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CN116396875A - 一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 Download PDF

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CN116396875A CN202211649119.2A CN202211649119A CN116396875A CN 116396875 A CN116396875 A CN 116396875A CN 202211649119 A CN202211649119 A CN 202211649119A CN 116396875 A CN116396875 A CN 116396875A
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China
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gene
cgkcs
plasmid
genetically engineered
yarrowia lipolytica
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CN202211649119.2A
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韦柳静
冯鑫
赵鑫茹
杨敬林
王磊
花强
陈骏
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East China University of Science and Technology
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East China University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。所述基因工程菌为在解脂耶氏酵母Po1f中敲除基因PEX10、并表达来源于高山被孢霉菌的C16/18延长酶基因MaELO3、来源于拟南芥的延长酶基因AtKCS和来源于海甘蓝的延长酶基因CraKCS的菌株，所述基因工程菌还表达来源于碎米荠属的延长酶基因CgKCS。进一步表达来源于高山被孢霉菌的去饱和酶基因MaD15D，并过表达菌株自身的二酰基甘油转移酶基因DGA1和其自身的Δ9去饱和酶基因OLE1后，在摇瓶发酵中神经酸的产量为111.6mg/L，通过外源添加1％的菜籽油，神经酸的产量可以达到185.1mg/L。本发明构建的解脂耶氏酵母基因工程菌，其操作简便，性能稳定可靠，能够应用于大规模的商业化生产。

Description

一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
背景技术
神经酸(C24H46O2)是一种超长链单不饱和脂肪酸，根据不饱和键的位置和碳链长度，命名为顺式15-二十四烯酸或ω-9二十四烯酸。神经酸是神经纤维以及神经细胞的核心成分，同时也是大脑生长和发育所必需的脂肪酸。神经酸最早在哺乳动物鲨鱼大脑中分离出来，因此也被称为鲨鱼油酸或鲨胆油酸。鲨鱼的大脑在受到严重损伤后，可以在短时间内自我修复，也是因为神经酸对受损脑组织中，神经纤维的修复和再生具有促进作用。神经酸具有的高价值的生物功能，使其在药理和营养方面的应用中发挥重要作用。
神经酸通过从动植物组织中提取或者化学合成法获得，动物来源的神经酸主要来自海洋生物。由于神经酸的市场价值和商业价值，在过去很长一段时间，发达国家是通过捕杀大量的鲨鱼来获取神经酸。出于对鲨鱼的保护禁止捕捞，神经酸资源出现短缺。利用化学合成法，以顺-13-十二烷基甲酯为前体合成神经酸，结果神经酸产率低，而且副产物多。因此，商业上的神经酸大部分来源于植物。研究表明一些野生植物的种子油中存在神经酸，但由于受生长周期、生存环境和数量的限制，使天然植物来源的神经酸的提取受限。
随着基因工程的发展，实现通过工程化改造植物、微藻和微生物来生产神经酸，使神经酸的大规模生产成为潜在可能。相比于酿酒酵母，解脂耶氏酵母作为一种产油酵母，能够高水平生产脂肪和油脂，并合成脂肪酸，可以为神经酸提供充足的脂肪酸前体，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株，是神经酸合成的优势基因工程菌。
目前，一般通过外源引入神经酸合成途径相关基因来进行工程化改造，但神经酸的合成途径非常复杂、涉及众多相关基因，且不同物种来源的神经酸合成途径相关基因配合不同的底盘菌生产神经酸的效果也不同。如前所述，神经酸广泛存在于各种动、植物和微生物中，因此，目前亟需在现有海量的不同物种来源的神经酸合成途径相关基因中筛选到适合解脂耶氏酵母提高神经酸生产水平的基因。
发明内容
为解决现有技术中利用解脂耶氏酵母生产神经酸的产量不高的问题，本发明构建了能够表达脂肪酸延长酶基因AtKCS、CraKCS、MaELO3和CgKCS的解脂耶氏酵母，使其有效产超长链脂肪酸(VLCFAs)。
在此基础上，过表达了两拷贝的延长酶基因(CgKCS)及去饱和酶基因(MaD15D)的融合表达形式CgKCS-L-MaD15D、Δ9去饱和酶(OLE1)和二酰基甘油转移酶基因(DGA1)的融合表达形式OLE1-L-DGA1和二酰基甘油转移酶基因(DGA1)基因，成功获得了产神经酸的解脂耶氏酵母生产菌株。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的基因工程菌，所述基因工程菌为在解脂耶氏酵母Po1f中敲除基因PEX10，并表达来源于高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的C16/18延长酶基因MaELO3、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延长酶基因AtKCS和来源于海甘蓝(Crambeabyssinica)的延长酶基因CraKCS的菌株，所述基因工程菌还表达来源于碎米荠属(Cardamine graeca)的延长酶基因CgKCS。
本发明所述解脂耶氏酵母Po1f为现有已知基因改造酵母，其基因型为MatA，leu2-270，ura3-302，xpr2-322，axp-2；表型为Leu-，Ura-，DAEP，DAXP，Suc+。
本发明所述基因PEX10为解脂耶氏酵母Po1f中与β氧化相关的基因。
如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因CgKCS；或，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因CgKCS和2个拷贝的所述延长酶基因CgKCS和来源于高山被孢霉菌的去饱和酶基因MaD15D的融合基因CgKCS-L-MaD15D。
在本发明的具体实施方案中，所述融合基因CgKCS-L-MaD15D为通过NEB连接酶将linker插入到所述延长酶基因CgKCS和所述去饱和酶基因MaD15D中，使其使用同一套启动子和终止子，所述linker为本领域常规。
融合酶可以减少合成途径中中间物的积累，本发明将延长酶CgKCS和去饱和酶MaD15D融合来促进神经酸的产生，以减少其他超长链脂肪酸的生成。虽然本发明将所述延长酶基因CgKCS和所述去饱和酶基因MaD15D进行融合，但本领域技术人员能够合理预期，即便将这两个基因拆开，分别转入菌株的基因组单独表达，也能提升菌株产神经酸的产量。
如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌还过表达其自身的二酰基甘油转移酶基因DGA1。
在本发明的优选实施方案中，所述基因工程菌共含有2个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因DGA1。即菌株本身含有1个拷贝DGA1，再额外转入1个拷贝DGA1。
如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌共含有2个拷贝其自身的二酰基甘油转移酶基因DGA1，还含有1个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因DGA1和其自身的Δ9去饱和酶基因OLE1的融合基因OLE1-L-DGA1。即菌株本身含有1个拷贝DGA1，再额外转入1个拷贝DGA1和1个拷贝融合基因OLE1-L-DGA1。
二酰基甘油转移酶DGA1可以促进C22:0、C24:0脂肪酸积累，Δ9去饱和酶OLE1有利于C24:1的形成，经过发明人多次实验，多拷贝一个DGA1和一个OLE1-L-DGA1是最有利于神经酸(C24:1)生产的。
在本发明的具体实施方案中，融合基因OLE1-L-DGA1为通过NEB连接酶将linker插入到所述二酰基甘油转移酶基因DGA1和所述Δ9去饱和酶基因OLE1中，使其使用同一套启动子和终止子，所述linker为本领域常规。
融合酶可以减少合成途径中中间物的积累，本发明将二酰基甘油转移酶DGA1和Δ9去饱和酶OLE1融合来促进神经酸的产生，以减少其他超长链脂肪酸的生成。虽然本发明将所述二酰基甘油转移酶基因DGA1和所述Δ9去饱和酶基因OLE1进行融合，但本领域技术人员能够合理预期，即便将这两个基因拆开，分别转入菌株的基因组单独表达，也能提升菌株产神经酸的产量。
如技术方案之一所述的基因工程菌，所述C16/18延长酶基因MaELO3的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；和/或，所述延长酶基因AtKCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；和/或，所述延长酶基因CraKCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示；和/或，所述延长酶基因CgKCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36所示；和/或，所述二酰基甘油转移酶基因DGA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；和/或，所述融合基因CgKCS-L-MaD15D的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；和/或，所述融合基因OLE1-L-DGA1的核苷酸序列如SEQ IDNO:40所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种如技术方案之一所述的基因工程菌的构建方法，所述构建方法包含将待表达基因整合至解脂耶氏酵母的基因组中，所述整合的方法为在解脂耶氏酵母中转入包含待表达基因的整合表达质粒；和/或，所述构建方法基于CRISPR/Cas9操作系统。
如技术方案之二所述的构建方法，当所述构建方法基于CRISPR/Cas9操作系统时，包含如下步骤：
(1)构建含有donor质粒和sgRNA质粒的质粒对，所述donor质粒含有待表达基因，所述sgRNA质粒含有靶向基因组上待整合位点的sgRNA序列。
(2)将所述质粒对同时转化到解脂耶氏酵母中，筛选获得目的菌株。
如技术方案之二所述的构建方法，所述donor质粒或所述整合表达质粒中的待表达基因的启动子为UAS4B+TEF；和/或，所述donor质粒的骨架为pHR_hrGFP；和/或，所述sgRNA质粒的骨架为pCRISPRyl；和/或，所述整合表达质粒的骨架为pINA1269或p3204。
在本发明的优选实施方案中，所述donor质粒为包含所述延长酶基因CgKCS或所述融合基因CgKCS-L-MaD15D的pHR_hrGFP质粒，所述整合表达质粒为包含所述二酰基甘油转移酶基因DGA1的pINA1269质粒或包含所述融合基因OLE1-L-DGA1的p3204质粒。
在本发明中，所述启动子UAS4B+TEF为由来源于质粒PINA1312的启动子hp4d中的增强子部分UAS4B和来源于解脂耶氏酵母菌Polf中DNA的强启动子TEF组成的启动子，其具体构建方法参见专利CN 107815425 A。
在本发明中，所述pHR_hrGFP指代的是包含质粒pHR_A3_hrGFP、pHR_F1-3_hrGFP、pHR_AXP_hrGFP、pHR_F1_hrGFP、pHR_A1-2_hrGFP和pHR_E1-3_hrGFP在内的质粒的统称；所述pCRISPRyl指代的是包含质粒pCRISPRyl_A3、pCRISPRyl_F1-3、pCRISPRyl_AXP、pCRISPRyl_F1、pCRISPRyl_A1-2和pCRISPRyl_E1-3在内的质粒的统称；其中，A3、F1-3、AXP、F1、A1-2和E1-3分别对应于解脂耶氏酵母基因组中特定的基因位点。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种生产神经酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵如技术方案之一所述的基因工程菌，并从中分离得到神经酸；所述培养基优选YPD培养基。
在本发明的较佳实施方案中，所述培养基中还额外添加油脂或油酸；所述油脂优选菜籽油。
在本发明的更佳实施方案中，所述菜籽油添加的体积百分比为1％。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之一所述的基因工程菌在生产神经酸中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果为(1)神经酸的产量高：本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌NA06构建方法简便，通过发酵可以高产神经酸，能使神经酸在50mL摇瓶中达到111.6mg/L的产量，具有良好的应用前景。(2)通过对其合成前体的加入，在添加1％的菜籽油时，本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌NA06能使神经酸在50mL摇瓶中达到185.1mg/L的产量。(3)其构建方法简便，通过CRISPR/Cas9及整合型质粒回补筛选标记的方式仅仅导入4个基因(CgKCS、CgKCS-L-MaD15D、DGA1、DGA1-L-OLE1)，获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够应用于大规模的商业化生产，前景良好。
附图说明
图1为引入延长酶基因和神经酸合成酶基因后，解脂耶氏酵母生成神经酸的代谢途径。
图2为产神经酸菌株的摇瓶发酵结果图。
图3A为不同种类的油/油酸的添加对神经酸(即C24:1)产量的影响。
图3B为不同的菜籽油添加浓度对神经酸(即C24:1)产量的影响。
图3C为菌株NA06在是否添加1％菜籽油的条件下，发酵产神经酸(即C24:1)的结果。
图4为未经过密码子优化的CgKCS基因与经过密码子优化的CgKCS-opt基因生产超长链脂肪酸对比图，其中C24:1指代神经酸。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本申请所用的解脂耶氏酵母是在专利CN 111979135 A中能够有效生产LCFAs的菌株GQ07(对应于本发明的NA02，其是在解脂耶氏酵母Po1f中敲除PEX10基因，并表达来自拟南芥的延长酶基因AtKCS、海甘蓝的延长酶基因CraKCS、和高山被孢霉菌的C16/18延长酶基因MaELO3)的基础上，为提升神经酸的产量，本发明进一步过表达碎米荠属的延长酶基因CgKCS以及CgKCS-opt，探究密码子优化对基因CgKCS的影响；进一步过表达延长酶基因(CgKCS-opt)及去饱和酶基因(MaD15D)的融合表达形式CgKCS-opt-L-MaD15D、Δ9去饱和酶(OLE1)和二酰基甘油转移酶基因(DGA1)的融合表达形式OLE1-L-DGA1、和二酰基甘油转移酶基因(DGA1)基因最终得到产神经酸的解脂耶氏酵母工程菌(参见图1)。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明涉及的菌株和质粒来源如下：
1、解脂耶氏酵母Po1f，质粒pINA1269：根据Madzak,C.,Treton,B.,Blanchin-Roland,S.2000.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretionvectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in theyeast Yarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol,2(2),207-216所记载的制备方法制得。
2、质粒pINA1312：参见Nicaud,J.M.,Madzak,C.,van den Broek,P.,Gysler,C.,Duboc,P.,Niederberger,P.,Gaillardin,C.2002.Protein expression and secretionin the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res,2(3),371-379所记载的制备方法制得。
3、质粒pCRISPRyl_F1和pHR_F1_hrGFP、pCRISPRyl_A3和pHR_A3_hrGFP、pCRISPRyl_F1-3和pHR_F1-3_hrGFP、pCRISPRyl_AXP和pHR_AXP_hrGFP、pCRISPRyl_A1-2和pHR_A1-2_hrGFP、pCRISPRyl_E1-3和pHR_E1-3_hrGFP：参见Zhang,X.K.，Wang,D.N.，Chen,J.，Liu,Z.J.，Wei,L.J.，Hua,Q.2020.Metabolic engineering of beta-carotenebiosynthesis in Yarrowia lipolytica.Biotechnol Lett，42(6)，945-956所记载的制备方法制得。
4、质粒p3204：在pINA1312的基础上将启动子替换为UAS4B+TEF。解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10：在解脂耶氏酵母Po1f的基础上敲除了PEX10基因。参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of FattyAcid Ethyl Esters by the Oleaginous Yeast Yarrowia lipolytica throughMetabolic Engineering and Process Optimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得。
5、质粒pHR_F1_MaELO3和p32UTMaELO3：含有来源于高山被孢霉菌的C16/18延长酶基因MaELO3。质粒pHR_A3_AtKCS和p32UTAtKCS：含有来源于拟南芥的延长酶基因AtKCS。质粒pHR_F1-3_CraKCS和p32UTCraKCS：含有来源于海甘蓝的延长酶基因CraKCS。质粒pHR_AXP_CgKCS和p32UTCgKCS：同时含有来源于碎米荠属的延长酶基因CgKCS。质粒pHR_AXP_CgKCS-opt和p32UTCgKCS-opt：同时含有来源于碎米荠属并经密码子优化的延长酶基因CgKCS-opt。质粒pHR_A1-2_CgKCS-opt-L-MaD15D、pHR_E1-3_CgKCS-opt-L-MaD15D和p32UTCgKCS-opt-L-MaD15D:含有来源于碎米荠属的延长酶基因CgKCS-opt和来源于高山被孢霉菌的去饱和酶基因MaD15D。质粒p32UTOLE1-L-DGA1：含有来源于解脂耶氏酵母内源的Δ9去饱和酶基因OLE1和二酰基甘油转移酶基因DGA1。质粒p69DGA1和p32DGA1：含有来源于解脂耶氏酵母内源二酰基甘油转移酶基因DGA1。
构建上述质粒的引物序列如表1所示。
表1质粒对的引物序列
Figure SMS_1
以下实施例中延长酶基因CgKCS为未经密码子优化的基因(核苷酸序列如SEQIDNO:33所示)，延长酶基因AtKCS，CraKCS，CgKCS-opt和MaELO3均指优化后的AtKCS，CraKCS，CgKCS和MaELO3基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示。二酰基甘油转移酶基因DGA1的优化序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:38所示，融合基因CgKCS-opt-L-MaD15D的核苷酸序列如SEQ IDNO:39所示，融合基因OLE1-L-DGA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
实施例1构建产长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌
(1)延长酶基因AtKCS，CraKCS，CgKCS-opt和MaELO3表达质粒p32UTAtKCS，p32UTCraKCS、p32UTCgKCS-opt和p32UTMaELO3的构建。依次使用引物32UTAtKCS-f和32UTAtKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1～2所示)、32UTCraKCS-f和32UTCraKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:3～4所示)、32UTCgKCS-opt-f和32UTCgKCS-opt-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:5～6所示)、32UTMaELO3-f和32UTMaELO3-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:7～8所示)将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延长酶基因AtKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)、海甘蓝(Crambe abyssinica)的延长酶基因CraKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQID NO:35所示)、碎米荠属(Cardamine graeca)的延长酶基因CgKCS-opt的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示)和高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的C16/18延长酶基因MaELO3的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，依次得到质粒p32UTAtKCS、p32UTCraKCS、p32UTCgKCS-opt和p32UTMaELO3。其中，密码子优化过的AtKCS，CraKCS，CgKCS-opt和MaELO3基因是通过分别将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，海甘蓝(Crambe abyssinica),碎米荠属(Cardamine graeca)和高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的AtKCS，CraKCS，CgKCS-opt和MaELO3的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，构建含有启动子为UAS4B+TEF的优化的MaELO3基因的donor质粒pHR_F1_MaELO3以及启动子为UAS8B+TEF优化的AtKCS基因的donor质粒pHR_A3_AtKCS、优化的CraKCS基因的donor质粒pHR_F1-3_CraKCS和优化的CgKCS-opt基因的donor质粒pHR_AXP_CgKCS-opt。分别依次与sgRNA质粒pCRISPRyl_F1、pCRISPRyl_A3、pCRISPRyl_F1-3和pCRISPRyl_AXP可以组成一对敲入质粒对。
本实施例中的敲入质粒对为本领域常规的重组载体，其中sgRNA质粒中含有亮氨酸筛选标记，donor质粒中含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，该敲入质粒对能够依次敲入上述优化的MaELO3基因、AtKCS基因、CraKCS基因和CgKCS-opt基因。
具体步骤如下：
(1)首先需要获得目的基因的表达盒，依次使用引物依次使用引物32UTAtKCS-f和32UTAtKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1～2所示)、32UTCraKCS-f和32UTCraKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:3～4所示)、32UTCgKCS-opt-f和32UTCgKCS-opt-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:4～6所示)、32UTMaELO3-f和32UTMaELO3-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:7～8所示)获取对应p32UTAtKCS、p32UTCraKCS、p32UTCgKCS-opt和p32UTMaELO3质粒的相应“AtKCS”、“CraKCS”、“CgKCS-opt”通过酶切位点NheI和pteI分别依次构建到质粒pHR_A3_hrGFP、pHR_F1-3_hrGFP、pHR_AXP_hrGFP、pHR_F1_hrGFP中，得到质粒pHR_A3_AtKCS、pHR_F1-3_CraKCS、pHR_AXP_CgKCS-opt。“UAS4B+TEF-MaELO3”片段，通过酶切位点NheI和BssHII，得到质粒pHR_F1_MaELO3。
(4)将步骤(3)中所得的质粒pHR_F1_MaELO3和sgRNA质粒pCRISPRyl_F1同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10中，将筛选标记进行回收后获得菌株GQ06，经验证，菌株GQ06中敲入MaELO3基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(5)将步骤(3)中所得的质粒pHR_A3_AtKCS和sgRNA质粒pCRISPRyl_A3同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3中，将筛选标记进行回收后获得菌株NA01，经验证，菌株NA01中敲入AtKCS基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(6)将步骤(3)中所得的质粒pHR_F1-3_CraKCS和sgRNA质粒pCRISPRyl_F1-3同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS中，将筛选标记进行回收后获得菌株NA02(即专利申请CN 111979135 A中的菌株GQ07)，经验证，菌株NA02中敲入CraKCS基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(7)将步骤(3)中所得的质粒pHR_AXP_CgKCS-opt和sgRNA质粒pCRISPRyl_AXP同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS-F1-3CraKCS中，将筛选标记进行回收后获得菌株NA03，经验证，菌株NA03中敲入CgKCS-opt基因。其中，转化使用试剂盒FrozenEZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
实施例2构建产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌
(1)延长酶基因及去饱和酶基因的融合表达形式CgKCS-opt-L-MaD15D，内源的Δ9去饱和酶OLE1和DGA1融合表达形式OLE1-L-DGA1和二酰基甘油转移酶基因DGA1的表达质粒p32UTCgKCS-opt-L-MaD15D，p32UTOLE1-L-DGA1、p32DGA1、p69DGA1的构建。依次使用引物32UTCgKCS-opt-L-MaD15D-f和32UTCgKCS-opt-L-MaD15D-r(核苷酸序列分别如序列表SEQID NO:21～22所示)、32UTOLE1-L-DGA1-f和32UTOLE1-L-DGA1-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:23～24所示)、69-DGA1-f和69-DGA1-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:25～26所示)、32DGA1-f和32DGA1-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:27～28所示)、将来源于碎米荠属(Cardamine graeca)的延长酶基因CgKCS-opt和来源于高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的去饱和酶基因MaD15D的优化序列的融合基因CgKCS-opt-L-MaD15D(其核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示)，解脂内源的Δ9去饱和酶OLE1和二酰基甘油转移酶基因DGA1的优化序列的融合基因OLE1-L-DGA1(其核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示)，以及二酰基甘油转移酶基因DGA1的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示)，通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，依次得到质粒p32UTCgKCS-opt-L-MaD15DCgKCS-opt-L-MaD15D，p32UTOLE1-L-DGA1、p32DGA1和pINA69。其中，密码子优化过的CgKCS-opt和MaD15D基因是通过分别将来源于拟南碎米荠属(Cardamine graeca)和高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的CgKCS-opt和MaD15D的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，分别构建含有优化的CgKCS-opt-L-MaD15D基因的donor质粒pHR_A1-2_CgKCS-opt-L-MaD15D和pHR_E1-3_CgKCS-opt-L-MaD15D。分别依次与sgRNA质粒pCRISPRyl_A1-2、pCRISPRyl_E1-3可以组成一对敲入质粒对。
本实施例中的敲入质粒对为本领域常规的重组载体，其中sgRNA质粒中含有亮氨酸筛选标记，donor质粒中含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，该敲入质粒对能够依次敲入上述优化的CgKCS-opt-L-MaD15D基因。
具体步骤如下：
(1)首先需要获得目的基因，依次使用引物32UTCgKCS-opt-L-MaD15D-f和32UTCgKCS-opt-L-MaD15D-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1～2所示)、获取p32UTCgKCS-opt-L-MaD15D质粒的“CgKCS-opt-L-MaD15D”片段。通过酶切位点NheI和BssHII分别构建到质粒pHR_A1-2_hrGFP、pHR_E1-3_hrGFP中，得到质粒pHR_A1-2_CgKCS-opt-L-MaD15D、pHR_E1-3_CgKCS-opt-L-MaD15D。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_A1-2_CgKCS-opt-L-MaD15D和sgRNA质粒pCRISPRyl_A1-2同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS-F1-3CraKCS-AXPCgKCS-opt中，将筛选标记进行回收后获得菌株NA04，经验证，菌株NA04中敲入CgKCS-opt-L-MaD15D基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(3)将步骤(1)中所得的质粒pHR_E1-3_CgKCS-opt-L-MaD15D和sgRNA质粒pCRISPRyl_E1-3同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS-F1-3CraKCS-AXPCgKCS-opt-A1-2CgKCS-opt-L-MaD15D中，将筛选标记进行回收后获得菌株NA05，经验证，菌株NA05中敲入CgKCS-opt-L-MaD15D基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ YeastTransformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(4)将步骤(1)中所得的质粒p32UTOLE1-L-DGA1和p69DGA1质粒转化入解脂耶氏酵母NA05中，获产得神经酸的解脂耶氏酵母菌株NA06。
(5)将步骤(1)中所得的质粒p32DGA1质粒转化入解脂耶氏酵母NA03中，获产得神经酸的解脂耶氏酵母菌株NA07。
所述的质粒p32DGA1的构建步骤为：将来源于解脂耶氏酵的DGA1基因，通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32DGA1，所述DGA1基因的核苷酸序列如SEQID NO:38所示。
根据本发明，步骤(4)的质粒p32UTOLE1-L-DGA1的构建步骤为：将来源于解脂耶氏酵母的OLE1基因和DGA1基因通过NEB连接酶，通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTOLE1-L-DGA1，所述OLE1-L-DGA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
所述的质粒p69DGA1的构建步骤为：将来源于解脂耶氏酵的DGA1基因，构建到质粒pINA1269中，得到质粒p69DGA1。
实施例3测定菌株产神经酸
将实施例1和实施例2制备的菌株GQ06，NA01，NA02，NA03，NA04，NA05，NA06和NA07在加有3mL YPD(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)的试管中，接种100μL菌液，在37℃，220rpm的条件下培养24h。然后将菌株接种于放有50mL YPD的三角瓶内，接种的体积根据接种后摇瓶内菌液的OD600＝0.01进行确定。37℃，220rpm的条件下发酵培养3天，所有的摇瓶实验设置两个平行。
脂肪酸的提取：将发酵后摇瓶内的菌液充分混合均匀，取20mL培养液到50mL的螺口离心管中。6400rpm离心4min。倒掉上清加入20mL的去离子水，用涡旋震荡仪混合均匀，相同条件离心，倒掉上清，重复步骤一次。在离心管内加入5mL的4mol/L的盐酸，混合均匀，30℃，220rpm振荡30min。从摇床取出离心管，放入沸水浴中保持5min，到时间后迅速插入冰上，保持5min，重复步骤该操作一次。加入20mL的充分混合的溶液，其中V甲醇：V氯仿＝1:2，30℃，220rpm振荡30min，然后6400rpm离心4min。出现明显的分层，吸出澄清的位于下层的液体，转移到带塞的玻璃试管中。玻璃试管提前在105℃烘干至恒重后称重。
脂肪酸的衍生：本实验采用GC(气相色谱仪)进行产物的检测，由于GC无法检测到脂肪酸，只能将脂肪酸衍生为对应的脂肪酸甲酯进行检测，具体过程如下：将冷却至室温的玻璃管内加入3mL的现配制的0.5mol/L甲醇氢氧化钾溶液(2.8g氢氧化钾溶于100mL甲醇中)，盖上玻璃塞，在超声中溶解油脂。油脂溶解后，在75℃的恒温水浴锅保温20min。20min以后取出玻璃管，在试管中加入3mL的14％三氯化硼溶液，75℃保温20min。取出试管加入1mL饱和NaCl和500μL的正己烷，在旋涡震荡仪上150rpm保持1.5min。震荡以后试管内液体会分层，将上层液体取到1.5mL的EP管内，12000rpm离心1min。离心后取上层液体50μL于新的1.5mL的EP管内，再加入150μL的正己烷和40μL的0.5g/L的C17:0脂肪酸甲酯的内标，混合均匀，即V内标：V样品＝1:4。通过0.22μm有机相滤膜过滤到气相瓶，即可进行GC检测。
脂肪酸含量的测定：采用的是GC检测法，色谱柱为DB-5HT(30m)T用气相色谱仪器检测(0.1μm)。进样口温度280℃，进样量为1μL，检测器温度200℃，分流比20:1。具体程序是：起始柱温为150℃，保持2min，然后以20℃/min的升温速度升至180℃，接着又以4℃/min的升温速度升至215℃，保持1.5min，最后以20℃/min的升温速度升至300℃。
分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。发酵培养3天后，提取神经酸使用GC(气相色谱仪)检测各神经酸组分的含量。
神经酸含量的测定：发酵结束后，从发酵液中提取得到解脂耶氏酵母工程菌中的总油脂。使用1mL正己烷将提取的油脂溶解，取200μl样品与1g/L内标C28:0神经酸混合用0.22μm的有机相滤膜过滤后用GC进行检测。
色谱柱为DB-5HT。起始柱温为150℃，保持2min，然后以20℃/min的升温速度升至180℃，接着又以8℃/min的升温速度升至200℃，接着以1℃/min的升温速度升至218℃，最后以3.5℃/min的升温速度升至350℃并保持10min。进样量为1μL，检测器温度为200℃，进样口温度为280℃，分流比为20:1。
测定神经酸的结果如图2所示。其中的NA06工程菌产量为111.6mg/L，是解脂耶氏酵母中产神经酸菌株中神经酸产量最高的菌株。
实施例4神经酸生产菌株的发酵培养
本实验以产神经酸的解脂耶氏酵母菌株NA07为发酵菌株，通过在50mL的YPD发酵培养基中添加不同油/油酸，探究解脂耶氏酵母合成神经酸的最佳培养基组成。将在甘油保种管保藏的菌株在YPD固体平板上划线，挑取单克隆菌株，接种加有3mL YPD培养基的15mL短试管中(在试管中添加氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性以防染菌)，试管置于30℃恒温摇床中220rpm过夜培养后，将处于指数生长期的细胞接种到250mL摇瓶中。设置0.25mL不同油/油酸，包括菜籽油(CO，colleseed oil)、大豆油(SO，soybean oil)、葵花籽(SSO，sunflower seed oil)、油酸(OA，ω-9octadecanoic acid)、餐厨废弃油脂(WCO，wastecooking oil)。结果如图3A所示，其中control(对照)组表示不额外添加油/油酸，在实验测得最佳辅助碳源是菜籽油，在YPD培养基中添加0.25mL的菜籽油，神经酸的含量达到95.2mg/L。
本实验以产神经酸的解脂耶氏酵母菌株NA07为发酵菌株，通过在50mL的YPD发酵培养基中添加不同体积的菜籽油，探究解脂耶氏酵母合成神经酸的最佳培养基组成。将在甘油保种管保藏的菌株在YPD固体平板上划线，挑取单克隆菌株，接种加有3mL YPD培养基的15mL短试管中(在试管中添加氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性以防染菌)，试管置于30℃恒温摇床中220rpm过夜培养后，将处于指数生长期的细胞接种到250mL摇瓶中。设置不同的菜籽油添加梯度0，0.25mL，0.5mL，0.75mL，1mL，1.25mL(对应的体积百分比分别为0％，0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％)。结果如图3B所示。在实验测得的最佳菜籽油添加量0.5mL于50mL YPD的培养基条件下，发酵培养菌株NA06结果如图3C所示，NA06的神经酸产量为185.1mg/L，是目前解脂耶氏酵母中神经酸的最高产量。
图3B结果显示：在实验中添加0，0.25mL，0.5mL，0.75mL，1mL，1.25mL等不同梯度的菜籽油，其中0.5mL即1％的菜籽油添加更利于神经酸在解脂耶氏酵母中的合成。图3C结果显示：在添加0.5mL菜籽油的50mL YPD中，菌株NA06的发酵结果，显示解脂耶氏酵母中神经酸的产量达到最高是185.1mg/L。
实施例5密码子优化对基因CgKCS的影响
(1)延长酶基因AtKCS，CraKCS，CgKCS和CgKCS-opt表达质粒p32UTAtKCS，p32UTCraKCS、p32UTCgKCS和p32UTCgKCS-opt的构建。将来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)的延长酶基因AtKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)、海甘蓝(Crambe abyssinica)的延长酶基因CraKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO:35所示)、碎米荠属(Cardamine graeca)的延长酶基因CgKCS的未优化序列(其核苷酸序列如SEQID NO:33所示)和延长酶基因CgKCS的优化序列CgKCS-opt(其核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示)，通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，依次得到质粒p32UTAtKCS、p32UTCraKCS、p32UTCgKCS和p32UTCgKCS-opt。其中，未经密码子优化的CgKCS是来源于碎米荠属(Cardamine graeca)；密码子优化过的AtKCS，CraKCS，CgKCS-opt基因是通过分别将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，海甘蓝(Crambe abyssinica)和碎米荠属(Cardamine graeca)AtKCS，CraKCS和CgKCS的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，构建含有启动子为UAS4B+TEF的优化的AtKCS基因的donor质粒pHR_A3_AtKCS、优化的CraKCS基因的donor质粒pHR_F1-3_CraKCS、优化的CgKCS基因的donor质粒pHR_AXP_CgKCS和优化的CgKCS-opt基因的donor质粒pHR_AXP_CgKCS-opt。分别依次与sgRNA质粒pCRISPRyl_A3、pCRISPRyl_F1-3、pCRISPRyl_AXP和pCRISPRyl_AXP可以组成一对敲入质粒对。
本实施例中的敲入质粒对为本领域常规的重组载体，其中sgRNA质粒中含有亮氨酸筛选标记，donor质粒中含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，该敲入质粒对能够依次敲入上述优化的AtKCS基因、CraKCS基因、CgKCS基因和CgKCS-opt基因。
具体步骤如下：
(1)首先需要获得目的基因的表达盒，依次使用引物依次使用引物32UTAtKCS-f和32UTAtKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1～2所示)、32UTCraKCS-f和32UTCraKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:3～4所示)、32UTCgKCS-f和32UTCgKCS-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:29～30所示)32UTCgKCS-opt-f和32UTCgKCS-opt-r(核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:5～6所示)获取对应p32UTAtKCS、p32UTCraKCS、p32UTCgKCS和p32UTCgKCS-opt质粒的相应“AtKCS”、“CraKCS”、“CgKCS”、“CgKCS-opt”通过酶切位点NheI和pteI分别依次构建到质粒pHR_A3_hrGFP、pHR_F1-3_hrGFP、pHR_AXP_hrGFP、pHR_AXP_hrGFP中，得到质粒pHR_A3_AtKCS、pHR_F1-3_CraKCS、pHR_AXP_CgKCS、pHR_AXP_CgKCS-opt。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_AXP_CgKCS和sgRNA质粒pCRISPRyl_AXP同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3中，将筛选标记进行回收后获得菌株JL00，经验证，菌株JL00中敲入CgKCS基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast TransformationIITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(3)将步骤(1)中所得的质粒pHR_AXP_CgKCS_opt和sgRNA质粒pCRISPRyl_AXP同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3中，将筛选标记进行回收后获得菌株JL01，经验证，菌株JL01中敲入CgKCS_opt基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ YeastTransformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(4)将步骤(1)中所得的质粒pHR_A3_AtKCS和sgRNA质粒pCRISPRyl_A3同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-AXPCgKCS或Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-AXPCgKCS_opt中，将筛选标记进行回收，经验证，该菌株敲入AtKCS基因。其中，转化使用试剂盒FrozenEZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(5)将步骤(1)中所得的质粒pHR_F1-3_CraKCS和sgRNA质粒pCRISPRyl_F1-3同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS-AXPCgKCS或Po1f-ΔPEX10-F1MaELO3-A3AtKCS-AXPCgKCS_opt中，将筛选标记进行回收后获得菌株JL02和JL03，经验证，菌株JL02中敲入CgKCS基因，菌株JL03中敲入CgKCS_opt基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
将构建的解脂耶氏酵母基因工程菌从保种甘油管中吸取100-200μL菌液接种于5mL YPD培养基培养16-24小时。然后以初始OD600为0.01的接种量再分别接种于50mL新的YPD培养基中。30℃，220rpm发酵培养3天后收菌。经过油脂提取以及甲酯化后用GC(气相色谱)检测各种链长的脂肪酸含量。
图4结果显示：看出对照菌株GQ07的C20和C22脂肪酸含量明显高于JL02和JL03。说明在过表达CgKCS之后，更有利于细胞合成超长链脂肪酸，C24脂肪酸从极少量变为明显增多，尤其是在过表达密码子优化后CgKCS_opt基因的菌株中，细胞能够合成4.6mg/L的神经酸，比对照菌株提高了4.75倍，证明优化后的CgKCS_opt基因在结合其他三个脂肪酸延长酶的基础上，能够使细胞更加有效地合成神经酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的基因工程菌，所述基因工程菌为在解脂耶氏酵母Po1f中敲除基因PEX10、并表达来源于高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的C16/18延长酶基因MaELO3、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延长酶基因AtKCS和来源于海甘蓝(Crambe abyssinica)的延长酶基因CraKCS的菌株，其特征在于，所述基因工程菌还表达来源于碎米荠属(Cardamine graeca)的延长酶基因CgKCS。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因CgKCS；或，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因CgKCS和2个拷贝的所述延长酶基因CgKCS和来源于高山被孢霉菌的去饱和酶基因MaD15D的融合基因CgKCS-L-MaD15D。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还过表达其自身的二酰基甘油转移酶基因DGA1；
优选地，所述基因工程菌共含有2个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因DGA1。
4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌共含有2个拷贝其自身的二酰基甘油转移酶基因DGA1，还含有1个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因DGA1和其自身的Δ9去饱和酶基因OLE1的融合基因OLE1-L-DGA1。
5.如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述C16/18延长酶基因MaELO3的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；和/或，所述延长酶基因AtKCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；和/或，所述延长酶基因CraKCS的核苷酸序列如SEQ IDNO:35所示；和/或，所述延长酶基因CgKCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:36所示；和/或，所述二酰基甘油转移酶基因DGA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；和/或，所述融合基因CgKCS-L-MaD15D的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；和/或，所述融合基因OLE1-L-DGA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包含将待表达基因整合至解脂耶氏酵母的基因组中，所述整合的方法为在解脂耶氏酵母中转入包含待表达基因的整合表达质粒；和/或，所述构建方法基于CRISPR/Cas9操作系统。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，当所述构建方法基于CRISPR/Cas9操作系统时，包含如下步骤：
(1)构建含有donor质粒和sgRNA质粒的质粒对，所述donor质粒含有待表达基因，所述sgRNA质粒含有靶向基因组上待整合位点的sgRNA序列；
(2)将所述质粒对同时转化到解脂耶氏酵母中，筛选获得目的菌株。
8.如权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述donor质粒或所述整合表达质粒中的待表达基因的启动子为UAS4B+TEF；和/或，所述donor质粒的骨架为pHR_hrGFP；和/或，所述sgRNA质粒的骨架为pCRISPRyl；和/或，所述整合表达质粒的骨架为pINA1269或p3204；
优选地，所述donor质粒为包含所述延长酶基因CgKCS或所述融合基因CgKCS-L-MaD15D的pHR_hrGFP质粒，所述整合表达质粒为包含所述二酰基甘油转移酶基因DGA1的pINA1269质粒或包含所述融合基因OLE1-L-DGA1的p3204质粒。
9.一种生产神经酸的方法，其特征在于，所述方法包括在培养基中发酵如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌，并从中分离得到神经酸；所述培养基优选YPD培养基；
较佳地，所述培养基中还额外添加油脂或油酸；所述油脂优选菜籽油；
更佳地，所述菜籽油添加的体积百分比为1％。
10.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌在生产神经酸中的应用。
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