CN116406292A - 免疫·炎症性疾病的治疗药 - Google Patents

Abstract

本发明提供以激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体为有效成分的免疫·炎症性疾病治疗药。另外，还提供具有以下的a)及b)的特征的抗体，a)重链可变区的第三CDR包含序列号4的氨基酸序列；b)轻链可变区的第三CDR包含序列号6的氨基酸序列。

Description

免疫·炎症性疾病的治疗药

技术领域

本发明涉及包含针对人TIGIT的抗体的免疫·炎症性疾病的治疗药。本发明还涉及能够具有免疫·炎症性疾病的治疗活性的、具有特定一级结构的抗人TIGIT抗体等。

背景技术

近年，以免疫检查点蛋白为靶标的医药、尤其是抗癌剂的开发活跃地进行着。免疫检查点蛋白是防止因免疫系统的异常激活导致的免疫·炎症性疾病的发病等的因子，已知PD-1(Programmed cell death protein 1，程序性细胞死亡蛋白1，别名CD279)、PD-L1(Programmed cell death ligand 1，程序性细胞死亡配体1，别名B7-H1/CD274)、PD-L2(Programmed cell death ligand 2，别名：B7-DC/CD273)及CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen4，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原，别名CD152)等是主要的分子。另外，作为上述以外的免疫检查点蛋白，可举出TIGIT(T-cell immunoreceptor withimmunoglobulin and ITIM domains，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体，别名zB7R1)。TIGIT是存在于自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、记忆T细胞、调节性T细胞(regulatory T cell；Treg cell)、滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell；Tfhcell)等中的免疫检查点受体。已知的是，CTL及NK细胞中，TIGIT与其2个配体即CD155(PVR)或CD112(Nectin2)中的任一者的相互作用从而抑制免疫激活，另一方面，Treg中的TIGIT表达增强通过该相互作用而抑制免疫应答的能力。TIGIT与CD155或CD112的结合带来的免疫抑制作用是由于与在细胞毒性T细胞及NK细胞中表达的免疫激活受体CD226针对同一配体(即，CD155配体及CD112配体)的竞争性抑制而产生的。

报道了着眼于TIGIT介导的信号转导，通过针对TIGIT的激动剂或抗TIGIT激动性抗体，经由TIGIT阳性T细胞的功能抑制来治疗免疫·炎症性疾病等的方法(专利文献1、2)。然而，迄今为止，尚不存在包含抗TIGIT激动性抗体的获批的医药，期望创造出治疗效果、安全性等优异的抗TIGIT抗体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/124667号

专利文献2：国际公开第2009/126688号

发明内容

发明所要解决的课题

因此，本发明的课题在于提供具有与人TIGIT结合的能力、可增强该TIGIT介导的信号的抗人TIGIT激动性抗体、以及包含针对人TIGIT的激动性抗体的新型免疫·炎症性疾病的治疗药。

用于解决课题的手段

本申请的发明人在进行关于在阐明免疫疾病的发病机理的基础上探索创新药物靶标的研究的过程中，发现了类风湿性关节炎患者中TIGIT表达水平升高。尤其是在患者中还确认到：健康人中TIGIT表达水平也高的Tfh细胞、外周辅助性T细胞(peripheral T；Tphcell)、Treg细胞中TIGIT表达水平显著较高。此外，发现了类风湿性关节炎患者的Tph细胞中的TIGIT表达水平也与疾病活动性相关。因此，获得了可通过以TIGIT为靶标来开发类风湿性关节炎等免疫·炎症性疾病的治疗药的构思，本申请的发明人为解决上述课题而进行了深入研究。首先，建立多个小鼠抗人TIGIT(抗hTIGIT)抗体，从该建立的抗体之中筛选出多个特别强的激动性抗体。针对筛选出的激动性抗体，进一步用TIGIT表达水平高的Tfh细胞验证了增殖抑制，结果发现，特定的抗体(克隆M1-8)可以抑制Tfh细胞的增殖，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1]

免疫·炎症性疾病治疗药，其以激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体为有效成分。

[1’]

哺乳动物中的免疫·炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，向该哺乳动物施予有效量的激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体。

[1”]

激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体，其用于免疫·炎症性疾病的治疗的用途。

[2]

如[1]所述的治疗药，其具有Tfh细胞抑制作用。

[2’]

Tfh细胞的抑制剂，其是含有激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体而成的。

[3]

如[1]或[2]所述的治疗药，其具有Treg细胞激活作用。

[3’]

Treg细胞的激活剂，其是含有激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体而成的。

[4]

如[1]至[3]中任一项所述的治疗药，其中，免疫·炎症性疾病选自由类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、IgG4相关性疾病、高安氏动脉炎(Takayasu’s Arteritis)、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、ANCA相关性血管炎、混合性结缔组织病、脊柱关节炎、贝赫切特综合征、成人斯蒂尔病(Adult onset still’s disease)、多发性硬化症、视神经脊髓炎、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、溃疡性大肠炎、克罗恩病(Crohndisease)、干癣(psoriasis)(干癣性关节炎(psoriatic arthritis))、寻常型白癜风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张型心肌病、1型糖尿病、巴泽窦氏病(Basedow-Krankheit)、桥本病、IgA肾病、膜性肾病、溶血性贫血、及特发性血小板减少性紫癜组成的组。

[5]

如[1]至[4]中任一项所述的治疗药，其中，抗人TIGIT抗体为与人TIGIT(序列号1)进行结合的抗体。

[6]

如[5]所述的治疗药，其中，抗体中，

a)重链可变区的第三CDR包含序列号4的氨基酸序列，且，

b)轻链可变区的第三CDR包含序列号6的氨基酸序列。

[7]

如[5]或[6]所述的治疗药，其中，抗体包含下述a)及b)，

a)包含下述CDR的重链可变区：

i)包含序列号2的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含序列号3的氨基酸序列的第二CDR，

b)包含下述CDR的轻链可变区：

i)包含序列号5的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸的氨基酸序列的第二CDR。

[8]

如[5]至[7]中任一项所述的治疗药，其中，抗体还包含Fc结构域。

[9]

如[8]所述的治疗药，其中，前述Fc结构域来源于人。

[10]

如[8]或[9]所述的治疗药，其中，前述Fc结构域是突变Fc结构域。

[11]

抗体，其中，

a)重链可变区的第三CDR包含序列号4的氨基酸序列，且，

b)轻链可变区的第三CDR包含序列号6的氨基酸序列。

[12]

如[11]所述的抗体，其与人TIGIT(序列号1)进行结合。

[13]

如[11]或[12]所述的抗体，其包含下述a)及b)，

a)包含下述CDR的重链可变区：

i)包含序列号2的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含序列号3的氨基酸序列的第二CDR，

b)包含下述CDR的轻链可变区：

i)包含序列号5的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸的氨基酸序列的第二CDR。

[14]

如[11]至[13]中任一项所述的抗体，其还包含Fc结构域。

[15]

如[14]所述的抗体，其中，前述Fc结构域来源于人。

[16]

如[14]或[15]所述的抗体，其中，前述Fc结构域是突变Fc结构域。

[17]

经分离的核酸，其编码[11]～[16]中任一项所述的抗体。

[18]

宿主细胞，其含有[17]所述的经分离的核酸。

[19]

[11]～[16]中任一项所述的抗体的制造方法，所述方法包括在制造前述抗体的条件下培养[18]所述的宿主细胞的步骤。

发明效果

根据本发明，可提供与人TIGIT进行结合的抗体。该抗体能够成为免疫·炎症性疾病治疗药，因此本发明对使用了该治疗药的免疫·炎症性疾病的治疗而言是有用的。

附图说明

[图1]表示用重组人TIGIT-His-mFc蛋白进行了免疫的小鼠的抗血清中的抗体效价的测定结果。各图表的纵轴表示荧光强度的中值(Median fluorescence intensity，中位荧光强度)。各图表的横轴表示log[血浆稀释度](log[plasma dilution])。

[图2]表示培养上清液中的M1-8抗体的与多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞的结合活性。

[图3]表示培养上清液中的M1-8抗体的重组TIGIT与PVR表达细胞的结合抑制活性。

[图4]表示M1-8纯化抗体的生物活性(激动剂活性、拮抗剂活性、细胞毒性)。

[图5]表示M1-8纯化抗体的与人、食蟹猕猴、及小鼠TIGIT表达细胞的结合活性。

[图6]从上往下依次表示TIGIT刺激带来的对CD8阳性细胞的增殖抑制效果(％inhibition of proliferation，增殖抑制百分比)及细胞因子(IFNγ、颗粒酶B、穿孔素)的产生抑制效果(％Suppression of cytokines production，细胞因子产生的抑制百分比)。各图表的横轴从左往右依次表示CD3/PVR0、CD3/PVR0.075、CD3/PVR0.025、CD3/PVR0.75、CD3/PVR2.5。

[图7-1]a：为示出了在原本TIGIT表达低的细胞(CD4+初始T细胞)及表达高的细胞(Tfh细胞)中，TIGIT表达因刺激而如何变化的图。b：为示出了基于抗TIGIT激动性(agonistic)抗体的刺激抑制Tfh细胞的增殖的图。

[图7-2]a：为示出Tfh细胞、non-Tfh细胞及CD4+初始T细胞中的激活刺激导致的TIGIT表达的经时变化的图。Non-Tfh细胞显示出Tfh细胞与初始T细胞的中间程度的TIGIT表达。b：为示出基于抗TIGIT激动性(agonistic)抗体的刺激抑制Tfh细胞及non-Tfh细胞的增殖、而该抑制效果对Tfh细胞而言更显著的图。

[图8]为示出了抗TIGIT激动性抗体对Tfh细胞带来的刺激抑制Tfh细胞介导的B细胞的激活的图。以浆细胞的比例、培养上清液中的IgG浓度来评价来自Tfh细胞的对B细胞的刺激。以绝对值及将同型(isotype)的结果设为100时的相对值表示。

[图9-1]为示出了抗TIGIT激动性抗体带来的对Treg细胞的刺激抑制了效应T细胞(Effector T cell)的细胞增殖的图。

[图9-2]为示出抗TIGIT激动性抗体带来的对Treg细胞(FrI及FrII)的刺激抑制非Treg应答CD4+T细胞(CD25-)的增殖、该抑制效果在Treg细胞(FrI)中更显著的图。右边的柱状图的纵轴表示：

抑制率(％)＝[1-(经共培养的应答T细胞(responder T cell)的增殖)/(经单独培养的应答T细胞的增殖)]×100。*：p<0.05

[图10]为示出了抗TIGIT激动性抗体改善咪喹莫特(Imiquimod)诱发狼疮模型小鼠的脾肿大、抑制脾脏淋巴细胞的增殖的图。以未涂布、抗TIGIT、同型分别为n＝4、3、4的3个组进行比较。

[图11-1]从左往右表示用抗TIGIT激动性抗体以与图10同样的3个组就咪喹莫特诱发狼疮模型小鼠的脾脏中的CD69+(激活)T细胞在T细胞中所占的比例、CD4+效应记忆T细胞及Tfh细胞在CD4+T细胞中所占的比例、生发中心B细胞及浆细胞在B细胞中所占的比例、以及该小鼠血浆中的抗dsDNA抗体量进行比较的图。仅抗dsDNA抗体在同型组中有1只未能采集到血液，成为n＝3。各数据的箱形图从左往右分别表示非涂布组、抗TIGIT涂布组及同型涂布组。*：p<0.05

[图11-2]为示出了抗TIGIT激动性抗体的施予对咪喹莫特诱发狼疮模型小鼠的免疫应答带来的效果的图。上段从左往右以3个组(仅施予同型、涂布咪喹莫特+施予抗TIGIT、涂布咪喹莫特+施予同型，分别为n＝4、5、5)对脾脏中的CD69+(激活)T细胞在CD4+T细胞中所占的比例、CD4+效应记忆T(Tem)细胞及Tfh细胞在CD4+T细胞中所占的比例、生发中心(GC)B细胞在B220⁺细胞中所占的比例进行了比较，下段从左往右以3个组(仅施予同型、涂布咪喹莫特+施予抗TIGIT、涂布咪喹莫特+施予同型，分别为n＝4、5、5)对浆细胞在脾细胞中所占的比例、及该小鼠血浆中的抗dsDNA抗体量进行了比较。各柱状图从左往右依次分别表示非涂布组、同型涂布组及抗TIGIT涂布组。*：p<0.05

[图12]为示出了抗TIGIT激动性抗体改善EAE小鼠的临床评分的图。每1组以6只实施，针对同型施予组、抗TIGIT激动性抗体施予组以时间序列示出临床评分。

[图13]为示出了通过施予抗TIGIT激动性抗体，EAE小鼠的脑、脊髓、脾脏中的Treg细胞增殖的图。每组以3只实施，对同型施予组、抗TIGIT激动性抗体施予组各自的脑、脊髓、脾脏中的细胞进行染色，对Treg细胞的比例进行比较。各数据的箱形图从左往右依次分别表示抗TIGIT涂布组及同型涂布组。

具体实施方式

与人TIGIT进行结合的抗体或其片段

本发明提供具有包含特定序列的互补决定区(CDR)并与人TIGIT进行结合的抗体或其片段。以下，作为上述抗体和包含其片段的物质，使用“本发明的抗体”这一术语。另外，本发明的抗体也可以是经分离的物质。本说明书中，所谓“经分离的”，意指特定成分(例如：本发明的抗体、编码该抗体的核酸等)被从其自然环境的成分(例如：细胞等)中鉴定、分离或回收的状态。

本发明的抗体包含：包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区的第三CDR(也称为CDR3)、和包含序列号6所示的氨基酸序列的轻链可变区的第三CDR。另外，一个方式中，本发明的抗体包含：i)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的第一CDR(也称为CDR1)及ii)包含序列号3所示的氨基酸序列的重链可变区第二CDR(也称为CDR2)、以及iii)包含序列号5所示的氨基酸序列的轻链可变区的第一CDR及iv)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸(YAS)所示的氨基酸序列的轻链可变区的第二CDR。作为包含序列号2～4各自所示的重链可变区的CDR1～3的重链可变区的一个例子，可举出包含序列号7所示的氨基酸序列的重链可变区，但重链可变区并不限于包含该序列的重链可变区。另外，作为包含序列号5、YAS及序列号6各自所示的CDR1～3的轻链可变区的一个例子，可举出包含序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区，但轻链可变区并不限于包含该序列的轻链可变区。

包含抗人TIGIT激动性抗体的免疫·炎症性疾病治疗药

本发明提供以激活作为抑制性免疫检查点分子的人TIGIT的抗人TIGIT抗体为有效成分的免疫·炎症性疾病治疗药(以下，有时也称为“本发明的治疗药”)。关于作为本发明的治疗药的有效成分的抗体的一个方式，可举出具有包含特定序列的互补决定区(CDR)并与人TIGIT进行结合的抗体或其片段。以下，关于作为本发明的有效成分的上述抗体和包含其片段的物质，使用“抗人TIGIT激动性抗体”这一术语。

如下述实施例所示，抗人TIGIT激动性抗体具有针对滤泡辅助性T(Tfh)细胞的抑制作用(以下，有时也称为“Tfh细胞抑制作用”)，因此具有起因于Tfh细胞激活的免疫·炎症性疾病的治疗效果。此外，抗人TIGIT激动性抗体具有针对Treg细胞的激活作用(以下，有时也称为“Treg细胞激活作用”)。因此，本发明的另一方式中，提供Tfh细胞的抑制方法，前述方法包括使含有抗人TIGIT激动性抗体而成的Tfh细胞的抑制剂、或抗人TIGIT激动性抗体接触Tfh细胞的步骤。此外，另一方式中，还提供Treg细胞的激活方法，前述方法包括使含有抗人TIGIT激动性抗体而成的Treg细胞的激活剂、或抗人TIGIT激动性抗体接触Treg细胞的步骤。

本说明书中，所谓“免疫·炎症性疾病”，意指因免疫耐受的打破而引起的伴有炎症的疾病。关于作为本发明的治疗药的对象疾病的免疫·炎症性疾病，例如，可举出类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、IgG4相关性疾病、高安氏动脉炎、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、ANCA相关性血管炎、混合性结缔组织病、脊柱关节炎、贝赫切特综合征、成人斯蒂尔病、多发性硬化症、视神经脊髓炎、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、溃疡性大肠炎、克罗恩病、干癣(干癣性关节炎)、寻常型白癜风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张型心肌病、1型糖尿病、巴泽窦氏病、桥本病、IgA肾病、膜性肾病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜。作为本发明的治疗药的施予对象，例如，可举出灵长类动物，作为该灵长类动物，可举出狐猴、懒猴、树鼩、猴(例如：食蟹猕猴等)、人。优选人。因此，将有效量的抗人TIGIT激动性抗体或本发明的治疗药施予至前述灵长类动物的治疗方法也包含于本发明中。

本说明书中，“Tfh细胞抑制作用”包括Tfh细胞的增殖抑制作用和Tfh细胞的功能抑制作用这两者。作为该Tfh细胞的功能，例如，可举出B细胞的成熟与激活、抗体产生的促进效果等。另外，“Treg细胞激活作用”包括Treg细胞的增殖促进作用、Treg细胞的功能激活作用这两者。作为该Treg细胞的功能，例如，可举出经由抑制效应T细胞来抑制自身免疫应答的功能、经由分泌IL-10、TGFβ等抗炎症性细胞因子来抑制过度炎症的功能等。

(抗人TIGIT激动性抗体)

一个方式中，抗人TIGIT激动性抗体包含：包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区的第三CDR(也称为CDR3)、和包含序列号6所示的氨基酸序列的轻链可变区的第三CDR。另外，抗人TIGIT激动性抗体还可能包含：i)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的第一CDR(也称为CDR1)及ii)包含序列号3所示的氨基酸序列的重链可变区第二CDR(也称为CDR2)、以及iii)包含序列号5所示的氨基酸序列的轻链可变区的第一CDR及iv)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸(YAS)所示的氨基酸序列的轻链可变区的第二CDR。作为包含序列号2～4各自所示的重链可变区的CDR1～3的重链可变区的一个例子，可举出包含序列号7所示的氨基酸序列的重链可变区，但重链可变区并不限于包含该序列的重链可变区。另外，作为包含序列号5、YAS及序列号6各自所示的CDR1～3的轻链可变区的一个例子，可举出包含序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区，但轻链可变区并不限于包含该序列的轻链可变区。

抗人TIGIT激动性抗体通过与TIGIT进行结合，从而能够激活TIGIT(换言之，针对TIGIT发挥激动剂活性)。本说明书中，所谓“激活TIGIT”，意指与未使该抗体结合的对照(也包括使不具有TIGIT的激活作用的抗体接触的组)相比、或与使该抗体结合前相比，通过使该抗体结合，TIGIT介导的信号激活。另外，本说明书中，“抗人TIGIT激动性抗体”意指与未使该抗体结合的对照相比、或与使该抗体结合前相比，通过使该抗体结合而激活使TIGIT介导的信号激活的抗体。该TIGIT介导的信号的激活可以通过本身已知的方法中的任一种方法、例如荧光素酶检测等进行评价。另外，也可以利用该评价方法筛选出除包含上述中记载的具体的CDR1～3的抗体之外的抗人TIGIT激动性抗体。

本说明书中，“进行结合”这样的术语意指“具有进行结合的能力(having anability to bind)”，是指与1个或其以上的其他分子形成非共价键复合物的能力。作为本发明的复合物的例子，可举出抗人TIGIT激动性抗体与TIGIT的复合物。抗人TIGIT激动性抗体与包含序列号1所示的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_776160.2)的人TIGIT蛋白进行结合。一个方式中，抗人TIGIT激动性抗体不仅与人TIGIT蛋白进行结合，也与人以外的灵长类(例如：食蟹猕猴等)的TIGIT进行结合，但不与啮齿类(例如：小鼠等)的TIGIT进行结合。因此，以下，也可以将“人TIGIT”替换记载为“灵长类TIGIT”。该抗体的结合能力可以利用本身已知的方法中的任一种方法进行评价，例如，可以通过使TIGIT与抗体接触并对与TIGIT结合后的抗体进行检测或测定而进行。

抗人TIGIT激动性抗体只要包含上述重链可变区的CDR3及轻链可变区的CDR3则可以为任何抗体或其片段。抗体的类别没有特别限定，可以为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等任意的同型。优选为IgG或IgM，若考虑纯化的容易性等，则更优选为IgG。另外，作为抗体的片段，只要包含上述重链可变区的CDR3及轻链可变区的CDR3并与人TIGIT进行结合则没有特别限定，例如，可举出具有上述CDR的Fab、Fab’、F(ab’)₂等抗体片段等。

另外，抗人TIGIT激动性抗体优选如全身(full-body)的抗体、使Fab区与Fc结构域结合而成的抗体那样具有Fc结构域。该Fc结构域可以是野生型的，也可以是突变体。如本技术领域已知的那样，抗体的Fc结构域与多个Fc受体及配体相互作用，赋予被称为效应功能的重要功能。作为该Fc受体，可举出但不限于以下的受体：(人中的)包含同种型FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc的FcγRI(CD64)；同种型FcγRIIa(包含同种异型H131及R131)、包含FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158及F158并与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关))及FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；FcRn(新生儿型受体)、C1q(涉及补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体蛋白)以及FcRn(涉及血清半衰期的新生儿型受体)。可以如以下所概述的那样在1个以上的位置进行合适的氨基酸突变：例如，US专利申请11/841,654及其所引用的参考文献、US2004/013210、US2005/0054832、US2006/0024298、US2006/0121032、US2006/0235208、US2007/0148170。

另外，抗人TIGIT激动性抗体的上述CDR以外的部分(例如，CDR以外的可变区部分、恒定区、Fc结构域等)只要对TIGIT具有激动剂活性则可以包含任何氨基酸序列，另外，可以来源于任何动物。作为该动物，例如，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬、猴、猩猩、黑猩猩、人等哺乳动物，优选来源于人。

抗人TIGIT激动性抗体可以使用编码抗体或其片段的核酸或载体以基因工程的方式生产。例如，可以将编码抗人TIGIT激动性抗体的核酸导入宿主细胞使抗体或其片段表达，利用本身已知的方法将该抗体或其片段分离。作为该分离方法，例如，可举出使用了蛋白质A等的亲和柱、其他的层析柱、过滤器、超滤、盐析、透析等，也可以适当组合这些方法。另外，抗体的片段也可以通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶对上述制作而成的全身抗体进行处理而制作。

(编码抗人TIGIT激动性抗体的核酸)

本发明提供编码前述本发明的抗体的经分离的核酸(以下，有时也称为“本发明的核酸”)。本发明的核酸包括编码本发明的抗体的重链的核酸及编码轻链的核酸、编码抗体的片段的核酸等。编码本发明的抗体、抗人TIGIT激动性抗体或其片段的核酸可以为DNA也可以为RNA，或者还可以为DNA/RNA嵌合体，优选为DNA。另外，该核酸可以是双链，也可以是单链。双链的情况下，可以是双链DNA、双链RNA或DNA：RNA的杂交体(hybrid)。另外，编码抗体或其片段的核酸只要可以在体外(in vitro)或细胞中表达多肽，则该核酸也可以包含天然核苷酸、修饰核苷酸、核苷酸类似物、或它们的混合物。

编码抗体或其片段的核酸(例如，本发明的核酸)可利用本身已知的方法而构建。例如，基于序列表中记载的抗人TIGIT激动性抗体的氨基酸序列，设计编码该氨基酸的碱基序列，化学合成DNA链，或者利用PCR法、Gibson Assembly法将合成的部分重叠的寡DNA短链连接，从而能够构建编码抗人TIGIT激动性抗体的全长或一部分的DNA。

另外，编码抗体或其片段的核酸可以整合至表达载体。因此，可提供包含上述的编码抗体或其片段的核酸中的任一种的表达载体。该情况下，编码抗体的重链的核酸、编码抗体的轻链的核酸可以整合至不同的表达载体，也可以整合至1个表达载体。整合至1个表达载体的情况下，这2种核酸可以介由能实现多顺反子表达的序列而被整合。通过使用能实现多顺反子表达的序列，能更有效地表达整合至1种表达载体的多个基因。作为能实现多顺反子表达的序列，例如，可举出2A序列(例如：源自口蹄疫病毒(FMDV)的2A序列(F2A)、源自马鼻炎A病毒(ERAV)的2A序列(E2A)、源自猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV-1)的2A序列(P2A)、源自东亚细亚病毒(Thosea asigna virus，TaV)的2A序列(T2A序列)(PLoS ONE3，e2532，2008、Stem Cells 25，1707，2007))、内部核糖体进入位点(IRES)(U.S.PatentNo.4,937,190)等。

作为用于上述载体的启动子，例如可使用EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、TCR Vα基因启动子、TCRVβ基因启动子等。

除了上述启动子以外，上述载体可以根据期望包含转录及翻译调控序列、核糖体结合位点、增强子、复制起点、poly A添加信号、选择标记基因等。作为选择标记基因，例如可举出二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。

(包含编码抗人TIGIT激动性抗体的核酸的宿主细胞)

本发明的一个实施方式中，将包含上述的编码本发明的核酸的重链的核酸和编码轻链的核酸的表达载体导入宿主细胞内，可在该细胞内形成抗体。因此，本发明的一个方式中，提供含有本发明的核酸或载体的、宿主细胞(以下，有时也称为“本发明的宿主细胞”)。此外，提供使用了前述宿主细胞的、本发明的抗体的制造方法(以下，有时也称为“本发明的制法”)。本发明的制法包括在制造本发明的抗体的条件下培养本发明的宿主细胞的步骤。

作为能用作使本发明的抗体、抗人TIGIT激动性抗体表达的细胞的细胞，例如，可举出哺乳动物细胞。作为该哺乳动物细胞，例如，可举出能从美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)、Manassas、VA获得的多种永生化细胞株，其中可举出中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如，Hep G2)、及许多其他细胞株，但并不限于此。也可使用包括细菌(例如：大肠杆菌等)、酵母、昆虫及植物(不限于这些)在内的非哺乳动物细胞使重组抗体表达。另外，抗人TIGIT激动性抗体也可在牛、鸡等转基因动物中制造。

将编码抗体或其片段的核酸(例如，本发明的核酸)或载体导入宿主细胞的方法没有特别限定，可使用已知的方法。导入核酸、质粒载体的情况下，可利用例如磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、显微注射法、脂质体转染法等而进行。编码抗体或其片段的核酸也可以以RNA的形态直接导入细胞，用于在细胞内表达抗体。作为RNA的导入方法，可以使用已知的方法，例如，适宜使用脂质体转染法、电穿孔法等。

(抗人TIGIT激动性抗体的制造方法)

所得到的重组宿主细胞可在适合表达的条件下(例如，诱导物的存在下，合适的非人动物中，添加有合适的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的培养基等)维持，制造由其编码的1种以上的多肽。在一些情况下，在一个细胞中制造重链，在另一细胞中制造轻链。

使用哺乳动物细胞作为使本发明的抗体、抗人TIGIT激动性抗体表达的细胞的情况下，作为培养该细胞的培养基，例如，可使用包含约5～约20％的胎牛血清的最少必需培养基(MEM)〔Science，122，501(1952)〕，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)〔Virology，8，396(1959)〕，RPMI 1640培养基〔The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)〕，199培养基〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)〕等。培养基的pH优选为约6～约8。培养通常于约30℃～约40℃进行。也可以根据需要进行通气、搅拌。

人TIGIT的检测或测定用试剂或试剂盒

如上所述，本发明的抗体具有与人TIGIT进行结合的能力。因此，在另一方式中，提供包含本发明的抗体的、人TIGIT(或人以外的TIGIT)的检测或测定用试剂(以下，有时也称为“本发明的试剂”)。可以使该本发明的抗体与标记物质等结合而将抗体本身用作人TIGIT的检测或测定用试剂，或也可以与其他试剂等组合而对人TIGIT进行检测或测定。因此，还提供包含本发明的抗体的、人TIGIT的检测或测定用试剂盒(以下，有时也称为“本发明的试剂盒”)。本发明的试剂或试剂盒可以用于使用了Western印迹、免疫染色、EIA(EnzymeImmunoassay，酶免疫测定)或ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附剂测定)的方法(例如：直接法、间接法、竞争法、夹心法等)等。

本发明的试剂或试剂盒中除本发明的抗体之外也可包含其他抗体(包括其片段，以下同样)或试剂等，这些抗体或试剂等可以预先与上述抗体一起收纳，也可以收纳于分开的容器中。作为抗体或试剂等，可举出不同于与人TIGIT进行结合的本发明的抗体的抗体或其片段(以下，有时也称为“抗人TIGIT抗体”)、二抗、标记物质(例如，荧光色素(例如：荧光素等)、酶(例如：Horseradis h peroxidase：HRP(辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶(AP)等)、放射性物质等)、底物(作为AP的底物的PNPP(p-nitrophenyl ph osphate，对硝基苯磷酸酯)、作为HRP的底物的ABTS(2,2’-Azino bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid]-diammonium salt，2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)、OPD(o-phenylenedia mine dihydrochloride，邻苯二胺盐酸盐)、TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)等)、用于终止酶的反应的终止液、担载体、结合有标记物质的人TIGIT(以下，有时也称为“标记人TIGIT”)、反应容器以及用于稀释处理液、抗体的缓冲液、浓度已知的标准物质、阳性对照(例如重组人TIGIT等)、阴性对照、记载有方案的使用说明书等。这些试剂等也可根据需要预先混合。

上述试剂或试剂盒中所含的本发明的抗体可以预先固定化于担载体。作为本发明中使用的担载体，没有特别限定，例如，可举出聚苯乙烯等聚合物、玻璃珠、磁性粒子、微孔板、免疫层析用滤纸、玻璃过滤器等不溶性担载体。优选为ELISA中使用的微孔板。另外，人TIGIT(也包括经标记的人TIGIT、结合有BSA等其他肽的人TIGIT)也可以固定化于上述担载体(优选微孔板)。因此，本发明的一个实施方式中，提供包含固定化有本发明的抗体的微孔板的ELISA用途的试剂或试剂盒、或包含固定化有人TIGIT的微孔板及本发明的抗体的ELISA用途的试剂或试剂盒。

包含二抗的本发明的试剂或试剂盒例如可以用于Western印迹法、免疫染色、EIA或ELISA的间接法等。二抗只要可与本发明的抗体结合则没有特别限定，可以适当选择。另外，二抗优选结合有上述的标记物质，上述试剂或试剂盒也可包含针对该标记物质的上述底物等。将本发明的试剂或试剂盒用于ELISA间接法的情况下，例如，可以将人TIGIT固定化于微孔板，使本发明的抗体与其反应，接着使针对该抗体的经酶标记的二抗反应，洗涤后，对微孔板中残留的酶活性进行检测或测定，由此对人TIGIT或其量进行检测或测定。

包含标记人TIGIT的本发明的试剂或试剂盒例如可以用于EIA或ELISA的竞争法等。标记人TIGIT只要可与本发明的抗体结合就没有特别限定。作为与人TIGIT进行结合的标记物质，没有特别限定，例如，可举出上述的荧光色素、酶等。标记物质可以直接地与人TIGIT结合，也可以间接地与人TIGIT结合。直接的结合例如通过介由接头(例如：NHS酯、马来酰亚胺等)等的交联反应等而进行，但并不限于该方法。间接的结合例如可以通过使1个以上的标签(例如：生物素等)结合于生物素，介由针与该标签进行结合的物质(例如：(链霉)亲和素、针对标签的抗体等)使标记物质与标签结合等而进行。因此，标记人TIGIT可以以添加有标签的人TIGIT和具有与该标签进行结合的物质的标记物质为不同的物质的形态而提供。上述试剂或试剂盒中除标记人TIGIT之外也可以包含针对标记物质的上述的底物等。将本发明的试剂或试剂盒用于EIA或ELISA的竞争法的情况下，例如，将本发明的抗体固定化于微孔板，使包含人TIGIT的试样及浓度已知的标记人TIGIT在同一微孔板内同时反应，反应后对微孔板中残留的酶活性进行检测或测定，由此可以对人TIGIT或其量进行检测或测定。

包含抗人TIGIT的本发明的试剂或试剂盒例如可以用于ELISA夹心法等。与人TIGIT结合的抗体只要可与人TIGIT结合就没有特别限定，优选结合有标记物质。作为该标记物质，没有特别限定，例如，可举出上述的荧光色素、酶等。上述试剂或试剂盒中除抗人TIGIT抗体之外也可以包含针对标记物质的上述底物等。将本发明的试剂或试剂盒用于ELISA夹心法的情况下，例如，将本发明的抗体固定化于微孔板，使人TIGIT反应，接着使经标记的抗人TIGIT抗体反应，洗涤后，对微孔板中残留的酶活性进行检测或测定，由此可以对人TIGIT进行检测或测定。

抗人TIGIT抗体可以通过使用人TIGIT、其部分肽、或添加有氨基酸等的修饰人TIGIT作为免疫原、利用现有的一般制造方法而制造。该抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、它们的片段等，但并不限于此。优选的抗体为单克隆抗体或其片段。作为抗体或该抗体的片段，例如，可举出具有与人TIGIT结合的能力的、Fab、Fab’、F(ab’)2等片段等的以基因工程方式制作的缀合物分子、或经聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定作用的分子等修饰而成的它们的衍生物等，但并不限于此。另外，作为上述抗人TIGIT抗体，可以使用市售的抗体。

人TIGIT的检测或测定方法

在另一方式中，本发明提供使用了本发明的抗体、试剂或试剂盒的、人TIGIT的检测或测定方法(以下，有时也称为“本发明的方法”)。一个实施方式中，本发明的方法包括：

(1)使试样中的人TIGIT与本发明的抗体接触的步骤；及

(2)对已与该人TIGIT结合的本发明的抗体进行检测或测定的步骤。

前述方法例如可以适用于Western印迹法、免疫染色、EIA或ELISA(例如：直接法、间接法、夹心法等)等。

上述步骤(1)中，使试样中的人TIGIT与本发明的抗体接触的方法没有特别限定，例如，可以通过将试样与包含本发明的抗体的溶液混合等而进行。试样为组织切片的情况下，也可以通过向该组织切片添加包含本发明的抗体的溶液，从而使人TIGIT与本发明的抗体接触。作为使人TIGIT与本发明的抗体接触时的条件，没有特别限制，通常于0～45℃的温度下接触，优选于0～40℃的温度下接触，更优选于4～37℃的温度下、进一步优选于25℃～37℃的温度下接触。另外，作为接触的时间，也没有特别限制，通常为5分钟～6小时，优选为10分钟～2小时，更优选为20分钟～1小时。

另外，上述步骤(1)可以通过下述方式进行：向固定化有本发明的抗体的担载体添加试样；或者使试样中的人TIGIT固定化于担载体，向该担载体添加本发明的抗体；等等。作为该担载体，可以使用与上述1.中记载的同样的担载体。作为使本发明的抗体或试样中的人TIGIT固定化于担载体的方法，没有特别限制，例如，可举出利用物理吸附、静电相互作用、疏水性相互作用、交联剂等的方法等。本发明的抗体的固定化时的溶液中的浓度根据担载体的材质、形状、固定化的方法等适当调节即可，例如，可举出5～50μg/mL的浓度，优选为10～40μg/mL。将人TIGIT固定化的情况下，可以适当调节人TIGIT的溶液中的浓度。若对固定化后的担载体进行基于封闭剂的封闭操作，则本发明的抗体或人TIGIT的非特异性吸附被抑制，测定时的背景也被抑制。封闭剂从EIA、ELISA等利用了抗原抗体反应的测定领域中通常使用的制剂之中适当选择即可，作为优选的封闭剂，可举出胶原肽(Collagenpeptide)。

在步骤(1)之后，为了将未能结合于人TIGIT的抗体、未能结合于抗体的人TIGIT除去，也可设置洗涤步骤。作为洗涤步骤中使用的洗涤液，例如，可举出缓冲液(pH6～8)等，更具体而言，可举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液等。另外，这些缓冲液中也可以适当含有盐类、表面活性剂、蛋白质、糖、两性离子化合物等。另外，也可适宜使用市售的免疫反应用试剂盒中所含的洗涤液。

上述步骤(2)中的对已与人TIGIT结合的本发明的抗体进行检测或测定的方法没有特别限制，可以利用本身已知的方法而进行。作为该方法，可举出“Methods inENZYMOLOGY”Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同刊Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同刊Vol.74(Immunochemical Techniques(PartC))、同刊Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D：Selected Immunoassays))、同刊Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E：Monoclonal Antibodies and GeneralImmunoassay Methods))、同刊Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I：HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies))(以上为Academic Press公司发行)等中记载的方法。

具体而言，例如，上述步骤(1)中使用了结合有标记物质的本发明的抗体的情况下，对该标记物质或其量进行检测或测定，从而可以对已与人TIGIT结合的本发明的抗体或其量进行检测或测定。或者，也可以在步骤(2)之后，使本发明的抗体和人TIGIT形成的复合物与对本发明的抗体进行结合的、结合有标记物质的二抗、或结合有标记物质的抗人TIGIT抗体接触，对该标记物质或其量进行检测或测定。在检测或测定之前，为了将未能结合于本发明的抗体或人TIGIT的二抗或抗人TIGIT抗体除去，也可以设置洗涤步骤。洗涤步骤可以通过与上述的在步骤(1)之后任意进行的洗涤步骤同样的方法而进行。另外，二抗及抗人TIGIT抗体也可以使用与上述3中记载的同样的抗体。

使用荧光物质作为标记物质的情况下，针对其发出的荧光，可以使用酶标仪等来对标记物质或其量进行检测或测定。另外，使用酶作为标记物质的情况下，可以添加通过该酶的作用而降解并显色、发光等的底物，从而使用酶标仪等对其显色、发光、它们的水平等进行检测或测定。另外，使用放射性物质作为标记物质的情况下，可以利用闪烁计数器等对该物质所发出的辐射剂量进行检测或测定。还可以基于如此检测或测定而得的数据，使用图像处理软件(例如：Image J等)等对人TIGIT的量进行定量化。

另外，本发明的方法的另一实施方式中，本发明的方法包括：

(1’)使标记人TIGIT及试样中的人TIGIT与本发明的抗体接触的步骤；及

(2’)对已与该标记人TIGIT结合的本发明的抗体进行检测或测定的步骤。

前述方法例如可以适用于EIA或ELISA的竞争法等。

上述步骤(1’)中，使标记人TIGIT及试样中的人TIGIT与本发明的抗体接触的方法没有特别限定，例如可以通过将包含标记人TIGIT的溶液、试样和包含本发明的抗体的溶液混合等而进行。作为使标记人TIGIT及人TIGIT与本发明的抗体接触时的条件，可举出与上述步骤(1)中记载的条件同样的条件。

另外，上述步骤(1’)也可以通过下述方式进行：向固定化有本发明的抗体的担载体添加试样及浓度已知的标记人TIGIT；或者使试样中的人TIGIT固定化于担载体，向该担载体添加标记人TIGIT及本发明的抗体；等等。关于该担载体的种类、固定化方法、封闭剂等，可以使用与上述步骤(1)中记载的同样的物质。

步骤(1’)之后，为了将未能结合于人TIGIT或标记人TIGIT的抗体、未能结合于抗体的人TIGIT或标记人TIGIT除去，也可以设置洗涤步骤。作为洗涤步骤中使用的洗涤液，可以使用与上述步骤(1)中记载的同样的洗涤液。

上述步骤(2’)中的对已与标记人TIGIT结合的本发明的抗体进行检测或测定的方法可以通过对已结合于标记人TIGIT的标记物质或其量进行检测或测定，从而对已与人TIGIT结合的本发明的抗体或其量进行检测或测定。

使用荧光物质作为标记物质的情况下，针对其发出的荧光，可以使用酶标仪等来对标记物质或其量进行检测或测定。另外，使用酶作为标记物质的情况下，可以添加通过该酶的作用而降解并显色、发光等的底物，从而使用酶标仪等对其显色、发光、它们的水平等进行检测或测定。另外，使用放射性物质作为标记物质的情况下，可以利用闪烁计数器等对该物质所发出的辐射剂量进行检测或测定。本发明的方法中，试样中所含的人TIGIT的量多的情况下，可与本发明的抗体结合的标记人TIGIT减少，标记水平(例如：显色或荧光水平)变弱。另一方面，试样中的人TIGIT的量少的情况下，可与本发明的抗体结合的标记人TIGIT增加，标记水平(例如：显色或荧光水平)变强。

作为本发明的方法中使用的试样，例如，可举出从动物采集的试样。另外，前述试样可以为已知包含人TIGIT(例如，包括表达人TIGIT的细胞的形态等)的试样，或也可以为不清楚是否包含人TIGIT的试样。作为该动物，例如，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬、猴、猩猩、黑猩猩、人等哺乳动物。作为源自动物的试样，例如，可举出血液、血清、血浆、唾液、尿、泪、汗、乳汁、鼻涕、精液、胸腔积液、消化道分泌液、脑脊液、间质液、及淋巴液等，优选为血清及血浆。另外，还优选为通过培养细胞而得到的细胞群。这样的试样可以利用本身已知的方法而得到，例如，血清、血浆可以通过按照常规方法从受试动物采血并将液性成分分离而制备，脑脊液可以通过脊椎穿刺等已知的手段而采集。

含有本发明的抗体的医药

另外，本发明提供含有上述本发明的抗体作为有效成分的医药。通过本发明的抗体，可以抑制CD8阳性T细胞等细胞毒性T细胞(CTL)或自然杀伤(NK)细胞中的TIGIT激活介导的免疫激活，还能增强调节性T细胞(Treg细胞)中的TIGIT激活介导的免疫应答抑制能力。因此，含有本发明的抗体而成的医药可以用于自身免疫性疾病、与CTL或NK细胞的激活有关的疾病的预防或治疗。作为该疾病，例如，可举出类风湿性关节炎、干癣、干癣性关节炎、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、乳糜泻、移植物抗宿主病(GVHD)、肠易激综合征。另外，作为上述疾病，例如，也可举出干燥综合征、非酒精性脂肪肝炎(NASH)及原发性胆汁性肝硬化。作为本发明的医药的施予对象，例如，可举出灵长类动物，作为该灵长类动物，可举出狐猴、懒猴、树鼩、猴(例如：食蟹猕猴等)、人，可优选举出人。

本发明的抗体、抗人TIGIT激动性抗体优选按照常规方法制备成医药组合物。进一步地，本发明的治疗药也可根据需要包含医药上可接受的担载体及/或添加物。例如，可以包含表面活性剂(PEG、吐温等)、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、着色剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂(磷酸、柠檬酸、其他有机酸等)、螯合剂(EDTA等)、悬浮剂、等渗剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、流动性增强剂、矫味剂等。然而，上述医药组合物并不限于此，也可以适当包含其他常用的担载体。具体而言，可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。另外，也可以包含其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶及免疫球蛋白等蛋白质、以及氨基酸。制成注射用的水溶液的情况下，将抗人TIGIT激动性抗体溶解于例如包含生理盐水、葡萄糖或其他佐剂的等渗液。作为佐剂，例如，可举出D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，此外也可以与适宜的助溶剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80、HCO-50)等并用。

另外，可以根据需要将多肽封入微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚(甲基丙烯酸甲酯)等的微胶囊)中，或者也可以制成胶体药物传递系统(脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子及纳米胶囊等)(参见Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition&,OsloEd.(1980)等)。

医药组合物中的抗人TIGIT激动性抗体的含量例如为医药组合物整体的约0.01～100重量％，优选为0.1～99.9重量％。

上述医药组合物能通过经口或非经口中的任一者施予，优选被非经口施予。具体而言，通过注射及经皮施予被施予至患者。作为注射剂型的例子，例如可以通过静脉内注射、肌内注射或皮下注射等全身或局部地进行施予。可以在治疗部位或其周围进行局部注入、尤其是肌内注射。作为经皮施予剂型的例子，例如，可举出软膏剂、凝胶剂、乳霜剂、湿敷剂、及贴剂等，可以全身或局部地进行施予。另外，可以根据患者的年龄、症状而适当选择施予方法。作为施予量，例如，以每1次每1kg体重计，作为抗人TIGIT激动性抗体，能够在0.5mg～10mg的范围内选择。然而，本发明的医药组合物并不限于这些施予量。

本申请说明书的序列表的序列号示出以下的序列。

(序列号1)人TIGIT的氨基酸序列

(序列号2)克隆M1-8 H-CDR1的氨基酸序列

(序列号3)克隆M1-8 H-CDR2的氨基酸序列

(序列号4)克隆M1-8 H-CDR3的氨基酸序列

(序列号5)克隆M1-8 L-CDR1的氨基酸序列

(序列号6)克隆M1-8 L-CDR3的氨基酸序列

(序列号7)克隆M1-8重链可变区的氨基酸序列(小鼠型重链可变区)

(序列号8)克隆M1-8轻链可变区的氨基酸序列(小鼠型轻链可变区)

用以下的实施例进一步对本发明具体地进行说明，但本发明的范围并不限于这些实施例。

[实施例]

实施例1：新型抗人TIGIT激动性抗体(M1-8)的制作

＜重组人TIGIT-His-mFc蛋白的制作＞

重组人TIGIT-His-mFc蛋白的制备使用Expi293表达系统(Thermo)而进行。对转染了人TIGIT-His-mFc表达质粒的细胞进行培养后，通过Ni-NTA Cartridge(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation)柱和基于Superdex200 pg柱的凝胶过滤从其培养上清液中纯化重组人TIGIT-His-mFc蛋白。

＜免疫方法＞

将重组人TIGIT-His-mFc蛋白与TiterMax一同以成为10μg/只的方式对6-8周龄的CD2F1雌性小鼠的两膝窝进行皮下免疫。之后每隔3～4天日用相同量的免疫原与CpG/Alum一同进行11次追加免疫。在摘取淋巴结3天前，作为最终免疫，将免疫原用磷酸缓冲生理盐水(PBS，pH 7.4)稀释为1mg/mL，各自腹腔内施予100μL。

＜血中抗体效价的测定＞

自初次免疫起36天后，从尾静脉采血，用生理盐水对所得到的血液进行100倍稀释。将经稀释的血液于4℃进行5分钟离心后回收上清液，从而得到抗血清。抗体效价利用下述方法进行测定。在有多西环素或无多西环素的条件下对多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞进行2天培养。将细胞用PBS洗涤之后，添加细胞解离缓冲液(Cell Dissociationbuffer，GIBCO)，于室温静置10分钟，由此将细胞从培养瓶剥离。将所得到的细胞用FACS缓冲液(包含1％ FBS的PBS)洗涤2次后，使用FACS缓冲液以成为1×10⁶个细胞/mL的细胞密度的方式分别使之悬浮。将悬浮液以各100μL分注于96孔V底培养板，离心后除去上清液。向该培养板中分注各100μL经FACS缓冲液稀释的抗血清，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，分注各100μL经AlexaFluoro647(注册商标)标记的抗小鼠IgG抗体，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤2次后，用200μL的FACS缓冲液使之悬浮，使用Cytomics FC500MPL测定已结合的抗体。

图1中示出所得到的中位荧光强度。在用重组TIGIT蛋白进行了免疫的小鼠的抗血清中，确认到针对多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞的抗体效价的升高。

＜单克隆抗体的制作＞

最终免疫3天后，从确认到抗体效价升高的小鼠No.1、2、4、5摘取淋巴结，在40μm滤网(strainer)上压迫、过滤，悬浮于DMEM中。对于用于杂交瘤制作的融合伴侣，使用了P3-X63.Ag8.U1(P3U1)。分别将淋巴细胞及P3U1用DMEM洗涤3次，以细胞数之比成为1:1的方式进行混合。将用融合缓冲液(0.3M甘露醇，0.1mM氯化钙，0.1mM硫酸镁)洗涤了2次的细胞以1.51×10⁷个细胞/mL悬浮于融合缓冲液。细胞融合使用BTX按照手册而实施。将融合后的细胞用ClonalCell^TM-HY培养基C(STEMCELL)洗涤1次，用相同培养基以成为1.67×10⁶个细胞/mL的方式悬浮后，在37℃、5％CO₂条件下静置一晚。将所得到的融合细胞离心，用ClonaCell^TM-HY培养基C以1×10⁶个细胞/mL悬浮后，与ClonaCell^TM-HY培养基D混合，接种于培养板。在37℃、5％CO₂条件下培养10天后，使用克隆Pix挑取杂交瘤集落，接种于以200μL/孔添加有ClonaCell^TM-HY培养基E的培养板。在37℃、5％CO₂条件下培养3天后回收培养上清液，供于筛选。

＜一过性表达细胞的制作＞

一过性表达细胞使用Expi293F表达系统(Thermo)按照手册而制作。具体而言，将处于对数增殖期的Expi293F细胞以成为1x10⁶个细胞/mL的细胞密度的方式悬浮后，以各35mL分注于125mL锥形烧瓶(Elenmeyer flask)。将37.5μg的TIGIT表达质粒和50μL的293Fectin分别以最终容量成为1.25mL的方式稀释于OptiMEM I培养基，于室温静置5分钟。将经稀释的DNA溶液与293Fectin溶液混合，进一步于室温静置20分钟。向细胞添加混合液，于37℃、8％CO₂、120rpm培养2天，回收细胞。

＜一次筛选(Mirrorball assay)＞

一次筛选使用一过性表达细胞株及其亲本株而进行。回收细胞后，用FACS缓冲液洗涤3次，将以3×10⁵个细胞/mL悬浮的细胞与经相同缓冲液稀释为1μg/mL的AlexaFluor(注册商标)647标记抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)抗体各自以等量混合，分别以各20μL分注于384孔培养板。向该培养板添加10μL用FACS缓冲液进行了10倍稀释的杂交瘤的培养上清液，用培养板混合器搅拌后，进行1分钟离心。于室温静置1小时后，使用微孔板成像仪(plate imager)(Mirrorball)测定荧光强度。

＜基于ELISA法的培养上清液中的抗体浓度测定＞

向96半孔ELISA板以各50μL分注用PBS稀释为5μg/mL的抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)抗体，于4℃静置一晚。接着，用洗涤缓冲液(包含0.05％吐温20的PBS)将培养板洗涤2次后，分注各100μL封闭缓冲液(包含20％免疫封闭剂(ImmunoBlock)的PBS)，于室温静置1小时。向该培养板添加各50μL用分析缓冲液(assay缓冲液)(包含10％免疫封闭剂的PBS)进行了100倍或1,000倍稀释的杂交瘤培养上清液、或小鼠IgG1标准溶液(0-300ng/mL)，于室温静置1小时。向用洗涤缓冲液洗涤了3次的培养板分注各50μL的HRP标记抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)抗体，于室温静置1小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后，分注各50μL的Sure Blue/TMB过氧化物酶底物(KPL)，于室温使之反应5分钟。分注各50μL的0.5M硫酸终止反应，然后使用酶标仪(SpectraMax)测定450nm的吸光度。校准曲线的制作及浓度的计算使用了Softmax。

人、猴、及小鼠TIGIT表达细胞使用多西环素表达诱导CHO细胞株而制作。即，将人、猴、及小鼠TIGIT表达质粒转染至多西环素表达诱导CHO细胞株。将转染后的细胞用有限稀释法进行克隆之后，在含有多西环素的培养基中培养，从而诱导TIGIT的表达，选择确认到表达的细胞作为TIGIT表达细胞。

＜二次筛选(FACS)＞

二次筛选以与血中抗体效价测定同样的方法进行。即，在有多西环素或无多西环素的条件下对多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞进行2天培养。将细胞用PBS洗涤之后，添加细胞解离缓冲液(GIBCO)，于室温静置10分钟，由此将细胞从培养瓶剥离。将所得到的细胞用FACS缓冲液(包含1％ FBS的PBS)洗涤2次后，使用FACS缓冲液以成为1×10⁶个细胞/mL的细胞密度的方式分别使之悬浮。将悬浮液以各100μL分注于96孔V底培养板，离心后除去上清液。向该培养板添加各100μL用FACS缓冲液稀释为1μg/mL的杂交瘤培养上清液，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，分注各100μL经AlexaFluoro647(注册商标)标记的抗小鼠IgG抗体，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤2次后，用200μL的FACS缓冲液使之悬浮，使用Cytomics FC500MPL测定已结合的抗体。

图2中示出培养上清液中的M1-8抗体的与多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞的结合活性。

＜三次筛选(重组TIGIT、PVR表达细胞结合抑制试验)＞

将用FACS缓冲液稀释为2nM的重组人TIGIT人IgG1Fc融合蛋白(R&D systems，7898-TG-050)与稀释为10-1,000ng/mL的杂交瘤培养上清液以成为1:1的方式分别混合于96孔V底培养板中，于室温30分钟静置。将在多西环素存在下培养了2天的多西环素表达诱导人PVR表达细胞以1×10⁶个细胞/mL悬浮于FACS缓冲液，以各100μL分注于另一96孔V底培养板。将包含细胞的培养板离心，丢弃上清液后，添加已预先混合的TIGIT、培养上清液混合液，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，分注各100μL经AlexaFluoro647(注册商标)标记的抗人IgG抗体，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤2次后，用200μL的FACS缓冲液使之悬浮，使用Cytomics FC500MPL测定已结合的TIGIT-Fc。

图3中示出重组TIGIT、PVR表达细胞结合抑制试验的结果。市售的抗人TIGIT抗体(克隆MSBA43)抑制了TIGIT与PVR表达细胞的结合，但是培养上清液中的M1-8抗体并没有抑制。

＜基于ELISA法的抗体的分型(isotyping)＞

向96半孔ELISA板分注各50μL用PBS稀释为5μg/mL的各种抗小鼠同型抗体(ITM，BioLegend)，于4℃静置一晚。接着，用洗涤缓冲液(包含0.05％吐温20的PBS)将培养板洗涤2次后，分注各100μL的SuperBlock(PBS)封闭缓冲液(Thermo)，于室温静置1小时。向该培养板添加50μL用分析缓冲液(包含10％SuperBlock(PBS)封闭缓冲液的PBS)进行了10倍稀释的杂交瘤培养上清液，于室温静置1小时。向用洗涤缓冲液洗涤了3次的培养板分注各50μL的HRP标记抗小鼠IgG抗体，于室温静置1小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后，分注各50μL的SureBlue/TMB过氧化物酶底物(KPL)，于室温使之反应5分钟。分注各50μL的0.5M硫酸终止反应，然后使用酶标仪(SpectraMax)测定450nm的吸光度。由分型的结果可知M1-8抗体为小鼠IgG1/k。

＜抗体的CDR区域的确定＞

M1-8抗体的CDR按照IMGT编号系统进行定义。

＜抗体纯化＞

将在ClonaCell^TM-HY培养基E中培养并处于对数增殖期的杂交瘤悬浮液0.5mL添加于包含Daigo’s T培养基(10％超低IgG FBS，1％MEM NEAA，1％丙酮酸钠，1％L-丙氨酰-L-谷胺酰胺，1％青霉素-链霉素，43％ F-12营养混合物，43％ Iscove’s改良Dulbecco’s培养基)0.5mL的24孔培养板，于37℃、5％CO₂条件下进行培养。培养2～3天后，添加于包含Daigo’s T培养基4mL的6孔培养板，进一步培养2～3天，由此适应Daigo’s T培养基。确认细胞充分适应后，添加于包含45mL的Daigo’s T的T-75培养瓶，于37℃、5％CO₂条件下进行培养。7～10天后回收培养液，进行离心，由此得到培养上清液。

利用蛋白A树脂从所得到的培养上清液中纯化单克隆抗体。向培养上清液中添加使用PBS进行了平衡的0.6mL的50％浆液蛋白A Sepharose树脂(Slurry Protein ASepharose resin)，于4℃振荡一晚。于4℃离心10分钟后，吸去部分上清液，将树脂悬浮于剩下的培养基中后，添加于24孔过滤板(Whatman)。将树脂用5mL的PBS洗涤3次后，用2.5mL的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-盐酸/0.3M NaCl，pH 3.0)将已结合的抗体洗脱。立即使用0.3mL的中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 8.0)来中和洗脱液。就小鼠IgG1的纯化而言，将培养上清液与小鼠IgG1结合缓冲液(1.5M甘氨酸-盐酸，3M NaCl，pH 9.5)等量混合之后添加蛋白A Sepharose树脂。另外，洗涤时，代替PBS而使用小鼠IgG1结合缓冲液进行洗涤。就所得到的纯化抗体而言，使用超滤柱(Amicon)将缓冲液置换为PBS，利用分光光度计(NanoDrop)进行浓度测定。

＜纯化抗体的生物活性的测定＞

·抗体的连续稀释溶液的制备(Day 0)

将受试抗体及作为阳性对照的PVR(重组人CD155/PVR、R&D systems，2530-CD-050)、作为阴性对照的IgG用培养基(RPMI1640：FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation 189-02025、10％ FBS：CORNING，37-076-CVR，1×PS：青霉素-链霉素溶液(×100)、FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 168-23191)进行连续稀释。受试抗体与IgG从最终浓度10μg/mL至100ng/mL以3倍倍比制备5点浓度的连续稀释液，PVR从最终浓度33μg/mL至333ng/mL以3倍倍比制备5点浓度的连续稀释液。

·包被培养板的准备(Day 0)

将抗人CD3(eBioscience，16-0037)用PBS(D-PBS(-)、FUJIFILM Wako PureChemical Corporation 045-29795)稀释至3μg/mL，以各50μL/孔添加于96孔培养板(黑色硬质平底细胞培养表面处理聚苯乙烯微孔板，CORNING，3916)。进行密封并于4℃的冰箱中静置一晚。

·细胞的接种与样品的添加(激动剂分析试验(agonist assay))(Day 0)

向多西环素(Doxycycline)表达诱导人TIGIT表达细胞(hTIGIT/Jurkat)以成为2μg/mL的方式添加多西环素，以各60μL/孔接种于预先各添加有48μL/孔培养基的96孔培养板(透明平底细胞培养表面处理微孔板，CORNING，3598)。进一步以各12μL/孔添加先进行了连续稀释的受试抗体及阳性对照、阴性对照，向100％对照的孔中以各12μL/孔添加最终浓度3.3μg/mL的PVR，向0％对照的孔中以各12μL/孔添加培养基。在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养一晚。

·细胞的接种与样品的添加(拮抗剂分析试验(antagonist assay))(Day 0)

向多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞(hTIGIT/Jurkat)中以成为2μg/mL的方式添加多西环素，以各60μL/孔接种于预先在样品及阳性对照、阴性对照的孔中添加有36μL/孔的培养基、在100％对照及0％对照的孔中添加有48μL/孔的培养基的96孔培养板(透明平底细胞培养表面处理微孔板，CORNING，3598)。以各12μL/孔添加先进行了连续稀释的受试抗体及阳性对照、阴性对照，100％对照的孔中以各12μL/孔添加培养基，0％对照的孔中以各12μL/孔添加最终浓度3.3μg/mL的PVR。进一步，样品及阳性对照、阴性对照的孔中以各12μL/孔添加最终浓度3.3μg/mL的PVR。在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养一晚。

·细胞的接种与样品的添加(细胞毒性/生长抑制分析试验)(Day 0)

向多西环素表达诱导人TIGIT表达细胞(hTIGIT/Jurkat)中以成为2μg/mL的方式添加多西环素，针对预先以各48μL/孔添加了培养基的96孔培养板(透明平底细胞培养表面处理微孔板，CORNING，3598)，除0％对照的孔以外，以各60μL/孔接种。0％对照的孔中添加60μL/孔的培养基。进一步以各12μL/孔添加先进行了连续稀释的受试抗体及阳性对照、阴性对照，100％对照的孔中以各12μL/孔添加最终浓度3.3μg/mL的PVR，0％对照的孔中以各12μL/孔添加培养基。在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养一晚。

·细胞的刺激(Day 1)

去除抗人CD3包被培养板的溶液，用200μL/孔的PBS洗涤1次后，以90μL/孔转移在Day0添加了样品的各分析试验的细胞溶液。将抗人CD28(eBioscience，16-0289)稀释为最终浓度2μg/mL，以各10μL/孔添加于该培养板。用培养板混合器(Titramax 100，Heidolph)搅拌后，在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养一晚。

·测定(Day 2)

激动剂分析试验与拮抗剂分析试验的测定使用了Nano-Glo(注册商标)萤光素酶检测系统(Promega，N1120)，细胞毒性/生长抑制分析试验的测定使用了CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay System(Promega，G7572)。将细胞从CO₂培养箱恢复至室温，向细胞以100μL/孔添加用Nano-Glo^TM萤光素酶检测缓冲液进行了50倍稀释的Nano-Glo^TM荧光素酶检测底物溶液、或以100μL/孔添加用CellTiter-Glo(注册商标)缓冲液溶解的CellTiter-Glo(注册商标)底物溶液，用培养板混合器(Titramax 100，Heidolph)搅拌，孵育3分钟后，用荧光分析仪(Mutilabel Counter)Envision(2103Envision，PerkinElmer)测定1秒钟的发光值。

·分析

样品的值用以下的计算式算出。

激动剂分析试验：

样品的激动剂活性(％)＝(1-(化合物的测定值-100％对照孔的平均值)/(0％对照的平均值-100％对照孔的平均值))×100

将计算而得的表达度(％)使用GraphPad Prism图表化，算出EC50值。

拮抗剂分析试验：

样品的拮抗剂活性(％)＝(化合物的测定值-100％对照孔的平均值)/(0％对照的平均值-100％对照孔的平均值)×100

将计算而得的抑制率(％)使用GraphPad Prism图表化，算出IC50值。

细胞毒性/生长抑制分析试验：

样品的细胞毒性(％)＝(1-(化合物的测定值-0％对照孔的平均值)/(100％对照的平均值-0％对照孔的平均值))×100

将计算而得的毒性(％)使用GraphPad Prism图表化，算出IC50值。

图4中示出M1-8抗体的生物活性的测定结果。M1-8抗体显示出激动剂活性，但没有显示出拮抗剂活性。另外，M1-8抗体在本条件下没有对本测定中使用的人TIGIT表达细胞显示细胞毒性，且对细胞增殖也没有造成影响。

＜交叉反应性试验＞

所得到的抗体的交叉反应性试验使用人、猴、及小鼠TIGIT表达细胞并利用FACS而进行。即，在有多西环素或无多西环素的条件下对多西环素表达诱导细胞进行2天培养。将细胞用PBS洗涤之后，添加细胞解离缓冲液(GIBCO)，于室温静置10分钟，由此将细胞从培养瓶剥离。将所得到的细胞用FACS缓冲液(包含1％ FBS的PBS)洗涤2次后，使用FACS缓冲液以成为1×10⁶个细胞/mL的细胞密度的方式分别使之悬浮。将悬浮液以各100μL分注于96孔V底培养板，离心后除去上清液。向该培养板添加各100μL用FACS缓冲液稀释为1μg/mL的纯化抗体，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，分注各100μL经AlexaFluoro647(注册商标)标记的抗小鼠IgG抗体，于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤2次后，用200μL的FACS缓冲液使之悬浮，使用Cytomics FC500MPL测定已结合的抗体。

图5中示出M1-8抗体的对人、猴、小鼠TIGIT的交差反应性的结果。可知抗体M1-8与人和猴TIGIT进行结合，但未与小鼠TIGIT结合。

下述的实施例中使用了以下的抗体·培养基：

人；抗CD3(Hit3a)，抗CD4(FITC，OKT4或BV510，OKT4)，抗CD19(BV421，HIB19)，抗CD25(PE，BC96)，抗CD27(BV510，O323)，CD38(FITC，HIT2)抗CD45RA(BV421，HI100)，抗CD127(FITC，A019D5)，抗CD138(APC，MI15)，抗CXCR5(PerCP/Cy5.5，J252D4)，抗人TIGIT(PE-Cy7，A15153G)(均为BioLegend)，7-氨基放线菌素D(Bay Bioscience)，抗TIGIT激动性抗体(克隆M1-8，武田药品工业)。

小鼠；表面染色抗CD44(FITC，IM7)，抗CD62L(PE，MEL-14)，抗CD69(APC,H.12F3)，抗CD95(APC，SA367H8)，抗CD138(BV421，281-2)，抗CD185(PE，L138D7)，抗GL7(PE-Cy7，GL7)，(均为BioLegend)，抗B220(PE，RA3-6B2)，抗CD3ε(PE-cy5，145-2C11)，抗CD4(eFluor450或APC(均为Thermo Fisher Scientific)，细胞内染色抗Foxp3(PE，FJK-16sThermo Fisher Scientific)。

同型对照；mIgG1(MG1-45)(均为Biolegend)。

完全RPMI(向RPMI1640中添加下述物质：2mM L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，55μM2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific)，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，10％ FBS(Thermo Fisher Scientific))。

就统计分析而言，使用Wilcoxon秩和检验调查连续变量之间的差。认为P值<0.05是显著的。所有统计分析使用JMP 15(SAS Institute)而实施。

实施例2：TIGIT激活介导的CD8阳性T细胞的激活抑制的验证

使用肝素采血管(TERUMO)从4名健康人采集人外周血，使用Ficoll-paque plus(GE healthcare)分离PBMC。通过使用了CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)的MACS从PBMC中分离CD8阳性T细胞。用CFSE(Invitrogen)试剂对这些细胞进行染色之后，悬浮于RPMI1640/10％ FBS/PSG培养基，以1x10⁵个细胞/孔接种于96孔圆底培养板。将结合有抗人CD3抗体(Biolegend)和人PVR-Fc(R&D systems)或人IgG1-Fc(R&D systems)的Dynabeads-M450(Invitrogen)以成为1x10⁵个珠/孔的方式混合于接种后的细胞中，在5％CO₂、37℃条件下培养3天。

抗体向Dynabeads-M450结合的方法如下所述。将Dynabeads-M450悬浮于结合缓冲液(0.1M磷酸钠pH 7.6)，使用磁石洗涤1次后，再次悬浮于结合缓冲液，将抗CD3抗体以成为2.5μg/10⁷个珠、将PVR-Fc和IgG1-Fc以PVR-Fc与IgG1-Fc合计成为2.5μg/10⁷个珠的方式混合于其中，于4℃旋转一晚进行混合。第二天，用清洗缓冲液(Wash buffer)(PBS/0.1％BSA/2mM EDTA)并使用磁石洗涤2次后，用封闭缓冲液(0.2M Tris-HCl pH 8.5/0.1％BSA)于室温旋转4小时，一边进行混合。使用清洗缓冲液和磁石洗涤1次，最后以成为4x10⁷个珠/ml的方式悬浮于清洗缓冲液。将制作的Dynabeads/抗体/Fc复合物于4℃保存，在后续实验中使用。

将CD8阳性T细胞与Dynabeads/抗CD3抗体/PVR-Fc混合，在5％CO₂、37℃条件下培养3天后，回收培养上清液，用ELISA法测定IFNγ(Biolegend)、颗粒酶(GranzymeB)(Mabtech)、穿孔素(Mabtech)的产生量。另外，回收细胞，用抗CD3抗体-APCCy7、抗CD8抗体-BV421、抗CD4抗体-BV510(全部为Biolegend)染色，与CFSE一同用FACS进行检测，基于CFSE的稀释比例定量分析出细胞增殖的比例。将结果示于图6。根据图6，CD8阳性T细胞的增殖及细胞因子(IFNγ、颗粒酶B、穿孔素)的产生量以依赖PVR-Fc量的方式被抑制。根据这些结果，暗示了PVR介由与作为其配体的TIGIT结合而抑制CD8阳性T细胞的激活，以及抗TIGIT激动性(agonistic)抗体抑制CD8阳性T细胞的激活。

实施例3：对Tfh细胞造成的效果

使用Lymphoprep(Axis-Shield)将采血至肝素采血管(TERUMO，Tokyo，Japan)中的血液制成PBMC。此外，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)对CD4+T细胞进行阴性选择。使用各种抗体对细胞表面进行染色，用FACSAria III流式细胞仪划分成以下的各细胞群。Tfh；CD45RA-CXCR5+，初始T；CD45RA+CXCR5-，non-Tfh；CD45RA-CXCR5-。

将所得到的CD4+初始T细胞、Tfh细胞以1×10⁴/孔置于96孔U培养板，加入与细胞相同量的Dynabeads人T-激活剂CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific)，开始培养。各细胞在相同条件中以4孔开始培养，在24小时、48小时、72小时、96小时后，使用FACSVerse流式细胞仪分析细胞上的TIGIT表达。使用FlowJo软件版本10.4.2(FlowJo，OR，USA)对细胞增殖进行分析。

结果如图7-1a所示，原本TIGIT表达高的Tfh细胞因刺激而使TIGIT表达进一步上升，相对于此，TIGIT表达低的初始T细胞没有确认到TIGIT表达因刺激而上升。

另外，用2μM的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific)将各细胞于37℃染色7分钟，进行洗涤，在以10μg/ml固定化有抗CD3抗体2μg/ml、抗CD28抗体1μg/ml、及同型(小鼠IgG1)或抗TIGIT激动性抗体的96孔平底培养板中进行96小时培养。死细胞用7-氨基放线菌素D进行染色并除去，使用FACSVerse流式细胞仪分析活细胞。使用FlowJo软件版本10.4.2(FlowJo，OR，USA)对细胞增殖进行分析。

结果如图7-1b所示，在Tfh细胞中，增殖因抗TIGIT激动性抗体刺激而被显著抑制，相对于此，初始T细胞中未确认到抑制效果。即，显示出抗TIGIT激动性抗体针对TIGIT表达高的细胞的选择性增殖抑制效果。

在CD4+初始T细胞、Tfh细胞之外，对non-Tfh细胞也与上述同样地调查了细胞上的TIGIT表达。其结果是，non-Tfh细胞中确认到Tfh细胞与初始T细胞的中间程度的TIGIT表达(图7-2a)。

另外，利用与上述同样的使用了CellTrance violet的流式细胞术分析，对Tfh细胞与non-Tfh细胞比较了抗TIGIT激动性抗体的增殖抑制效果，结果可知，该抗体虽然对non-Tfh细胞也显示增殖抑制效果，但对Tfh细胞更具选择性地显示抑制效果(图7-2b)。

实施例4：Tfh细胞对B细胞带来的效果

使用Lymphoprep(Axis-Shield)将采血至肝素采血管(TERUMO，Tokyo，Japan)中的血液制成PBMC。进一步，使用CD19 Microbeads对CD19+细胞进行阳性选择。使用各种抗体对细胞表面进行染色，用FACSAria III流式细胞仪分成以下的各细胞群。记忆B；CD19+CD27+，效应T；CD25-CD45RA-(关于Tfh细胞，用实施例3的方法分离)。

将Tfh细胞在以10μg/ml固定化有同型(小鼠IgG1)或抗TIGIT激动性抗体的96孔U培养板中进行37℃、30分钟培养。向其中加入记忆B细胞，用混合有0.2μg/ml的葡萄球菌肠毒素B(Sigma)的培养基培养1周。死细胞用7-氨基放线菌素D进行染色并除去，使用FACSVerse流式细胞仪分析活细胞。使用FlowJo软件版本10.4.2(FlowJo，OR，USA)分析浆细胞的比例，使用人IgG ELISA kit(Bethyl)测定培养上清液中的IgG。

结果如图8所示，在与经抗TIGIT激动性抗体刺激后的Tfh细胞共培养的组中抑制了浆细胞的增殖，还抑制了IgG的产生。

实施例5：对Treg细胞带来的效果

使用Lymphoprep(Axis-Shield)将采血至肝素采血管(TERUMO，Tokyo，Japan)中的血液制成PBMC。进一步地，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)对CD4+T细胞进行阴性选择。使用各种抗体对细胞表面进行染色，用FACSAria III流式细胞仪划分为以下的各细胞级分(关于效应(Effector)，经过96小时后)。Treg(FrI)；CD25+CD45RA+，Treg(FrII)；CD25+CD45RA-，效应T(Effector T)；CD25-CD45RA-，非Treg应答CD4+T细胞；CD25-。

将所得到的Treg细胞(FrI)在以10μg/ml固定化有抗CD3抗体2μg/ml，抗CD28抗体1μg/ml，及同型(小鼠IgG1)或抗TIGIT激动性抗体的96孔平底培养板中，用加入有IL-2(R&D)10ng/ml的培养基进行6小时培养。另一方面，使用实施例2同样的方法，用CellTraceviolet(CTV；Thermo Fisher Scientific)对经过96小时后进行分级而得的CD4+效应T细胞进行染色，洗涤，与经激活处理的Treg细胞以1:1(各1×10⁴)进行96小时培养。死细胞用7-氨基放线菌素D染色并除去，使用FACSVerse流式细胞仪分析活细胞。使用FlowJo软件版本10.4.2(FlowJo，OR，USA)对细胞增殖进行分析。

结果如图9-1所示，经抗TIGIT激动性抗体刺激后的Treg细胞抑制了效应T细胞的增殖。抗TIGIT激动性抗体对Treg细胞的刺激作用于Treg细胞的激活。

与上述同样地，将Treg细胞(FrI)或Treg细胞(FrII)在同型(小鼠IgG1)或抗TIGIT激动性抗体的存在下、用抗CD3抗体及抗CD28抗体刺激6小时。用CTV标记非Treg应答CD4+T细胞(CD25-)，与经激活处理的各Treg细胞级分以1:1(各1×10⁴)的比例进行96小时共培养。然后，与上述同样地以CTV荧光的稀释为指标对应答T细胞的细胞增殖进行分析。其结果是，任意的Treg细胞级分均抑制了应答T细胞的增殖，但在抗TIGIT激动性抗体的存在下激活各Treg细胞级分时，Treg细胞的激活被进一步增强，尤其是在作为初始Treg细胞而为人所知的Treg(FrI)中，该效果更为显著(图9-2)。

实施例6：对咪喹莫特诱发狼疮模型小鼠带来的效果

购入6-8周龄的雌性C57BL/6JJcl小鼠(日本CLEA)。，使其与按照常规方法制作的敲入有人TIGIT(hTIGIT)基因的同品系小鼠交配，使用得到的同代的纯合子型、野生型的hTIGIT敲入小鼠。实验均在庆应义塾大学医学部动物房中进行，按照与庆应义塾大学医学部中的动物实验等相关的章程实施。

在10-12周龄的雌性的TIGIT-KI小鼠的右耳廓每周3次以50mg/kg涂布5％咪喹莫特乳霜(持田制药)，由此制作咪喹莫特诱发狼疮模型小鼠。施予实验如下进行。均为每周施予2次。分为3组，在开始后第42天进行分析。

未涂布：未涂布咪喹莫特/以300μg/ml腹腔内施予同型(mIgG1)

抗TIGIT：涂布咪喹莫特/以300μg/ml腹腔内施予抗TIGIT激动性抗体

同型：涂布咪喹莫特/以300μg/ml腹腔内施予同型(mIgG1)

摘取小鼠脾脏并测量重量。将脾脏切碎并通过40μm的细胞滤网，使用HLB溶液(IBL)进行溶血处理，测定总脾细胞数。使用抗CD16/CD32(BD Biosciences)将小鼠脾细胞于4℃培养5分钟，进行20分钟表面染色。就染色时的培养基而言，使用向PBS混合了0.5％BSA和2mM EDTA而成的培养基。各细胞以下述方式定义：Tem；CD44+CD62L-，Tfh；CXCR5+PD-1+，浆细胞；CD19-CD138+，GC B细胞；CD95+GL7+。分析时，采集血液，用“LBIS抗dsDNA-小鼠ELISA试剂盒”(SHIBAYAGI公司制)测定血中的抗dsDNA抗体效价。

结果如图10所示，在抗TIGIT激动性抗体施予组中抑制了脾肿大、及淋巴细胞的增殖。如图11-1所示，抗TIGIT激动性抗体的施予显著地抑制了B细胞中的浆细胞的比例的增大。另外，针对T细胞中的活化T细胞的比例、CD4阳性T细胞中的CD4+效应或记忆T(Effectoror memory T)(Tem)细胞、Tfh细胞的比例、B细胞中的生发中心B细胞的比例的增大、抗dsDNA抗体的产生的增多也显示出抑制倾向。增加小鼠的个体数进行了同样的实验，结果，抗TIGIT激动性抗体相对于同型，显著地抑制了CD4阳性T细胞中的Tem细胞、Tfh细胞的比例、B细胞中的生发中心B细胞的比例、及脾细胞中的浆细胞的比例的增大、以及抗dsRNA抗体产生的增多(图11-2)。

如上所述，抗TIGIT激动性抗体抑制了由疾病导致的淋巴细胞的增殖、尤其是活化T细胞的增殖。此外，培养实验中的结果是，同样抑制了由Tfh细胞介导的B细胞的激活。

实施例7：对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis：EAE)小鼠带来的效果

对12周龄的雄性TIGIT-KI小鼠皮下注射200μg的MOG_35-55肽(Synpeptide，Shanghai，China)和向弗氏(Freund’s)不完全佐剂中加入400μg的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)而成的物质(Difco Laboratories)，进一步在当天、及第2天腹腔内施予400ng百日咳毒素(List Biologicals)。诱导开始第0天、第2天、第4天、第10天、第17天腹腔内施予100μg的抗TIGIT激动性抗体或同型(mIgG1)。接连几天用以下的方法测定临床评分，在第30天进行分析(第0天，无变化；第1天，尾部肌力下降；第2天，尾部麻痹；第3天，后肢肌力下降；第4天，前肢肌力下降；第5天，前肢麻痹；第6天，濒死或死亡)。就浸润至脑、脊髓、脾脏的细胞的分析而言，使用各种抗体并用流式细胞术进行分析。

结果如图12所示，在抗体施予组中，EAE的临床评分降低。如图13所示，抗体施予组中，在脑、脊髓、脾脏中也均确认到促进Treg细胞的增殖的倾向。

结果·考察

根据以上的结果，在体外、体内均证明了抗TIGIT激动性抗体对Tfh细胞的抑制效果、及对B细胞的由Tfh细胞介导的抑制效果。针对Treg细胞，确认到抗TIGIT激动性抗体在体外实际上显示针对效应T细胞的抑制效果、在体内也暗示可通过施予本抗体而促进Treg细胞的增殖的结果。使用了疾病模型动物的研究确认到本抗体的有效性。以上的效果均是以往的抗体未曾观察到的效果。在免疫·炎症性疾病中抑制活化T细胞、激活Treg细胞，作为治疗药而言是合乎道理的，今后可能会广泛成为人的免疫·炎症性疾病治疗药。

产业上的可利用性

根据本发明，可激活人TIGIT介导的信号，由此能够抑制Tfh细胞及激活Treg细胞，因此对免疫·炎症性疾病的预防或治疗而言是有用的。

本申请以于2020年10月9日在日本提出申请的日本特愿2020-171278为基础，通过在此提及而将其内容全部并入本说明书中。

Claims (19)

1.免疫·炎症性疾病治疗药，其以激活抑制性免疫检查点分子(TIGIT)的抗人TIGIT抗体为有效成分。

2.如权利要求1所述的治疗药，其具有Tfh细胞抑制作用。

3.如权利要求1或2所述的治疗药，其具有Treg细胞激活作用。

4.如权利要求1至3中任一项所述的治疗药，其中，免疫·炎症性疾病选自由类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、IgG4相关性疾病、高安氏动脉炎、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、ANCA相关性血管炎、混合性结缔组织病、脊柱关节炎、贝赫切特综合征、成人斯蒂尔病、多发性硬化症、视神经脊髓炎、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、溃疡性大肠炎、克罗恩病、干癣(干癣性关节炎)、寻常型白癜风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张型心肌病、1型糖尿病、巴泽窦氏病、桥本病、IgA肾病、膜性肾病、溶血性贫血、及特发性血小板减少性紫癜组成的组。

5.如权利要求1至4中任一项所述的治疗药，其中，抗人TIGIT抗体为与人TIGIT(序列号1)进行结合的抗体。

6.如权利要求5所述的治疗药，其中，抗体中，

a)重链可变区的第三CDR包含序列号4的氨基酸序列，且，

b)轻链可变区的第三CDR包含序列号6的氨基酸序列。

7.如权利要求5所述的治疗药，其中，抗体包含下述a)及b)，

a)包含下述CDR的重链可变区：

i)包含序列号2的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含序列号3的氨基酸序列的第二CDR，

b)包含下述CDR的轻链可变区：

i)包含序列号5的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸的氨基酸序列的第二CDR。

8.如权利要求5所述的治疗药，其中，抗体还包含Fc结构域。

9.如权利要求8所述的治疗药，其中，所述Fc结构域来源于人。

10.如权利要求8或9所述的治疗药，其中，所述Fc结构域是突变Fc结构域。

11.抗体，其中，

a)重链可变区的第三CDR包含序列号4的氨基酸序列，且，

b)轻链可变区的第三CDR包含序列号6的氨基酸序列。

12.如权利要求11所述的抗体，其与人TIGIT(序列号1)进行结合。

13.如权利要求11所述的抗体，其包含下述a)及b)，

a)包含下述CDR的重链可变区：

i)包含序列号2的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含序列号3的氨基酸序列的第二CDR，

b)包含下述CDR的轻链可变区：

i)包含序列号5的氨基酸序列的第一CDR；

ii)包含酪氨酸-丙氨酸-丝氨酸的氨基酸序列的第二CDR。

14.如权利要求11所述的抗体，其还包含Fc结构域。

15.如权利要求14所述的抗体，其中，所述Fc结构域来源于人。

16.如权利要求14所述的抗体，其中，所述Fc结构域是突变Fc结构域。

17.经分离的核酸，其编码权利要求11所述的抗体。

18.宿主细胞，其含有权利要求17所述的经分离的核酸。

19.权利要求11所述的抗体的制造方法，所述方法包括在制造所述抗体的条件下培养权利要求18所述的宿主细胞的步骤。

Images