基因组之后剩余的高阳离子度。因此，由于共价阳离子化而减弱的催化活性并不影响细胞内部所产生的抗病毒活性。
在替代性实施例中，通过与阳离子树枝状大分子共处理实现了经突变的阳离子或阳离子化的RNA酶功效的增强。癌症治疗研究显示，阳离子化可以降低酶促活性，而仅仅更高的剂量往往可能杀死所有细胞。而在抗病毒应用中，与直觉相反地，其根据以下原因进行操作。当增强的RNA酶/DNA酶更容易进入细胞时，其能够攻击病毒RNA，并且还攻击在已发表的癌症治疗研究中示出的天然细胞RNA，以引起高整体细胞毒性。然而，在当前公开的实施例中，健康(和癌症)细胞的RNA如下受到调节：在空间上，位于细胞的某些位置中；并且在时间上，仅在细胞生命的某些功能时间段暴露。相比之下，病毒RNA没有被调节到相同的位置或时间：其入侵并释放其自身的RNA，以进行复制。因此，在抗病毒应用中，与抗肿瘤相反，RNA酶的阳离子化被优化以快速且有效地拦截和降解病毒RNA，而不损害天然宿主细胞。为了提供这样的优化，各个实施例提供了增加水平的阳离子化净电荷，这降低了酶促活性，但改进了RNA酶抑制剂(RI)的内吞、运输和逃避，并且由此提高了总体治疗有效性。
通过当前公开的方法和组合物实施例的阳离子化对核酸酶的净电荷的优化与先前发表的工作有所区别，如图17所示。图17中示出的图描绘了根据先前发表的结果的示意特性的这种比较。图的x轴示出了阳离子化的核酸酶的净电荷。图的y轴示出了预测的(基于起到内吞和酶促活性的竞争效应的表明的特征)化合物的治疗有效性。核糖核酸酶(RNA酶A)111的抗病毒用途的有效性与onconase 113对抗HIV的有效性进行了比较。实线117描绘了抗癌治疗研究中阳离子化的核酸酶的结果。这些数据111、113和117源自已发表的研究。基于所公开的阳离子化的核酸酶化合物的特性以及在此解释的细胞间机制和酶机制，示出了所公开的实施例组合物的经优化的有效性115。
外泌体是核内体来源的细胞源性胞外囊泡的一种类别并且直径通常为30-150nm，这是是胞外囊泡的最小类型。被脂质双层包被，外泌体被释放到胞外环境中，所述胞外环境含有源自原始细胞的内容物的复杂货物，包含蛋白质、脂质和核物质。外泌体是通过其形成方式定义的，即通过多泡体的融合和胞吐进入到胞外空间中。
在各个实施例中，通过超离心分离外泌体胞外囊泡以将外泌体处理为合适的处理组合物载体囊泡，即单独的或有效组合的所公开的核酸酶和阳离子化的核酸酶的载体囊泡。以下是超离心过程的实例：
1.将来自血液或细胞培养上清液的血浆在11,000xg下离心30分钟。
2.将上清液回收并且在18,000xg下进一步离心30分钟。
3.将上清液回收并且在100,000xg下再一次超离心2小时。
4.将所产生的团粒回收并且在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并且在100,000xg下再次离心2小时。
5.将最终的团粒通过外泌体富集。
在各个实施例中，可以通过以上超离心过程分离的外泌体被用作所选核酸酶的组合物或阳离子化的/非阳离子化的核酸酶的组合的载体结构，此外泌体结构将核酸酶载送到细胞边界，从而促进内吞或用于使核酸酶或经修饰的核酸酶渗透到细胞内部的其它机制。在各个实施例中，根据本领域已知的技术将应用选择的核酸酶的组合物上样到外泌体载体中。在替代性实施例中，使用合成外泌体作为载体结构，而不是天然存在的外泌体。
外泌体的上样(用核酸酶或阳离子化的核酸酶)是基于其作为囊泡的物理行为，特别是通过表面张力的毛细管力以类似于肥皂泡维持其完整性的方式自愈的能力实现的。外泌体必须悬浮在期望的分子组分(核酸酶)的溶液中，并且暴露于冲击扰动，通常是电(电穿孔)或可能地引起空化气泡的声波超声。这种机电扰动的结果是破坏外泌体壁并且多个孔、窗口打开，分子物种(核酸酶)可以通过布朗扩散(Brownian diffusion)迅速进入所述多个孔、窗口。在通过自然表面张力闭合暂时的孔后，核酸酶被困在现在密封的外泌体中。在这种形式下，核酸酶可以通过内吞过程被载送到细胞中，此时外泌体首先与细胞膜融合，芽接到细胞内部中并且打开以释放或进入细胞内部。然后外泌体在细胞内部的自然降解释放核酸酶，由此在细胞内部递送其治疗能力。总体来说，外泌体以类似于特洛伊木马(Trojanhorse)的方式起作用，在堡垒内递送士兵-杀死受感染的细胞内部的敌人病毒。
在各种治疗方法实施例中，抗病毒药剂的阳离子化的DNA酶和RNA酶组分以混合物的形式一起施用，以便在抑制病毒繁殖时协同地起作用。可替代地，可以在相对短的时间段内连续施用阳离子化的DNA酶和阳离子化的RNA酶组分，以便仍实现两种阳离子化的核酸酶的协同活性。例如，与制备和施用阳离子化的DNA酶和阳离子化的RNA酶的单一溶液相反，可以制备阳离子化的DNA酶的溶液并且可以制备阳离子化的RNA酶的单独溶液。施用一种溶液然后施用另一种溶液可以提供与两者的混合物的抗病毒作用相同的抗病毒作用。当不同的处理需要不同比率的核酸酶时，单独制备每种核酸酶组分是有利的。
组合物可以口服施用，如与保护包衣一起施用，或者其可以附着到如水溶性聚合物等载体上并注射到受试者体内。通过注射施用可以包含例如静脉内、皮下、肌肉内和皮内注射。其它类型的施用可以包含例如局部、吸入或植入到身体部位或腔体中。当阳离子化的DNA酶和阳离子化的RNA酶组合物或具有两种酶的特性的其它核酸酶被局部用于治疗，例如，浅表、皮肤和粘膜病毒感染时，其可以被调配为药学上可接受的组合物，如洗剂、乳霜、溶液、乳剂、药膏、栓剂等。另外，其可以被提供用于以药学上可接受的漱口水调配物的形式施用以治疗或预防口腔病毒感染。
针对治疗或预防动物病毒感染施用的阳离子化的DNA酶和阳离子化的RNA酶的调配物的最佳有效剂量将取决于受试者的大小和体重。在某些示例实施例中，递送的初步剂量应足以使获得的每种核酸酶的全身、局部(local或topical)浓度介于每磅体重约1个与5个降解测定单位之间。对于约65磅的儿童，递送的速率选择性地为50个至150个降解测定单位，每日施用约1次至6次，优选地施用约3次至6次，更优选地施用约3次至4次。与成人患者相关的实施例利用根据患者体重、病状和年龄缩放的剂量方案。某些实施例利用示例已发布的剂量作为初步方案，如豹蛙酶(onconase)已在临床试验中用作患有恶性间皮瘤的患者的单一药剂；患者每周静脉内施用480μg/m2；最大耐受剂量(MTD)为960mg/m2。
在替代实施例中，阳离子化的核酸酶的所公开的组合可以针对预防作用施用。当用作预防剂时，本实施例包含适于维持组合物的稳定血清或组织水平以破坏到来的病毒感染的施用方案。在各个实施例中，组合物可以通过吸入施用，包含通过如喷射雾化器、更复杂的超声雾化器和使用氟碳推进剂的剂量定量的吸入器等装置。在其它实施例中，组合物的合适调配物被处理成通过干粉吸入器(DPI)吸入的粉末形式。所公开的阳离子化的核酸酶吸入由于已知核酸酶通过气溶胶和液滴传输到呼吸系统上的粘膜组织而被鉴定为适于covid-19的实施例。
施用的量和速率取决于酶制剂的比活性和稳定性，并且在给定以上有效剂量范围的情况下完全在本领域的技术人员的确定范围内。例如，与比活性较低的制剂所需的酶的量相比，可以使用较少量的来自比活性较高的调配物的酶。有效剂量范围内的治疗应继续到临床症状缓解为止。如果出现另外的感染，则应恢复治疗。可替代地，临床症状消失后继续治疗可以有利地作为预防复发的措施。
虽然本发明的方法在一些情况下是关于阳离子化的胰腺DNA酶和RNA酶描述的，但本发明的原理的实践被设想为利用在其使病毒核酸水解的特性上等效于以上提到的核酸酶的抗病毒药剂。阳离子化的DNA酶和阳离子化的RNA酶优选地是在通过本领域众所周知的方法从牛或猪胰腺中分离之后进行阳离子化的。这些方法包含用弱硫酸溶液从细碎的胰腺中提取酶蛋白，用硫酸铵使酶蛋白逐步沉淀，用色谱法纯化核酸酶以及冻干酶。可替代地，本发明的核酸酶组分可以通过如原核表达系统中的高水平表达等重组方法产生。重组表达提供了优于蛋白质和酶的经典生化纯化的许多优势。例如，核酸酶由于细菌的易于发酵特性可以大量高效地产生，并且更容易纯化为均质。DNA酶和RNA酶(阳离子化前)也是容易商购获得的。具有DNA酶和RNA酶(阳离子化前)的特性的细菌核酸内切酶的商业制剂也可获得，并且可以使用下面描述的方法处理成其公开的阳离子组合物。
在各个实施例中，用于阳离子化的和/或非阳离子化的核糖核酸酶(RNA酶)的碱基核酸酶选自以下组：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。
在各个实施例中，用于阳离子化的和/或非阳离子化的RNA酶的碱基核酸酶选自以下组：RNA酶I、RNA酶A、RNA酶H、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、RNA酶E、RNA酶G、PNPA酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II。
在各个实施例中，用于阳离子化的和/或非阳离子化的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)的碱基核酸酶选自以下组：脱氧核糖核酸内切酶和脱氧核糖核酸外切酶。
在各个实施例中，用于阳离子化的和/或非阳离子化的DNA酶的碱基核酸酶选自以下组：DNA酶I、DNA酶II、微球菌核酸酶、核酸外切酶III、绿豆核酸酶，核酸酶BAL 31、核酸酶SI。
在各个实施例中，将阳离子化的核酸酶与树枝状大分子混合和/或复合以利用所展示的正树枝状大分子效应，所述效应实质性地增加了阳离子化的核酸酶的催化活性/效应，从而以高对数标度实质上消除了靶病毒。通过定量PCR检测确认了体外实验的结果，详情如下。
在各个实施例中，通过针对特定抗病毒应用的实验优化选择所选树枝状大分子。虽然在本文所述的实验中所选的树枝状大分子是第2代PAMAM树枝状大分子，但替代性实施例利用其它树枝状大分子以获得经优化的正树枝状大分子效应以催化RNA酶的抗病毒作用。
实例1
在一示例实验方法中，对RNA酶和DNA酶的存在对病毒感染(HCoV-NL63/OC43)的抑制作用的功效的确认，并且由此通过以下示例逻辑和相关联的方案确认了病毒产生或细胞病变效应。
如以上所解释的，RNA酶和DNA酶核酸酶起到破坏受感染的细胞的病毒核酸的作用。酶可以在病毒膜融合期间进入细胞，然后在从病毒中释放后对核酸起作用。细胞核酸可能受到细胞应答通路和内部细胞结构(如细胞核)的影响但受到限制。这允许不成比例地破坏将没有这样的保护的病毒核酸。
在本例中，RNA酶A被用作示例核糖核酸酶。所使用的RNA酶A为来自牛胰腺的牛胰腺核糖核酸酶A，目录号Fisher EN0531，其中抗病毒活性≧100库尼茨单位/mg。
方法1：用已知浓度的病毒感染细胞(第0天)，观察经处理的细胞和未经处理的细胞中的细胞病变效应(大约第4天)。这测试了对病毒感染的直接抑制作用。结果是根据组织培养感染剂量确定的，这是在验证病毒滴度时使用的方法，所述病毒滴度表明当具有经培养的细胞的测试孔板用经稀释的病毒溶液接种时，50％的细胞被感染的浓度。此称为TCID50。
图12描绘了使用HEK293T细胞对DNA酶和RNA酶影响病毒复制的时间过程测定。
将Bsc-1或HEK293T细胞在具有2％胎牛血清(FBS)、100U/mL盘尼西林(penicillin)和100mg/mL链霉素的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium，DMEM)中以5x 104个细胞/孔接种在96孔板中，持续两天(从第-2天至第0天)，并且在37℃下在5％ CO2的潮湿环境下培养。在第0天以MOI 0.5进行OC43病毒感染，且然后将0.25mg/ml DNA酶和0.25mg/ml RNA酶与病毒一起添加到细胞中，以测试预防和治疗能力。病毒感染和DNA酶-RNA酶处理阶段两天后(第2天)，从每个孔中收集细胞培养基以进行RT-PCR，以对从图12中示出的以下4个组中的受感染细胞释放的病毒进行定量。去除培养基后，将其余细胞固定并且用抗OC43抗体染色，以便可视化与细胞相关的病毒。在病毒感染和DNA酶-RNA酶处理阶段四天后(第4天)，细胞病变效应变得明显/可见，按照李-明二氏方法(Reed–Muench method)计算阳离子化的DNA酶-RNA酶的所有4个组(如图13所示)或6个组(如图14所示)的TCID50。在上面描述的每个时间点，捕获并记录细胞的显微图像，以记录细胞形态变化。
图13描绘了实验实施例中的非阳离子化的核酸酶的四个实验组：第1组，无病毒感染并且无DNA酶-RNA酶处理。第2组，无病毒感染但具有DNA酶-RNA酶处理。第3组，具有病毒感染但无DNA酶-RNA酶处理。第4组，具有病毒感染和DNA酶-RNA酶处理。
图14描绘了另一实验实施例中的阳离子化的核酸酶的六个实验组：第1组，无病毒感染并且无DNA酶-RNA酶处理。第2组，无病毒感染但具有DNA酶-RNA酶处理。第3组，无病毒感染但具有阳离子化的DNA酶-RNA酶处理。第4组，具有病毒感染但无DNA酶-RNA酶处理。第5组，具有病毒感染和DNA酶-RNA酶处理。第6组，具有病毒感染和阳离子化的DNA酶-RNA酶处理。
方法2：在96孔板中用含已知的高浓度的病毒的不同的培养基感染病毒。1个感染周期后收集病毒。滴定至新的板以观察TCID50。这证实了对病毒复制和产生的影响。
图15描绘了方法2的使用HEK293T细胞对DNA酶和RNA酶影响病毒复制的时间过程测定。在某些实施例中，方法2利用与方法1相同的实验组设计，所述实验组设计被修改为在第2天收集具有第二代病毒的培养基来感染第二组新鲜细胞。
以上所述的方案和方法是用于验证所公开的组合物的治疗功效、剂量和方案的方案实例，这些组合物包含单个或多个核酸酶、单个或多个阳离子化的核酸酶、组合的单个或多个阳离子化的和非阳离子化的核酸酶以及由外泌体结构承载的单个或多个阳离子化的和/或非阳离子化的核酸酶。
在美国CDC认证的BSL2实验室(生物安全实验室2级)按照以上方法一(图12)下的方案进行实验。图13第1-4组的测试的结果表明，HCoV-OC43病毒，β冠状病毒属(与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2相同的属)对HEK293T型细胞产生了清晰可见的细胞病变效应。这允许通过标准TCID50方法对在细胞上的病毒复制效应进行直接视觉显微评估。测试的DNA酶/RNA酶调配物为50％牛胰腺核糖核酸酶RNA酶A和50％牛胰腺脱氧核糖核酸酶DNA酶I。
TCID50的这些结果显示，非阳离子化的DNA酶-RNA酶将HCoV-OC43病毒滴度降低了大约五倍，从1.58·105的TCID50降低至7.34·105rus。这表明，与基线HCoV-OC43感染的培养基相比，DNA酶-RNA酶有效地将病毒复制降低了4.65倍(即0.7个对数)，并且将病毒存在降低了78.5％。图18示出了作为实验对照组和用RNA酶/DNA酶处理的组的斑块形成单位(PFU)的浓度的这些实验结果的图表。
基于这些非阳离子化的DNA酶-RNA酶对病毒活性的影响的体外结果，以及以上对通过阳离子化实现的所公开的组合物增强和如通过使所选核酸酶与以上所述的指定树枝状大分子调配物复合实现的其它所公开的增强或通过其它所公开的增强的基础的解释。
实例2
第二示例实验方法证实了将与高度阳离子化分子树枝状大分子(第2代聚PAMAM树枝状大分子)复合的RNA酶/DNA酶共处理以增强核糖核酸酶作为抗病毒(HCoV-NL63/OC43)剂的功效的有效性。
在此示例实验组中，在图19中示出的各种实验组合中使用了相同的方法，包含细胞组合物、病毒样品以及来自实例1的RNA酶/DNA酶调配物。实验组包含与病毒、RNA酶/DNA酶和以上提到的10μM树枝状大分子的调配物。
些实验的结果显示，实验对照组、用RNA酶/DNA酶处理的组、树枝状大分子组和树枝状大分子/核酸酶组的树枝状大分子的使用与斑块形成单位(PFU)的浓度的协同功效，其在图23中示出。
实例3
第三示例实验方法用于证实高度阳离子化的和轻度阳离子化的RNA酶增强核糖核酸酶作为抗病毒(HCoV-NL63/OC43)剂的功效的有效性和安全性。
阳离子化的RNA酶的混合物是根据先前发布的方法制备的，并且被分为其中混合物的平均净电荷被视为“轻度”、“轻微”或“低”带电荷的或阳离子RNA酶的聚合混合物以及净电荷被视为“高度”或“高”带电荷的或阳离子RNA酶的第二混合物。
最初，阳离子化过程开始于示例RNA酶A，即抗病毒活性为75-125库尼茨单位的牛胰腺核糖核酸酶A型XII-A，目录号Sigma R5500。
为了制备不同阳离子化净电荷的RNA酶混合物，采用以下工艺。用乙二胺使牛胰腺RNA酶A的羧基(羧基的数量n＝11)酰胺化，以通过碳二亚胺反应将羧酸盐阴离子的负电荷转化为正电荷。两种反应条件在使用的EDC的量方面有所不同，并且经组合的产物是不同修饰的蛋白质的混合物。根据第一反应条件制备在本文被鉴定且定义为“轻度”或“低”阳离子化的RNA酶的阳离子化的RNA酶的混合物。根据第二反应条件制备在本文被鉴定且定义为“高度”或“高”阳离子化的RNA酶的阳离子化的RNA酶的混合物。“阳离子化的”被称为“偶联反应”，因为其使所使用的阳离子剂偶联或缀合以与RNA酶的可用羧基偶联或缀合。如下所述，RNA酶与阳离子剂之间的偶联反应可以在单一阳离子剂的情况下使用，以通过使用在本文被称为阳离子化催化剂的制品来启动偶联反应的浓度和时间来获得不同水平的聚合阳离子化(总净电荷变化)。在各个实施例中，可以使用替代性阳离子剂和阳离子催化剂，本文描述了其中的一些。除了此实例中使用的乙二胺外，适于与RNA酶的可用羧基偶联或缀合的替代性阳离子剂的实例包含2-氨基乙醇和牛磺酸。
在本实例和接下来的实例(实例3和4)中描述的示例实施例中，在两种不同条件下进行了偶联反应以获得轻度和高度阳离子化的RNA酶A。通过将50mg RNA酶A溶解于5ml阳离子剂溶液，即2M乙二胺盐酸盐-NaOH，pH 5.0中制备了两种溶液。偶联反应是通过在室温下搅拌下向第一溶液添加10mg阳离子化催化剂EDC，从而引起轻度或低水平阳离子化以制备高度阳离子化的RNA酶A，向第二溶液添加80mg EDC，然后在3小时时添加80mg EDC，并且在18小时时添加40mg。将所有反应混合物在室温下持续搅拌21小时，然后在4℃下对蒸馏水进行透析。
为了确定每种混合物(轻度或高度)的最终聚合净电荷，可以通过阳离子交换色谱法根据净电荷对阳离子化的RNA酶A进行分馏。基于根据已发布数据的计算估计，由以上方法获得的轻度阳离子化的RNA酶的聚合净电荷为大约+11至+13，并且由以上方法获得的高度阳离子化的RNA酶的聚合净电荷为大约+21至+23。
在此实例中，初始地，测试了使用HEK293T细胞的阳离子化的RNA酶的细胞毒性。接下来，选择存活细胞超过80％的最高剂量以进行将与高度阳离子分子树枝状大分子(如上所述的第2代聚PAMAM树枝状大分子)复合的RNA酶/DNA酶共处理以增强核糖核酸酶作为抗病毒(HCoV-NL63/OC43)剂的功效的抗病毒测试。
在这组示例实验中，在图21中示出的各种实验组合中使用了相同的方法，包细胞组合物、病毒样品以及来自实例1的RNA酶/DNA酶调配物。
图22中示出的这些实验的结果表明，对于轻度阳离子化的RNA酶的10ug/ml的浓度，80％的对照细胞存活。高度阳离子化的RNA酶的实验结果的插值估计在0.2-0.5μg/ml的浓度水平下对照细胞的存活率为80％。这些单独实验结果的随时间推移的增长在图23示出。对于轻度阳离子化的RNA酶，经6天过去的时间段显示出1μg/ml 125、10μg/ml127和100μg/ml 131的浓度。对于高度阳离子化的RNA酶，经6天过去的时间段还显示出1μg/ml 133、10μg/ml 135和100μg/ml 129的浓度。
图24示出了使用HEK293T细胞减少OC43病毒的有效性的所测试调配物的比较结果。图表包含对照组141、上述RNA酶和DNA酶的调配物143、第2代聚PAMAM树枝状大分子145、与第2代聚PAMAM树枝状大分子复合的RNA酶和DNA酶的组合147、上述高度阳离子化的RNA酶的调配物149以及上述温和阳离子化的RNA酶的调配物151的TCID50结果。实验结果显示，与对照组相比，250μg/ml的RNA酶和DNA酶的调配物143的有效减少为4.8倍。实验结果显示，与对照组相比，250μg/ml的RNA酶和DNA酶的调配物143的有效减少为4.8倍。实验结果显示，与对照组相比，10μM第2代聚PAMAM树枝状大分子的调配物145的有效减少为4.8倍。实验结果显示，与对照组相比，250μg/ml RNA酶、DNA酶和10μM第2代聚PAMAM树枝状大分子的组合147的有效减少为10倍。实验结果显示，与对照组相比，高度阳离子化的RNA酶的调配物149的有效减少可忽略不计。实验结果显示，与对照组相比，轻度阳离子化的7.5μg/ml RNA酶的调配物151的有效减少为6.8倍。上述结果显示，RNA酶/DNA酶的新颖调配物、与所选树枝状大分子混合/和或复合的RNA酶/DNA酶的组合以及轻度阳离子化的RNA酶具有意想不到的抗病毒有效性。
实例4
第四示例实验方法用于确认轻度阳离子化的RNA酶以及轻度阳离子化的RNA酶与所公开的示例PAMAM树枝状大分子的组合调配物增强核糖核酸酶/树枝状大分子组合作为抗病毒(HCoV-NL63/OC43)剂的功效的有效性和安全性。鉴于组合的出人意料的高水平的有效性，按照处理方案进行了RT-qPCR测试以测量病毒负载。
图25示出了对于针对所测病毒的有效性进行测试的各种对照和核酸酶/树枝状大分子调配物。在这组示例实验中，在图22中示出的各种实验组合中使用了相同的方法，包含细胞组合物和病毒样品、来自实例3的轻度阳离子化的RNA酶和第2代PAMA树枝状大分子。
测试结果显示，与未进行处理的对照细胞组相比，在体外使用HEK293T细胞，与10uM树枝状大分子组合的10ug/ml轻微阳离子化的RNA酶的调配物将OC43病毒滴度降低到可以忽略不计的水平。如可以从图中看到的，结果表明轻度阳离子化的RNA酶和PAMAM树枝状大分子具有非常强的协同作用。抗病毒调配物的出人意料的非常显著的有效性通过高度灵敏的RT-qPCR测试得到证实，如下详述的。
为了进行RT-qPCR测试，在针对RT-qPCR测试进行或不进行轻微RNA酶加树枝状大分子处理的情况下进行病毒感染后3天和5天收集细胞培养基。对逆转录酶(RT)使用了来自感染病毒的RNA以引导互补DNA(cDNA)合成。将所产生的cDNA用作模板以与SYBR RT-PCR试剂盒进行RT-qPCR反应。反应条件为：在50℃下RT 30分钟，在94℃下对逆转录酶(RT)灭活15分钟，然后是95℃持续15秒、60℃持续45秒,40个周期。最后，使用65℃持续5秒和95℃持续5秒的条件。
在95℃持续60秒、40℃持续60秒、65℃持续1秒，然后以0.07℃每秒的速率从65℃缓慢增加到95℃的条件下进行熔解曲线分析。
对于经鉴定的所选病毒，使用了以下引物：
●OC43-F：ATGTCAATACCCCGGCTGAC
●OC43-R：GGCTCTACTACGCGATCCTG
请注意，这种PCR反应的限制为10-100个颗粒，这足以检测孔是否受到感染或有病毒存在。
3天后RT-qPCR测试的结果在图27中示出。通过轻度阳离子化的RNA酶/树枝状大分子调配物处理3天后，在培养基中不可检测到病毒。图示出了调配物的反应荧光单元对测试周期以及对照病毒浓度。轻度阳离子化的RNA酶(10μg/mL)和第2代PAMAM树枝状大分子(10μM)的调配物的qPCR病毒检测结果显示为未检测到161；进行处理的轻度阳离子化的RNA酶(10μg/mL)仅显示出病毒负载为10-6 155、10-5 159、10-4 153和10-3 157倍稀释的检测曲线。
5天后RT-qPCR测试的结果在图28中示出。通过轻度阳离子化的RNA酶/树枝状大分子调配物处理5天后，在培养基中不可检测到病毒。图示出了调配物的反应荧光单元对测试周期以及对照病毒浓度。轻度阳离子化的RNA酶(10μg/mL)和第2代PAMAM树枝状大分子(10μM)的调配物的结果显示为未检测到173，进行处理的轻度阳离子化的RNA酶(10μg/mL)仅显示出病毒负载为10-6 167、10-5 159、10-4 165和10-3 163倍稀释的检测曲线。
图29示出了汇总了所有实验结果的比较抗病毒有效性的表。前2列表示根据前面的图的相关联的实验编号，以及测试孔是否包含病毒样品。其余列表示治疗调配物和初始组分浓度。表的每个单元格的数字表示引入所测试治疗剂后病毒的减少(表示为log10)。这种病毒减少是在相关实验结束时在将治疗调配物添加到计算出的病毒负载之前，以计算出的病毒负载的比率测量的。例如，值大于1表示在用示出的核酸酶和/或树枝状大分子的调配物在孔中对病毒进行体外处理后，原始病毒负载的量大幅减少超过“10倍”。轻度阳离子RNA酶与第2代PAMAM树枝状大分子组合的强协同抗病毒作用由超过5.0(病毒负载减少100,000倍以上)的值表示。如以上详述的，这些结果已通过RT-qPCR测试得到证实。
虽然实验结果是针对体外方案提出的，但这些结果表示可以通过类比转化为体内测试方案和活受试者治疗调配物的浓度和部分调配物。在各个实施例中，轻度阳离子化的RNA酶的治疗调配物指示为可能低于7.5μg/ml，并且可能高于所测试的20μg/ml。在各个实施例中，第2代PAMAM树枝状大分子的治疗调配物指示为可能低于10μM，并且可能高于所测试的20μM水平。在各个实施例中，轻度阳离子化的RNA酶和树枝状大分子的以上浓度可以至少利用所测试的浓度的范围进行分级组合。在各个实施例中，树枝状大分子可以选自第1代到第10代树枝状大分子，对于每个树枝状大分子，其表面或端基的数量越来越多。如通过意想不到的实验结果显示的，对于广泛的调配物来说，树枝状大分子和阳离子RNA酶组合的协同抗病毒作用已被证明是安全且有效的(在体外)，并且这种作用由此表明组分浓度的范围更大并且所述组分的范围更大。对于轻微阳离子RNA酶和树枝状大分子的治疗性施用，根据病毒感染的动物的特性，包含动物的物种、年龄、性别和体重，校准所选浓度和剂量。
虽然RNA酶对癌细胞的细胞毒性作用是已知的，但以上所述的调配物的意想不到的正树枝状大分子效应是意想不到的。在替代实施例中，在将树枝状大分子与阳离子化的核酸酶混合和/或复合时在催化活性/有效性方面表现出的意想不到的正树枝状大分子效应可被用作抗癌治疗组合物。
在各个实施例中，通过使核酸酶阳离子化并且将其用作与树枝状大分子的混合物和/或复合物来进行协同地放大核酸酶切割活性的方法。针对以上所述的条件观察到这种意想不到的效应的机制，以及这种机制是否不依赖于细胞内条件在此进行了探索。
为了更多地了解以上观察到的和描述的正树突效应的机制，设计并进行了额外一组实验。这些实验的基本前提是确定该机制是病毒RNA与树枝状大分子RNA酶复合物/混合物之间的直接相互作用而不依赖于细胞相互作用的结果，还是该机制有其它原因。
对于这组实验，使用了可商购获得的基于酵母的RNA作为实验的目标组分。为了确定RNA酶对RNA酶-树枝状大分子复合物/混合物的正树枝状大分子效应对RNA的比较酶促作用，使用了RNA酶以首先使RNA饱和。在确定了饱和水平(在室温下在15分钟的给定时间内)后，使用了较低浓度的轻度阳离子化的RNA酶和轻度阳离子化的RNA酶-树枝状大分子复合物/混合物来确定调配物的相对酶促活性。
在图30中，示出了实验调配物的化学组分，包含其储备液浓度和使用时的浓度。请注意，如以上实验中使用的，本组实验中使用了同样的PAMAM树枝状大分子、RNA酶和轻度阳离子化的RNA酶与上述实验中使用的相同。另外，使用了源自酵母的胞外RNA(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific,Catalog)，目录号：AM7119)作为靶向RNA(在本文称为tRNA或总RNA)。
对于每个实验，制备了组分的基础混合物，所述混合物由图31中列示的化学和生化组分组成，包含总RNA。所述组分各自以图31中列示的分数量以来自图30的浓度被包含在内。注意，图31中列示的量是以微升(μL)为单位的。在图35中，实验组成是针对6个实验中的每个实验列示的，包含对照实验。如所列示的，实验包含1)用水和碱基RNA混合物进行的对照实验，2)饱和浓度RNA酶的碱基RNA混合物，3)与单独的树枝状大分子的碱基RNA混合物，4)低于饱和浓度的轻度阳离子化的RNA酶的碱基RNA混合物，5)低于饱和浓度的RNA酶和树枝状大分子的碱基RNA混合物，6)低于饱和浓度的轻度阳离子化的RNA酶和树枝状大分子的碱基RNA混合物。
在图33中，示出了用于消化总RNA的这组实验的比较结果的条形图。总的来说，结果表明，包含树枝状大分子与RNA酶对于RNA酶或轻度阳离子化的RNA酶的酶促活性没有影响或有轻微的负面影响。
这些实验结果强调在抗病毒实验中观察到的意想不到的正树突效应，因为对于胞外条件，特别是没有病毒-细胞相互作用的条件下，没有观察到这种效应。正树突效应显然是沿从RNA酶进入到细胞质中直到RNA在细胞内部消化的通路的上游步骤的结果。
图34和下面的方程提供了树枝状大分子/RNA酶混合物或复合物增强RNA酶在细胞内部的酶促活性的反应动力学效应的模型。在图37的左侧，细胞边界显示为221，其限定了细胞的外部201和内部203。RNA酶209和树枝状大分子211调配混合物通过细胞边界的内吞和胞吐用其相应的相关速率常数kendo 205和kexo 207显示。反映细胞实现从核内体释放RNA酶和树枝状大分子的速率的速率常数(示出为DR周围的圆圈)被限定为树枝状大分子的浓度的函数[D]，并且被鉴定为krel([D])219。在存在RNA酶抑制剂I的情况下，一些RNA酶与抑制剂结合，从而形成r·I 215，并且“自由”释放的RNA酶r 217的其余部分可用于针对RNA的酶作用。反应在减轻或降低时RNA酶抑制剂活性的速率的速率常数作为阳离子化的因子被鉴定为kc i 223。基于已发布的结果，假设kc i随着RNA酶阳离子化程度的增加而降低或接近于零。交替表达时，RNA酶的阳离子化对RNA酶抑制剂活性是拮抗性的，或者阳离子化降低了RNA酶和抑制剂相互作用的概率。
在如以上所述的实例4等实验的(稳态)以及树枝状大分子和核酸酶混合物/复合物的等效变异调配物中，含有树枝状大分子/RNA酶复合物/混合物(在细胞内部)的核内体的浓度[DR]可以由以下定义：
其中kendo是RNA酶内吞的速率，kexo是RNA酶/树枝状大分子胞吐的速率，并且krel([D])是与树枝状大分子的浓度相关联的RNA酶的胞内释放的速率。胞外RNA酶的浓度被鉴定为[R]，胞内RNA酶/树枝状大分子的浓度被鉴定为[DR]，并且胞内树枝状大分子浓度被鉴定为[D]。
在稳态下(当[DR]变化的速率为零时)，树枝状大分子/RNA酶的浓度被确定为：
因此，细胞质中可用于(病毒)RNA的酶消化的释放的RNA酶的速率被定义(在变化的r速率为零的稳态下)为：
求解细胞质[r]217中释放的或可用的RNA酶浓度得到：
因此，在树枝状大分子/RNA酶的示例实施例调配物中，细胞质中可用于酶促活性的有效释放的RNA酶的此模型不可预测地且反直觉地与树枝状大分子相关度量和RNA酶阳离子化相关度量的乘积成比例。具体地，树枝状大分子相关度量是核内体释放树枝状大分子和RNA酶的速率(作为树枝状大分子浓度的函数)，并且RNA酶相关度量是RNA酶抑制剂对阳离子化的RNA酶的有效性的速率乘以RNA酶浓度的倒数。通过增加施用的树枝状大分子浓度和RNA酶阳离子化，可用的“自由”RNA酶至少以这些速率的乘积增加，而不是以复合物或混合物组分的相加或总和增加，所述相加或总和另外可以为预测的有效性。
实施例包含核酸酶和树枝状大分子复合物/混合物的所有调配物，如在以上实验结果中呈现的表现出酶有效性的示例调配物(细胞质中可用的自由释放的核酸酶)，所述酶有效性超过单独施用的核酸酶和树枝状大分子的相加有效性。如实例中所示的酶有效性与抗病毒调配物中的抗病毒有效性直接相关。
对于旨在涉及人类治疗用途的实施例组合物和方法，此类组合物和方法在美国须经FDA批准。
尽管上面已经列举了具体优点，但各个实施例可以包含所列举的优点中的一些优点、不包含任何优点或包含所有优点。
在审查了附图和描述之后，其它技术优点对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。
应当理解的是，尽管示范性实施例在图中进行了说明并在上面进行了描述，但本公开的原理可以使用任何数量的技术来实施，无论目前已知与否。本公开绝不应限于附图中示出的和以下描述的示例性实施方案和技术。
除非另有说明，否则附图中描绘的物品不必按比例绘制的。
在不脱离本公开的范围的情况下，可以对本文所述的系统、设备和方法进行修改、添加或省略。例如，系统和设备的组件可以是集成的或单独的。此外，本文公开的系统和设备的操作可以由更多、更少或其它组件来执行，并且所描述的方法可以包含更多、更少或其它步骤。另外，步骤可以以任何合适的顺序进行。如本文档中所用，“每个”是指集合的每个成员或集合的子集的每个成员。
为了帮助专利局和在本申请中发布的任何专利的任何读者解释所附的权利要求，申请人希望注意，除非在特定权利要求中明确使用了词语“用于...的装置”或“用于...的步骤”，否则他们不希望所附的权利要求或权利要求要素中的任何一条援引35U.S.C.112(f)的规定。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明的实施例。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式。将进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其组。此外，就详细描述或权利要求中使用术语“包含(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”、“包含(comprised of)”或其变化形式的程度而言，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。
虽然已通过描述各个实施例说明本发明并且虽然已相当详细地描述了这些实施例，但诸位申请人并不意图将所附权利要求的范围约束或以任何方式限制为此类细节。另外的优点和修改对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。例如，本发明的实施例可以与其它声环境结合使用。因此，本发明在其较宽方面并不限于所示出且描述的具体细节、代表性方法以及说明性实例。因此，可以在不脱离申请人的一般发明概念的精神或范围的情况下偏离此类细节。
本文所描述的仅仅被视为说明本发明的原理。因此，本领域的技术人员在本发明的精神和范围内提供其它和不同实施例完全在其职权范围内。
对于旨在涉及人类治疗用途的实施例组合物和方法，此类组合物和方法在美国须经FDA批准。
本文所描述的仅仅被视为说明本发明的原理。因此，本领域的技术人员在本发明的精神和范围内提供其它和不同实施例完全在其职权范围内。
工业应用
以上所述的实施例包含可用于治疗和预防病毒感染，具体地冠状病毒感染，包含与活宿主的冠状病毒感染相关的疾病的化合物。具体地，提供了用于治疗和预防冠状病毒，如covid-19的化合物和组合物和/或方法。

Claims (25)

1.一种用于治疗被病毒感染的哺乳动物的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包括与树枝状大分子混合或复合的核酸酶；
其中所述核酸酶和所述树枝状大分子经选择，以使得所述药物组合物的抗病毒有效性超过所述核酸酶的抗病毒有效性和所述树枝状大分子的抗病毒有效性的加性抗病毒有效性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶为阳离子化的核酸酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述阳离子化的核酸酶为阳离子化的RNA酶A。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述阳离子化的RNA酶A选自由以下组成的群组：RNA酶A-SO3 -、RNA酶A-OH和RNA酶A-NH3 +。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒为冠状病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述冠状病毒为SARS-2-Cov或covid-19。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述树枝状大分子选自以下群组：第1代聚PAMAM树枝状大分子、第2代聚PAMAM树枝状大分子、第3代聚PAMAM树枝状大分子、第4代聚PAMAM树枝状大分子、第5代聚PAMAM树枝状大分子、第6代聚PAMAM树枝状大分子、第7代聚PAMAM树枝状大分子、第8代聚PAMAM树枝状大分子、第9代聚PAMAM树枝状大分子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述树枝状大分子的治疗浓度为至少3μM并且低于30μM。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述阳离子化的核酸酶的治疗浓度为至少5μg/ml并且低于30μg/ml。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述冠状病毒为HCoV-OC43。
11.一种用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包括至少一种核酸酶和至少一种树枝状大分子的治疗有效调配物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述核酸酶为阳离子化的核酸酶。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种核酸酶包括阳离子化的RNA酶A。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述阳离子化的RNA酶A选自以下群组：RNA酶A-SO3 -、RNA酶A-OH和RNA酶A-NH3 +。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述病毒感染为冠状病毒。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述冠状病毒为covid-19。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述阳离子化的核酸酶的碱基核酸酶选自由以下组成的群组：RNA酶I、RNA酶A、RNA酶H、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、RNA酶E、RNA酶G、PNPA酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II。
18.根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种树枝状大分子包括第2代聚PAMAM树枝状大分子。
19.根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种树枝状大分子选自由以下组成的群组：第1代聚PAMAM树枝状大分子、第2代聚PAMAM树枝状大分子、第3代聚PAMAM树枝状大分子、第4代聚PAMAM树枝状大分子、第5代聚PAMAM树枝状大分子、第6代聚PAMAM树枝状大分子、第7代聚PAMAM树枝状大分子、第8代聚PAMAM树枝状大分子、第9代聚PAMAM树枝状大分子。
20.根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种树枝状大分子的治疗浓度为至少3μM并且低于30μM。
21.根据权利要求11所述的组合物，其中所述核酸酶的治疗浓度为至少5μg/ml并且低于30μg/ml。
22.根据权利要求15所述的组合物，其中所述冠状病毒为HCoV-OC43。
23.一种包括核酸酶和树枝状大分子的组合物的用途，其用于制备用于治疗人类冠状病毒的药物。
24.根据权利要求21所述的组合物的用途，其中所述核酸酶为阳离子化的核酸酶。
25.根据权利要求21所述的组合物的用途，其中所述树枝状大分子为第2代PAMAM树枝状大分子。
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