CN116426617B

CN116426617B - 一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用

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Publication number: CN116426617B
Application number: CN202310456362.0A
Authority: CN
Inventors: 刘兆成; 邹健; 张瑞
Original assignee: Wuxi Peoples Hospital
Current assignee: Wuxi Peoples Hospital
Priority date: 2023-04-25
Filing date: 2023-04-25
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2043-04-25
Also published as: CN116426617A

Abstract

本发明属于生物医药及基因检测技术领域，具体涉及一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用。本发明以所述突变富集检测体系进行荧光定量PCR，可以实现稀有基因突变的富集，实现对突变模板占比为万分之一及以上的稀有基因突变的选择性高效扩增。同时，本发明不需要特殊反应试剂和碱基特殊修饰，成本低；不需要特殊的反应程序，操作简单。

Description

一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用

技术领域

本发明属于生物医药及基因检测技术领域，具体涉及一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用。

背景技术

基因变异如DNA点突变和SNP（单核苷酸多态性）在疾病发展中发挥着重要作用，因此可作为疾病诊断的分子标志物。例如，BRAF V600E是甲状腺癌中最常见的基因突变，基于FNBAs（细针穿刺活检标本）的BRAF V600E检测被常规用于辅助甲状腺癌的诊断。液体活检是一种非侵入性诊断技术，能够很好地对肿瘤基因组进行分析，包括对不同液体中的循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞或外泌体的检测。ctDNA液体活检有几个优点，包括样本可获得性、无创性和较低的肿瘤异质性。富集癌症患者ctDNA中的稀有突变在指导治疗以及监测癌症复发甚至癌症早期筛查方面具有很大的前景。例如，为了确定EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶抑制剂是否是最佳的治疗方案，建议对所有晚期NSCLC肿瘤患者进行EGFR突变检测。

然而，由于大量野生模板背景的存在，稀有的单核苷酸变异难以被高灵敏度地检测出，这阻碍了突变检测在临床和诊断上的应用。目前，已经发展出许多基于杂交和PCR的方法，如CRISPR-Cas系统、基于内切酶IV检测、ARMS、ASB-PCR、使用toehold-hairpin引物的PCR、BDA技术、COLD-PCR等。但这些基因分型方法大多需要特定的修饰碱基、操作复杂、灵敏度有限或多重检测能力受限。因为技术原理优势，虽然数字PCR能很好检测稀有突变，但需要特殊的设备，操作复杂且多重性的灵活程度低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用，所述突变富集检测体系可以实现稀有突变的高效富集，能够检测万分之一及以上的稀有突变的单重或多重检测。

本发明提供了一种高灵敏的突变富集检测体系，包括引物组和荧光定量PCR扩增试剂；

所述引物组包括野生特异性封阻引物和突变特异性引物；所述野生特异性封阻引物由互补序列与突出序列构成，所述互补序列位于3’端，且所述互补序列与野生型和突变型基因均互补，所述突出序列位于5’端，所述突出序列与延伸出的扩增子互补且形成发夹结构，所述突出序列的5’端与所述延伸出的扩增子上的野生碱基互补，不与突变碱基配对；所述突变特异性引物的3’端的碱基与所述延伸出的扩增子上的突变碱基互补配对。

优选的，所述第一序列的长度为15~25个碱基，所述突出序列的长度为15~35个碱基。

优选的，所述突变特异性引物的长度为15~25个碱基；所述突变特异性引物的3’端的碱基与突变型基因的突变碱基互补配对。

优选的，所述引物组包括第一引物组或第二引物组，所述第一引物组包括野生特异性上游封阻引物和突变特异性下游引物；

所述第二引物组包括突变特异性上游引物和野生型特异性下游封阻引物。

优选的，所述突变富集检测体系还包括通用发光探针。

优选的，所述突变富集检测体系中的引物组和通用探针序列的核苷酸序列如组合A）~组合C）中的任意一种或多种所示：

所述组合A）中的野生特异性封阻引物、突变特异性下游引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；

所述组合B）中的野生特异性封阻引物、突变特异性下游引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；

所述组合C）中的野生特异性封阻引物、突变特异性下游引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述野生特异性封阻引物、突变特异性引物和通用发光探针的浓度分别独立为0.01~3μM。

本发明还提供了上述技术方案所述的突变富集检测体系在制备基因突变检测试剂中的应用。

优选的，所述基因突变包括检测EGFR基因的T790M突变、BRAF基因的V600E突变和EGFR基因的L858R突变中的一种或多种。

本发明还提供了一种非疾病诊断的基因突变富集检测方法，包括如下步骤：

以上述技术方案所述的突变富集检测体系对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增，得到突变基因的扩增Ct₁值；

以检测参考基因的试剂对参考基因进行荧光定量PCR扩增，得到参考基因的扩增Ct₂值；

通过计算所述突变基因的扩增Ct₁值与参考基因的扩增Ct₂值差值∆Ct，判定所述待测样本中是否含有所述基因突变。

有益效果

本发明提供了一种高灵敏的突变富集检测体系，包括引物组和荧光定量PCR扩增试剂；所述引物组包括野生特异性封阻引物和突变特异性引物；所述野生特异性封阻引物由互补序列与突出序列构成，所述互补序列位于3’端，且所述互补序列与野生型和突变型基因均互补，所述突出序列位于5’端，所述突出序列与延伸出的扩增子互补且形成发夹结构，所述突出序列的5’端与所述延伸出的扩增子上的野生碱基互补，不与突变碱基配对；所述突变特异性引物的3’端的碱基与所述延伸出的扩增子上的突变碱基互补配对。以所述突变富集检测体系进行荧光定量PCR，可以实现稀有基因突变的富集，实现对突变模板占比为万分之一及以上的稀有基因突变的选择性高效扩增。同时，本发明不需要特殊反应试剂和碱基特殊修饰，成本低；不需要特殊的反应程序，操作简单。

实现所述检测的原理（图1）在于，本发明通过联合使用野生特异性封阻引物和突变特异性引物的突变富集检测方法HBC-PCR（hairpin blocker cleavage PCR），检测野生型模板时，野生特异性hairpin blocker的5’端碱基和野生碱基互补配对，进一步阻碍了突变特异性引物3’端碱基和野生型模板错配的可能，实现更大程度的非特异扩增抑制。对于突变型模板，突变特异性引物3’端碱基与其互补配对，从而实现引物延伸和模板扩增，而hairpin blocker的5’端碱基不能和突变位点的突变碱基配对，且在之后的扩增中被Taq酶的外切酶活性消化，基于这种hairpin和酶切机制，实现了突变型模板的特异性扩增，从而实现万分之一的稀有变异的有效检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明基因突变富集检测方法的检测原理图，其中A为基因突变富集检测方法的检测流程图，B为基因突变富集检测方法的荧光定量PCR扩增曲线图；

图2为本发明实施例1中HBC- PCR检测不同浓度比例的EGFR T790M突变型模板的扩增曲线；

图3为本发明实施例2中HBC- PCR检测不同浓度比例的BRAF V600E突变型模板的测序峰图；

图4为本发明实施例3中HBC-PCR多重检测不同浓度比例突变型模板的Ct值；

图5为本发明实施例4中使用HBC-PCR检测甲状腺癌症穿刺样本中的BRAF V600E突变和肺癌血浆ctDNA样本中EGFR L858R的突变检测结果图，其中A为HBC-PCR检测的24个甲状腺癌穿刺DNA样本和阳性对照（PC）、阴性对照（NC）的Ct值以及和参考基因比较而得的∆Ct值结果图，B为HBC-PCR检测的12个肺癌血浆ctDNA样本和阳性对照（P-C）、阴性对照（N-C）的Ct值以及和参考基因比较而得的∆Ct值结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种高灵敏的突变富集检测体系，包括引物组和荧光定量PCR扩增试剂；所述引物组包括野生特异性封阻引物（blocker引物）和突变特异性引物；所述野生特异性封阻引物由互补序列与突出序列构成，所述互补序列位于3’端，且所述互补序列与野生型和突变型基因均互补，所述突出序列位于5’端，所述突出序列的5’端与所述延伸出的扩增子上的野生碱基互补，不与突变碱基配对；所述突变特异性引物的3’端的碱基与所述延伸出的扩增子上的突变碱基互补配对。

在本发明中，所述引物组优选依据所述基因突变的野生型模板和突变型模板设计得到；所述引用组包括野生特异性封阻引物和突变特异性引物。本发明所述野生特异性封阻引物的3’端为与野生型基因和突变型基因模板均互补的互补序列，5’端为与延伸出的野生型扩增子互补形成发卡结构的突出序列，所述互补序列和突出序列组成所述野生特异性封阻引物。本发明所述突出序列所述突出序列的5’端与所述延伸出的扩增子上的野生型碱基互补，不与突变碱基配对。本发明所述第一序列的长度优选为15~25个碱基；所述突出序列优选为15~35个碱基。

在本发明中，所述突变特异性引物的长度优选为15~25个碱基；所述突变特异性引物的3’端的碱基与突变型基因的突变碱基互补配对。

本发明所述野生特异性封阻引物和突变特异性引物优选为合成的单链DNA或是经过修饰的改变杂交亲和力的DNA，更优选包括锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）或DNA小沟结合物（MGB）中一种或多种。

在本发明中，所述引物组优选存在两种形式的组合，即优选包括第一引物组或第二引物组，所述第一引物组优选包括野生特异性上游封阻引物和突变特异性下游引物；所述第二引物组包括突变特异性上游引物和野生特异性下游封阻引物。本发明所述第一引物组和所述第二引物组中各组分的特征与上述对所述引物组中的野生特异性封阻引物和突变特异性引物的特征相同，不再进行赘述，依据具体检测的基因突变灵活设计即可。

在本发明中，所述突变富集检测体系优选还包括通用发光探针。本发明所述通用发光探针包括但不限于Taqman探针、分子信标或荧光染料。当使用通用通用探针时可以增强qPCR扩增的特异性。

本发明所述野生特异性封阻引物、突变特异性引物和通用发光探针的浓度分别优选独立为0.01~3μM。

在本发明中，所述突变富集检测体系为单重检测体系或多重检测体系。当所述突变富集检测体系包括一种基因突变时，所组成的突变富集检测体系为单重检测体系；当所述突变富集检测体系包括两种或多种基因突变时，所组成的突变富集检测体系为多重检测体系。

在本发明中，所述突变富集检测体系中的引物组和通用探针序列的核苷酸序列如组合A）~组合C）中的任意一种或多种所示：

所述组合A）中的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；所述SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.1：CGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCTTGAGCAGGTACTGGGAG；SEQ ID NO.2：CCGTGCAGCTCATCAT；SEQ ID NO.3：GGACTATGTCCGGGAACACAAAGA，在所述SEQ ID NO.3的5’和3’两端分别标记有ROX和BHQ荧光标记，即ROX-GGACTATGTCCGGGAACACAAAGA-BHQ。

所述组合B）中的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；所述SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.4：ACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTAATGAGATCTACTGTTTTCCT；SEQ ID NO.5：CCACTCCATCGAGATTTCT；SEQ ID NO.6：ACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGA，在所述SEQ ID NO.6的5’和3’两端分别标记有FAM和BHQ荧光标记，即FAM-ACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGA-BHQ。

所述组合C）中的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.9所示；所述SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.7：AGCCCAAAATCTGTGATCTTGAATGAACTACTTGGAGGACCG；SEQ ID NO.8：CCAGCAGTTTGGCCC；SEQ ID NO.9：CTGGCAGCCAGGAACGTACTGGT，在所述SEQ ID NO.9的5’和3’两端分别标记有ROX和BHQ荧光标记，即ROX-CTGGCAGCCAGGAACGTACTGGT-BHQ。

在本发明中，所述荧光定量PCR扩增试剂优选包括热启动聚合酶，聚合酶buffer、dNTPs和MgCl₂。本发明对所述荧光定量PCR扩增试剂各组分的来源没有特殊限定，常规市售产品即可。

本发明所述野生特异性封阻引物和突变特异性引物能够特异性扩增突变型模板，抑制或减少扩增野生型模板，以此实现突变型模板的富集，实现稀有基因突变的检测。

基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的突变富集检测体系在制备基因突变检测试剂中的应用。本发明所述突变检测优选包括液体活检、无创产前筛查、核酸扩增、肿瘤体外诊断和基因分型中的一种或多种。

在本发明中，所述基因突变优选包括但不限于所述突变检测试剂包括检测EGFR基因的T790M突变、BRAF基因的V600E突变和EGFR基因的L858R突变中的一种或多种。本发明用于检测所述检测EGFR基因的T790M突变、BRAF基因的V600E突变和EGFR基因的L858R突变的引物组和通用探针的核苷酸序列依次如上述技术方案中的组合A）~组合C）所示，即所述EGFR基因的T790M突变的引物组和通用探针序列如组合A）所示，所述BRAF基因的V600E突变的引物组和通用探针序列如组合B）所示，以此类推，不再赘述。

通过计算所述突变基因的扩增Ct₁值与参考基因的扩增Ct₂值差值，判定所述待测样本中是否含有所述基因突变。

本发明以上述技术方案所述的突变富集体系对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增，得到突变基因的扩增Ct₁值。本发明所述待测样本优选为含有所述基因突变和/或野生型基因的样本。本发明所述DNA优选包括逆转录所得cDNA、合成的质粒DNA或单链DNA。本发明对所述待测样本的DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规制备方法即可。本发明对所述荧光定量PCR扩增的程序没有特殊限定，依据所述引物组的退火温度和荧光定量PCR扩增试剂进行设定即可。

本发明以检测参考基因的试剂对参考基因进行荧光定量PCR扩增，得到参考基因的扩增Ct₂值。本发明所述参考基因优选包括但不限于ACTB基因，所述检测ACTB基因的试剂优选包括引物组和通用探针；所述引物组的上游引物、下游引物以及通用探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10~SEQ ID NO.12所示；所述SEQ ID NO.10~SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.10：AGGCATCCTCACCCTGAAG；SEQ ID NO.11：CATTGTAGAAGGTGTGGTGCC；SEQ ID NO.12：GCATCGTCACCAACTGGGACG，在所述SEQ ID NO.12的5’和3’两端分别标记有TAMRA和BHQ荧光标记，即TAMRA-GCATCGTCACCAACTGGGACG-BHQ。

得到所述突变基因的扩增Ct₁值与参考基因的扩增Ct₂值后，本发明通过计算所述突变基因的扩增Ct₁值与参考基因的扩增Ct₂值差值ΔCt，判定所述待测样本中是否含有所述基因突变。

本发明所述判定方式优选包括：通过扩增野生型样本中获得的Ct差值ΔCt₁本发明所述ΔCt的计算公式优选如下：ΔCt₁ = Ct[突变基因]-Ct[参考基因]-3×SD[突变基因]；当所述ΔCt高于ΔCt₁为突变阴性或低于检测限无法检出，当所述ΔCt低于ΔCt₁为突变阳性。

本发明以所述突变富集检测体系对待测样本进行荧光定量PCR可以实现突变型模板的高效富集，在此基础上，通过计算所述突变基因的扩增Ct值与参考基因的扩增Ct值差值的差值，获得检测结果。此方法操作简单，成本低且特异性较强。

本发明所述富集检测方法同样可实现疾病诊断的基因突变检测，检测步骤同上，不再进行赘述。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

一种基因突变富集检测方法，步骤如下：

高灵敏的突变富集检测体系组分如步骤1）和步骤2）所示：

EGFR基因的T790M突变（简写为EGFR T790M）的引物组，依据野生型基因模板和突变型基因模板设计野生特异性上游封阻引物，突变特异性下游引物和通用型荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；所述SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.1：CGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCTTGAGCAGGTACTGGGAG；SEQ ID NO.2：CCGTGCAGCTCATCAT；SEQ ID NO.3的5’端和3’端加上荧光标记后的序列：ROX-GGACTATGTCCGGGAACACAAAGA-BHQ。

HBC-qPCR的反应体积为30μL，含有2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，野生特异性上游封阻引物0.2μM，突变特异性引物0.03μM，通用型荧光探针0.07μM，0.03U/μL热启动聚合酶；各突变比例不同的模板10μL，突变比例不同的模板在进行qPCR扩增时，各自独立成管，每个管的反应体积均为30μL。其中各突变比例的模板依次包括突变比例分别为0%、0.01%、0.1%、1%、10%和50%的模板；在本实施例中，突变比例指的是突变模板占总模板的比例，如突变比例为10%的模板指的是：9000拷贝的突变型模板和81000拷贝野生型模板混合，在实际配置中，是使用野生型模板不断的稀释，得到突变比例不同的模板。在本实施例中，野生型模板为质粒DNA（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），突变型模板为293T基因组DNA（293T细胞系中提取的基因组DNA）。

将步骤1）和步骤2）中的突变富集检测体系进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸30s，55个循环。

使用ABIQuantStudio Test系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图2所示。

由图2可以得出：本发明的检测方法具备检测万分之一突变的能力。

实施例

一种基因突变富集检测方法，步骤如下：

高灵敏的突变富集检测体系组分如步骤1）和步骤2）所示：

BRAF基因的V600E突变（简写为BRAF V600E）的引物组，依据野生型基因模板和突变型基因模板设计野生特异性上游封阻引物，突变特异性下游引物和通用型荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；所述SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列从5’端到3’端具体如下：SEQ ID NO.4：ACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTAATGAGATCTACTGTTTTCCT；SEQ ID NO.5：CCACTCCATCGAGATTTCT；SEQ ID NO.6的5’端和3’端加上荧光标记后的序列：FAM-ACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGA-BHQ。

2）HBC-qPCR的反应体积为30μL，含有2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，野生特异性上游封阻引物0.2μM，突变特异性引物0.2μM，通用型荧光探针0.05μM，0.03U/μL热启动聚合酶；各突变比例不同的模板10μL，突变比例不同的模板在进行qPCR扩增时，各自独立成管，每个管的反应体积均为30μL。其中各突变比例的模板依次包括突变比例分别为0%、0.01%、0.1%、1%、10%和50%的模板；在本实施例中，突变比例指的是突变模板占总模板的比例，如突变比例为10%的模板指的是：9000拷贝的突变型模板和81000拷贝野生型模板混合，在实际配置中，是使用野生型模板不断的稀释，得到突变比例不同的模板。在本实施例中，野生型模板为BHT101细胞系基因组DNA，突变型模板为293T 细胞系基因组DNA。

3）将步骤1）和步骤2）中的突变富集检测体系进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸30s，55个循环。

4）使用ABIQuantStudio Test系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图3所示。

由图3可以得出：本发明的检测方法具备检测万分之一突变的能力。

实施例

一种基因突变富集检测方法，步骤如下：

高灵敏的突变富集检测体系组分如步骤1）和步骤2）所示：

使用本方法多重检测 BRAF基因的V600E突变（简写为BRAF V600E），EGFR基因的L858R突变（简写为EGFR L858R），依据野生型基因模板和突变型基因模板设计野生特异性上游封阻引物、突变特异性下游引物和通用型探针，具体如表1所示：

表1 多重检测引物组序列

2）HBC-qPCR的反应体积为30μL，含有2.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，BRAF V600E的野生特异性Blocker上游引物0.2μM，突变特异性下游引物0.2μM，通用型荧光探针0.05μM；EGFR L858R的野生特异性Blocker上游引物0.2μM，突变特异性下游引物0.2μM，通用型荧光探针0.05μM；ACTB的上游引物0.2μM，下游引物0.2μM，通用型荧光探针0.05μM；0.03U/μL热启动聚合酶，各突变比例不同的模板10μL。突变比例不同的模板在进行qPCR扩增时，各自独立成管，每个管的反应体积均为30μL。其中各突变比例的模板依次包括突变比例分别为0%、0.01%、0.1%、1%和10%的模板；在本实施例中，突变比例指的是突变模板占总模板的比例，如突变比例为10%的模板指的是：9000拷贝的突变型模板和81000拷贝野生型模板混合，在实际配置中，是使用野生型模板不断的稀释，得到突变比例不同的模板。在本实施例中，野生型模板为BHT101细胞系基因组DNA和合成的质粒DNA，突变型模板为293T细胞系基因组DNA。

4）使用ABIQuantStudio Test系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图4所示。

由图4可以得出：本发明的检测方法具备检测万分之一突变的能力。

实施例

采用本发明中基因突变富集检测方法检测甲状腺癌症患者穿刺样本中的BRAFV600E和肺癌患者血浆ctDNA样本中的EGFR L858R的突变情况；共24个甲状腺癌症穿刺DNA样本和12个肺癌患者血浆ctDNA样本被使用。多重HBC-PCR的反应体系和实施例3中相同。结果如图5所示，其中A为HBC-PCR检测的24个甲状腺癌穿刺DNA样本和阳性对照（PC）、阴性对照（NC）的Ct值以及和参考基因比较而得的∆Ct值；其中阴性对照为总浓度为50ng的野生型293T基因组DNA；阳性对照为在野生型293T基因组DNA中加入突变DNA，配置的最终突变比例为0.1%。

∆Ct大于17（虚线标出）的样本被认为阴性，小于17被认为阳性。星号（*）表示没有扩增信号，被赋予50的Ct值。B为HBC-PCR检测的12个肺癌血浆ctDNA样本和阳性对照（P-C）、阴性对照（N-C）的Ct值以及和参考基因比较而得的∆Ct值。∆Ct大于18（虚线标出）的样本被认为阴性，小于18被认为阳性。星号（*）表示没有扩增信号，被赋予50的Ct值。

由图5可以得出，本发明中的基因突变富集检测方法（HBC-PCR）可以成功应用于穿刺组织DNA和血浆ctDNA样本的检测。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种非疾病诊断的基因突变富集检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

以检测EGFR基因的T790M突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增检测；其中，所述荧光定量PCR扩增检测的反应体系体积为30μL，含有2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，野生特异性封阻引物0.2μM，突变特异性引物0.03μM，通用型荧光探针0.07μM，0.03U/μL热启动聚合酶，以及模板DNA 10μL；所述荧光定量PCR扩增检测的反应程序为：95℃ 3min；再95℃ 10s，56℃ 30s，55个循环；或者，

以检测BRAF基因的V600E突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增检测；其中，所述荧光定量PCR扩增检测的反应体系体积为30μL，含有2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，野生特异性封阻引物0.2μM，突变特异性引物0.2μM，通用型荧光探针0.05μM，0.03U/μL热启动聚合酶，以及模板DNA10μL；所述荧光定量PCR扩增检测的反应程序为：95℃ 3min；再95℃ 10s，56℃ 30s，55个循环；或者，

以检测BRAF基因的V600E突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针，和检测EGFR基因的L858R突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增检测；其中，所述荧光定量PCR扩增检测的反应体系体积为30μL，含有2.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，BRAF V600E的野生特异性封阻引物0.2μM，BRAF V600E的突变特异性引物0.2μM，BRAF V600E的通用型荧光探针0.05μM，EGFR L858R的野生特异性封阻引物0.2μM，EGFR L858R的突变特异性引物0.2μM，EGFR L858R的通用型荧光探针0.05μM，0.03U/μL热启动聚合酶，以及模板DNA 10μL；所述荧光定量PCR扩增检测的反应程序为：95℃ 3min；再95℃ 10s，56℃ 30s，55个循环；

所述检测EGFR基因的T790M突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；

所述检测BRAF基因的V600E突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示；

所述检测EGFR基因的L858R突变的野生特异性封阻引物、突变特异性引物以及通用发光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的基因突变富集检测方法，其特征在于，所述基因突变富集检测的步骤为：

通过对待测样本的DNA进行荧光定量PCR扩增检测，得到待测样本的DNA的扩增Ct₁值；

以检测参考基因的试剂对参考基因进行荧光定量PCR扩增检测，得到参考基因的扩增Ct₂值；

通过计算所述待测样本的DNA的扩增Ct₁值与参考基因的扩增Ct₂值差值∆Ct，判定所述待测样本中是否含有基因突变。

3.根据权利要求2所述的基因突变富集检测方法，其特征在于，所述参考基因为ACTB基因，用于检测所述ACTB基因的上游引物、下游引物和通用性荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求1所述的基因突变富集检测方法，其特征在于，分别以含有不同突变比例的待测样本的DNA作为模板DNA，各突变比例不同的模板DNA为突变比例分别为0.01%、0.1%、1%、10%或50%的模板DNA；各突变比例不同的模板DNA在进行荧光定量PCR扩增检测时，各自独立成管。