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CN116375857A - 一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116375857A
CN116375857A CN202310329690.4A CN202310329690A CN116375857A CN 116375857 A CN116375857 A CN 116375857A CN 202310329690 A CN202310329690 A CN 202310329690A CN 116375857 A CN116375857 A CN 116375857A
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chain variable
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tau protein
antibody
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CN202310329690.4A
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伍波
沈晨光
周妮娜
孙志华
蒋宇珊
董晓宁
尹美移
吴智广
李超辉
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Tianjin Hongyutai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Tianjin Hongyutai Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请涉及免疫学的技术领域，具体公开了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用，所述单链抗体包括包含重链可变区和轻链可变区，以及用于连接所述重链可变区和所述轻链可变区的柔性连接肽；所述重链可变区的互补决定区具有如SEQ ID No.1～3所示的片段，所述轻链可变区的互补决定区具有如SEQ ID No.4～6所示的片段。本申请所述单链抗体具有较高的灵敏度和特异性，且检测限低至50pg/mL，可应用于实际样本的检测中。

Description

一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是中枢神经系统进行性退行性疾病，是引起痴呆的最常见原因，因此又称老年痴呆病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，从病理改变到出现明显症状可经历数十年，最终导致认知功能障碍。阿尔茨海默病两大典型的病理改变包括：细胞内淀粉样斑块(AmyloidPlaques)形成和细胞外神经原纤维缠结(NeurofibrillaryTangles，NFTs)，进而出现突触丧失，神经元死亡。淀粉样斑块的主要组成成分为β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)，引起NFTs的主要成分为异常Tau蛋白。针对Aβ的药物(Aβ疫苗、γ分泌酶抑制剂)在临床研究中多数已宣告失败，而且越来越多的研究指向Tau蛋白过度磷酸化才是阿尔茨海默病产生神经毒性的直接原因，Tau蛋白过度磷酸化后与微管蛋白的结合力仅是正常Tau蛋白的1/10，失去了其促进微管装配形成的生物学功能并丧失维持微管稳定的作用，引起神经元微管结构广泛破坏，正常轴突转运受损，最终导致突触丢失，神经元功能损伤，发生脑神经退行性病变。因此，Tau蛋白成为阿尔茨海默病最有希望的治疗靶点。
随着基因工程技术的发展，治疗性抗体药物逐渐占据全球市场，抗Tau蛋白单克隆抗体及基因工程抗体的研制是Tau蛋白靶向诊治方向之一，可为阿尔茨海默病人的诊断和治疗奠定一定的技术和物质基础。
免疫球蛋白(Ig)或抗体是免疫系统的重要组成部分，根据结构它们扮演了双重角色。它们一方面能够通过抗原结合片段位点特异性结合抗原，另一方面可通过Fc段激活免疫系统其他细胞介导免疫反应。它们可分为多克隆抗体(多种抗体能识别抗原多个表位)和单克隆抗体(mAbs)。后者是高度特异性的抗体，只能识别抗原的某一特定表位，被广泛应用于免疫组化、流式细胞、免疫印迹及相关技术中。除此以外，在最近的20年里，单抗也成为癌症治疗的重要组成部分。它们的医疗应用可以扩展到慢性炎症疾病、移植和感染中(例如HIV单抗在治疗人类HIV疾病中效果显著)。
单克隆抗体(MAb)虽然具有特异性强和亲和力高的优点，但其现有生产技术存在生产成本高、规模难于工业放大和质控等缺点，基因工程小分子抗体是单克隆抗体的理想替代产品。重组抗体是继多抗和单抗后的第三代抗体，其利用重组DNA技术改造抗体的基因结构，然后将重组抗体基因转入原核或真核表达系统中表达，形成了重组抗体。与多抗和单抗的制备相比，重组抗体技术具有以下特点和优势：①不需要免疫动物；②抗体工程菌比杂交瘤细胞稳定，易保存，适于大规模工业化生产；③可获得高亲合力的特异性抗体。其中单链抗体(Singlechainvatiablefragment,ScFv)具有分子量小、组织穿透力强、体内循环半衰期短、免疫原性低、易于进行基因工程改进等优点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用。目前，还未见有针对Tau蛋白的重组单链抗体的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种针对Tau蛋白N端区域的重组单链抗体，以及该重组单链抗体的制备方法和应用。该单链抗体可对Tau蛋白进行高特异性、高灵敏度、高准确性检测。
申请人以Tau蛋白N端区域的氨基酸序列(SEQ ID No.14)与BSA(牛血清白蛋白)偶联形成免疫复合物，并利用该BSA-多肽(免疫原)对动物进行免疫制备交瘤细胞，通过间接ELISA法筛选能够分泌识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并分析与Tau蛋白N端区域多肽(SEQ ID No.14)的亲和性，得到了一株与所述Tau蛋白N端区域多肽具有较强结合力的杂交瘤细胞株，对该杂交瘤细胞株进行抗体序列的测定及分析，设计重组质粒，经大肠杆菌杆菌周质腔表达，最终得到了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体。
作为本申请的第一个实施方案，提供了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，所述单链抗体包括包含重链可变区VH和轻链可变区VL，以及用于连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的柔性连接肽；
所述重链可变区VH的互补决定区具有CDR1H、CDR2H和CDR3H的片段，所述CDR1H、CDR2H和CDR3H的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1～3所示；
所述轻链可变区VL的互补决定区具有CDR1L、CDR2L和CDR3L的片段，所述CDR1L、CDR2L和CDR3L的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4～6所示。
在本实施方案中，所述重链可变区VH的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示。
在本实施方案中，所述轻链可变区VL的氨基酸序列优选如SEQ ID No.8所示。
在本实施方案中，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)n所示的肽链，其中，n为整数。
优选的，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。
在本实施方案中，所述重链可变区VH的N端通过柔性连接肽与所述轻链可变区VL的C端相连；或所述所述轻链可变区VL的N端通过柔性连接肽与所述重链可变区VH的C端相连。
在本实施方案中，所述单链抗体按照轻链可变区VL-柔性连接肽-重链可变区VH的顺序构成，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
作为本申请的第二个实施方案，提供了一种DNA分子，所述DNA分子编码上述所述单链抗体。
作为本申请的第三个实施方案，提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含上述所述CDR1H、CDR2H和CDR3H的片段，以及所述CDR1L、CDR2L和CDR3L的片段。
优选的，所述重组质粒包含氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的所述重链可变区VH和氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的轻链可变区VL。
优选的，所述重组质粒包含氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的所述单链抗体。
作为本申请的第四个实施方案，提供了一种检测Tau蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述所述单链抗体；或包含上述所述DNA分子；或包含上述所述重组质粒。
作为本申请的第五个实施方案，提供了上述所述单链抗体的制备方法，以能够更好的制备上述用于检测Tau蛋白的所述单链抗体，制备的所述单链抗体可更好的用于Tau蛋白的靶向诊治。
所述制备方法包括以下步骤：
1)cDNA模板的合成
取处于对数生长期的分泌抗Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，反转录PCR合成cDNA；
2)PCR扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因
以获得的cDNA为模板，设计所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的引物，进行PCR获得所述所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段；
3)合成单链抗体
采用重叠延伸PCR通过柔性连接肽连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段，合成得到所述单链抗体基因；
4)构建重组工程菌
将所述单链抗体核苷酸序列重组至原核表达载体中，构建获得表达所述单链抗体的重组表达质粒，将所述重组表达质粒导入基因工程菌中构建重组工程菌；
5)单链抗体的表达
将得到的重组工程菌进行诱导培养，获得所述单链抗体并纯化。
进一步的，由于所述单链抗体按照轻链可变区VL-柔性连接肽-重链可变区VH的顺序构成，需要在所述单链抗体按照轻链可变区VL的3`端和所述重链可变区VH的5`端分别加入部分所述柔性连接肽序列。
同时为了方便后续对所述单链抗体的克隆表达，所述轻链可变区VL的引物VL-F中引入酶切位点和保护碱基，所述重链可变区VH的引物VH-R中引入酶切位点和保护碱基。
进一步的，设计的所述轻链可变区VL的引物为如SEQ IDNo.10～11所示的核苷酸序列，所述重链可变区VH的引物为如SEQ IDNo.12～13所示的核苷酸序列。
进一步的，所述PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA2μL，25μM上下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL。
进一步的，所述PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
作为本申请的第六个实施方案，提供了所述单链抗体或所述DNA分子或所述重组质粒在制备Tau蛋白检测产品中的应用。
本申请的有益效果为：
本申请通过对得到的单克隆抗体进行基因分析，得到了该单克隆抗体的重链可变区VH和重链可变区VL的基因，进而利用重组抗体技术将重链可变区VH和重链可变区VL通过柔性连接肽按照重链可变区VH-柔性连接肽-轻链可变区VL的顺序重组，构成了单链抗体。该单链抗体获取方便，分子量较小不需要糖基化即可形成有功能的抗体分子，所以可以在原核细胞中进行表达。相较传统单克隆抗体生产技术，成本低、周期短。
同时本申请单链抗体能够特异性的针对Tau蛋白的N端区域，能够同时检测Tau蛋白的6种异构体，适用性更强。而且具有较高的灵敏度和特异性，经实验证明本申请单链抗体检测限低至50pg/mL，与Tau蛋白N端区域多肽的ELISA检测的OD450值可达3.718，与完整Tau蛋白的ELISA检测的OD450数值可达3.649，与Tau蛋白C端区域多肽不结合，可应用于实际样本的检测中。
附图说明
图1是本申请实施例2中Tau-ScFv单链抗体的电泳图；
图2是本申请实施例3中免疫学检测Tau蛋白的电泳图。
具体实施方式
下面将结合本申请具体的实施例，对本申请技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
由于Tau蛋白具有6种异构体，以完整Tau蛋白作为免疫原制备的抗Tau蛋白抗体，该抗Tau蛋白抗体结合完整Tau蛋白的抗原决定簇较难确定；而如果以针对某一种Tau蛋白异构体制备抗Tau蛋白抗体，得到的抗Tau蛋白抗体的适应性又较差，对检测结果的准确性也存在一定的影响，同时如果要实现对样本的准确检测，则需要针对不同异构体的抗Tau蛋白抗体结合使用，检测成本高，不利于推广使用。本申请以Tau蛋白N端区域多肽作为免疫原，通过与牛血清白蛋白复合偶联得到了含有Tau蛋白N端区域多肽的免疫复合物(BSA-多肽)，其中Tau蛋白N端区域多肽的氨基酸具体如(SEQ ID No.14)所示。将得到的免疫复合物(BSA-多肽)对小鼠进行免疫注射，经过细胞融合后，筛选出能够分泌识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分析该单克隆抗体的基因序列，得到了单克隆抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
在一些具体的实施例，本申请以得到的单克隆抗体的轻重链序列为基础，构建了一种单链抗体，所述单链抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，以及用于连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的柔性连接肽Linker。
在所述重链可变区VH中包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示的互补决定区CDR1H、CDR2H和CDR3H，或所述互补决定区CDR1H、CDR2H和CDR3H分别与如SEQ ID No.1～3所示的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列，具体如具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。在所述轻链可变区VL的中包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.4～6所示的互补决定区CDR1L、CDR2L和CDR3L，或所述互补决定区CDR1L、CDR2L和CDR3L分别与如SEQ ID No.4～6所示的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列，具体如具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。
进一步的，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，或与如SEQ IDNo.7所示的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列，具体如具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。进一步的，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或与如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有80％以上一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列，具体如具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。
优选的，所述重链可变区VH的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示。所述轻链可变区VL的氨基酸序列优选如SEQ ID No.8所示。
所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)n所示的肽链，其中，n为整数。具体的，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)2所示的肽链，或所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。优选的，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。
所述单链抗体的氨基酸结构中，所述重链可变区VH的N端通过柔性连接肽与所述轻链可变区VL的C端相连，具体的所述连接肽Linker的N端与所述轻链可变区VL的C端相连，所述连接肽Linker的C端与所述重链可变区VH的N端相连，则所述单链抗体的序列结构按照轻链可变区VL-柔性连接肽Linker-重链可变区VH的顺序连接构成。或所述所述轻链可变区VL的N端通过柔性连接肽与所述重链可变区VH的C端相连，具体的所述连接肽Linker的C端与所述轻链可变区VL的N端相连，所述连接肽Linker的N端与所述重链可变区VH的C端相连，则所述单链抗体的序列结构按重链可变区VH-柔性连接肽Linker-轻链可变区VL的顺序连接构成。
优选的，所述单链抗体的序列结构按照轻链可变区VL-柔性连接肽-重链可变区VH的顺序构成，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
在一些具体的实施例，所述单链抗体的制备方法包括以下步骤：
1)cDNA模板的合成
取处于对数生长期的分泌抗Tau蛋白N端区域多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，反转录PCR合成cDNA；其中采用Trizol(TRIzol试剂购自Invitrogen公司)提取杂交瘤细胞株的总RNA，以总RNA为模版，利用随机引物，根据反转录试剂盒(反转录cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司)的说明操作步骤，合成cDNA。
其中，分泌抗Tau蛋白N端区域多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下方法得到：
①免疫原制备
以氨基酸序列如SEQ ID No.14所示的Tau蛋白N端区域多肽与BSA(牛血清白蛋白)偶联。合成SEQ ID No.14所示的Tau蛋白N端区域多肽，合成时在C端增加一个半胱氨酸用于与BSA连接，再通过SPDP偶联法将合成的多肽与BSA偶联，获得BSA-多肽，即为免疫原，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。
通过ELISA验证上述BSA-多肽的免疫原性。使用100μL浓度为5μg/mL的BSA-多肽包被ELISA检测板，加入100μL浓度为1μg/mL的商品化的单克隆抗体(Purified anti-Tau，品牌：BioLegend，货号806501)，每孔再加入100μL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗鼠IgG二抗(Thermo fisher)，最后测定其在450nm处的OD值。使用BSA作为对照。结果显示单独的载体蛋白BSA几乎不与商品化的单克隆抗体结合，而BSA-多肽与商品化的单克隆抗体具有良好的结合能力，表明BSA-多肽制备成功，其具有良好的免疫原性，可用于后续的免疫操作中。
②动物免疫
使用BSA-多肽免疫4～6周龄的雌性Balb/c小鼠(江苏集萃药康生物技术股份有限公司)，免疫前眼眶采血20μL，离心后获得血清，后续用作阴性对照。
首次免疫时，每只小鼠注射BSA-多肽50μg，使用生理盐水稀释至体积为200μL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后腹部皮下多点注射。每14天皮下加强免疫1次，剂量为每只小鼠注射BSA-多肽25μg，使用生理盐水稀释至体积为200μL，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。第3次加强免疫7天后眼眶取血，通过ELISA检测血清抗体效价，对达到要求的小鼠进行冲击免疫，剂量为每只小鼠腹腔注射BSA-多肽50μg，注射时用生理盐水稀释至体积为100μL，获得免疫小鼠。免疫后，对免疫小鼠眼眶采血20μL，离心后获得血清，后续用作阳性对照。3天后进行细胞融合。
③细胞融合
将新鲜摘下的免疫小鼠脾脏置于细胞筛上碾碎过滤，与SP2/0细胞(骨髓瘤细胞)按数量比为3:1混合，1000rpm室温离心5min，弃上清。将装有离心后的细胞的离心管放入37℃温水浴中，边搅动细胞边缓慢加入1mL聚乙二醇溶液(Sigma，P7181-5×5mL)。在水浴中静置1min，缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基(Hyclone，SH30243.01B)，1000rpm离心5min，弃上清。加入含血清的DMEM培养基，并将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔接种150μL，使细胞密度为1×105个/孔，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。24h后加入50μL含HAT(Gibco，21060017)的培养基。此后每3～5天进行换液。
④细胞筛选
待细胞密度达到约50％时，收集细胞上清，通过间接ELISA法筛选能够分泌识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，步骤如下：
通过SPDP偶联法将SEQ ID No.14所示的Tau蛋白N端区域多肽与KLH偶联，获得KLH-多肽，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。用100μL浓度为0.5μg/mL的KLH-多肽包被ELISA检测板，37℃静置1h。用PBST清洗4次，取100μL杂交瘤细胞的培养基上清加入包被KLH-多肽的ELISA检测孔中，同时，用动物免疫后的免疫小鼠血清(按1:10000稀释)作为阳性对照，用动物免疫前的小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h。用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG(H+L)F(ab')2片段(Jackson，115-036-003，使用1％BSA按1:5000稀释)，37℃孵育1h。用PBST洗涤4次后，加入TMB(Solarbio，PR1210-2×250mL)显色，测定450nm处的OD值。OD450数值大于0.5的，判定为阳性克隆株。
⑤杂交瘤细胞株的建立
经过3次亚克隆和间接ELISA筛选后，共获得8株分泌特异性识别Tau蛋白N端区域抗体的杂交瘤细胞株，克隆编号依次命名为N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7和N-8。通过间接ELISA法检测上述8株杂交瘤细胞株分泌的抗体与SEQ ID No.14所示的Tau蛋白N端区域多肽的亲和性，杂交瘤细胞株N-6与SEQ ID No.14所示的Tau蛋白N端区域多肽的结合能力最强，因此选择其分泌的抗体作为识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体，并用于后续的实验。
将筛选出的杂交瘤细胞株N-6送交南京泰德生物工程有限公司进行抗体序列的测定及分析。经过序列的测定及分析，确定本申请中的识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，核苷酸序列为SEQ ID No.15；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，核苷酸序列为SEQ ID No.16。
经过分析，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
2)PCR扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因
以获得的cDNA为模板，设计所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的引物，进行PCR获得所述所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段。
用于扩增所述重链可变区VH的引物对为VH-F和VH-R，用于扩增所述轻链可变区VL的引物对为VL-F和VL-R，其中，VL-F、VH-R分别含有NdeⅠ和HindⅢ酶切位点；VH-F、VL-R含互补的Linker序列。引物由合肥国肽生物科技有限公司合成：
VL-F：5'-GGAATTCCATATGGAATTCCGACGTGGTGCTGACCC AGAC-3'(SEQ ID No.10)
VL-R：5'-CCACCGCCACCGAGCCCTCCACCCAGTTGGCGTAG TTGGTGGTG-3'(SEQ IDNo.11)
VH-F：5'-ACCTAGGCCGCCACCGCCAAGGCCTGACCGGCAA CTTCTTC-3'(SEQ ID No.12)
VH-R：5'-CCCAAGCTTGGGTGTTCTTGGCGTTGTCCCT-3'(SEQ ID No.13)。
3)单链抗体的表达
采用重叠延伸PCR通过柔性连接肽连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段，合成得到所述单链抗体基因，将所述单链抗体核苷酸序列连接至pET22b(+)中，构建获得表达所述单链抗体的重组表达质粒，基因结构为VL-Linker-VH-His。
该重组表达质粒包含上述所述CDR1H、CDR2H和CDR3H的片段，以及所述CDR1L、CDR2L和CDR3L的片段。优选的，所述重组表达质粒包含SEQ ID No.7所示的重链可变区，以及SEQID No.8所示的轻链可变区。
4)单链抗体的表达
将所述重组表达质粒导入基因工程菌中构建重组工程菌，诱导培养，获得所述单链抗体并纯化。
在一些具体的实施例，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含所述单链抗体，由于所述单链抗体可以特异性的识别Tau蛋白N端区域，所述试剂盒可用于检测识别6种Tau蛋白异构体，保证了上述识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体对Tau蛋白的所有异构体均可有效检出，适用性更强，也保证了检测结果的准确性。或所述试剂盒包含编码所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的DNA分子。或所述试剂盒包含编码重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的DNA分子。或包含所述重组表达质粒。
原则上，所述单链抗体或编码所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的DNA分子或所述重组质粒或编码重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的DNA分子或所述重组表达质粒可用于制备任何适用于检测Tau蛋白的产品。
实施例1Tau-ScFv原核表达系统的构建
1)Tau-ScFv单链抗体基因的构建
以得到的分泌抗Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株N-6，利用Trizol法(TRIZOLReagent购自TaKaRa公司)提取总RNA，并以提取的总RNA为模版，利用随机引物，根据反转录试剂盒(反转录cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司)的说明操作步骤，合成cDNA。以得到的cDNA为模板，通过PCR方法扩增重链可变区VH、轻链可变区VL和连接肽基因片段，通过胶回收试剂盒(TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit)纯化获得3段基因片段。所述PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA2μL，25μM上下游引物各1μL，ddH2O8.5μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的重链可变区VH和轻链可变区VL基因连接为Tau-scFv基因(轻链可变区VL-柔性连接肽-重链可变区VH)。PCR反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
取重叠延伸PCR产物，利用引物VL-F和VH-R进行Tau-ScFv基因的扩增，PCR产物回收试剂盒回收目的基因，并与载体pET22b(+)分别进行双酶切，按照载体与目的基因摩尔比1:10比例(0.03pmol:0.3pmol)配置T4 DNAligase连接体系，16℃反应过夜。
pET-Tau-ScFv重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过AMP抗性筛选后，提取质粒并送至公司测序，显示pET-Tau-ScFv重组质粒构建成功。从-70℃冰箱中取200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上，将连接产物加入感受态细胞中混匀，冰上放置30min；42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟，向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)；混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)；8000rpm离心1min，弃大部分上清，留约50～100μl，菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。同时做两个对照，对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。挑取平板上长势良好的单克隆菌落，用阳性克隆筛选的方法进行菌株的筛选。将阳性克隆转至5mL具有氨苄抗性的液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，用质粒小提试剂盒提取质粒并鉴定。
实施例2Tau-ScFv单链抗体表达纯化
挑取上实施例1中测序正确的菌株，于含AMP的液体LB培养基内培养过夜，提取质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，菌液涂于氨苄抗性的琼脂板，37℃培养过夜。次日，挑取单菌落于5mL LB-A液体培养基中，37℃220rpm 12-16h，菌落PCR鉴定阳性克隆，准备重组蛋白的诱导表达。挑取上步获得的阳性克隆菌株于新鲜的含AMP的液体LB培养基内，37℃200rpm震荡培养至细菌对数期，即OD600＝0.8左右，加入IPTG至终浓度为1mM，22℃200rpm震荡培养12-16h，次日，将菌液于4℃5000rpm离心12min，弃上清，0.1M预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)重悬菌体并洗涤；用PBS缓冲液将菌体悬浮，加入1mM蛋白酶抑制剂PMSF，将菌液放置在冰上用超声波细胞破碎仪超声破碎菌体细胞，直至细胞完全破碎。取100μL全菌液加入5×SDS上样缓冲液，100℃静置5min，以备SDS-PAGE电泳检测，移液器小心加样至凝胶孔径中，电泳槽内30mA恒流至溴酚蓝跑出凝胶底部，凝胶经染色、脱色后于凝胶电泳系统分析目的蛋白的表达。重组蛋白通过Ni-NTA(GE Healthcare,Chicago)亲和层析进行纯化，并通过逐步透析对纯化的Tau-ScFv重组蛋白进行复性，最后经超纯水透析后，冻干，调整浓度后通过SDS-PAGE检测纯度及蛋白浓度。
结果：SDS-PAGE显示经IPTG诱导的菌株中出现明显的蛋白条带，同时经纯化、复性的scFv重组蛋白条带单一，浓度较高，表明Tau-ScFv单链抗体重组表达成功，能够用于后续实验(图1)。
实施例3Tau-ScFv单链抗体免疫印迹法鉴定
1)样品处理
合成完整的Tau蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，委托合肥国肽生物科技有限公司进行完整Tau蛋白的合成，将浓缩的Tau蛋白悬液分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3～5min。将处理过的样品加入上样孔，每孔内加样品10μl，在恒流条件下进行电泳；起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，直至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶。
2)转膜
准备：转移缓冲液(Tris5.8g甘氨酸2.9g SDS 0.37g甲醇200ml V＝1L)、转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张硝酸纤维素膜(NC膜)。剪切滤纸和膜时一定要戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。
转膜前，NC膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒，浸湿为止，在平衡液中平衡(甲醇的作用是固定大分子蛋白，使小分子物质易转移出去)。将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张NC膜浸泡在转移缓冲液中，然后取出SDS-PAGE胶，将浓缩胶轻轻刮去，并在胶的一角做一缺角作为标记以区分上样顺序。将胶在转膜缓冲液(25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3)中浸泡5min左右，以平衡离子强度。夹子打开平放底部黑色电极(阴极)，放一张海绵垫片，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫片上放置1张转移缓冲液浸泡过的滤纸，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。取出浸在转膜液中的凝胶平放在滤纸上，排除所有气泡。将NC膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，玻棒来回擀几遍排除所有气泡，注意在膜的正面作上标记(可以将膜的一角剪去或用签字笔在膜的边角上做记号)。在膜上盖一张转移缓冲液浸泡过的滤纸，同样须确保不留气泡。最后盖上另一张海绵垫，盖上阳极板(白色)，夹紧，保证对凝胶有一定压力。将夹子放入转移槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面，恒压110V转移60min。转膜时将转移槽放入冰水中进行。转膜过程中电转液用磁力搅拌器搅拌。
2)免疫学检测
取膜，将膜正面朝上在1×PBST溶液中摇动五分钟，洗一次，移至含有封闭液(含10％脱脂奶粉的瓶PBST缓冲液；脱脂奶粉5g，PBST 100ml)的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1小时。取出膜在1×PBST溶液中洗5分钟，摇动，洗两次，放入1×PBST缓冲液中(内含5％脱脂牛奶)，同时加入Tau-ScFv单链抗体与HRP-His标签抗体到缓冲液中，孵育60min，用1×PBST洗至少三次，5min/次。在暗室中，将1×显影液(50ml)和定影液(50ml)分别到入塑料盒中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大25px)；打开X光片夹，将膜放入X光片夹，并将发光液均匀涂抹在膜上，之后把X光片放在膜上，关上X光片夹，曝光3min，打开X光片夹，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，立刻将X光片浸入定影液中，定影时间5～10min，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。其中，显影液(5X)：自来水375ml，米吐尔1.55g，亚硫酸钠22.5g，碳酸钠33.75g，溴化钾20.95g，补水至500ml，配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。定影液：自来水700ml，硫代硫酸钠240g，亚硫酸钠15g，冰乙酸12.6ml，硼酸7.5g，钾明矾15g，加水定容至1000ml，室温保存。发光液：鲁米诺试剂2ml，过氧化氢1.3ml。
结果如图2所示，本申请Tau-ScFv单链抗体可以实现特异性识别Tau蛋白，无杂带。
实施例4Tau-ScFv单链抗体亲和力
采用竞争性ELISA方法检测Tau-ScFv单链抗体的抗原结合活性，即Tau-ScFv单链抗体亲和力测定。
①结合对象
结合对象为Tau蛋白N端区域多肽、Tau蛋白C端区域多肽和完整Tau蛋白。
其中，Tau蛋白N端区域多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，Tau蛋白C端区域多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。通过SPDP偶联法将上述两条多肽分别与KLH偶联，得到KLH-N端区域多肽和KLH-C端区域多肽，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。
其中，完整Tau蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。将编码完整Tau蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体pCDNA 3.4中，构建重组载体，在293T细胞中瞬时表达验证蛋白成功表达，并进行纯化，获得完整Tau蛋白。
②具体检测方法为：
分别用100μL浓度为0.5μg/mL的KLH-N端区域多肽、KLH-C端区域多肽和完整的Tau蛋白包被ELISA检测板，37℃静置1h。用PBST清洗4次，再用5％BSA封闭ELISA检测板，37℃静置1h，用PBST洗涤4次，制得KLH-N端区域多肽包被的ELISA检测板、KLH-C端区域多肽包被的ELISA检测板以及完整的Tau蛋白包被ELISA检测板。
分别用1％BSA稀释本申请提供的Tau-ScFv单链抗体以及商品化的单克隆抗体(Purified anti-Tau，品牌：BioLegend，货号806501)至终浓度均为0.5μg/mL，分别取100μL稀释后的抗体加入到KLH-N端区域多肽包被的ELISA检测板、KLH-C端区域多肽包被的ELISA检测板以及完整的Tau蛋白包被ELISA检测板的检测孔中，以1％BSA作为阴性对照，37℃静置1h。
用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL HRP-His标签抗体(使用1％BSA按1:5000稀释)，37℃孵育1h，用PBST洗涤4次后，加入TMB进行显色，测定450nm处的OD值。
表1Tau-ScFv单链抗体的结合能力
Figure BDA0004154515610000221
由表1可以看出，本申请中Tau-ScFv单链抗体与Tau蛋白N端区域多肽具有良好的亲和性，结合后的OD450数值可达3.718，高于商品化的单克隆抗体的3.453，说明本申请Tau-ScFv单链抗体与Tau蛋白N端区域多肽具有较好的结合能力。同时本申请Tau-ScFv单链抗体与Tau蛋白C端区域多肽的OD450仅为0.013，低于商品化的单克隆抗体，说明本申请Tau-ScFv单链抗体与Tau蛋白C端区域多肽不结合。另外，本申请Tau-ScFv单链抗体与完整的Tau蛋白也具有良好的亲和性，但结合能力低于Tau蛋白N端区域多肽，推测可能原因为完整的Tau蛋白会形成相应的高级结构，从而在一定程度上影响了Tau-ScFv单链抗体与相应抗原决定簇的结合。
实施例5Tau-ScFv单链抗体灵敏性
①结合对象
结合对象为KLH-N端区域多肽，Tau蛋白N端区域多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.14所示。
②检测方法
将KLH-N端区域多肽稀释至终浓度依次为500ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、500pg/mL、50pg/mL和5pg/mL，使用100μL上述不同浓度的KLH-N端区域多肽稀释液对ELISA检测板进行包被，再进行ELISA检测，具体的操作步骤参见实施例4。
③检测结果
本申请Tau-ScFv单链抗体以及商品化的单克隆抗体(Purified anti-Tau，品牌：BioLegend，货号806501)的灵敏度检测结果如表2所示。
表2Tau-ScFv单链抗体的灵敏度
Figure BDA0004154515610000231
由表2可以看出，本申请中Tau-ScFv单链抗体相比商品化的单克隆抗体表现出了良好的灵敏性，灵敏度提高了一个数量级，可以有效检出样本中浓度低至50pg/mL的Tau蛋白。
实施例6基于ELISA法检测Tau蛋白的试剂盒
本实施例提供了一种检测Tau蛋白的试剂盒，该试剂盒的组成如下：Tau-ScFv单链抗体(实施例2纯化Tau-ScFv单链抗体)，酶标板，封闭液(5％脱脂乳粉)，HRP-His标签抗体(最佳稀释度1:6400)、显色液(四甲基联苯胺)、终止液(2mol/L H2SO4)、包被液(20mmol/LpH8.5，Tris-HCl)和洗涤液(PBST溶液)。
该试剂盒使用方法如下：
①纯化单抗包被：用包被液将Tau-ScFv单链抗体稀释至1:800，4℃过夜，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
②封闭：每孔加200μL 5％脱脂乳粉，于37℃孵育1h；
③加抗原：每孔加100μL样品，于37℃孵育1～2h；
④加酶标二抗：用5％脱脂乳粉将HRP-羊抗鼠IgG二抗稀释至1:6400，37℃孵育1.5h，每孔100μL；
⑤底物显色：每孔加显色液100μL，显色10min；
⑥终止反应：每孔加2mol/L浓硫酸50μL/孔，测定OD450nm反应值。
在第①～④每步之间用洗涤液洗板3～5次，每次10min。
本实施例试剂盒对10例临床样本是否表达Tau蛋白进行检测，同时使用商品化的单克隆抗体作为对照。
对样本进行裂解，取样本裂解液对ELISA检测板进行包被，再分别使用试剂盒和商品化的单克隆抗体(Purified anti-Tau，品牌：BioLegend，货号806501)进行ELISA检测，结果如表3所示。
表3临床样本的Tau蛋白表达情况检测结果
Figure BDA0004154515610000251
由表3可以看出，针对上述10例临床样本，本申请的Tau蛋白的ELISA检测试剂盒与商品化的单克隆抗体的检测结果的一致性为100％，表明其具有良好的准确性与特异性，与市售产品在使用中具有等效性，可应用于实际的临床检测中。
综上，本申请构建的Tau-ScFv单链抗体具有与市售抗体相近的特异性与准确性，但具有更好的灵敏度以及与Tau蛋白的结合能力，检出限低至50pg/mL，可应用于实际样本的检测中，在相关的理论研究以及临床检测中具有重要的应用价值。

Claims (10)

1.一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包括包含重链可变区VH和轻链可变区VL，以及用于连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的柔性连接肽；
所述重链可变区VH的互补决定区具有CDR1H、CDR2H和CDR3H的片段，所述CDR1H、CDR2H和CDR3H的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1～3所示；
所述轻链可变区VL的互补决定区具有CDR1L、CDR2L和CDR3L的片段，所述CDR1L、CDR2L和CDR3L的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4～6所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述重链可变区VH的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示；所述轻链可变区VL的氨基酸序列优选如SEQID No.8所示。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体按照轻链可变区VL-柔性连接肽-重链可变区VH的顺序构成，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
5.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1～4中任一项所述的单链抗体。
6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求1～4中任一项所述的单链抗体或权利要求5所述的DNA分子。
7.一种检测Tau蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～4中任一项所述的单链抗体或权利要求5所述的DNA分子。
8.权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括：
1)cDNA模板的合成
取处于对数生长期的分泌抗Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，反转录PCR合成cDNA；
2)PCR扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因
以获得的cDNA为模板，设计所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL的引物，进行PCR获得所述所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段；
3)合成单链抗体
采用重叠延伸PCR通过柔性连接肽连接所述重链可变区VH和所述轻链可变区VL片段，合成得到所述单链抗体基因；
4)构建重组工程菌
将所述单链抗体核苷酸序列重组至原核表达载体中，构建获得表达所述单链抗体的重组表达质粒，将所述重组表达质粒导入基因工程菌中构建重组工程菌；
5)单链抗体的表达
将得到的重组工程菌进行诱导培养，获得所述单链抗体并纯化。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述轻链可变区VL的引物为如SEQ IDNo.10～11所示的核苷酸序列，所述重链可变区VH的引物为如SEQ ID No.12～13所示的核苷酸序列。
10.权利要求1～4中任一项所述的单链抗体或权利要求5所述的DNA分子或权利要求6所述的重组质粒在制备Tau蛋白检测产品中的应用。
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