CN116420066A - 目标物质的检测方法和装置、以及试剂 - Google Patents

Abstract

提供一种目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从所述复合体分离并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质。通过该技术，与以往的技术相比能够高灵敏度且廉价地检测试样中的目标物质。

Description

目标物质的检测方法和装置、以及试剂

技术领域

本发明涉及检测试样中的目标物质的检测方法和检测装置，尤其涉及能够高灵敏度且廉价地检测通过免疫反应而捕捉到的目标物质的检测方法和检测装置、以及试剂。

背景技术

一直以来，已知通过检测与疾病相关的特定抗原或抗体作为生物标记物、从而发现疾病或定量地分析治疗效果等的免疫测定法。近年来，为了更有效地检测生物标记物，对于检测微量生物标记物的高灵敏度检测的需求日益提高。作为免疫测定方法之一的酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)(本说明书中有时也称为“ELISA法”。)是用特异性抗体、与靶抗体结合的抗原、互补核酸来捕捉试样溶液所包含的靶抗原、抗体或核酸并利用酶反应进行检测的方法，由于成本等优势已经得到广泛普及。

ELISA法是能够进行目标物质的定量检测的测定方法，目前所普及的ELISA法几乎都是在96孔微孔板上进行操作，工序数多且需要烦杂的操作。另外，由于经历多个反应工序，因此需要大量的劳动和时间才能得到测定结果。因此，正在寻求缩短操作时间、反应时间。进而还寻求进一步的高灵敏度检测。

为了实现高灵敏度检测，想到了提高酶与底物的反应性。因此，提出了使免疫复合体(标记化合物)从固相游离、使其在自由液体介质中反应的技术(专利文献1)。该专利文献1中，以将生物素类或官能团化偶氮色素以及亲和素类引入免疫复合体的方式设计了免疫复合体的构成要素。例如，作为标记抗体，准备了通过链霉亲和素-生物素的结合而结合有报告基团的抗体。当在固相上形成免疫复合体时，报告基团通过链霉亲和素-生物素的结合而被导入免疫复合体中。之后如果加入过量链霉亲和素，则复合体中的链霉亲和素被所添加的链霉亲和素置换出来，免疫复合体中的报告分子则游离出来。因此，该技术中，可以在自由液体介质中检测报告分子，并与待检体中的被检体浓度相关联。一般认为，与检测固定化于固相的免疫复合体上所结合的报告分子相比，从与分析试剂的反应性方面来说检测游离报告分子的方式更有利。

另一方面，利用微细加工技术开发了在μm级别的微容器中进行反应的微反应器。使用反应场为微空间的微反应器有望提高反应速度。使用微小的流路、反应室在微反应器上实现提取、分离等实验操作的方式也被称为Lab on a chip。另外，提出了在圆盘状的盘上形成微反应器且利用旋转所产生的离心力分配试样液、分离生物学材料的技术(专利文献2)。另外，提出了如下技术：在圆盘状的盘上形成多个腔室、流路、储槽等，通过使盘旋转来执行试剂的送液、废液，在微反应器中实施孔中所进行的免疫测定步骤(专利文献3)。

进而，在微反应器中的免疫测定中，为了检测低浓度的目标物质，提出了使用标记珠的方法(专利文献4)。例如，专利文献4公开了一种圆盘状的盘，其表面设置有填充抗体修饰标记珠的珠填充部、检测区域。并且公开了：用标记珠上的抗体捕捉注入盘中的试样液中的抗原，并且标记珠上结合有抗原的标记珠复合体通过盘的旋转而被送入检测区域，被检测区域中固定的抗体捕捉；利用光盘装置的光学读取手段对该结合状态的标记珠复合体的数量进行计数，从而检测试样中的目标物质。

另外，近年通过将珠和凹陷设置有飞升尺寸的微孔的阵列组合的方法开发了ELISA法实施系统。详细而言，对于试样溶液中的抗原，在珠上构建夹心ELISA(抗体、抗原、酶标记抗体的免疫复合体)，接着将包含珠的溶液与底物一起导入到凹陷设置有飞升尺寸的微孔的阵列上。导入的珠的一部分因为重力沉降而收纳于微孔。然后去除未被收入的珠，对阵列进行图像化。微孔被设计为每1孔中仅能进入1个珠，仅收纳了已形成免疫复合体的珠的孔中，底物被标记酶转化为荧光物质。对荧光孔实施数字式计数，则即使目标物质的浓度低也能够对其实施检测(非专利文献1、2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平6-505802

专利文献2：日本特开2008-185423

专利文献3：日本特表2002-503331

专利文献4：日本特开2012-255772

非专利文献

非专利文献1：David H.Wilson et al.,The Simoa HD-1Analyzer:A NovelFully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivityand Multiplexing,Journal of Laboratory Automation 2016,Vol.21(4)533-547

非专利文献2：饭野亮太,1分子デジタルELISAによる感染·疾病バイオマーカーの超高感度検出,https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/pdf/2013ultraprecision.pdf

发明内容

发明要解决的问题

但是，专利文献1中记载的技术仅公开了使作为标记物的报告分子从自由液体介质中游离、并在该液体中与底物进行反应，不足以实现能够检测低浓度的目标物质那样的检测灵敏度的提高、反应性提高。

另外，专利文献2中对于以高灵敏度进行免疫测定法这一点没有任何公开。专利文献3中不过是将在同一反应场中进行免疫复合体的形成和检测的以往ELISA法的工序安装到了微反应器上。而且，微反应器一方面由于反应场小而能够提高反应速度、反应性，另一方面存在由于反应容量小而信号强度变小的问题。因此，利用专利文献2和3中记载的技术实施免疫测定时，存在需要高灵敏度的检测器、相机，成本提高的问题。同样地，非专利文献1和2中记载的系统在荧光检测时需要高性能的相机、荧光分光器，因此不能解决系统价格高昂的问题。

专利文献4公开了将检测对象设为标记珠、从而使用通用的光盘装置实施免疫测定的技术。通常，微反应器中粒状物的输送也是造成堵塞的原因，但是专利文献4的技术中在检测区域中固相化抗体、捕捉流入该检测区域的负载有抗原的标记珠，因此有可能发生标记珠的局部堆积，有时存在实际操作变得困难的问题。另外，存在如下问题：检测区域中捕捉的标记珠彼此接近时，会导致检测错误。

而且，专利文献4中记载的技术是一边使标记珠流下一边使固相化的抗体与标记珠负载的抗原之间进行抗原抗体反应的，因此检测区域整体均成为该抗原抗体反应的反应场。反应性会受抗原与抗体的接触频率的影响，因此整个检测区域成为反应场的该技术中抗原抗体反应效率容易下降。另外，由于是在同一反应场进行标记珠的捕捉和其检测(即，抗原的检测)，因此在反应效率低时检测灵敏度会下降。进而，抗体的流下速度可能导致固相化的抗体难以捕捉标记珠，因此存在检测灵敏度、检测速度进一步变差的问题。

另外，专利文献3和4中进行免疫检测时，为了借助检测区域中固定的抗体来捕捉目标物质，必须预先实施在微反应器内部的检测区域进行抗体的固定化的预处理，存在供于检查的微反应器的准备较为烦杂的问题。

另外，非专利文献1和2中记载的技术存在如下问题：所导入的珠在微孔中的收纳率低；各孔的检测虽然能够进行，但是不能得到充分的灵敏度，可能会影响检测数据的可靠性。

本发明的目的之一在于，提供与以往的技术相比能够高灵敏度且廉价地检测试样中的目标物质的技术。

用于解决问题的方案

根据本发明的一个方面，提供一种目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从上述复合体分离并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质。

根据本发明的优选实施方式，上述固相为选自由面状体、板状体、粒状体、纤维体、机织布、无纺布、薄膜和片组成的组中的至少1种。需要说明的是，纤维体是指：细丝状物质一条条地存在或相互缠绕而以棉状、块状存在的状态，机织布是指纤维状物织成布状而得的物质，无纺布是指纤维未经织造、缠绕而成的片状物。另外，薄膜和片是指：以人造物中的、主要使用高分子原料的物质为对象的薄膜状物，相对薄者称为薄膜，相对厚者称为片。薄膜和片的呼称是惯用的，根据情况，片也包括将纤维状的原料层叠而制造者，机织布、无纺布、片是存在部分交叉的概念。

根据本发明的另一优选实施方式，上述固相为粒状体，且为选自由磁性颗粒、胶乳颗粒和树脂颗粒组成的组中的至少1种。

根据本发明的另一优选实施方式，上述第1捕捉物质为选自由与目标物质特异性合的抗体、抗体片段、抗体变体、适体和核酸组成的组中的至少1种。

根据本发明的另一优选实施方式，上述第2捕捉物质为选自由与目标物质特异性合的抗体、抗体片段、抗体变体、适体和核酸组成的组中的至少1种。

根据本发明的另一优选实施方式，其包括如下步骤：在形成上述复合体后去除未形成上述复合体的上述第2捕捉物质。

根据本发明的另一优选实施方式，上述标记物为选自由金属胶体颗粒、酶、发光物质和荧光物质组成的组中的至少1种。

根据本发明的另一优选实施方式，其包括如下步骤：在上述第2反应场中，产生基于标记物的信号。

根据本发明的另一优选实施方式，上述标记物为酶，其包括如下步骤：在上述第2反应场中与底物反应而产生信号。

根据本发明的另一优选实施方式，上述标记物为金属胶体颗粒，其包括如下步骤：在上述第2反应场中产生基于金属胶体颗粒的信号。

根据本发明的另一优选实施方式，其包括如下步骤：在上述第2反应场中实施将基于标记物的信号增强的增强反应。

根据本发明的另一优选实施方式，包括：上述标记物为金属胶体颗粒，上述增强反应是通过以金属离子为底物的还原反应使金属胶体颗粒生长的反应。

根据本发明的另一优选实施方式，从上述复合体的分离上述包含标记物的部分是通过选自由加热处理、pH调节处理、氧化还原处理、酶处理和竞争反应处理组成的组中的至少1个处理来进行的。

根据本发明的另一优选实施方式，上述信号为透射光、反射光、散射光、发光和荧光中的至少1种。

根据本发明的另一优选实施方式，上述第2反应场的容量小于上述第1反应场的容量。

根据本发明的另一优选实施方式，从上述复合体分离的上述包含标记物的部分不包含固相。

根据本发明的又一方面，提供一种目标物质的检测装置，其至少包括：

第1反应场，使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从上述复合体分离；

第2反应场，利用基于在第1反应场中从上述复合体分离的部分的标记物的信号来检测目标物质；和

通路，供从上述复合体分离的部分由第1反应场向第2反应场移动。

根据本发明的另一方面，提供一种试剂，其用于包括下述步骤的目标物质的检测方法：在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从上述复合体分离并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质，其中，所述试剂具有使包含标记物的部分分离的作用。

根据本发明的优选实施方式，上述试剂包含选自由pH调节剂、变性剂、还原剂、酶、竞争剂、以及醇或酯及这些的衍生物组成的组中的至少1种，以发挥使包含标记物的部分分离的作用。

根据本发明的另一优选实施方式，上述试剂包含pH调节剂，以发挥使包含标记物的部分分离的作用。

发明的效果

根据本发明的检测方法和检测装置，可以使暂时结合于目标物质而形成了复合体的标记物转移到不同于进行复合体形成的第1反应场的第2反应场，并基于标记物进行目标物质的检测。因此，可以将第2反应场设为专门用于检测的场，能够提高目标物质的检测灵敏度。

另外，例如将第2反应场设为微空间时，能够以更高灵敏度检测目标物质。另外，将第2反应场设为微空间时，被检测物经由微流路而进行输送。在此，根据本发明，仅将结合于固相的上述复合体中包含标记物的一部分转移到第2反应场即可，因此例如可以使固相滞留在第1反应场，可减少输送时的堵塞问题。因此，可以使用微反应器之类的微空间适宜地实施高灵敏度的检测。

另外，根据本发明的试剂，可以提供适合于所述检测的试剂。

附图说明

图1是说明本发明的检测方法的一实施方式的概要的图。

图2是示出适于实施本发明的检测方法的微反应器的一实施方式的概略俯视图。

图3是示出实施例1中的各试剂的pH值与切断特性的关系的图。

图4是示出实施例2中的NaOH浓度(pH值)与切断特性的关系的图。

图5是示出实施例3中的各种变性剂的切断特性的图。

图6是示出实施例5的敏化反应所引起的金胶体粒径变化的图。

图7是示出实施例6中的金属胶体颗粒的粒径与散射光强度的关系的图。

图8是示出实施例7中溶出的金胶体颗粒(包含金胶体颗粒的部分)的浓度(对应于抗原浓度)与散射光强度的关系的图。

具体实施方式

＜本发明的检测方法＞

本发明的检测方法包括如下步骤：(1)在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体的步骤；和，(2)使包含标记物的部分从上述复合体分离(包括接触物理结合和切断化学键)并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质。

上述步骤(1)例如可以通过下述步骤来实施：(1-1)在第1反应场中在固相上固定第1捕捉物质的步骤；(1-2)制备被标记物标记的第2捕捉物质与包含目标物质的试样的混合液的步骤；和，(1-3)在第1反应场中使上述混合液与固定于上述固相的第1捕捉物质反应而生成固相-第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质-标记物所示的复合体的步骤。步骤(1-3)之后，可以设置用于从第1反应场排除上述复合体以外的物质的清洗步骤。另外，步骤(1-2)可以通过分别单独准备包含目标物质的试样和包含被标记的第2捕捉物质的溶液、并且在要导入第1反应场前将两者混合而进行；或者，可以通过将任一者导入第1反应场后再将另一者导入第1反应场而进行，在后者的情况下，可以同时进行步骤(1-3)。

上述步骤(2)例如可以通过下述步骤来实施：(2-1)使包含标记物的部分从上述复合体分离的步骤；(2-2)使分离后的包含标记物的部分移动到第2反应场的步骤；和，(2-3)在第2反应场中利用基于上述包含标记物的部分标记物的信号，来检测基于被第1捕捉物质和第2捕捉物质捕捉的目标物质量的信号的步骤。在步骤(2-3)之前，也可以设置将产生基于标记物的信号所需的显色剂等试剂与包含标记物的部分混合的步骤。

这里所检测的信号基于与目标物质暂时结合而形成了上述复合体的标记物，其量与形成了复合体的目标物质相关，因此通过本发明可以进行目标物质的检测。另外，输送到第2反应场的可以仅为结合于固相形成的上述复合体中的、包含标记物的一部分，减少了固相也一起输送时容易发生的堵塞问题。因此，本发明的检测方法适于使用微反应器那样的微空间中的检测。

需要说明的是，本说明书中，如“第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质-标记物”那样用连字符连接表示时，是指相互间以物理或化学方式而结合。另外，“第2捕捉物质-标记物”有时记作“具有标记物的第2捕捉物质”，或简单记作“第2捕捉物质”。

以下，使用图1说明本发明的测定方法的一实施方式。图1是示出本发明的测定方法的一实施方式的概念的概要图。需要说明的是，为了简化说明，图1示出了目标物质为抗原、第1和第2捕捉物质为一抗的情况。

初始状态下，在图1中的四边形所围成的反应场(第1反应场)中，准备固定有用于捕捉目标物质的第1捕捉物质的固相(图1的(a))。向其中导入包含目标物质的试样溶液时(图1的(b))，目标物质特异性地被第1捕捉物质捕捉。在适宜地通过清洗工序去除被捕捉的目标物质以外的物质后，导入被标记物标记的第2捕捉物质，第2捕捉物质与目标物质结合，在固相上形成目标物质被夹入到第1捕捉物质与第2捕捉物质之间的复合体(图1的(c))。通过清洗工序将多余的第2捕捉物质去除到体系外。即，形成固相上固定化有与被捕捉的目标物质对应量的标记物的状态。

然后，对于所形成的复合体赋予包含酶、氧化还原剂、酸、碱的试剂、热、光、振动等(图1的(d))，使包含标记物的部分从固相分离。需要说明的是，该分离的部分(包含标记物的部分)可以仅为标记物，也可以是在标记物上结合有某些分子团的状态。分子团不限于第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质的复合体、目标物质-第2捕捉物质的复合体、第2捕捉物质之类的原分子团原样残留者(即，分子间结合被切断而产生者)，也可以是原分子团内的分子内结合被切断而片段化者。

分离出的包含标记物的部分从固相下切下来而游离(图1的(e))，被导入图1中的圆角四边形所示的检测反应场(第2反应场)。此时，导入到检测反应场(第2反应场)的溶液中存在的标记物(包含标记物的部分)可以评价所捕捉的目标物质的量，因此测定标记物的存在(量)则可以测定目标物质的存在(量)。换言之，本发明中，在进行检测反应的第2反应场中不需要与目标物质暂时结合的该标记物以外的固相、目标物质。

并且，在图1所示的实施方式中，还向检测反应场(第2反应场)导入了与标记物反应的反应物质(图1的(f1)、(f2_b))。例如，标记物为酶时，可导入底物作为反应物质。作为底物，可选择与酶反应而转化为荧光物质的底物、通过与酶反应而产生显色的物质，通过检测所产生的荧光、显色来测定目标物质(图1的(g1))。

另外，标记物为金属胶体颗粒等不溶性颗粒时，可以通过直接测定该颗粒的浊度、光的散射、吸光度的变化来检测目标物质(f2_a)，标记物为金属胶体颗粒时，为了在金属胶体颗粒表面进一步生成金属胶体颗粒而使粒径变大，也可以添加作为反应物质的发生胶体敏化反应的金属盐溶液等试剂，这种情况下，可以检测因胶体生长而增强的散射光、吸光度(图1的(g2))。

由于如此地从固相分离了与检测反应有关的包含标记物的部分并将其导入检测反应场(第2反应场)，从而即使使用微反应器进行免疫测定，也能够大幅地减小要通过流路的物质的尺寸，能够使反应物质顺利且容易地移动到检测反应场(第2反应场)。

以上使用图1示出了本发明的检测方法的一实施方式的概念，但是本发明不限于上述。在能够利用后述的标记物直接检测目标物质时，例如不需要导入底物时、不需要标记物的增强(敏化)时，不再需要在检测反应场(第2反应场)中与标记物反应的反应物质。

另外，标记物的增强(敏化)反应并非必须在检测反应场(第2反应场)中实施，也可以在于第1反应场中包含标记物的部分后且导入第2反应场之前这一期间进行增强(敏化)反应。这种情况下，可以在第1反应场与第2反应场之间设置不同于第1反应场、第2反应场的进行增强反应的反应场。

关于第1、第2反应场，将在后文详述。

＜目标物质＞

成为本发明的测定方法的分析对象的目标物质只要能够通过免疫学方式或基因学方式进行检测则没有特别限定。例如，可例示细菌、病毒等病原体以及各种蛋白、肽、核酸、外泌体、各种低分子化合物等。

＜第1捕捉物质＞

本发明的第1捕捉物质具有将目标物质捕捉到固相上的功能，固定在固相上而使用，例如在目标物质为抗原时，使用与目标物质特异性反应的抗体，在目标物质为抗体时，使用与该抗体特异性反应的抗原。

另外，作为本发明的第1捕捉物质，除了上述抗原和抗体以外也可以使用核酸、适体、配体(底物、抑制剂、拮抗剂)、受体。例如目标物质为细菌来源的DNA时，可以使用与其DNA互补的核酸分子作为第1捕捉物质，另外，在目标物质为转录因子之类的序列特异性DNA结合蛋白转录因子时，可以使用具有特定的序列的DNA作为第1捕捉物质。

用作第1捕捉物质的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，从反应特异性的观点出发，优选单克隆抗体。

用作第1捕捉物质的抗体也包括抗体以及反应性与该抗体实质上同等的抗体片段和抗体变体。作为抗体片段，可列举Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv片段等。

＜第2捕捉物质＞

本发明的第2捕捉物质与被第1捕捉物质捕捉的目标物质结合，将目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与第2捕捉物质之间，形成固定于固相的复合体、即按照固相-第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(具有标记物的第2捕捉物质)的顺序结合的复合体。目标物质为抗原时，第2捕捉物质与第1捕捉物质同样地使用与目标物质特异性反应的抗体。另一方面，目标物质为抗体时，可以使用该抗体所特异性结合的抗原，另外也可以是与该抗体结合的不同于第1捕捉物质的抗体，还可以使用利用不同于产生该抗体的宿主的宿主制作的抗体。因此，第2捕捉物质为抗体时，形成固相-抗原(第1捕捉物质)-目标物质-抗原(第2捕捉物质)或抗体(第2捕捉物质)这样的免疫复合体、固相-抗体(第1捕捉物质)-目标物质-抗原(第2捕捉物质)或抗体(第2捕捉物质)这样的免疫复合体。

另外，作为本发明的第2捕捉物质，除了上述抗原和抗体以外也可以使用核酸、适体、生物素-亲和素之类的配体-受体的特异性组合。例如在细菌来源的DNA的情况下，可以使用包含靶区域的互补核酸分子作为第2捕捉物质，另外，在目标物质为转录因子之类的序列特异性DNA结合蛋白转录因子时，可以使用具有特定序列的DNA作为第2捕捉物质。

用作第2捕捉物质的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，从反应特异性的观点出发，优选单克隆抗体。

用作第2捕捉物质的抗体也包括抗体以及反应性与该抗体实质上同等的抗体片段和抗体变体。作为抗体片段，可列举Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv片段等。

＜标记物＞

标记物是用于标记第2捕捉物质的，只要可生成某种可检测的信号则没有特别限制。可以是例如酶、金属胶体颗粒、荧光物质、显色物质、发光物质、荧光源物质、显色源物质、发光源物质、用颜料着色的聚苯乙烯胶乳等合成胶乳或天然橡胶胶乳等胶乳、酶、可用结合有荧光物质的亲和素来检测的生物素。作为优选的标记物，可列举酶、金属胶体颗粒、荧光物质、发光物质、显色物质、荧光源物质、发光源物质、显色源物质。作为更优选的标记物，可列举酶、金属胶体颗粒、荧光物质、发光物质、荧光源物质、发光源物质，作为进一步优选的标记物，可列举金属胶体颗粒、酶、发光物质、荧光物质，作为进一步更优选的标记物，可列举酶、金属胶体颗粒。

需要说明的是，第2捕捉物质为抗体的情况包括第2捕捉物质即抗体具备标记物的情况和识别该抗体的抗体(例如二抗)具备标记物的情况。后一种情况下，具备标记物的抗体本身可视为标记物。

标记物与第2捕捉物质结合的方法没有限制，例如可以利用基于物理吸附的结合、化学结合、利用亲和性的结合和这些的组合等结合方法。可以利用公知的方法使标记物与第2捕捉物质结合。

基于标记物的信号包括：标记物本身为信号源、且由标记物发出的信号；标记物为反应基剂，受到其它化合物的作用而发出的、来自标记物的信号；标记物为催化剂，与另行添加的底物反应生成其它生成物，该生成物所发出的信号；由于标记物所参与的反应而产生的信号。即，“基于标记物而产生的信号”、“基于标记物而生成的信号”不仅意味着标记物与其以外的物质反应而产生(生成)信号，还包括标记物单独产生(生成)信号的情况。与此相关的是，“基于标记物而产生的信号”、“基于标记物而生成的信号”是不仅包括通过标记物所参与的物理反应、化学反应和生物化学反应生成信号的情况、而且包括标记物吸收能量而发出信号的情况的概念。

例如，标记物若为酶，则向反应体系中添加酶可催化的酶底物，通过酶反应使底物进行反应，由此生成信号。底物可以是通过酶反应而呈色的显色团(显色源物质)、通过酶反应而产生荧光的荧光团(荧光源物质)、通过酶反应而发光的发光物质(发光源物质)。标记物为显色源物质等时，将用于以这些为反应原料(底物)而生成显色物质等的反应试剂(酶、化合物)导入第2反应场，生成信号。

另外，标记物为生物素、与结合在信号物质上的亲和素结合的情况等中，通过向标记物中添加信号物质，从而产生基于标记物的信号。

另外，作为标记物吸收能量而发出信号的例子，作为一例，可列举例如以吸光度、吸收光谱等光学物理量的减少成为信号的例子。

基于标记物而产生的信号(基于标记物而生成的信号)优选可通过光学方式检测。作为所述信号的具体例，可列举来自标记物或通过标记物发生反应而生成的生成物、即信号物质的透射光、反射光、散射光、荧光、磷光、发光中的任意者，可以利用所述信号来检测标记物或其生成物。

就可作为标记物使用的荧光物质而言，可例示出例如异硫氰酸荧光素、包含铕系金属的色素、GFP蛋白，作为发光物质，可例示出例如萤光素-萤光素酶发光系统等。

可作为标记物使用的酶(以下适宜地称为“标记酶”。)可以是通常用于ELISA法中的各种酶，可列举例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等。

第2捕捉物质为抗体时，可以通过戊二醛法、高碘酸法或马来酰亚胺法等使这些酶结合、标记在期望的第2捕捉物质上。另外，也可以通过上述方法使这些酶结合到作为第2捕捉物质的抗体的二抗上，使该二抗与作为第2捕捉物质的抗体结合，从而进行标记。另外，作为另一方法，也可以通过基因工程方法使抗体和酶结合并表达，从而以抗体酶复合体形式进行制备。这种情况下，由于不需要理由规定方法使酶与抗体结合，因此可以得到使酶在不失活的情况下结合于抗体的酶标记抗体。

另外，作为可用于通过比色法定量这些酶的催化活性的色素，可列举5-氨基水杨酸、邻苯二胺、2,2’-叠氮基二(3-乙基苯并噻唑啉)-6’-磺酸(ABTS)、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷和对硝基苯基磷酸二钠等。这些色素可根据标记酶的种类来选择，例如标记酶为过氧化物酶(HRP)时可选择ABTS，为β-D-半乳糖苷酶时可选择邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷，另外为碱性磷酸酶时可选择对硝基苯基磷酸二钠盐。

另外，作为发光底物，例如在碱性磷酸酶时可以使用二氧杂环丁烷系化合物，在过氧化物酶时可以使用鲁米诺系化合物，作为荧光底物，在碱性磷酸酶时可以使用4-甲基伞形酮磷酸酯，在过氧化物酶时可以使用刃天青、试卤灵衍生物，但是不限于这些。

作为可用作标记物的金属胶体颗粒，可以适宜地选择使用各种金属胶体颗粒，可列举例如金胶体、银胶体、铂胶体等金属胶体以及它们的复合金属胶体。作为复合金属胶体，可列举例如负载铂的金胶体、负载铂的钯胶体等。

作为本发明中优选的金属胶体颗粒，可列举金胶体颗粒、其复合金属胶体颗粒、或银胶体颗粒，更优选金胶体颗粒。

金属胶体颗粒的粒径通常为1nm～500nm。作为标记使用的金属胶体颗粒优选使用1nm～500nm左右者。另外，进行光学检测时的金属胶体颗粒(金属颗粒)的粒径优选为10nm～10μm。在此，适合检测的金属颗粒的粒径根据所选择的光学检测相同的灵敏度、精度、测定条件等而不同，例如检测系统使用通用的光拾取器时，通常为100nm～10μm、优选100nm～5μm、更优选200nm～5μm，处于1μm～3μm的范围时，可以使检测更加容易。

另外，在使用组合激光器和发光二极管来检测散射光的简易检测系统时，金属胶体颗粒的粒径为100nm以上即可，为150nm以上时更容易检测。粒径为200nm以上时，能够充分地检测。优选为100nm～3μm，更优选为200nm～1μm。需要说明的是，根据检测反应场的结构、大小、检测时间等测定条件的不同，使散射光强度更强的1μm～3μm的范围有时更为优选。

包含标记物的部分被导入到进行检测反应的反应场(第2反应场)。并且在第2反应场中进行基于标记物的信号的检测。

详细如后所述，例如，如标记物为酶时那样，在另行添加的底物与标记物即酶反应、由来自底物的生成物发出信号的情况下，在微孔(微容积)中形成第2反应场时，标记物与对应底物等的接触概率提高，因此反应速度增大，能够提高信号生成效率、缩短检测前的时间。另一方面，反应容量变小时，成为信号源的物质的量也减少，因此信号变得微弱。

另外，在应用微反应器时，试样(包含标记物的部分)向第2反应场的微孔中的输送使用微流路。标记物为金属胶体颗粒等不溶性物质时，为了避免流路的堵塞，结合于第2捕捉物质的金属胶体颗粒等标记物的粒径越小越优选。这种情况下，这些标记物的粒径设为适合于所形成的流路宽度的范围。例如，微反应器的流路直径为15μm左右时，标记物的粒径优选为200nm以下，为1nm～100nm，更优选为1nm～80nm，特别优选为1nm～50nm。

颗粒尺寸小时，基于其得到的光学信号也变得微弱。

这种信号微弱的情况下，可以通过在微孔中进行增强反应而提高反应速度，同时随着增强反应信号强度也增大，由此变得容易检测。另外，可以使标记物(结合标记物的复合体或其片段)的大小为适合于在微流路进行输送的大小，由此能够抑制微流路内的堵塞地向第2反应场输送，能够避免妨碍测定的情况。

所述信号增强的方法可以利用公知的方法，例如标记物、基于其生成的信号物质为荧光物质时，可以是使用光敏化剂来增大荧光强度、荧光寿命的方法。另外，标记物为酶的情况等，在酶参与信号生成时，可以通过进行除了标记酶以外还组合使用其它酶的酶循环法来进行信号增强。

作为酶循环反应体系，可以使用公知的循环反应体系。作为公知的酶循环反应，众所周知有NAD循环、CoA循环、ATP循环，另外可以例示日本特开平4-335898号公报、日本特开2014-124165号公报记载的方法，即，使作为信号物质的硫代NAD(P)H以几何级数增强，从而通过比色法高灵敏度地进行蛋白或核酸的定量、光学检测。

日本特开2014-124165号公报中公开了使硫代NAD(P)H在反应体系内积累、增强的反应。根据该反应，在标记物的酶为碱性磷酸酶(ALP)时，添加磷酸化的底物(具有磷酸基的雄酮衍生物等)从而使碱性磷酸酶的酶反应生成物成为酶循环反应的底物，使用3α-羟基类固醇脱氢酶等实施酶循环法。进而，标记物的酶不限于碱性磷酸酶，也可以使用葡糖苷酶、半乳糖苷酶、果糖苷酶、甘露糖苷酶或过氧化物酶、并且使用作为所述酶的底物的具有特定的官能团、键的雄酮衍生物来实施酶循环法。需要说明的是，这种情况下，通过酶循环反应生成的硫代NADH等成为信号物质，通过对其量进行吸光度测定或测定基于生成的硫NADH等的颜色变化，可以检测基于标记物的信号。

另一方面，标记物为金属胶体颗粒时，作为信号增强方法，可列举例如使胶体颗粒生长、使粒径变大的敏化反应。由此，输送时所述金属胶体颗粒为微尺寸，检测时所述金属胶体颗粒可以变为大尺寸。金属胶体颗粒的吸光度等光学特性会根据粒径尺寸而发生明显变化。随着颗粒尺寸的增大，产生的信号也增大，光学检测变得容易。另外，粒径变化则表面等离子体激元特性也变化，随之极大吸收波长也变化。随着改变粒径尺寸的改变，可光学测定波长也可以与极大吸收一致地进行测定，光学检测可变得更加容易。由此，可实现微反应器中的反应物质(标记物)的顺利输送和检测灵敏度的提高这两者。敏化反应例如可以通过日本特开2009-192270号公报记载的方法来进行。

在此，在本发明中，例如使用金属胶体作为标记物时，利用该金属胶体的催化活性或组合使用还原剂而在标记物的金属胶体表面将另行添加于反应体系的包含金离子、银离子的金属盐溶液中的金属离子还原、使其堆积也能够增大金属胶体的粒径，也能够增大可检测的信号。

作为与敏化作用对应的金属胶体颗粒，成为核的金属种优选为对氧化还原的稳定性高者。需要说明的是，成为核的金属胶体颗粒可以由单独一种金属形成，也可以为复合金属。关于所述金属胶体颗粒，作为标记物，可列举金胶体、铂胶体等金属胶体以及它们的复合金属胶体，此外还可列举用红色和蓝色等各颜料着色的聚苯乙烯胶乳等合成胶乳、天然橡胶胶乳等胶乳，其中特别优选金胶体等金属胶体。例如，可列举金胶体颗粒、铂胶体颗粒、钯胶体颗粒等。另外，作为复合金属胶体颗粒，可列举在金胶体颗粒上负载有铂胶体颗粒的铂-金胶体颗粒等。

所述金属胶体颗粒可以利用公知方法来制造，在金胶体颗粒的情况下，例如可以将四氯金酸(HAuCl₄)水溶液在沸腾下用柠檬酸等还原剂还原，从而制备金胶体颗粒。另外，如果在所制备的金胶体颗粒存在下进一步将氯铂酸(H₂[PtCl₆])用柠檬酸、抗坏血酸等还原剂还原，则可以制造铂-金胶体颗粒。

所述金属胶体颗粒的敏化反应可以如下进行：通过还原反应使金属从包含金属离子的溶液析出并堆积在金属胶体颗粒表面，从而使金属胶体的粒径生长，由此而进行。作为成为金属离子供给源的金属盐，可列举属于元素周期表第4、5、6周期的金属的盐，优选使用金、铂、银、钯、镍、钴、铜等的盐。析出的金属可以为与金属胶体颗粒同种的金属，也可以为异种的金属，只要能够在简易条件下实施还原反应就没有限制。

例如，钯-铂胶体颗粒可以通过使用包含镍离子、钴离子、铜离子这些金属离子中的任意种的溶液作为敏化剂溶液而使该胶体颗粒生长。

另外，例如对于金胶体颗粒，可以使用包含氯金酸的敏化剂溶液作为金离子供给源，在作为标记物的金胶体颗粒表面堆积金胶体而使该胶体颗粒生长。另外，对于金胶体颗粒，可以使用包含硝酸银的敏化剂溶液而在金胶体颗粒表面堆积银胶体，以复合金属胶体颗粒形式生长。铂-金胶体颗粒可以利用铂的催化活性而使用硝酸银、硫酸铜等包含铜盐等的敏化剂溶液来生长。

敏化剂溶液含有成为上述金属离子的供给源的各种金属盐作为必需成分，可以根据需要还含有络合剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂等。作为这样的敏化剂溶液，也可以使用现有公知的化学镀敷溶液。

作为络合剂，可列举氨、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐等。作为pH调节剂，可列举乙酸盐、丙酸盐、铵盐等。作为稳定剂，可列举各种表面活性剂等。

为了促进金属离子的还原反应，可以使用含有还原剂的溶液。作为还原剂，可列举柠檬酸、抗坏血酸、次磷酸钠、水合肼、硫酸肼、硼氢化钠、二甲基胺硼烷、甲醛、罗谢尔盐、葡萄糖、乙二醇等，但是不限于这些。所使用的还原剂可根据要还原的金属离子而适宜选择。

需要说明的是，敏化反应可以利用包含金属离子成分和还原剂这两者的敏化剂溶液来进行，也可以在即将进行敏化反应之前将包含金属离子成分的金属盐溶液和包含还原剂的还原剂溶液混合。特别优选将金属盐溶液和还原剂溶液分别添加到反应体系中的方法。另外，利用金属胶体颗粒的催化活性，即使不添加还原剂溶液也能够实施敏化反应。

＜包含标记分子的部分的切出方法＞

本发明的检测方法中，在第1反应场中在固相上形成第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(具有标记物的第2捕捉物质)的复合体后，从该复合体切出(分离)包含标记物的部分，该部分从固相游离到溶液中。如上所述，该分离部分只要包含标记物即可，不需要包含标记物的第2捕捉物质保持原本的状态。即，可以切断标记物与第2捕捉物质的结合而使其分离，也可以切断固相与第1捕捉物质的结合，只要标记物或包含标记物的部分被分离即可，可以切断复合体内的任意结合。包含标记物的部分优选为从所形成的复合体中分离出的而包含标记物的部分，更优选为不含第1捕捉物质、包含标记物的部分，进一步优选不含第1捕捉物质和第2捕捉物质而仅为标记物。

如上所述，标记物与第2捕捉物质的结合方法没有限制，可以利用例如基于物理吸附的结合、化学结合、利用亲和性的结合和这些的组合等结合方法。可以利用公知的方法使标记物与第2捕捉物质结合。

作为切断(分离)包含标记物的部分的手段，可以例示：从外部提供热、光、振动等物理能量来进行切断的方法；添加包含氧化剂、还原剂等的切断试剂的方法。切断试剂可以切断固相与第1捕捉物质的结合，也可以切断复合体内的其它结合。优选可以从形成在固相上的复合体中分离包含标记的部分者，特别优选将目标物质与第2捕捉物质之间或第2捕捉物质与标记物结合切断者。

作为切断结合的切断试剂，可例示出pH调节剂、变性剂、还原剂、酶、竞争剂、以及醇或酯和这些的衍生物等，优选例示出pH调节剂、变性剂、还原剂、酶、竞争剂等，更优选例示出pH调节剂、变性剂、还原剂、酶等。

pH调节剂包括酸、碱、这些的盐，是改变pH的化合物或组合物。酸可以为无机酸和有机酸中的任意者，碱可以为无机碱和有机碱中的任意者。作为所述酸和碱，可例示出盐酸、硼酸(boric acid)、碳酸、硝酸、乙酸、硼酸(boronic acid)、甲酸、柠檬酸、磷酸、草酸、乳酸、苹果酸、水杨酸、甘氨酸盐酸盐、甘氨酸氢氧化钠、氢氧化钠、三乙胺、二甲胺、甲胺等胺类、氨、碳酸氢钠、他们的盐等，但是不限于这些。其中，优选强酸和强碱，作为其具体例，可列举盐酸、硝酸、甲酸、磷酸、草酸、甘氨酸盐酸盐、甘氨酸氢氧化钠、氢氧化钠、三乙胺、二甲胺、甲胺等胺类。

变性剂是改变蛋白、核酸的高级结构的试剂，可例示出尿素、胍盐等蛋白变性剂、十二烷基硫酸钠等表面活性剂，但是不限于这些。

作为还原剂，作为可切断二硫键者，可例示出2-巯基乙醇、二硫苏糖醇。

酶是对复合体的构成要素的一部分进行水解的物质，可例示出胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、核酸酶、特异性作用于构成要素的特定键的酶。

竞争剂可例示出竞争目标物质与第1或第2捕捉物质的结合的激动剂、拮抗剂、竞争性抗体。

切断试剂的种类、浓度可根据对象复合体的结构、结合力适宜选择，可在不会使标记物丧失功能的范围内调整。

在此，为了将复合体的任意部分特异性地切断，可以预先向复合体的规定部分导入接头。例如，在使固相与第1捕捉物质、或者使标记物与第2捕捉物质结合时，为了在这两对对象物质间进行连接，可使用该接头。接头只要在两末端具有能够形成化学键的规定的官能团、反应基团即可，可以借助接头的两末端的官能团使标记物和第2捕捉物质等对象物质之间连接。接头可以是为了使固相与第1捕捉物质、或者使标记物与第2捕捉物质连接而使用，但是不限于此。作为接头的两末端的官能团或反应基团，可列举例如形成酰胺键、二硫键、酯键等共价键者。这种情况下，可以通过对接头的末端键部位进行水解、还原剂处理而切断复合体。

另外，接头与对象物质的结合机制不限于上述共价键，也可以是例如物理吸附、离子键、生物素-亲和素之类利用分子间亲和性的结合以及这些的组合等结合方式。

进而，构成接头的分子结构没有限定，可以使用蛋白、肽、糖链、核酸、聚乙二醇等合成高分子。另外，也可以使用形成亲和性结合的生物素-亲和素等。这种情况下，可以用内肽酶、糖分解酶、内切核酸酶等酶、酸、表面活性剂等对接头进行处理，从而将接头在中间切断。

所述接头部分的切断可以通过来自外部的物理能量、酶等切断试剂来进行切断。

具体而言，例如在切断二硫键时，可以用2-巯基乙醇、二硫苏糖醇之类分子内具有硫醇基的还原剂进行作用而进行切断。另外，生物素-亲和素结合的情况下，可以通过添加pH调节剂而改变反应体系的pH或使用溶出缓冲液而将上述结合切断。另外，在接头分子由糖链构成时，可以用特异性的酶作用于构成糖链的单糖与单糖的键而切断特定的键。

另外，使用具有组氨酸标签的接头时，例如在第1捕捉物质上结合末端具有组氨酸标签的接头分子，将用螯合基团衍生化的镍固相化于固相的表面，从而可以借助组氨酸标签将第1捕捉物质固定化于固相。如果向其中添加作为组氨酸标签竞争剂的组氨酸、咪唑作为切断试剂，则可以使组氨酸标签从镍上解离，因此可以使包含标记物的复合体从固相分离。

上述切断试剂可以在添加后去除，也可以使其失活。例如，在通过添加pH调节剂而使反应场从中性变为酸性、碱性时，进一步加入pH调节剂而使其恢复中性的处理则属于这种情况。

＜固相＞

固相是第1捕捉物质所结合的不溶性的固体。固相是第1反应场中复合体所结合的支架，加工成可留置在第1反应场的形态、形状、大小。

固相的形态或形状没有特别限定，可例示出面状体(反应容器表面、即反应容器内表面等具有规定面积的面)和收纳于反应容器内的板状体、粒状体、纤维体、机织布、无纺布、薄膜、片等。板状体、粒状体和纤维体可以为中空、实心、多孔等的任意形态。粒状体的形状可以选择球体、环状体、扁平体、柱状体、不定形状体等各种形状。粒状体例如可以为选自磁性颗粒、胶乳颗粒、树脂颗粒中的至少1种。

另外，作为固相与第1捕捉物质之间的结合，可以使用例如利用了物理吸附、共价键、离子键、亲和性的结合以及这些的组合等结合模式。优选通过共价键、离子键以强于基于亲和力、吸附力的结合力的键将第1捕捉物质固定化于固相。

所述固相中，优选使用比表面积大者，例如优选使用板状体、粒状体、纤维体、机织布、无纺布，更优选使用粒状体、纤维体、机织布、无纺布，进一步优选使用粒状体。优选比表面积大者，因此板状体和粒状体的粒径越小越优选。

＜反应场＞

本发明的目标物质的检测方法中，向具有预先固定化有第1捕捉物质的固相的第1反应场中导入试样，使固相上的第1捕捉物质与试样中的目标物质反应，经过清洗操作后导入第2捕捉物质，形成夹入了目标物质的复合体。接着进行清洗操作而将多余的第2捕捉物质排出到反应体系外。然后，如上所述那样切断复合体的结合，使包含标记物的部分分离。直至分离该包含标记物的部分为止的工序在第1反应场中进行。

第1反应场只要是能够形成固相-第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(具有标记物的第2捕捉物质)的复合体、并且能够使包含标记物的部分从该复合体分离的场，就没有特别限制。

需要说明的是，从输送性等观点出发，从复合体分离的包含标记物的部分优选不含固相。因此，优选使复合体在固相与第1捕捉物质之间、在第1捕捉物质内部、在第1捕捉物质与目标物质之间、在目标物质的内部、在目标物质与第2捕捉物质之间、在第2捕捉物质的内部、或者在第2捕捉物质与标记物之间分离，游离出包含标记物的部分。

作为第1反应场，可以使用例如试管、微型管、微孔板、微反应器内的腔室、生物盘等。另外，第1反应场中的操作可以手动进行，也可以自动进行。在使第1反应场中的操作自动化进行时，例如，第1反应场可以由以微反应器形态安装的装置来构成，进而可以使其以盘的形态构成。

第2反应场处于与第1反应场不同的位置，是第1反应场中分离出的包含标记物的部分要被导入的反应场。另外，第2反应场如上所述为利用基于标记物的信号检测目标物质的场。第1反应场中上述复合体以外的要素通过清洗而被排出到体系外，之后进行包含标记物的部分的切断工序。因此，第2反应场中抑制测定的夹杂物减少，上述包含标记物的部分以高纯度状态被导入。在第2反应场中生成基于标记物的信号。

第2反应场优选由微容积(微孔)来形成。另外，特别优选由小于等于第1反应场的反应容积的容积来形成。第2反应场可采取各种反应容器的方式。优选设有多个微孔，在第1反应场中分离而得的含有包含标记物的部分的溶液被分配至多个孔中。多个微孔中，收纳有包含标记物的部分的微孔可检测到信号，未收纳标记物的微孔则检测不到信号。因此通过对微孔“有”、“无”信号进行计数，可对试样中的目标物质的存在进行明确的判定。另外，通过采用有限稀释法并且以标记物在微孔中的分配服从泊松分布为前提进行校正，从而对于得到的检测结果能够近似计算出目标物质的浓度。

以微孔形成第2反应场时，在第2反应场中进行有标记物参与的化学反应(包括生化反应)时，可以增大反应效率，由此可提高反应速度。以下对在第2反应场中实施标记物相关化学反应的情况进一步进行详细说明。

微孔的容积可考虑反应速度和产生的信号的强度来设计。各微孔以容积在1×10^-8～100μL的范围内方式构成即可。

另外，微孔的个数可以设计为1个以上，优选在10²个～10⁷个的范围内进行设计。可以以作为第2反应场的全部微孔的总容积大于在第1反应场分离而得的含有包含标记物的部分的溶液的总量的方式来适宜设定微孔的容积和其个数。多个微孔可以以阵列状设置。

通过以能够收纳第1反应场的试样溶液总量的个数来形成微孔，由此可通过该个数使反应场的容积小于第1反应场。例如第2反应场的容积可以通过微孔数而为第1反应场的1/10²～1/10⁷的容积。

阵列可以采取各种形状，可列举圆形、三角形、四边形(例如正方形)、正六边形、正八边形等形状，可以为微孔板的形态、圆盘(盘状)的形态。

微孔中，可以固定化有与包含标记物的部分特异性结合的物质。例如，通过在分离而得的包含标记物的部分预先标记生物素，将溶液导入预先固相化有亲和素的微孔，由此可以使包含目标物质的部分高效地留置于微孔内。

从而，通过设置多个微孔，可以将第1反应场中分离而得的含有包含标记物的部分的溶液分配到各微孔中，在微空间中高效率地实施反应。因此，即使试样中的目标物质为低浓度，也能够更加可靠地检测其存在。

为了在微孔中进行反应和进行信号检测，第2反应场可以以将多个微孔收纳于反应装置的方式来构成。

＜反应装置＞

该反应装置是可称为微反应器的反应装置。反应装置构成为：在其内部具备微孔、和与微孔连通且借助供给口与外部连接的供给流路。另外，反应装置中，可以适宜地设置有用于将废液排出到装置外的排出口或用于储存废液的储槽、用于将废液从微孔输送到排出口或储槽的排出流路。微孔和供给流路形成在反应装置内部中，将从第1反应场导入的溶液和试剂、用于密封微孔的油等从供给口向反应装置内供给。

反应装置内，各微孔沿着流路而配置。这种情况下，微孔分别以与流路连通的形态凹陷设置。需要说明的是，反应装置形成为后述盘形状时，微孔在流路侧方且盘的外周侧凹陷设置。

反应装置内设置的流路以大于微孔的尺寸而形成。流路可以根据微孔的容积而适宜设计，例如可在流路宽度为1～1000微米的范围、流路的深度为1～1000微米的范围内适宜设计。通过使流路宽度与从第1反应场导入的溶液所含的标记物的尺寸相比足够宽，可以顺利地输送包含标记物的部分。

反应装置内的试样溶液的输送可以通过泵、基于移液管的压送来进行。另外，也可以将微反应器形成为盘状并利用盘旋转所产生的旋转力和离心力来进行流体的输送。

使反应装置形成为盘状时，只要能够通过旋转力、离心力来输送试样溶液，则流路的形状没有特别限定。流路可以形成为从盘中心部附近向外侧的放射状，也可以形成为螺旋状。另外，流路可以以波纹管状形成、设置分支而形成。形成为螺旋状时，可以以同心圆状形成多个流路，也可以仅形式1个流路。另外，可以是流路的一部分呈螺旋状的形状，还可以形成多个螺旋状的流路。为了输送通过离心力、旋转力而导入反应装置内的溶液等，可在盘的中心侧设置供给口。

按照下述方法来适宜地设计微孔的形状、数量、流路的宽度：为了得到用于输送从供给口导入的溶液等的离心力或旋转力以例如500～7000rpm的转速进行1秒～10分钟，由此能够使从第1反应场导入的溶液、另行添加的试剂等充满反应装置内设置的微孔。

将第2反应场设计为多个微孔时，从第1反应场导入的含有包含标记物的部分的溶液量设定为少于形成第2反应场的多个微孔的总容积的容量，并且期望为与流路连通而形成的第2反应场即微孔的总数的10％以上、优选为30％以上、更优选为50％以上、进一步优选为70％以上、特别是90％以上被充满的溶液量。

由第1反应场供给的溶液量超过构成第2反应场的微孔的总容积时，可以在流路的终端设置储存溶液或废液的储槽。或者，可以构成为：使超出的试样液从流路的终端流出。

反应装置可以使用例如丙烯酸类树脂、聚碳酸酯树脂、硅树脂等各种塑料、玻璃、硅等无机材料等公知材料通过公知的方法来制作。为了用肉眼或用光学手段观察流路和孔的状况，该材料优选透明。

另外，反应装置可以使用公知的方法来制作。例如，可以通过将具有流路和微孔的图案的片或板与具有试样液的供给部的平坦的片或板贴合而制造。也可以通过机械加工、使用光刻的蚀刻来形成。另外，为了增大从微孔入射到检测器的信号的光量，可以在微孔或其背面形成反射层。

在第2反应场中利用规定的检测手段来检测基于标记物的信号。检测手段优选使用非接触的能够检测信号者。例如，为了检测来自信号物质的透射光、反射光、散射光、荧光、磷光、发光，可以使用CCD相机、CMOS相机、光拾取器、发光二极管等光学传感器等。

另外，散射光可以用具备激光器和发光二极管的检测系统来测定。光拾取器虽然也具备激光器和发光二极管，但是光拾取器是测定来自对象的入射光方向上的反射光(返回光)、即吸光度者。另一方面，检测散射光的检测系统是检测不同于入射光方向的方向上的散射光者，这一点与光拾取器不同。

例如，散射光强度与溶液中的金属(胶体)颗粒的浓度成比例地增加，因此通过测定散射光强度能够测定溶液中的金属(胶体)颗粒的浓度。另外，金属(胶体)颗粒的粒径处于规定范围时，散射光强度与粒径之间有相关性，另外，特定方向的散射光强度会根据粒径而变化。因此，在设置散射光检测系统作为检测手段时，也可以检测基于标记物的信号。

另外，第2反应场中基于标记物生成信号时，可以将用于生成基于标记物的信号的试剂与含有包含标记物的部分的溶液一起导入微孔，也可以将这些试剂与含有包含标记物的部分的溶液分开导入微孔。另外，在实施信号的增强反应时，可以将除了上述以外还混合有信号增强所需要的试剂类的物质导入到微孔，也可以分别分开导入到微孔中。另外，例如敏化剂溶液由多个溶液构成时，可以将这些以混合状态导入微孔，也可以分别导入。

关于所述混合，可以使用另外的腔室实施含有包含标记物的部分的溶液和其它试剂类(与标记物反应的底物、酶、其它反应物质)的混合后，将混合溶液导入微孔，也可以在将含有包含标记物的部分的溶液从第1反应场导入作为第2反应场的微孔之前的流路上混入试剂类。

标记物与底物等的反应速度可以通过适当调整试剂组成、底物浓度来调整。因此，可以抑制在送液中标记物与试剂或试剂中的成分间发生反应。另外，向微孔导入这些后，反应速度会飞跃性地增大，因此可以适宜地实施目标反应。

需要说明的是，也可以以通过赋予热等来自外部的能量而引发反应的方式来构成试剂。

另外，也可以将试剂成分的一部分预先以干燥状态配置于微孔、流路。例如，通过将敏化剂溶液所含的金属盐成分、还原剂以干燥状态分别配置在第1反应场与第2反应场之间的流路中，从而利用导入流路内的溶液将各试剂溶解而制备敏化剂溶液和还原剂溶液，可以一边与溶液所含的标记物进行反应一边将溶液导入微孔。另外，作为另一方式，也可以将金属盐成分、还原剂预先以干燥状态配置在微孔内，通过导入包含标记物的溶液而使其溶解、引发敏化反应。

使上述第1反应场构成为盘的形态时，可以将构成第1反应场的第1盘和构成第2反应场的第2盘重叠而一体地形成反应装置。这种情况下，设计为第2盘面向检测器侧的方式。另外，形成连通口，使得能够从第1盘向第2盘输送试样溶液。

＜目标物质的检测方法1(抗体检查)＞

本发明的目标物质的例示性检测方法1中，将针对目标物质的抗原固定化于聚苯乙烯珠表面。接着进行封闭，然后向规定容量的腔室内填充聚苯乙烯珠。导入包含目标物质(抗体)的血清等试样，与珠接触一定时间而进行反应后，利用缓冲液进行清洗，接着导入二抗(标记抗体)溶液并反应一定时间。由此，在珠上形成抗原-抗体-二抗的夹心形态的免疫复合体。用缓冲液清洗后以成为pH2～4的方式导入切断试剂(pH调节剂)，使包含标记物的部分从形成于固相上的免疫复合体中游离。

腔室设置有过滤器或以小于珠直径方式形成的溶出口，在切断处理后，从溶出口获取包含标记物的溶液。然后向该溶液中混合用于基于溶液中的标记物而生成信号的试剂。标记物为显色物质以及荧光物质、发光物质、金属胶体颗粒等信号物质本身时，不需要所述试剂。标记物为酶时，混合通过酶反应而发出荧光、发光或显色的底物。另外，标记物为生物素等时，混合结合有亲和素的信号物质。需要说明的是，在酶参与信号生成的情况等中，其反应受pH影响时，在投入切断试剂后利用中和剂重新调整到pH7附近后再实施信号生成反应。

需要说明的是，溶出口可以设有可开关的盖子。另外，也可以以通过挤压腔室内的溶液而使溶液从溶出口流出的方式构成腔室。

然后，根据需要混合用于信号增强的试剂后，将溶液导入到设有多个微孔的反应装置，并分配到微孔中。在经过规定时间后或即刻使用光学手段检测来自微孔的信号。

利用所述方法可以实施检测目标物质的免疫测定法。

＜目标物质的检测方法2(抗原检查)＞

本发明的目标物质的例示性检测方法2中，可以实施被称为夹心方式的免疫测定法。首先，使用磷酸缓冲生理盐水(以下称为PBS)或缓冲液将针对目标物质的抗体稀释到合适的浓度并固定化于聚苯乙烯珠表面。接着进行封闭，然后向规定容量的腔室填充聚苯乙烯珠。导入包含目标物质(抗原)的血清等试样，与珠接触一定时间而进行反应后，利用缓冲液进行清洗，接着向腔室导入经标记的一抗而使其与抗原结合。由此在珠上形成抗体-抗原-抗体的夹心形态的免疫复合体。之后，可以通过与上述检测方法1同样的步骤实施检测目标物质的免疫测定法。

以下参照附图对本发明的优选实施方式进一步进行说明。

本发明的检测方法例如可以利用图2所示的装置来实施。

图2示出形成于压缩光盘(CD)、DVD、蓝光光盘(BD)之类的圆盘状塑料盘1内的微反应器。数字10表示用于接收规定容量的被检试样并暂时收纳的细长的试样储存部，在盘1的内侧(以下简称为“内侧”)的端部具备在盘1上方开口的试样添加口11。试样储存部10的内部收纳有浸渗了被标记物标记的第2捕捉物质的保持构件。数字20表示填充了固定有第1捕捉物质的聚苯乙烯珠等固相的捕捉区域，形成第1反应场。试样储存部10的盘1的外侧(以下简称为“外侧”)的端部通过流路12而与捕捉区域20的内侧的端部连通。捕捉区域20的外侧的端部与沿着盘1的圆周向相反方向而分支的T字型支管30的入口连通，支管30的沿着盘1的逆时针方向分支的出口借助流路31而与废液储液部40连通，沿着盘1的顺时针方向而分支的出口借助流路32而与出口51连通。T字型的支管30的内部设有切换液体流入方向的阀。所述阀使内部栓在封闭状态和开放状态之间进行切换，可以使用可利用电力、磁力、电磁力、机械机制、惯性力、离心力、热而工作的各种阀。另外，内部设置的栓可以例示出金属片、珠、空气、磁体、热熔性树脂、润滑脂等。理想方式是，作为栓，优选通过离心力而在支管内移动、从而能够切换到关闭位置的机制者(例如珠、空气等)。

出口51与设置于盘1的下层的具有第2反应场50的试样分析用盘连通。从第1反应场送出的试样溶液从出口51经由未图示的流路而被导入到试样分析用盘中，并被输送至第2反应场。盘1的下方配置有例如日本特开2012-255772号公报、日本特表2002-530786号公报记载的光盘的读取装置，从而能够检测来自第2反应场的信号。

试样储存部10的内侧的端部附近连接着流路60a的一端，第1储液部61、第2储液部62、第3储液部63、第4储液部64和第5储液部65从试样储存部10侧起按照该顺序串联地借助流路60a、60b、60c、60d、60e而连通。第1～3储液部61～63中收纳清洗液，所述清洗液用于冲洗捕捉区域20中形成的固定于固相的包含复合体(即，-第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(包含标记物))的复合体以外的物质。需要说明的是，本实施方式中设有3个储存清洗液的储液部，但是不限于此，设置了1个以上即可。

第4储液部64储存切断试剂，所述切断试剂用于从捕捉区域20中形成的复合体(即，固定于固相的第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(包含标记物))中仅切出包含标记物的部分并将其从捕捉区域20的外侧端部排出到支管30。

第5储液部65收纳有工作液，所述工作液用于挤压收纳于第1～4储液部61～64中的液体并使其向捕捉区域20的方向流出。作为工作液，通常选择不与试样溶液混溶者。

流路60a、60b、60c、60d、60e中充满了空气，随着来自第5储液部65的液体的挤压而向下游侧送出。捕捉区域20与流路12之间设有未图示的传感器，从而能够检测通过流路的物体为空气还是液体。可以利用该传感器检测液体的通过，可以判别是否从任意储液部流入了液体。

检测时，从试样添加口11注入试样溶液并充满试样储存部10，在试样储存部10内，试样溶液与被标记物标记的第2捕捉物质接触。之后使盘1逆时针旋转。于是，第5储液部65中收纳的工作液由于盘1旋转所产生的离心力而流出到流路60e中，挤压第1～4储液部61～64中收纳的液体和各流路60a、60b、60c、60d、60e的空气，使试样储存部10中收纳的试样溶液经由流路12而从其内侧端部流入捕捉区域20，此时如果试样溶液包含目标物质，则在捕捉区域20中形成包含固相-第1捕捉物质-目标物质-第2捕捉物质(包含标记物)的复合体。

再使盘1逆时针旋转，则第1～3储液部61～63中收纳的清洗液经由试样储存部10流入捕捉区域20，使捕捉区域20中形成的上述复合体以外的物质从捕捉区域20经由支管30和流路31而排出到废液储液部40。之后，第4储液部64中收纳的切断试剂经由试样储存部10流入捕捉区域20，从捕捉区域20中形成的上述复合体中仅切出包含标记物的部分。当传感器检测到切断试剂流入捕捉区域20时，使盘1暂时停止旋转，然后使盘1顺时针旋转。由此，将通过切断试剂进行上述切出而得的、含有包含标记物的部分的溶液从捕捉区域20经由支管30和流路32输送到第2反应场50。如果流路32内的空间52中配置有显色剂、敏化剂，则在第2反应场50中包含标记物的部分和显色剂、敏化剂发生混合，以状态被输送到试样分析用盘中，由于在第2反应场50中成为标记物发出可检测的信号的状态，可以使用合适的读取装置来检测信号。

实施例

以下通过实施例更详细地说明本发明。需要说明的是，本发明不受实施例的记载限定。

(参考例1)铂-金胶体悬浮液的制备

将使用的玻璃器具全部用王水清洗。将390mL的超纯水加入到烧瓶中使其沸腾，向该沸水中加入氯金酸水溶液(每1升水溶液中，以金计为1g，片山化学工业株式会社制)30mL，然后添加1重量％柠檬酸钠水溶液60mL。添加柠檬酸钠水溶液后，加入氯铂酸水溶液(每1升水溶液中，以铂计为1g，和光纯药工业株式会社制)数十mL。再在5分钟后加入1重量％柠檬酸钠水溶液60mL，进行4小时回流，得到铂-金胶体悬浮液。需要说明的是，在用于各实施例之前，为了能够可靠地检测包含标记物的部分的分离，适宜地添加试剂、还原剂而将胶体的粒径调整到100nm以上。

(参考例2)单克隆抗体的制备

将市售的SARS-CoV-2核衣壳蛋白(以下简称为“SARS-CoV-2NP”)(CUSABIO公司)作为免疫用抗原，按照常规方法获得抗SARS-CoV-2NP单克隆抗体(以下简称为“抗NP抗体”)。

具体而言，将100μg的SARS-CoV-2NP对小鼠(BALB/c、5周龄、日本SLC)免疫3次，将其脾细胞用于细胞融合。细胞融合中，使用作为小鼠骨髓瘤细胞的Sp2/0-Ag14细胞(Shulman等、1978)。细胞培养时，使用向杜尔贝科改良伊戈尔培养基(Gibco)中添加L-谷氨酰胺0.3mg/ml、青霉素G钾100单位/ml、硫酸链霉素100μg/ml、庆大霉素40μg/ml(DMEM)并向其中以10％加入胎牛血清(JRH)而成的培养液。细胞融合通过将免疫小鼠的脾细胞和Sp2/0-Ag14细胞混合并向其中添加聚乙二醇溶液(Sigma)来进行。融合细胞用HAT-RPMI[含有0.1mM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤和0.1mM胸苷(Gibco)的添加血清的RPMI]进行培养，通过酶联免疫法(ELISA)确认培养上清液中的抗体产生。将抗体产生阳性的细胞用HT-RPMI[包含0.1mM次黄嘌呤钠和0.1mM胸苷的添加血清的RPMI]进行培养，使其增殖。

向接种了2,6,10,14-四甲基十五烷(Kishida Chemical Co.,Ltd.)的小鼠(BALB/c、retire、日本SLC)腹腔内接种克隆而得的细胞，采集腹水。将该腹水供于蛋白G柱，纯化单克隆抗体。最终得到83个克隆的产生针对SARS-CoV-2NP的单克隆抗体的细胞。

(参考例3)金胶体悬浮液的制备

以氯金酸水溶液(每1升水溶液中，以金计1g，片山化学工业株式会社制)为原料，按照常规方法制备金胶体颗粒。具体而言，向通过加热而沸腾的纯水99ml中加入1％(v/w)氯金酸水溶液1ml，进而，在1分钟后加入1％(v/w)柠檬酸钠水溶液1.5ml，加热而沸腾5分钟后置于室温进行冷却。接着向该溶液中加入200mM碳酸钾水溶液而调节为pH9.0，向其中加入超纯水而使总量为100ml，得到悬浮有金胶体颗粒的金胶体悬浮液。需要说明的是，在未得到期望的粒径时，适当调整还原剂相对于氯金酸的添加量等而制作所需粒径的金胶体颗粒。

(实施例1)利用pH调节剂来分离包含标记物(铂-金胶体颗粒)的部分

(1)铂-金胶体标记抗体溶液的制备

对于从参考例2中获得的抗NP抗体中选出的1种抗NP抗体，按照以下步骤进行铂-金胶体标记。将蛋白换算重量为1μg的抗NP抗体(以下，示出蛋白换算重量时，以其纯化蛋白的基于重量分析的重量数值来示出)和参考例1中制备的粒径120nm的铂-金胶体悬浮液1mL混合，在室温下静置2分钟，使抗NP抗体结合到铂-金胶体颗粒的表面。然后，以相对于全部液量而言最终浓度为1.0％的方式加入10％牛血清白蛋白(以下记作“BSA”)水溶液，将铂-金胶体颗粒的残余表面用BSA封闭，由此制备铂-金胶体标记抗NP抗体溶液。然后对该溶液进行离心分离(600×g、25分钟)而使铂-金胶体标记抗NP抗体沉淀，除去上清液而获得铂-金胶体标记抗NP抗体。将获得的铂-金胶体标记抗NP抗体悬浮于含有10％蔗糖·1％BSA·0.5％Triton-X100(商品名)的50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)中，由此制得铂-金胶体标记抗体溶液。

(2)利用pH调节剂的切断处理

将参考例2中获得的抗NP抗体中的、与铂-金胶体标记中使用的抗NP抗体不同的抗体用Tris盐酸缓冲液制备成20μg/mL，由此制作抗体稀释液，向96孔微孔板的各孔中加入该抗体稀释液100μL，静置15-18小时而使抗体固相化。然后，在实施封闭处理后加入制备成10ng/mL的SARS-CoV-2NP溶液50μL和铂-金胶体标记抗体溶液50μL，在37℃下静置10分钟。接着用TBS-T(Tris Buffered Saline with Tween 20)清洗，排出清洗液后加入100μL的pH不同的各种试剂，在室温下静置2分钟后，回收孔内的溶液。将使用的试剂的种类和pH值示于表1。pH值使用pH计(LAQUA堀场公司制)来测定。

需要说明的是，柠檬酸溶液的pH按照将柠檬酸和柠檬酸钠混合而使其成为期望pH的溶液(pH2.94～pH6.96)的方式来调整。另外，磷酸溶液按照下述方法制备：将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合，以成为中性附近的期望pH(pH6.99～8.56)的方式来制备；将磷酸氢二钠和磷酸钠混合，以成为碱性的期望pH(pH11.33～12.85)的方式来制备。关于甘氨酸盐酸缓冲液、甘氨酸NaOH缓冲液和三乙胺溶液，添加盐酸或氢氧化钠而调节为期望的pH。另外，盐酸溶液和氢氧化钠溶液改变稀释倍率来调节pH。

[表1]

(3)铂-金胶体颗粒的测定

对于通过上述操作而回收的溶液，测定含有的铂-金胶体颗粒量。具体而言，向试样池中导入所回收的溶液，对试样池照射650nm的激光束，用安装于规定位置的发光二极管测定所得到的散射光。

由于散射光强度与溶液中的铂-金胶体颗粒的浓度成比例地增加，因此通过测定散射光强度，能够定量分析溶液中的铂-金胶体颗粒的浓度。即，通过用pH调节剂处理免疫复合体，能够检测从固相或免疫复合体分离的“包含铂-金胶体颗粒的部分”。

需要说明的是，铂-金胶体标记抗NP抗体非特异性地吸附(在抗原以外的场所)时，无法通过清洗操作去除，会通过pH调节剂而分离并混入测定试样中。因此，向与上述同样处理的孔中仅加入铂-金胶体标记抗NP抗体溶液100μL并在37℃下静置10分钟，接着用TBS-T清洗后加入pH调节剂液100μL，在室温下静置2分钟后从孔中回收溶液，进行散射光测定。对每种pH调节剂分别进行同样的操作，将得到的散射光强度作为各pH调节剂的空白值。

空白值可以评估非特异性吸附于孔内的铂-金胶体标记抗NP抗体来源的铂-金胶体颗粒的散射光强度，因此从测定值中减去该空白值，作为形成的免疫复合体的“包含铂-金胶体颗粒的部分”的散射光强度。将结果示于图3。

图3为示出各试剂的pH值与切断特性的关系的图。图3的下方显示各试剂的pH值和散射光强度的值，图3的上侧以图形示出各值。图的横轴为pH值，纵轴为散射光强度。由图3可知，pH值在中性附近时，散射光强度低。即，表明所添加的中性试剂的、复合体的“包含铂-金胶体颗粒的部分”的切断性能低。另一方面，添加的试剂为酸性、碱性时，散射光强度上升，表明利用酸、碱等pH调节剂可以切断固相上结合的复合体(固相-抗NP抗体-SARS-CoV-2NP-铂-金胶体标记抗NP抗体)的“包含铂-金胶体颗粒的部分”。

尤其是示出：pH低于4的pH调节剂(酸)、pH为10.6以上的pH调节剂(碱)，具有良好的切断性能，而且pH11.6以上的pH调节剂(碱)具有优异的切断性能。

(实施例2)利用氢氧化钠分离包含标记物(铂-金胶体颗粒)的部分

实施例1的结果表明氢氧化钠溶液的切断能力特别良好，因此改变氢氧化钠的浓度来进一步评价从结合于固相的复合体(固相-抗NP抗体-SARS-CoV-2NP-铂-金胶体标记抗NP抗体)切断包含标记物的部分的性能。

氢氧化钠浓度设为0.01mM、0.1mM、1mM、10mM、100mM、1M。并且除了使用制备成各浓度的氢氧化钠水溶液100μL以外，进行与实施例1同样的处理。将结果示于图4。

图4是示出氢氧化钠对复合体的切断性能的图。图4的下方显示氢氧化钠的各浓度下的pH值和散射光强度的值，图4的上侧以图形示出各值。图的横轴为氢氧化钠的摩尔浓度，纵轴为散射光强度。

由图4可知，在10mM以上的浓度时，氢氧化钠使免疫复合体的包含金胶体颗粒的部分游离。需要说明的是，10mM的氢氧化钠溶液的pH为11.87。

(实施例3)利用变性剂来分离包含标记物(铂-金胶体颗粒)的部分

通过与实施例1同样的方法准备具备固相化有抗NP抗体且实施了封闭处理的孔的微孔板。然后，对于以该微孔板的孔为固相而形成的复合体(固相-抗NP抗体-SARS-CoV-2NP-铂-金胶体标记抗NP抗体)，用变性剂代替pH调节剂进行作用，除此以外与实施例1同样地回收孔中的溶液，与实施例1的(3)同样地进行铂-金胶体颗粒量的测定。需要说明的是，变性剂使用了8M尿素、6M胍盐酸、或1％SDS。将结果示于图5。需要说明的是，为了比较，将使用1M-NaOH同样进行处理而得的结果一起示于图5。

图5是用游离出的金胶体(包含金胶体颗粒的部分)的散射光强度来示出变性剂对结合于固相的免疫复合体的作用的图。作为比较数据，示出了使用1M-NaOH的情况。如图5可知，任意变性剂均使包含铂-金胶体颗粒的部分游离。

(实施例4)包含标记物(碱性磷酸酶)的部分的分离

使在实施例1中向微孔板的固相化中使用的抗NP抗体化学结合于磁性颗粒(JSRLIFE SCIENCES公司制)而进行固相化。另外，使用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学)，用碱性磷酸酶(ALP)对实施例1中铂-金胶体标记抗NP抗体中使用的抗NP抗体100μg进行标记，由此制备ALP标记抗NP抗体溶液。向固相化有抗NP抗体的4mg/mL的磁性颗粒的分散液24μL中加入用TBS-T稀释1000倍的ALP标记抗体溶液120μL，加入1.2或12ng/mL的SARS-CoV-2NP溶液120μL，在37℃下静置30分钟。以磁力适当收集磁性颗粒，用TBS-T清洗后加入100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)或100mM三乙胺缓冲液(pH 11.5)200μL，在室温下搅拌2分钟，由此使ALP(包含ALP标记的部分)游离到液体中。接着在用磁力收集磁性颗粒的状态下采集上清液(包含游离ALP)，向用TBS稀释100倍而中和的液体5μL中加入以下的显色试剂反应试液(硫代NAD循环试剂)100μL，设置于酶标仪SH-9000(CORONA ELECTRIC Co.,Ltd.)，以405nm的吸光度经时测定37℃下的显色反应。

硫代NAD循环试剂

100mM Tris缓冲液pH 9.8

1.8mM硫代NAD

0.9mM NADH

3.8mM MgCl2

25单位/ml 3α-羟基类固醇脱氢酶

5mM雄酮3-磷酸酯

如表2所示，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)或三乙胺缓冲液(pH11.5)任一者处理时，通过吸光度计测到了405nm的显色反应。即，表明通过本处理能够使包含作为标记物的ALP的部分从固相游离，并且ALP的酶活性得以维持。

[表2]

该实验中，用95mAbs(光程＝3.03mm)能够检测1.2ng/mL的抗原。考虑到中和时的100倍稀释则能够检测12pg/mL的抗原，由抗原的分子量(49.7kDa)进行换算，可知能够检测0.2pM的抗原分子或碱性磷酸酶标记抗体。

ALP1分子处于体积1pL的微孔时，其ALP浓度成为1pM。设微孔的形状为1×1×1000μm，则其光程为1mm，推测通过ALP1分子的反应而产生的吸光度超过100mAbs(由本实施例的测定值进行线性推断，为1pM、光程1mm则为166mAbs)，表明足以进行检测。

(实施例5)金胶体颗粒的敏化处理

将参考例3中制备的金胶体颗粒悬浮液(粒径约12nm)用纯水制备成4.36nM的浓度，将其中的2μL加入到1M NaOH 100μL中并混合。该用1M NaOH的处理代表用pH调节剂对复合体进行的切断处理。向其中加入1M HCl100μL而进行中和。将该中和液6.35μL加入到10mMWalpole缓冲液(pH2.0)972μL与12.1M氯金酸液1.65μL的混合液中，再加入375mM羟胺盐酸盐20μL并混合，在室温下静置10分钟而进行敏化反应。然后进行离心而使溶液中的金胶体颗粒沉降，去除上清液，用超纯水清洗。将由此得到的金胶体颗粒分散液1μL滴加到贴合有碳带的试样架上，脱除大气，用电子显微镜TM4000Plus(日立制作所公司制)拍摄。加压电压设为15kv，倍率设为1000。拍摄5个视野以上，进行图像分析，由此计算平均粒径和标准偏差。需要说明的是，使用利用不含金胶体颗粒的超纯水代替4.36nM金胶体颗粒分散液并进行了同样的敏化处理者作为比较对象。将结果示于图6。

图6是示出敏化反应所引起的金胶体粒径的变化的图。图6的纵轴表示粒径。由图6可知，通过敏化反应，4.36nM金胶体颗粒分散液中的金胶体颗粒能够生长成粒径约3～5μm的颗粒。另一方面，不含金胶体颗粒时，也观察到金胶体颗粒的析出，但是与进行敏化处理时相比颗粒显著小，因此两者在检测中可明显区分。需要说明的是，调整反应条件当然可调整粒径，因此可知能够制备出粒径适合于检测体系的金胶体颗粒。

该结果表明，使用结合有微小的金胶体颗粒的标记抗体形成免疫复合体后(从固相侧)分离包含金胶体颗粒的部分的情况下，能够对分离出的部分所包含的金胶体颗粒进行敏化反应，而且该敏化后的金颗粒足以通过光学方式检测。

(实施例6)金属颗粒的粒径所引起的散射光强度的变化

(1)各种粒径的金胶体颗粒和铂胶体颗粒的准备

通过参考例1准备粒径120nm的铂-金胶体颗粒。另外，通过参考例3准备粒径12nm和200nm的金胶体颗粒，粒径500nm和1000nm的金(胶体)颗粒使用市售品(NANOPARTz,A11-500-CIT-DIH-1-50,A11-1000-NPC-DIH-1-100)。各颗粒准备了分散于溶液的状态的颗粒。

(2)散射光强度的测定

将上述所准备的各粒径的金胶体颗粒分散液稀释到可测定散射光的范围的浓度，通过与实施例1相同的方法实施散射光测定。将得到的散射光强度值除以浓度，计算出1nM下的散射光强度。其结果，获知随着金胶体颗粒的粒径增加散射光强度也增加。将结果示于图7。

图7是示出金属胶体颗粒的粒径与散射光强度的关系的图。横轴表示粒径(nm)，纵轴以对数示出散射光强度。由图7可知，从120nm起散射光强度显著增加，因此表明可以利用激光源和发光二极管的简单散射光检测体系从100nm左右起检测金属胶体颗粒。

(实施例7)基于包含标记物(铂-金胶体颗粒)的部分的抗原检测

将实施例1的固相化中使用的抗NP抗体用Tris盐酸缓冲液制备成20μg/mL，由此制备抗体稀释液。将其与磁性颗粒(JSR LIFE SCIENCES公司制)混合，通过化学键将抗NP抗体固相化于磁性颗粒。然后使固相化于磁性颗粒的抗NP抗体、制备成10、100、1000、10000pg/mL浓度的各个SARS-CoV-2NP溶液、实施例1中制备的铂-金胶体标记抗NP抗体在37℃下反应30分钟。从反应后的各溶液中分别用0.45μm离心式过滤器(默克公司)进行离心过滤，回收磁性颗粒，用TBS-T清洗5次。然后向磁性颗粒中加入1M-NaOH，对磁性颗粒上结合的复合体(磁性颗粒-抗NP抗体-SARS-CoV-2NP-铂-金胶体标记抗NP抗体)进行切断处理(溶出)，测定回收的溶出液的散射光强度。将测定结果示于图8。

图8是以散射光强度来示出溶出的铂-金胶体颗粒(包含铂-金胶体颗粒的部分)的浓度的图。纵轴以对数显示显示出散射光强度，横轴示出抗原浓度。由图8可知，基于铂-金胶体颗粒的散射光强度与抗原浓度成比例。即，抗原浓度升高时，溶出的铂-金胶体颗粒也随之增加，因此证实了对于固相上通过抗原抗体反应形成的复合体有效地实施了切断处理，而且切断的包含标记物的部分分离、溶出并被适当地检测。

(实施例8)利用竞争剂来分离包含标记物(ALP)的部分

与实施例7同样地将固相化有抗NP抗体的磁性颗粒用TBS(Tris缓冲生理盐水)制备成4mg/mL，向其中的24μL中分别加入0、0.1、1、10ng/mL的浓度的SARS-CoV-2NP 120μL，由此制作混合液。然后向制作的各混合液中加入ALP标记抗NP抗体120μL，进行搅拌，在37℃下反应10分钟后，以110μL分别注入到1.5mL管中。之后用磁力进行收集并用TBS-T对管中的磁性颗粒进行5次清洗，然后加入用TBS-T制备成666μg/mL的抗NP抗体液30μL，在室温下反应10分钟后回收上清液。需要说明的是，这里添加的抗NP抗体液所包含的抗NP抗体除了未进行ALP标记以外与之前添加的ALP标记抗NP抗体相同，其成为ALP标记抗NP抗体的竞争剂。

接着向回收的上清液中加入与实施例4同样的硫代NAD循环试剂100μL，设置于酶标仪SH-9000(CORONA ELECTRIC Co.,Ltd.)，以405nm的吸光度经时测定37℃下的显色反应。计算60分后的吸光度值减去无抗原条件(空白)而得的值。其结果，在SARS-CoV-2NP10ng/mL下确认到31mAbs的吸光度的显色反应。即，确认包含ALP标记的部分从复合体(磁性颗粒-抗NP抗体-SARS-CoV-2NP-ALS标记抗NP抗体)切断、溶出。

产业上的可利用性

根据本发明，能够高灵敏度且廉价地检测目标物质，因此可以作为医疗领域以及各种产业领域中的物质检测方法和装置来利用。

附图标记说明

1 盘

10 试样储存部

11 试样添加口

12 流路

20 捕捉区域

30 支管

31、32 流路

40 废液储液部

50第2反应场

51 出口

52 空间

60a、60b、60c、60d、60e流路

61、62、63、64、65储液部

Claims (20)

1.一种目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从所述复合体分离并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质。

2.根据权利要求1所述的目标物质的检测方法，其中，所述固相为选自由面状体、板状体、粒状体、纤维体、机织布、无纺布、薄膜和片组成的组中的至少1种。

3.根据权利要求2所述的目标物质的检测方法，其中，所述固相为粒状体，且为选自由磁性颗粒、胶乳颗粒和树脂颗粒组成的组中的至少1种。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，所述第1捕捉物质为选自由与目标物质特异性合的抗体、抗体片段、抗体变体、适体和核酸组成的组中的至少1种。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，所述第2捕捉物质为选自由与目标物质特异性合的抗体、抗体片段、抗体变体、适体和核酸组成的组中的至少1种。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在形成所述复合体后去除未形成所述复合体的所述第2捕捉物质。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，所述标记物为选自由金属胶体颗粒、酶、发光物质和荧光物质组成的组中的至少1种。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在所述第2反应场中产生基于标记物的信号。

9.根据权利要求8所述的目标物质的检测方法，其中，所述标记物为酶，并且所述方法包括如下步骤：在所述第2反应场中与底物进行反应而产生信号。

10.根据权利要求8所述的目标物质的检测方法，其中，所述标记物为金属胶体颗粒，并且所述方法包括如下步骤：在所述第2反应场中产生基于金属胶体颗粒的信号。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的目标物质的检测方法，其包括如下步骤：在所述第2反应场中实施使基于标记物的信号增强的增强反应。

12.根据权利要求11所述的目标物质的检测方法，其包括：所述标记物为金属胶体颗粒，所述增强反应是通过以金属离子为底物的还原反应使金属胶体颗粒生长的反应。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，从所述复合体分离所述包含标记物的部分是通过选自由加热处理、pH调节处理、氧化还原处理、酶处理和竞争反应处理组成的组中的至少1种处理来进行的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，所述信号为选自由透射光、反射光、散射光、发光和荧光组成的组中的至少1种。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，所述第2反应场的容量小于所述第1反应场的容量。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的目标物质的检测方法，其中，从所述复合体分离的所述包含标记物的部分不含固相。

17.一种目标物质的检测装置，其至少包括：

第1反应场，使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从所述复合体分离；

第2反应场，利用基于在第1反应场中从所述复合体分离的部分的标记物的信号来检测目标物质；和

通路，供从所述复合体分离的部分由第1反应场向第2反应场移动。

18.一种试剂，其用于包括下述步骤的目标物质的检测方法：在第1反应场中使目标物质夹入固定于固相的第1捕捉物质与被标记物标记的第2捕捉物质之间而形成复合体，使包含标记物的部分从所述复合体分离并移动到第2反应场，在第2反应场中利用基于标记物的信号检测目标物质，

其中，所述试剂具有使包含标记物的部分分离的作用。

19.根据权利要求18所述的试剂，其包含选自由pH调节剂、变性剂、还原剂、酶、竞争剂、以及醇或酯及这些的衍生物组成的组中的至少1种，以发挥使包含标记物的部分分离的作用。

20.根据权利要求19所述的试剂，其包含pH调节剂，以发挥使包含标记物的部分分离的作用。

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