CN116406303B

CN116406303B - 将gfap氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用

Info

Publication number: CN116406303B
Application number: CN202080104260.7A
Authority: CN
Inventors: 孔二艳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2025-07-29
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN116406303A; WO2022047734A1

Abstract

本发明提供了一种将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用，其中，所述GFAP氨基酸位点为GFAP的第291位半胱氨酸，将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的途径为阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化，所述应用为用于筛选治疗神经退行性疾病的药物的应用。本发明提供了新的神经退行性疾病治疗靶标的应用，也提供了该应用所需的相关载体、序列和筛选方案，基于此，能够开发有效的治疗神经退行性疾病的方法和制备治疗制剂的方法。

Description

将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用

技术领域

本发明涉及神经退行性疾病治疗靶标的应用，具体涉及，将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用。

背景技术

神经退行性疾病是神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而导致功能障碍的一类疾病，包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病以及脊髓性肌萎缩症等等。目前，这类疾病病因尚不明确也无法治愈，严重威胁着人类健康与日常生活。

GFAP是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)的英文简称，是星形胶质细胞活化的标志物。星形胶质细胞的活化(典型特征为星形胶质细胞数量的大量增生和变态)与几乎所有的神经退行性疾病(典型特征为神经元数量的大量减少)高度相关。在上述神经退行性疾病的病理筛查过程中常常看到，星形胶质细胞的增生和神经元数量减少的共存现象和伴随性发生。发明人认为胶质细胞的大量增生在一定程度上促进了神经元的凋亡过程，加速了神经退行性疾病的病情发展，是神经退行性疾病的负面因子，因此将靶向星形胶质细胞的增生与神经退行疾病的关系进行深入研究，本发明即为其中的一部分研究成果。

本发明一实施例中采用的婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(INCL)模型是神经退行性疾病的一种典型研究模型。婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(INCL或CLN1)是一种棕榈酰蛋白硫酯酶-1(PPT1)功能异常导致的隐性遗传性疾病，是神经元蜡样质脂褐素沉积病发病最早和最严重的一种类型,主要表现为精神运动倒退和视力减退，随后出现癫痫发作。INCL对应的小鼠疾病模型是将人类PPT1中自然突变的位点引入到小鼠的基因组中(PPT1-KI)，PPT1-KI小鼠很好的模拟了INCL的疾病表型和发病过程：病理特征表现为胶质细胞大量增生并伴随神经元的凋亡，发病过程表现为渐进性，6个月大的小鼠悬尾时后肢有癫痫发作(Seizure)的表型出现，小鼠寿命为6-8个月。目前，INCL还没有有效的治疗手段。

随着人口老龄化，神经退行性疾病的发病日益增加。发现新的神经退行性疾病治疗靶标，开发有效的治疗方法和制备治疗药剂的方法是亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用，其中，所述GFAP氨基酸位点为GFAP的第291位半胱氨酸，将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的途径为阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化，所述应用为用于筛选治疗神经退行性疾病的药物的应用。

阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰能有效降低胶质细胞的增殖速度，进而对神经元起到了保护作用。这是GFAP的第291位半胱氨酸成为治疗神经退行性疾病药物靶点的根本出发点。因此，所述应用包括将所述位点作为神经退行性疾病治疗靶标的任一种应用，只要是本领域技术人员知悉的基于治疗靶标所衍生出的用于筛选治疗神经退行性疾病的药物的应用都在本发明的保护范围之内。

所述神经退行性疾病可以是目前已发现的任一种神经退行性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病或者脊髓性肌萎缩症。

所述神经退行性疾病可以为任何含有GFAP表达基因的动物的神经退行性疾病，包括但不限于人类和小鼠。

根据所述应用，所述“阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化”的一种优选方法为，将GFAP的第291位半胱氨酸编码子突变为不含巯基氨基酸编码子的基因敲入方法。

所述基因敲入方法可以为：将含有GFAP第291位氨基酸编码子附近的序列添加接头形成两条加接头的互补序列，所述互补序列退火，插入酶切的载体形成重组载体，利用该重组载体进行基因重组将GFAP第291位的半胱氨酸突变为不含巯基氨基酸。

优选地，所述重组载体为插入BbsI酶切的pX458载体形成的重组载体；所述基因敲入利用Cas9的切割位点，完成敲入后封闭Cas9的切割位点。

各相关序列优选采用如下序列：

含有GFAP第291位氨基酸编码子附近的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，即，GFAP-gDNA序列：GCGCAGGGACTCCAGATCGC；

两条加接头的互补序列分别为如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列，即

GFAP-gDNA-F，序列2：CACCGCGCAGGGACTCCAGATCGC；

GFAP-gDNA-R，序列3：AAACGCGATCTGGAGTCCCTGCGC。

优选地，用于重组的序列GFAP-rDNA为基于基因组序列片段GFAP-DNA合成的含有突变位点的DNA序列，称为GFAP-rDNA，基因组序列片段GFAP-DNA如SEQ ID NO:4所示。

例如，将第291位的半胱氨酸突变为丙氨酸的含有突变位点的DNA序列GFAP-rDNA为如SEQ ID NO:5所示的序列。

根据所述应用，所述“阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化”的另一种优选方法为，对GFAP的第291位半胱氨酸翻译后修饰而阻断其棕榈酰化修饰。

所述应用可以为筛选用于治疗神经退行性疾病的药物，筛选指标为对GFAP的第291位半胱氨酸棕榈酰化修饰的阻断程度。

以上应用中的所述重组载体也是本发明的一部分，受本发明保护。

相关可以用于实现本发明的产品，亦是本发明的一部分。例如：

GFAP的第291位半胱氨酸突变为不含巯基氨基酸后的突变GFAP。

编码所述突变GFAP的核酸。

GFAP蛋白的第291位半胱氨酸突变或通过特异小分子结合第291位半胱氨酸从而阻断该位点能够阻断或降低GFAP蛋白的第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰，此位点的棕榈酰化修饰直接调控了胶质细胞的增殖速率。PPT1是调控GFAP的去棕榈酰化修饰酶，PPT1的缺失(PPT1-KI)导致GFAP棕榈酰化水平的显著增强，从而上调了胶质细胞的增殖速率，加速了神经元的凋亡，是疾病发展的促进因子。因此GFAP第291位半胱氨酸的突变阻断了由于PPT1缺失引起GFAP蛋白的棕榈酰化水平升高导致的胶质细胞的大量增殖。同时，GFAP蛋白的第291位半胱氨酸突变可以提升INCL中的tau-1(神经元轴突标志蛋白)和NeuN(神经元细胞核标志蛋白)含量，预示INCL疾病鼠大脑中的神经元得到了恢复。同时，INCL疾病小鼠在6个月时出现的后肢癫痫症状也有明显改善。本发明提供了新的神经退行性疾病治疗靶标的应用，也提供了该应用所需的相关载体、序列或者筛选手段，基于此，能够开发有效的治疗神经退行性疾病的方法和筛选、制备治疗药剂的方法。

附图说明

图1为Western blot检测图，显示HEK-293T细胞和小鼠脑组织中的GFAP存在棕榈酰化。

图2为吸光度测定图，显示GFAP第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰直接调控了胶质细胞的增殖速率。

图3为2BP处理样品的Western blot检测图，显示利用2-BP(棕榈酰化抑制剂)干扰GFAP第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰同样调控了胶质细胞的增殖速率。

图4为显示PPT1负调控GFAP棕榈酰化修饰的Western blot检测图。

图5为显示PPT1缺陷小鼠(PPT1-KI)中GFAP棕榈酰化修饰水平显著上升的Westernblot检测图。

图6为另一吸光度测定图，显示PPT1-KI小鼠中GFAP棕榈酰化修饰水平的上升在角质细胞中尤为明显，且上调了胶质细胞的增殖速率。

图7为利用CRISPR基因编辑技术构建GFAP第291位半胱氨酸突变为丙氨酸小鼠(GFAP-C291A)的测序结果图。

图8为显示构建的GFAP-C291A小鼠中GFAP的棕榈酰化修饰水平明显降低的Western blot检测图。

图9为另一吸光度测定图，显示GFAP-C291A小鼠中GFAP棕榈酰化修饰水平的下降也显著降低了胶质细胞的增殖速率。

图10为免疫组化检测图，显示利用免疫组化技术检测正常小鼠和PPT1缺陷小鼠背景下GFAP正常及突变体脑组织中的星型胶质细胞数量图。

图11为鼠脑染色切片扫描图像，显示利用组织透明化技术和免疫荧光技术检测正常小鼠和PPT1缺陷小鼠背景下GFAP正常及突变体脑组织中的星型胶质细胞和神经元的数量图。

图12为利用Western blot检测小鼠脑组织中GFAP蛋白、Tau-1蛋白和NeuN蛋白含量的图片。

图13为小鼠悬尾实验图片，显示小鼠悬尾实验中6个月大小鼠后肢癫痫行为学特征得到改善。

图14为小鼠生存曲线，显示PPT1-KI中敲入GFAP-C291A对小鼠寿命的改善情况。

具体实施方式

阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰能有效降低胶质细胞的增殖速度，进而对神经元起到了保护作用。这是GFAP的第291位半胱氨酸成为治疗神经退行性疾病药物靶点的根本出发点。该原理经过了充分的实验验证，在对本发明的实施例进行描述前，先对所述原理的实验验证进行说明，以证明本发明的所要求保护的各技术方案具有理论和实验依据。

GFAP的棕榈酰化修饰鉴定

1.检测样品制备

细胞样品：293T细胞(ATCC)从液氮中取出，37℃水浴锅中复苏，CO₂培养箱中，DMEM培养基，10cm培养皿中进行培养细胞，传至第三代时，293T细胞(ATCC)密度达到70％左右，Lip3000脂质体转染方法进行分别转染GFAP-Flag的质粒至标记好的293T细胞中，待转染24h后，细胞密度大约90％时，进行细胞收集，即10ml 1xPBS进行轻轻吹打培养皿中的细胞，并转移至15ml离心管中，室温进行800rcf,5min离心细胞，弃上清，将收集的细胞迅速放置冰上。按照1皿10cm细胞培养皿加1ml细胞裂解液(RIPA:PI＝100:1)的量进行计算要加的细胞裂解液。

脑组织样品：选取3月龄的B6小鼠进行实验。先用DDH₂O洗干净研磨容器，再用烘箱烘干，完全去除水分。用保温泡沫盒倒取适量液氮，再转移至烘干的研钵中，连同柱子一起进行预冷。将上述步骤重复两次，研磨容器均要充分预冷。研磨容器中加入鼠脑组织，倒入适量液氮，待脑组织变脆，迅速进行研磨。在研磨的鼠脑组织匀浆中加入RIPA Buffer(PMSF:RIPA＝1:100),冰上放置30分钟。12000rpm 4℃离心10分钟。取上清液体转移至新的离心管中，再取少量蛋白用于测蛋白浓度，剩余样品放置-80℃保存，备用。

2.利用Acyl-RAC(Resin-assisted Capture of S-Acylated Proteins)技术提取棕榈酰化蛋白

利用BCA方法测定蛋白浓度。取2mg的总蛋白样品，加4倍体积预冷的丙酮，-20℃放置30min，4℃10000rpm离心10min，沉淀蛋白。用含有PI和50mM NEM的Blocking缓冲液(100mM HEPES，1.0mM EDTA，2.5％SDS，pH 7.3)重悬样品，50℃震荡孵育1h。加4倍体积预冷的丙酮，-20℃放置30min，4℃10000rpm离心10min，沉淀蛋白；8ml 70％丙酮洗涤沉淀，重复3次。1.4ml Binding缓冲液(100mM HEPES，1.0mM EDTA，1％SDS，pH 7.3)重悬，使蛋白充分溶解，分为+HA和-HA。加入50ul制备好的胶珠，室温孵育4h，室温保证25℃，剩余取等量蛋白作为对照。1000g离心，弃上清。Binding缓冲液洗涤5次，1000rpm离心1min。50μl Laemmliloading缓冲液(2.1％ SDS，66mM Tris，50mM DTT)在42℃处理15min，洗脱目的蛋白。样品进行Western blot检测分析。

3.Western blot分析

电泳：首先清洗所需要的玻璃板,将玻璃板DDH₂O水清洗干净，再将玻璃板对齐后垂直卡在夹子上，进行准备配胶。配制10％浓度的SDS-PAGE胶，点样上述制备好的脑组织样品；将电泳槽与电泳仪相接，跑浓缩胶时先用80V，用时大约30-40分钟，跑至分离胶后用120V继续电泳，根据目的蛋白的分子量大小决定电泳时间。(电泳仪品牌Bio-Rad)

转膜：从负极(黑板)到正极(透明板)方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫，呈三明治样，将夹子放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。加1x转膜液和冰块放入盛有冰的容器中，一般设置电流300mA，时间为90分钟。(转膜仪品牌Bio-Rad)

封闭：1XTBST洗膜一次(约5分钟)。将PDVF膜(蛋白面朝下)移入盛有5％脱脂奶粉封闭液的平皿中，室温摇床孵育2h。1XTBST洗膜一次(约5分钟)。

抗体孵育：孵育Tau-1蛋白抗体，4℃过夜；孵育相应的酶标二抗。

曝光：将试剂盒中A,B两种发光剂按1:1的比例混合，摇匀后，根据膜的大小均匀洒在膜的蛋白面上，进行曝光。

4.实验结果

如图1所示，293T细胞表达样品HA处理检测出明显蛋白条带，小鼠脑组织样品HA处理检测出明显蛋白条带，实验结果显示GFAP是一个棕榈酰化蛋白，在细胞表达样品和小鼠脑组织样品中均有棕榈酰化修饰。

GFAP第291位半胱氨酸直接调控着胶质细胞的增殖

3皿密度大约70％的U251细胞中，按照Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)的说明书方法，分别转染等量的Flag，GFAP-Flag，和GFAP-C291A-Flag质粒至3皿U251细胞中24h。再将转染后的U251细胞分别接种置于96孔板中，以1x10⁴细胞/孔的密度进行接种。用细胞计数试剂盒(CCK8,Dojin,Kumamoto Japan)测定转染后不同时间点U251细胞的增殖率，使用酶标仪(Infinite M200 Pro,Tecan)在450nm下测定吸光度。所有的实验都重复了三次。

实验结果如图2所示，显示转染GFAP-Flag质粒的U251细胞的增殖速率显著高于转染GFAP-C291A-Flag质粒的U251细胞。

2-BP下调GFAP棕榈酰化修饰

细胞样品制备：复苏U251细胞，DMEM培养基进行培养，传3代后进行实验。称取适量2BP后，用DMSO进行溶解，配制成母液为10mM的溶液，再将10mM的母液按比例配制成浓度为100uM的2BP(DMEM进行稀释)，以备用。培养6皿U251细胞，密度约90％左右时，将6皿细胞中的随机5皿细胞培养基换成含2BP浓度为100um的DMEM培养基。剩余一皿加入等量DMSO后进行直接收集细胞。分别在2BP处理4h,6h,8h,10h,12h后进行收集细胞。

利用Acyl-RAC(Resin-assisted Capture of S-Acylated Proteins)技术提取棕榈酰化蛋白

Western blot分析

实验结果

如图3所示，在100μM 2-BP作用下，伴随时间的延长GFAP的修饰水平逐渐降低。

PPT1负调控GFAP的棕榈酰化修饰水平

细胞样品制备：HEK-293T细胞(ATCC)迅速从液氮中取出，37℃水浴锅中复苏，CO₂细胞培养箱中进行培养细胞，待传至第三代时，细胞密度达到70％左右，按照Lip3000脂质体转染试剂盒说明书的方法进行将GFAP-Flag质粒分别与Flag,APT1-Flag,APT2-Flag,PPT1-Flag,PPT2-Flag,ABHD17a-Flag质粒进行共转与至标记好的6皿HEK-293T细胞中，待转染24h后，细胞密度大约100％时，进行细胞收集，即10ml 1xPBS进行轻轻吹打培养皿中的细胞，并转移至15ml离心管中，室温进行800rcf,5min离心细胞，弃上清，将收集的细胞迅速放置冰上。按照1皿10cm细胞培养皿加1ml细胞裂解液(RIPA:PI＝100:1)的量进行计算要加的细胞裂解液。

Western blot分析

实验结果

如图4所示，在PPT1与GFAP共转染的样品中，GFAP的棕榈酰化修饰水平显著低于flag空载的对照，说明PPT1能够负调控GFAP的棕榈酰化修饰。

PPT1缺失小鼠的大脑中GFAP棕榈酰化修饰水平显著上升

脑组织样品：选取1，3，6月龄的B6和PPT1-KI小鼠进行实验。先用DDH₂O洗干净研磨容器，再用烘箱烘干，完全去除水分。用保温泡沫盒倒取适量液氮，再转移至烘干的研钵中，连同柱子一起进行预冷。将上述步骤重复两次，研磨容器均要充分预冷。研磨容器中加入鼠脑组织，倒入适量液氮，待脑组织变脆，迅速进行研磨。在研磨的鼠脑组织匀浆中加入RIPABuffer(PMSF:RIPA＝1:100),冰上放置30分钟。12000rpm 4℃离心10分钟。取上清液体转移至新的离心管中，再取少量蛋白用于测蛋白浓度，剩余样品放置-80℃保存，备用。

Western blot分析

实验结果

如图5所示，与B6小鼠相比，PPT1-KI小鼠脑中GFAP蛋白的棕榈酰化修饰伴随鼠龄增加显著上升。

PPT1缺失小鼠中GFAP棕榈酰化修饰水平的上升增强了胶质细胞的增殖速率

原代小鼠星形胶质细胞分离及培养

(1)选用P1-3的B6,PPT1-KI,GFAP-C291A/B6,GFAP-C291A/PPT1-KI四种基因型小鼠,将小鼠消毒后置于无菌培养皿中,在超净台中用干净镊子撕去蛛网膜及软脑膜,剔除掉海马区，小脑，血管,在无血管区用镊子夹取两侧大脑皮层组织，放入冷的HBSS中洗涤3遍,尽量将其剪碎并转移至15ml离心管中，弃掉HBSS。

(2)加入适量0.25％(如400ul 2.5％trypsin加HBSS至4ml)的胰蛋白酶液，37℃消化15min(每隔3min摇匀一次)，加1-2ml DMEM/F12++吹碎(<30次)。再加入2-3mlDMEM/F12++以终止消化。

(3)用100μm孔径的不锈钢网进行过滤,过滤后将滤液离心,1200rpm离心5min，弃上清。

(4)用DMEM/F12++培养基进行悬浮细胞，并吹打制成单细胞悬液,进行计数，接种细胞至PDL包被的培养瓶中(密度约1.5-3.0×10⁶个/cm²)于CO₂细胞培养箱中进行培养。

(5)次日换液(换半量),去除未贴壁的活力差或死亡细胞。

(6)继续培养9-14d,待培养液颜色略变黄时换液,每次换液稍加振摇。

胶质细胞增殖速率分析

将分离的B6和PPT1-KI小鼠的星形胶质细胞分别接种置于96孔板中，以2.5x10⁴细胞/孔的密度进行接种。用细胞计数试剂盒(CCK8,Dojin,Kumamoto Japan)测定转染后不同时间点U251细胞的增殖率，使用酶标仪(Infinite M200 Pro,Tecan)在450nm下测定吸光度。所有的实验都重复了三次。

结果如图6所示，PPT1-KI小鼠的星形胶质细胞的增殖速率显著增加。

下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行说明，并通过实验验证对发明效果进行说明。

实施例将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用

该应用中，所述GFAP氨基酸位点为GFAP的第291位半胱氨酸。所述“治疗神经退行性疾病”通过将GFAP的第291位半胱氨酸突变为不含巯基氨基酸而实现。该实施例中的不含巯基氨基酸具体为丙氨酸。下面通过描述将GFAP的第291位半胱氨酸突变为丙氨酸的具体方案，基于该技术方案所衍生的用于制备治疗神经退行性疾病的制剂的应用，或者为治疗神经退行性疾病的应用，以及相关载体、序列或者片段及其应用都属于本发明要保护的范围。

(一)将小鼠GFAP的第291位半胱氨酸突变为丙氨酸的具体方案如下

1.敲入方案

根据序列分析以小鼠GFAP的基因组序列为基础，设计GFAP-gDNA序列，如SEQ IDNO:1所示的序列1：GCGCAGGGACTCCAGATCGC；该序列通过CRIPR系统到入的切割位点，位于GFAP第291位氨基酸编码子附近；在GFAP-gDNA序列上添加接头序列本发明称GFAP-gDNA-F，为如SEQ ID NO:2所示的序列2：CACCGCGCAGGGACTCCAGATCGC；序列2的反向互补序列添加接头序列本发明称GFAP-gDNA-R，为如SEQ ID NO:3所示的序列3：AAACGCGATCTGGAGTCCCTGCGC；序列2和3直接退火，形成带有接头的双链DNA,插入BbsI酶切的pX458载体本发明称为pX458-GFAP-gDNA载体。基因组序列片段称GFAP-DNA，为如SEQ IDNO:4所示的序列4：

AACCAGTGGTTCCTGTCGGTGCTCACCGTGCCGCGCAGGGACTCCAGATCGCAGGTCAAGGCCTGCAGTTGGCGGC GATAGTCGTTAGCTTCGTGCTTGGCTTG

同时合成含有突变位点的DNA序列称GFAP-rDNA,为如SEQ ID NO:5所示的序列5：

AACCAGTGGTTCCTGTCGGTGCTCACCGTGCCGCGCAGGGACTCCAGATCAGCAGTCAAGGCCTGCAGTTGGCGGC GATAGTCGTTAGCTTCGTGCTTGGCTTG

用于重组的序列GFAP-rDNA，含有4个碱基突变，基因重组之后将第291位的半胱氨酸突变为丙氨酸，同时封闭Cas9的切割位点，防止再次切割。

2.受精卵显微注射及重组小鼠筛选

利用pX458-GFAP-gDNA载体体外转录gRNA/Cas9 mRNA(转录试剂盒：NEB，Cat.E2050S)，将gRNA/Cas9 mRNA和重组DNA片段显微注射至小鼠受精卵原核；获得F0代小鼠。

(二)通过对F0代小鼠以及筛选得到的自交纯合小鼠进行相关检测验证本实施例的效果。

1.利用PCR和测序分析对F0代小鼠进行基因型鉴定。检测结果，如图7所示，测序结果显示，GFAP基因根据设计成功重组。

2.利用F0代小鼠自交获得F1代小鼠，利用PCR和测序分析对F1代小鼠进行基因型鉴定；最终筛选得到GFAP第291位半胱氨酸突变为丙氨酸的GFAP-KI纯合小鼠。再进行如下检测分析。

GFAP第291位半胱氨酸突变为丙氨酸明显降低了GFAP的棕榈酰化修饰水平

脑组织样品：选取1，3，6月龄B6，PPT1-KI和PPT1-KI背景下导入GFAP-KI的小鼠进行实验。先用DDH₂O洗干净研磨容器，再用烘箱烘干，完全去除水分。用保温泡沫盒倒取适量液氮，再转移至烘干的研钵中，连同柱子一起进行预冷。将上述步骤重复两次，研磨容器均要充分预冷。研磨容器中加入鼠脑组织，倒入适量液氮，待脑组织变脆，迅速进行研磨。在研磨的鼠脑组织匀浆中加入RIPA Buffer(PMSF:RIPA＝1:100),冰上放置30分钟。12000rpm4℃离心10分钟。取上清液体转移至新的离心管中，再取少量蛋白用于测蛋白浓度，剩余样品放置-80℃保存，备用。

Western blot分析

实验结果

如图8所示，在含有GFAP-KI的小鼠脑中GFAP的棕榈酰化修饰水平显著降低。

GFAP第291位半胱氨酸突变为丙氨酸降低了胶质细胞的增殖速率

原代小鼠星形胶质细胞分离及培养

(5)次日换液(换半量),去除未贴壁的活力差或死亡细胞。

胶质细胞增殖速率分析

四种基因型星形胶质细胞分别接种置于96孔板中，以2.5x10⁴细胞/孔的密度进行接种。用细胞计数试剂盒(CCK8,Dojin,Kumamoto Japan)测定转染后不同时间点U251细胞的增殖率，使用酶标仪(Infinite M200 Pro,Tecan)在450nm下测定吸光度。所有的实验都重复了三次。

实验结果如图9所示，导入了GFAP-C291A小鼠的星型胶质细胞的增殖速率显著降低。

免疫组化分析小鼠脑组织星型胶质细胞数量

2.1.1小鼠繁育

将构建的GFAP敲入小鼠纯合子(GFAP-KI)与PPT1敲入小鼠纯合子进行杂交(PPT1-KI)，首先得到GFAP-KI/PPT1-KI杂合的小鼠；杂合小鼠进行自交繁育，然后通过PCR分析和测序分析，最终得到GFAP-KI/PPT1-KI均纯合的小鼠。

2.1.2小鼠灌注

分别取3月龄和6月龄PPT1-KO小鼠，3月龄和6月龄GFAP-KI/PPT1-KI双突变小鼠。实验小鼠进行腹腔麻醉，再进行灌注，即：先用约150ml 1xPBS快速灌注再用约150ml多聚甲醛进行灌注，待小鼠表现为躯干，四肢及肝脏僵硬，则灌注完成。解除固定，迅速取出脑组织，生理盐水冲洗干净，置于多聚甲醛中4℃进行外固定，固定时间不超过24h。心脏灌注后取脑组织，放于4％多聚甲醛中，固定24小时。制作成蜡块。

2.1.3免疫组化分析

石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟；取一定量pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然冷却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2次。每张切片加1滴3％H₂O₂，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次。除去PBS液，每张切片加1滴抗GFAP兔抗室温下孵育2小时。PBS冲洗3次。除去PBS，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3次。除去PBS，每张切片加1滴酶标抗兔抗抗体，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3次。除去PBS，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察5分钟。苏木素复染，0.1％ HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

2.1.4结果

如图10所示，对比PPT1-KI小鼠和PPT1-KI/GFAP-KI双突变小鼠的脑组织免疫组化结果，发现在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后，脑组织中的星型胶质细胞显著减少。

小鼠大脑皮层星型胶质细胞数量分析

小鼠灌注

取所需的实验小鼠进行腹腔麻醉，再进行灌注，即：先用约150ml1x PBS快速灌注再用约150ml多聚甲醛进行灌注，待小鼠躯干，四肢及肝脏僵硬，则灌注完成。解除固定，迅速取出脑组织，生理盐水冲洗干净，置于多聚甲醛中4℃进行外固定，固定时间不超过24h。

透明化处理

X-CLARITY(Logos Biosystems公司)方法进行小鼠脑组织透明化的处理：水凝胶孵育24h；聚合3h；组织透明化16h。

染色

透明化后的鼠脑进行染色：样品孵育在1％ PBST中，37℃，24h避光。(65rpm,中间换3次新的PBST)，将样品转移至一抗溶液(抗体按1:100稀释)，孵育5天左右。(37℃，避光，65rpm)，用1％ PBST溶液清洗24h，中途需要更换新的PBST，3次。(37℃，避光，65rpm)，

样品转移至荧光二抗溶液中(抗体按1:100稀释)，孵育5天左右。(37℃，避光，65rpm)，用1％ PBST溶液清洗24h，中途需要更换新的PBST，3次。(37℃，避光，65rpm)，用蒸馏水清洗至少三次，每次都需要更换新的蒸馏水，每次5分钟，共15分钟。(37℃，避光，65rpm)，成像前将脑组织切片放入Mounting Solution中孵育12h。(37℃，避光)，进行共聚焦显微镜进行扫描成像(Leica DMi8显微镜)。

如图11所示：6月龄的PPT1-KI小鼠大脑皮层的星型胶质细胞数量明显高于在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后的小鼠大脑皮层的星型胶质细胞；同时在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后的小鼠中神经元(NeuN染色)的数量有显著升高，说明GFAP第291位半胱氨酸突变后抑制了由PPT1缺失导致的星型胶质细胞增殖，也抑制了由于胶质细胞增生导致的神经元损伤。

小鼠脑组织Tau-1蛋白含量分析

2.2.1提取脑组织蛋白用CO₂处死小鼠，取脑组织。先用DDH₂O洗干净研磨容器，再用烘箱烘干，完全去除水分。用保温泡沫盒倒取适量液氮，再转移至烘干的研钵中，连同柱子一起进行预冷。将上述步骤重复两次，研磨容器均要充分预冷。研磨容器中加入鼠脑组织，倒入适量液氮，待脑组织变脆，迅速进行研磨。在研磨的鼠脑组织匀浆中加入RIPA Buffer(PMSF:RIPA＝1:100),冰上放置30分钟。12000rpm 4℃离心10分钟。取上清液体转移至新的离心管中，再取少量蛋白用于测蛋白浓度。根据蛋白浓度，100℃制样。

2.2.2Westorn blot分析

将不同小鼠相同量的脑组织蛋白进行电泳，转膜操作；孵育Tau-1蛋白抗体，4℃过夜；PBS洗膜，孵育相应的酶标二抗；PBS洗膜。在膜上滴加显色液，曝光拍照。具体步骤如下：

2.2.3结果

如图12所示，对比PPT1-KI小鼠和PPT1-KI/GFAP-KI双突变小鼠的脑组织中Tau-1蛋白含量，发现在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后，脑组织中的Tau-1蛋白显著增加，预示小鼠的神经元得到了恢复。

小鼠悬尾观察

取6月龄的小鼠，用镊子夹住小鼠的尾巴，倒吊着小鼠观察小鼠爪子的伸展状态。如图13所示，6月龄的PPT1-KI小鼠显示明显的发病状态，后腿爪子收缩在一起；在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后，后腿爪子呈现为张开状态，说明GFAP第291位半胱氨酸突变后恢复了由PPT1缺失导致的病症。

小鼠生存曲线

分析PPT1-KI小鼠和PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变小鼠的生存时间。如图14所示，在PPT1-KI小鼠的背景下引入GFAP第291位半胱氨酸突变后，小鼠的生存时间显著延长，说明GFAP第291位半胱氨酸突变后恢复了由PPT1缺失导致的病症。

以上实验能够验证，阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化修饰能有效降低胶质细胞的增殖速度，进而对神经元起到了保护作用。这正是GFAP的第291位半胱氨酸成为治疗神经退行性疾病药物靶点的根本出发点。根据现有生理生化知识，基于以上说明，能够表明本发明所请求保护的技术方案具有充分的理论和实验依据，本领域技术人员容易明白，本发明涉及众多具体的技术方案，这些方案不可能穷尽，以上对原理和实例的说明足以支持本发明的保护范围，也就是说，只要是将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用都应该受到本发明的保护。

SEQUENCE LISTING

<110> 孔, 二艳

<120> 将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用

<130> --

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GFAP-gDNA

<400> 1

gcgcagggac tccagatcgc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GFAP-gDNA-F

<400> 2

caccgcgcag ggactccaga tcgc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GFAP-gDNA-R

<400> 3

aaacgcgatc tggagtccct gcgc 24

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GFAP-DNA

<400> 4

aaccagtggt tcctgtcggt gctcaccgtg ccgcgcaggg actccagatc gcaggtcaag 60

gcctgcagtt ggcggcgata gtcgttagct tcgtgcttgg cttg 104

<210> 5

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GFAP-rDNA

<400> 5

aaccagtggt tcctgtcggt gctcaccgtg ccgcgcaggg actccagatc agcagtcaag 60

gcctgcagtt ggcggcgata gtcgttagct tcgtgcttgg cttg 104

Claims

1.将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的应用，其特征在于，所述GFAP氨基酸位点为GFAP的第291位半胱氨酸，将GFAP氨基酸位点作为神经退行性疾病治疗靶标的途径为阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化，所述应用为用于筛选治疗神经退行性疾病的药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述“阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化”的方法为，将GFAP的第291位半胱氨酸编码子突变为不含巯基氨基酸编码子的基因敲入方法。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因敲入方法为：将含有GFAP第291位氨基酸编码子附近的序列添加接头形成两条加接头的互补序列，所述互补序列退火，插入酶切的载体形成重组载体，利用该重组载体进行基因重组将GFAP第291位的半胱氨酸突变为不含巯基氨基酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体为插入BbsI酶切的pX458载体形成的重组载体；所述基因敲入利用Cas9的切割位点，完成敲入后封闭Cas9的切割位点。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

含有GFAP第291位氨基酸编码子附近的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列；

两条加接头的互补序列分别为如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述“阻断GFAP的第291位半胱氨酸的棕榈酰化”的方法为，对GFAP的第291位半胱氨酸翻译后修饰而阻断其棕榈酰化修饰。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，筛选用于治疗神经退行性疾病的药物的筛选指标为对GFAP的第291位半胱氨酸棕榈酰化修饰的阻断程度。

8.权利要求3或4所述的应用中的所述重组载体。

9.GFAP的第291位半胱氨酸突变为不含巯基氨基酸后的突变GFAP。

10.编码权利要求9所述的突变GFAP的核酸。