CN116334057B - 一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用，本发明方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换。本发明还涉及了由该方法构建得到的酶组装体及其应用。本发明通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本发明方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及酶组装领域，更具体地，本发明涉及一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用。
背景技术
相关技术中，提高酶稳定性的方法有：交联酶聚集体技术或活性包涵体技术；交联酶聚集体技术是一种用盐、有机溶剂或非离子聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联的无载体固定化方法。活性包涵体技术是指通过在酶分子的序列末端融合表达疏水或两亲性多肽，多肽之间的非特异性作用导致酶在表达过程中形成有活性的聚集体，即活性包涵体。以上两种技术都能够提高酶的稳定性，但因为其仅仅是将酶分子杂乱的聚集在一起，使得酶的聚集体的整体活性降低。
因此，如何精确设计酶组装体，使其能够在不影响酶的催化活性的基础上，提高酶的稳定性，具有较大的应用价值。目前，已经开发了许多关于蛋白质组装体的设计策略，驱动蛋白质组装的作用力主要有SpyTag-SpyCatcher形成的异肽键、分选酶催化N末端聚甘氨酸和C末端LPXTG标签的连接、分裂内含肽自催化的剪接反应、结构域交换等生物方法，然而这些生物方法不仅需要大量的基因操作，还存在蛋白质的组装速率慢，组装效率较低，无法控制组装体中蛋白的相对空间定位等问题。此外，还有引入主客体相互作用、戊二醛交联、金属配位作用的化学方法，然而这些化学方法存在非共价作用特异性低，组装效率低，分离纯化复杂等缺点，阻碍了酶组装的实际应用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明实施例提供了一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，该方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：
所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换；
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有至少两个马来酰亚胺端基。
本发明实施例提出了用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动米曲霉来源的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的自组装。通过突变引入的半胱氨酸与聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的点击加成反应(巯基-马来酰亚胺加成)，通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本发明方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。
优选地，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有两个或四个马来酰亚胺端基。
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的结构式为：PEG-X-MAL；其中，
PEG为聚乙二醇残基，MAL为马来酰亚胺基；
X为PEG与MAL的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rS-、-(CH2)rCOO-和-(CH2)rOCO-中一种或两种以上的组合，r为0-10的整数。优选地，r为0-5的整数。
在一些实施例中，所述PEG为直链聚乙二醇残基、四臂支链聚乙二醇残基、六臂支链聚乙二醇残基中的一种。
在一些实施例中，所述单一突变为以下任意一种：
(1)28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
(2)34位的苏氨酸(Thr)突变为半胱氨酸(Cys)；
(3)100位的天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
(4)180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)；
(5)194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)；
(6)220位的天冬氨酸(Asp)突变为半胱氨酸(Cys)；
优选地，所述单一突变为以下任意一种：
28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)。
更优选地，所述单一突变为194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物为双臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal2)，或四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal4)。优选为：四臂聚乙二醇马来酰亚胺，四臂聚乙二醇马来酰亚胺与双臂聚乙二醇马来酰亚胺相比而言，可以进一步提高酶自组装效率。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的分子量为2000-3400Da。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶的摩尔比为1:(1.5-2.5)，优选地，摩尔比为1：2。
在一些实施例中，所述交联的条件为：pH值为6.8-7.4，反应温度为0-10℃，反应时间为2-12小时。
本发明实施例还提供了由上述方法制备得到的酶组装体。本发明实施例制备的酶组装体具有催化活性高、热稳定性高、反应条件温和，高效，绿色安全等优点。
本发明实施例还提供了上述酶组装体在转化甘草酸生成甘草次酸中的应用。
本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明用聚乙二醇马来酰亚胺交联剂驱动米曲霉来源的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的自组装。通过突变引入的半胱氨酸与聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(交联剂)的点击加成反应(巯基-马来酰亚胺加成)，通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本发明方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。
(2)本发明酶组装体选择反应迅速、定量转化的巯基-马来酰亚胺反应作为驱动力，操作简单，组装效率高，易于扩大化生产。
(3)本发明β-葡萄糖醛酸苷酶组装体具有催化活性高、热稳定性高、反应条件温和，高效，绿色安全等优点。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为Native-PAGE验证N28C、T34C、N100C、Q180C、G194C、D220C通过双臂交联剂Mal2组装的可行性。
图2为Native-PAGE验证N28C、T34C、N100C、Q180C、G194C、D220C通过四臂交联剂Mal4组装的可行性。
图3为凝胶过滤色谱比较G194C-Mal2、G194C-Mal4与PGUS的组装程度和组装效率。
图4为PGUS游离酶的TEM图。
图5为G194C-Mal2组装酶的TEM图。
图6为G194C-Mal4组装酶的TEM图。
图7为突变体N28C、T34C、N100C、Q180C、G194C、D220C及对应组装体的相对活性。
图8为组装体N28C-Mal2、T34C-Mal2、N100C-Mal2、Q180C-Mal2、G194C-Mal2、D220C-Mal2在70℃的热稳定性。
图9为组装体N28C-Mal4、T34C-Mal4、N100C-Mal4、Q180C-Mal4、G194C-Mal4、D220C-Mal4在70℃的热稳定性。
图10为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的甘草次酸浓度变化。
图11为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的转化率变化。
图12为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的甘草次酸产率变化。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。具体实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下面实施例中所使用的材料、试剂、装置等，如无特殊说明，均可从商业途径或按照公开文献的方法制备得到。
除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的熟练技术人员通常理解的含义。
本发明实施例提供了一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，该方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：
所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换；
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有至少两个马来酰亚胺端基。
本发明实施例提出了用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动米曲霉来源的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的自组装。通过突变引入的半胱氨酸与聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的点击加成反应(巯基-马来酰亚胺加成)，通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本发明方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。
优选地，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有两个或四个马来酰亚胺端基。
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的结构式为：PEG-X-MAL；其中，
PEG为聚乙二醇残基，MAL为马来酰亚胺基；
X为PEG与MAL的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rS-、-(CH2)rCOO-和-(CH2)rOCO-中一种或两种以上的组合，r为0-10的整数。优选地，r为0-5的整数。非限制性的举例如：r为0、1、2、3、4、5。
非限制性地举例如，所述X选自：单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2O-、-CH2CH2O-、-CO-、-CH2CO-、-CH2CH2CO-、-CH2CH2CH2CO-、-NH-、-CH2NH-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2CH2NH-、-CONH-、-CH2CONH-、-CH2CH2CONH-、-CH2CH2CH2CONH-、-CH2S-、-CH2CH2S-、-COO-、-CH2COO-、-CH2CH2COO-、-NHCO-、-CH2NHCO-、-CH2CH2NHCO-、-CH2OCO-、-CH2CH2OCO-、-CH2CH2CH2OCO-中的一种或两种以上的组合。
在一些实施例中，所述PEG为直链聚乙二醇残基、四臂支链聚乙二醇残基、六臂支链聚乙二醇残基中的一种。
在一些实施例中，所述单一突变为以下任意一种：
(1)28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
(2)34位的苏氨酸(Thr)突变为半胱氨酸(Cys)；
(3)100位的天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
(4)180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)；
(5)194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)；
(6)220位的天冬氨酸(Asp)突变为半胱氨酸(Cys)；
优选地，所述单一突变为以下任意一种：
28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)。
更优选地，所述单一突变为194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物为双臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal2)，或四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal4)。优选为：四臂聚乙二醇马来酰亚胺，四臂聚乙二醇马来酰亚胺与双臂聚乙二醇马来酰亚胺相比而言，可以进一步提高酶自组装效率。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的分子量为2000-3400Da。
在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶的摩尔比为1:(1.5-2.5)，非限制性的举例如摩尔比可以为1:1.5、1:1.7、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.5。优选地，摩尔比为1：2。
在一些实施例中，所述交联的条件为：pH值为6.8-7.4，反应温度为0-10℃，反应时间为2-12小时。
本发明实施例还提供了由上述方法制备得到的酶组装体。本发明实施例制备的酶组装体具有催化活性高、热稳定性高、反应条件温和，高效，绿色安全等优点。
本发明实施例还提供了上述酶组装体在转化甘草酸生成甘草次酸中的应用。
下面进一步详细描述本发明实施例。
材料：引物合成：本发明实施例中中所使用引物均由金唯智生物技术有限公司合成制备。FastPfu高保真聚合酶购自全式金公司；限制性内切酶均购自Thermo Fisher公司；使用的质粒小提试剂盒及酵母基因组试剂盒购自天根公司。
本发明具体实施例中双臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal2)，购自芃硕生物公司，双马来酰亚胺PEG，货号PS2-M-2K，分子量为2k。
本发明具体实施例中四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal4)，购自芃硕生物公司，四臂-PEG-马来酰亚胺，货号PS4-M-2K，分子量为2k。
实施例1质粒构建
载体为实验室保存的pET28a(+)-PGUS，PGUS的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(PGUS的基因：Genbank注册序列号为EU095019)，28、34、100、180、194、220位点分别突变成半胱氨酸构建单点突变体N28C、T34C、N100C、Q180C、G194C、D220C，用于突变的引物如表1所示。使用博迈德TOP10感受态富集质粒，使用博迈德BL21感受态作为表达宿主，通过安升达公司对载体进行测序。
扩增体系为：FastPfu Buffer(5×)10.0μL、dNTP(2.5mM)4μL、pET28a(+)-PGUS模板1μL、上下游引物(5μM)各1μL、FastPfu高保真DNA聚合酶1μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为95℃预变性3分钟；95℃变性20秒、60℃退火20秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟。
限制性核酸内切酶Dpn I消化甲基化模板：点突变扩增产物5μL，10x digestbuffer1μL，限制性核酸内切酶Dpn I 1μL，用双蒸水补足10μL的酶切体系，酶切条件为37℃、1h，随后80℃反应20分钟使酶失活。
消化产物热击转化至E.coli TOP 10感受态细胞中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖20g/L)平板上，37℃培养约16小时。
采用菌落PCR和测序方法鉴定转化子。菌落PCR体系：模板LB平板单菌落，T7启动子和终止子通用引物各1μL，2x Taq mix(聚合美生物公司)10μL，用双蒸水补足20μL。PCR条件：预变性94℃5min，变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃1min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落PCR验证含有目标条带的转化子送DNA测序，确定质粒构建成功。
表1用于突变的引物
| Primer | Sequence(5’--3’) |
| N28C-F | ATCCGACGACTGCAATACGCAACCATGGACAAG |
| N28C-R | GTCGTCGGATGCTAGGGCAAATTTC |
| T34C-F | GCAACCATGGTGCAGCCAACTAAAAACGTCCCTG |
| T34C-R | CCATGGTTGCGTATTGTTGTCG |
| N100C-F | CGTCAATGGATGCCTGGTCGCGGACCATGTG |
| N100C-R | TCCATTGACGTAGATCCGGCC |
| Q180C-F | ATTCTGTGCCATGCCAGCACATTCAGGATATCACTGTTCG |
| Q180C-R | TGGCACAGAATACAGCCACACC |
| G194C-F | GGATGTGCAGTGCACCACCGGGCTG |
| G194C-R | CTGCACATCCGTCCGAACAGTG |
| D220C-F | GATAGATGAGTGTGGCACAACCGTAGCGACAAG |
| D220C-R | CTCATCTATCACGGCAACCTG |
PGUS的氨基酸序列如下：
MLKPQQTTTRDLISLDGLWKFALASDDNNTQPWTSQLKTSLECPVPASYNDIFADSKIHDHVGWVYYQRDVIVPKGWSEERYLVRCEAATHHGRIYVNGNLVADHVGGYTPFEADITDLVAAGEQFRLTIAVDNELTYQTIPPGKVEILEATGKKVQTYQHDFYNYAGLARSVWLYSVPQQHIQDITVRTDVQGTTGLIDYNVVASTTQGTIQVAVIDEDGTTVATSSGSNGTIHIPSVHLWQPGAAYLYQLHASIIDSSKKTIDTYKLATGIRTVKVQGTQFLINDKPFYFTGFGKHEDTNIRGKGHDDAYMVHDFQLLHWMGANSFRTSHYPYAEEVMEYADRQGIVVIDETPAVGLAFSIGAGAQTSNPPATFSPDRINNKTREAHAQAIRELIHRDKNHPSVVMWSIANEPASNEDGAREYFAPLPKLARQLDPTRPVTFANVGLATYKADRIADLFDVLCLNRYFGWYTQTAELDEAEAALEEELRGWTEKYDKPIVMTEYGADTVAGLHSVMVTPWSEEFQVEMLDMYHRVFDRFEAMAGEQVWNFADFQTAVGVSRVDGNKKGVFTRDRKPKAAAHLLRKRWTNLHNGTAEGGKTFQ
(SEQ ID NO：1)
实施例2蛋白表达与纯化
400mL LB培养基加入终浓度为的50μg/mL卡那霉素，接菌量1％，37℃培养5h至OD600＝0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，16℃过夜诱导16h。9000rpm离心收菌，50mM PBS(pH7.0，0.15M NaCl)重悬菌体，1200bar低温超高压破碎，13000rpm分离上清与沉淀，弃沉淀，上清过0.45μm水膜后。用AKTA系统和HisTrap HP亲和层析柱纯化，上样缓冲液为50mMPBS(pH7.0，0.15M NaCl)，洗脱缓冲液为50mM PBS(pH7.0，0.15M NaCl，200mM咪唑)，收集目的组分蛋白，用密理博(30kDa)超滤浓缩管脱盐。
实施例3组装及结构的验证
将交联剂Mal2、Mal4用无菌的去离子水溶解，配制成终浓度为20mM的母液，并稀释至10mM和1mM，现配现用。
根据Nanodrop测得蛋白的浓度，将Mal2、Mal4与蛋白(突变体)按照1:2的摩尔比混合，蛋白过量使得交联剂与蛋白之间尽可能形成组装。
反应条件：50mM PBS缓冲液，pH值为7.0，反应温度为4℃，反应时间为10小时。
构建得到N28C-Mal2、T34C-Mal2、N100C-Mal2、Q180C-Mal2、G194C-Mal2、D220C-Mal2、N28C-Mal4、T34C-Mal4、N100C-Mal4、Q180C-Mal4、G194C-Mal4、D220C-Mal4。
其中PGUS(PDB ID：5C71)作为对照组，PGUS为同源四聚体结构，由两个对称平面组成，通过TIM桶状结构域形成PGUS的四聚体界面。(具体结构见文献：Bo Lv,etal.Structure-guided engineering of the substrate specificity of a fungalβ-glucuronidase toward triterpenoid saponins[J].Journal of BiologicalChemistry.2018；293(2):433-443)
(1)Native-PAGE结果(分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％)如图1和图2所示，使用PGUS四聚体作为对照，观察到所有组装体都存在比四聚体迁移速率更慢的条带，条带的分子量不均一，说明所有突变体都能够与Mal2、Mal4交联组装。
(2)凝胶过滤色谱：使用Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱进行纯化和分析，使用PBS缓冲液作为凝胶过滤色谱的洗脱液，流速和检测波长分别为0.65mL/min和280nm。
图3显示PGUS、G194C-Mal2和G194C-Mal4的不同组装程度组装体的保留时间，PGUS四聚体的保留时间为12min，G194C-Mal2组装体可以观察到两个明显的峰，分别对应于组装体和未组装四聚体，组装体的保留时间约为8.5min。G194C-Mal4同样可以观察到两个明显的峰，其中组装体的保留时间约为9min，与G194C-Mal2组装体的保留时间接近。组装效率＝Sa/(Sa+Sf)×100，其中Sa代表组装酶的峰面积，Sf代表未组装游离酶的峰面积。对比组装体和四聚体的峰面积可以得到G194C-Mal2和G194C-Mal4的组装效率分别为13.4％和71.5％，因此使用四臂交联剂Mal4有利于提高组装效率。
图4为PGUS游离酶的TEM图，通过图4可以看出，PGUS为均匀分布的游离状态。
图5为G194C-Mal2组装酶的TEM图，通过图5可以看出，G194C-Mal2呈现一维线性组装结构，能够增加酶结构的刚性，避免了亚基解离导致的活性丧失，从而提高热稳定性。
图6为G194C-Mal4组装酶的TEM图。通过图6可以看出，G194C-Mal4呈现一维线性和分支状的混合结构，四臂交联剂Mal4中增加的马来酰亚胺基团能够与多个酶分子交联，提高了组装效率和组装分子量，从而进一步提高了组装酶的结构刚性和热稳定性。
实施例4酶活测定
反相高效色谱法建立定量测定生物转化甘草酸分析方法。仪器主要参数：岛津LC-10A，色谱柱：ASC Accurasil(4.6×250mm，5μm)，检测器：SPD-10AVP氘灯检测器，检测波长：254nm，流动相A为甲醇，流动相B为6‰的醋酸溶液，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温箱：40℃，工作站：LCsolution。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定义为：每个活力单位在上述条件下每分钟消耗1nmol的甘草酸所需要的酶量。
取40μg组装酶，加入到400μL 50mM pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制的2g/L甘草酸溶液。40℃条件下反应10min后，加入1000μL甲醇中混匀，用0.22μm水系滤膜过滤后，HPLC检测底物甘草酸和产物甘草次酸的含量。
图7展示了突变体N28C、T34C、N100C、Q180C、G194C、D220C及对应组装体的相对活性。通过图7可以看出，突变体和组装体的活性相对于PGUS基本都有所提高，例如G194C-Mal4的活性比PGUS提高了近45％，由此可见，采用本发明Mal2、Mal4不会影响酶活性。
实施例5热稳定性测定
取400μL浓度为1mg/mL的组装酶置于70℃金属浴保温孵育，每隔一定时间段取5μL酶，加入到100μL 50mM pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制的1.25mM pNPG。40℃金属浴反应5min后，添加200μL 0.4M Na2CO3终止反应，酶标仪检测pNP在405nm的吸光度。按pNPG法测定酶活力，以零时刻的酶活作为100％参照算出不同保温时间下的剩余酶活力，确定为β-葡萄糖醛酸苷酶的温度稳定性。1个酶活单位定义为在该上述反应条件释放1μmol的pNP所需要的酶量。
温度70℃孵育时，组装酶的残余活性随着孵育时间逐渐减少，图8展示了组装体N28C-Mal2、T34C-Mal2、N100C-Mal2、Q180C-Mal2、G194C-Mal2、D220C-Mal2在70℃的热稳定性。通过图8可以看出，游离PGUS的半衰期为43.2min，经过Mal2组装后，N28C-Mal2、T34C-Mal2、Q180C-Mal2和G194C-Mal2在超过1h的热处理后酶活几乎没有损失，继续延长热处理时间后，结果显示其热处理2h后四个组装体仍有80％以上酶活，最终得到的半衰期分别为155.2min、133.5min、169.2min和163.7min，热稳定性对比游离酶分别提高了2.6、2.1、2.9和2.8倍。N100C-Mal2和D220C-Mal2也显著提高了热稳定性，半衰期分别是游离PGUS的2.7和2.4倍。
图9展示了组装体N28C-Mal4、T34C-Mal4、N100C-Mal4、Q180C-Mal4、G194C-Mal4、D220C-Mal4在70℃的热稳定性。通过图9可以看出，经过Mal4组装后N28C-Mal4、Q180C-Mal4和G194C-Mal4在超过2h的热处理后酶活几乎没有损失，最终得到的半衰期分别为158.7min、198min和200.8min，热稳定性对比游离酶分别提高了2.67、3.58和3.65倍。T34C-Mal4、N100C-Mal4和D220C-Mal4也显著提高了热稳定性，半衰期分别是游离PGUS的2.6、3.0和2.7倍。
实施例6催化甘草酸的水解工艺
40℃催化甘草酸转化：70mL 2g/L甘草酸置于加热磁力搅拌器上水浴加热，使温度恒温至40℃。吸取8.51mL浓度为2.35mg/mL的酶液，用PBS缓冲液(50mM PBS、150mM NaCl)稀释到10mL，将酶液全部加入甘草酸中，间隔一定时间取样97μL，用3μL 1M NaOH终止反应。在40min、140min、240min、补加0.14g甘草酸。在终止反应的体系中加入1mL甲醇，摇匀后过0.22μm有机滤膜制样，HPLC检测GAMG和GA的量。
50℃催化甘草酸转化：70mL 2g/L甘草酸置于加热磁力搅拌器上水浴加热，使温度恒温至50℃。吸取8.51mL浓度为2.35mg/mL的酶液，用PBS缓冲液(50mM PBS、150mM NaCl)稀释到10mL，将酶液全部加入甘草酸中，间隔一定时间取样97μL，用3μL 1M NaOH终止反应。在40min、140min、240min、补加0.14g甘草酸。在终止反应的体系中加入1mL甲醇，摇匀后过0.22μm有机滤膜制样，HPLC检测底物甘草酸和产物甘草次酸的含量。
甘草酸转化率＝(S0-St)/St×100，其中S0代表提供的总甘草酸浓度，St代表t时刻的甘草酸浓度。甘草次酸产率＝SGA/SGL×100，其中SGA和SGL分别代表甘草次酸和甘草酸的摩尔浓度。
图10为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的甘草次酸浓度变化。从图10可以看出，当反应温度为40℃时，PGUS的甘草次酸浓度在80min后几乎不再增加，而G194C-Mal2和G194C-Mal4在140min后仍显示较高的催化活性。G194C-Mal2最终得到的甘草次酸浓度为2.24g/L，G194C-Mal4最终得到的甘草次酸浓度为1.9g/L。当反应温度为50℃时，PGUS的稳定性较低，甘草次酸浓度在10min后几乎不再增加，最终得到的甘草次酸浓度为0.25g/L。而G194C-Mal4在50℃显示出较高的催化活性和稳定性，80min后甘草次酸的产量增加缓慢，甘草次酸的最终浓度为1.1g/L。
图11为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的转化率变化。从图11可以看出，PGUS(40℃)、G194C-Mal2(40℃)、G194C-Mal4(40℃)、G194C-Mal4(50℃)在开始的140min内，甘草酸转化率的变化基本保持一致，10-40min时甘草酸转化率保持在60％左右，60-140min时甘草酸的转化率保持在80％左右。随着向反应体系中加入更多的甘草酸，PGUS(40℃)的转化率逐渐降低，可能是稳定性降低。而不同温度下的G194C-Mal2和G194C-Mal4在较高的甘草酸浓度下仍然保持较高的转化率。PGUS在50℃下基本失活。
图12为不同温度下组装体G194C-Mal2、G194C-Mal4和PGUS催化甘草酸转化的甘草次酸产率变化。从图12可以看出，0-40min，PGUS(40℃)、G194C-Mal2(40℃)、G194C-Mal4(40℃)、G194C-Mal4(50℃)的甘草次酸产率接近，40min以后G194C-Mal2(40℃)、G194C-Mal4(40℃)的甘草次酸产率保持在60％左右，且在260min以后甘草次酸产率能够明显增加。而PGUS(40℃)的甘草酸产率稳定在40％，在140min以后甘草次酸产率逐渐降低。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，该方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：
所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换；
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有至少两个马来酰亚胺端基；
所述单一突变为以下任意一种：
（1）28位天冬酰胺突变为半胱氨酸；
（2）34位的苏氨酸突变为半胱氨酸；
（3）100位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
（4）180位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸；
（5）194位的甘氨酸突变为半胱氨酸；
（6）220位的天冬氨酸突变为半胱氨酸；
所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的结构式为：PEG-X-MAL；其中，
PEG为聚乙二醇残基，MAL为马来酰亚胺基；
X为PEG与MAL的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rS-、-(CH2)rCOO-和-(CH2)rOCO-中一种或两种以上的组合，r为0-10的整数。
2.根据权利要求1所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述单一突变为以下任意一种：
28位天冬酰胺突变为半胱氨酸，或者是
194位的甘氨酸突变为半胱氨酸，或者是
180位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，r为0-5的整数。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物为双臂聚乙二醇马来酰亚胺，或四臂聚乙二醇马来酰亚胺。
5.根据权利要求4所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物为四臂聚乙二醇马来酰亚胺。
6.根据权利要求4所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的分子量为2000-3400Da。
7.根据权利要求4所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶的摩尔比为1:（1.5-2.5）。
8.根据权利要求7所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶的摩尔比为1：2。
9.根据权利要求4所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述交联的条件为： pH值为6.8-7.4，反应温度为0-10℃，反应时间为2-12小时。
10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的酶组装体。
11.权利要求10所述酶组装体在转化甘草酸生成甘草次酸中的应用。
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