CN116323676A

CN116323676A - 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途

Info

Publication number: CN116323676A
Application number: CN202180066494.1A
Authority: CN
Inventors: 周帅祥; 管哲; 伍伟伟; 高亚荣
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-06-23
Also published as: EP4223778A4; WO2022068810A1; JP2023544143A; EP4223778A1; US20230357389A1; TW202216783A; TWI837517B; AU2021352532A1; AU2021352532A9; KR20230079165A; CA3200865A1

Abstract

涉及特异性结合Claudin18.2和CD3的新型双特异性抗体和抗体片段以及含有所述双特异性抗体或抗体片段的组合物。此外，涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，涉及这些双特异性抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

Description

抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途

本发明涉及特异性结合Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及含有所述抗体的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。本发明还涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

发明背景

Claudins是一个蛋白质家族，是构成细胞紧密连接的重要组成部分。它们建立了控制细胞间分子流动的细胞间屏障，可控制细胞之间分子的流动。Claudins家族蛋白具有四次跨膜结构域，其N端和C端均包括在细胞质中。不同的Claudins蛋白在不同的组织上表达，其功能的改变与各个组织的癌症形成有关，比如Claudin-1表达在结肠癌中并且具有预后价值，Claudin-18在胃癌、胰腺癌高表达，Claudin-10表达在肝细胞癌中高表达。Claudins作为细胞膜表面蛋白，是各种治疗策略的有用靶标。

Claudin-18的同种型2(Claudin 18.2或CLDN18.2)是高度选择性的细胞谱系标记物，其在正常组织中的表达严格限于胃粘膜分化的上皮细胞，但不表达于胃干细胞区。CLDN18.2在相当一部分原发性胃癌中表达，并且在胃转移的癌组织中保留了其表达水平。除胃癌以外，在胰腺癌中也发现有CLDN18.2的表达，是治疗这些癌症的理想的靶标分子(Singh,P.,Toom,S.&Huang,Y.Anti-CLDN18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer.J Hematol Oncol 10,105(2017). https://doi.org/10.1186/s13045-017-0473-4)。

关于胃癌，2014年，全国胃癌新发病例约41万和死亡病例约29万例，几乎占全球发病人数和死亡人数的一半，且仍呈增长趋势。但是存在大量的未被满足的临床肿瘤治疗的需求，因此开发靶向Claudin18.2的药物十分必要。

CD3是与T细胞受体复合物(TCR)结合的在T细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原，并且是T细胞活化所需要的。功能性CD3由以下四种不同链中的两种的二聚缔合形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚体排列包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已显示针对CD3的抗体在T细胞上聚集CD3，从而以类似于通过肽负载的MHC分子参与TCR的方式引起T细胞活化。因此，已提出抗CD3抗体用于涉及T细胞活化的治疗目的。此外，已提出能够结合CD3和靶向肿瘤表面抗原的双特异性抗体能够将肿瘤细胞和T细胞衔接，从而直接活化T细胞，释放颗粒酶、穿孔素及细胞因子杀伤肿瘤，从而达到抑制肿瘤的治疗目的。CLDN18.2在胃癌、胰腺癌、胃食管交界癌等高表达，因此可以通过开发同时结合CD3和Claudin18.2的双特异性抗体来实现治疗目的。

发明概述

在一些方面，本发明提供了双特异性抗体，其中所述抗体包含两个结合结构域，其中所述第一结合结构域特异性结合CLDN18.2，且所述第二结合结构域特异性结合CD3。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合CLDN18.2的第一结合结构域是全人源的，和/或第二结合结构域是人源化的。

在一些方面，本发明的双特异性抗体是IgG样结构的双特异性抗体。

在一方面，本发明涉及以下实施方案：

1、双特异性抗体，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域特异性结合CLDN18.2，第二抗原结合结构域特异性结合 CD3，其中第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:4所示的A1-VH中所含的三个互补决定区域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，和如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:30、22或32所示的A2-VH中所含的三个互补决定区域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的A2-VL中所含的三个互补决定区域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。

2、实施方案1的双特异性抗体，其中

第一抗原结合结构域包含分别如以下氨基酸序列所示的A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3：SEQ ID NO:1、2和3，以及分别如以下氨基酸序列所示的A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3:SEQ ID NO:6、7和8；以及

第二抗原结合结构域包含

(i)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、20和29，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(ii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、20和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(iii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、31和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26。。

3、实施方案1或2的抗体，其中第一抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；和/或

轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

4.实施方案1-3中任一项的抗体，其中第二抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

5、实施方案1-4中任一项的抗体，其还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

6、实施方案1-5中任一项的抗体，其为IgG样结构的双特异性抗体。

7、实施方案1-6中任一项的抗体，其中所述抗体的重链恒定区来自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4，优选的IgG1。

8、实施方案1-6中任一项的抗体，其包含2个重链恒定区，其中一个重链恒定区A1-HC与第一抗原结构域的重链可变区A1-VH相连构成与CDLN18.2结合部分的重链，且另一个重链恒定区A2-HC与第二抗原结合结构域的重链可变区A2-VH相连构成与CD3结合部分的重链，且包含2个轻链恒定区，其中一个轻链恒定区A1-LC与第一抗原结构域的轻链可变区A1-VL相连构成与CLDN18.8结合部分的轻链，且另一个轻链恒定区A2-LC与第二抗原结合结构域的轻链可变区A2-VL相连构成与CD3结合部分的轻链。

9、实施方案8的抗体，其中A1-HC可以与A2-HC相同或不同，和/或A1-LC与A2-LC相同或不同。

10、实施方案8的抗体，其中与CLDN18.2结合部分的A1-VH和A1-VL是全人源的，且与CD3结合部分的A2-VH和A2-VL是人源化的。

11、实施方案8的抗体，其中与CLDN18.2结合部分的重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

与CLDN18.2结合部分的轻链

(i)包含与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

12.实施方案8或11的抗体，其中

与CD3结合部分的重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

与CD3结合部分的轻链

(i)包含与选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

13、分离的核酸，其编码实施方案1至12中任一项的抗体的轻链可变区或重链可变区，或轻链或重链。

14、包含实施方案13的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。

15、包含实施方案13的核酸或实施方案14的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-S细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

16、制备结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码实施方案1至12中任一项的抗体的核酸的条件下培养实施方案15的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体。

17、药物组合物，其包含实施方案1至12中任一项的结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，以及任选地一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)，以及任选地药用辅料。

18、药物组合，其包含实施方案1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。

19、预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段、或实施方案17的药物组合物、或实施方案18的药物组合。

20、实施方案19的方法，其中所述肿瘤为癌症，优选的，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)CLDN18.2，例如所述癌症为胰腺癌或胃癌或胃食管交界癌。

21、实施方案19-20中任一项的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。

附图说明：

图1显示了HB37A6抗体特异性结合细胞表面的CLDN18.2。

图2显示了HB37A6抗体不结合细胞表面的CLDN18.1。

图3显示了HB37A6抗体与胃癌细胞系NUGC-4、胃癌细胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌细胞系DAN-G-hCLDN18.2的结合。

图4显示了HB37A6抗体在胰腺癌小鼠模型的抗肿瘤效果。

图5显示了HB37A6抗体在胃癌小鼠模型的抗肿瘤效果。

图6显示了CD3单抗Hzsp34.24，Hzsp34.87和Hzsp34.97在细胞水平上的结合亲和力。

图7显示了CD3抗体Hzsp34.24、Hzsp34.87和Hzsp34.97的T细胞激活能力。

图8显示了显示了实施例中使用的双特异性抗体结构示意图。

图9显示了本发明的双特异性抗体特异性杀伤CLDN18.2阳性的胃癌细胞NUGC-4。

图10显示了双特异性抗体特异性杀伤CLDN18.2阳性的胰腺癌细胞DAN-GCLDN18.2。

图11显示了双特异性抗体对CLDN18.2表达阴性的细胞没有非特异性的杀伤。

图12显示了在NUGC-4中双特异性抗体依赖的T细胞介导的细胞因子释放。

图13显示了在DAN-G-CLDN18.2中双特异性抗体依赖的T细胞介导的细胞因子释放。

图14显示了CLDN18.2表达依赖的双特异性抗体介导的T细胞激活。

图15显示了双特异性抗体在NUGC-4胃癌人源化模型的体内药效结果。

图16显示了双特异性抗体在DAN-G-CLDN18.2胰腺癌人源化模型的体内药效结果。

图17显示了双特异性抗体在小鼠中的PK。

发明详述

I.定义

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

本文所用的术语“CLAUDIN”或“CLDN”是决定细胞间紧密连接结构的最重要的骨架蛋白，其参与粘附连接，并且在肿瘤细胞的转移和侵袭中起到重要作用。Claudin蛋白广泛存在于哺乳动物上皮和内皮细胞中，其分布主要是上皮细胞侧面以及基底细胞质膜上。不同的Claudin蛋白在不同组织中具有各自特异性表达，其中Claudin18(CLDN18)基因定位于3q22.3，分子量24kDa，包含261个氨基酸残基，属Claudins超家族成员，其蛋白结构包含2个细胞外环和4个穿膜区。人CLDN18或Claudin18蛋白的两个亚型分别是Claudin18.1或CLDN18.1(UniProt ID:P56856-1)，和Claudin18.2或CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)，在二者蛋白的一级结构序列中，仅N端信号肽至细胞外环1(Loop1)结构的某些位置的氨基酸残基上有所区别，尤其是在细胞外环1上，CLDN18.1和CLDN18.2仅8个氨基酸不同。CLDN18的两种亚型蛋白的种属间序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的细胞外环1在人、小鼠、猕猴等不同物种上序列完全一致，而人与小鼠的CLDN18.2蛋白同源性达到84％，表明CLDN18.2蛋白序列极端保守性(O.Tureci.等人.,Gene 481:83-92,2011)。CLDN18.2或其任何变体和同种型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者使用本领域熟知的技术和/或本文所述的那些技术重组产生。在一个实施方案中，本文所述的CLDN18.2是人CLDN18.2。

本文所用的术语“抗CLDN18.2抗体”、“抗CLDN18.2”、“CLDN18.2抗体”或“结合CLDN18.2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)CLDN18.2以致所述抗体可以用作靶向(人)CLDN18.2的治疗剂。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体在体外或体内以高亲和力结合(人)CLDN18.2。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体不结合CLDN18.1。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2的细胞结合而不结合表达CLDN18.1的细胞。在一些实施方案中，所述结合例如通过放射性免疫测定(RIA)、生物膜薄层干涉测定法(BLI)、MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术测量的。

本文所使用的术语“CD3”指表达在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分的抗原，且其是由下列四条受体链中的二条链所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人类CD3-εn(hCD3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P07766.2中所述的氨基酸序列。人类CD3-δ(hCD3δ)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P04234.1中所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所述的CD3是指来自人或食蟹猴的CD3。

本文所使用的术语“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”包含特异性识别单一CD3亚单元(例如ε、δ、γ或ζ)或与其结合的抗体和其抗原结合片段，以及特异性识别两个CD3亚单元的二聚复合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)以及与其连结的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可与可溶性CD3、结合CD3和/或细胞表面表达的CD3结合。可溶性CD3包含天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变异体，例如，缺乏跨膜区或另外不与细胞膜结合的单体和二聚体CD3结构。本发明提供以较低或不可检测的结合亲和力结合人类和食蟹猴CD3从而能够激活人类和食蟹猴的T细胞的抗体。在一些实施方案中，所述结合例如通过放射性免疫测定(RIA)、生物膜薄层干涉测定法(BLI)、MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术测量的。

“细胞表面表达的CD3”一词，指一个或多个CD3蛋白，其在活体内或活体外表达在细胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白暴露于细胞膜的胞外侧且易接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的CD3”包含包括在细胞膜中的功能性T细胞受体环境内的CD3蛋白。“细胞表面表达的CD3”一词包含表达作为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体(例如，δ/ε、γ/ε和ζ/ζCD3二聚体)部分的CD3蛋白。

效应细胞包含效应T细胞(T淋巴细胞)，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1、Th2和调节T细胞(Tregs)。效应细胞还可以包含天然的杀手细胞、巨噬细胞、粒细胞、浆细胞或B细胞(淋巴细胞)。

术语“多特异性抗体”是指至少是双特异性的抗体，即所述抗体包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合一种靶标或抗原且所述第二结合结构域结合另一抗原或靶标。因此，根据本发明的抗体包含对于至少两种不同的抗原或靶标的特异性。根据本发明的抗体也涵盖包含多个结合结构域/结合位点的多特异性抗体，诸如三特异性抗体，其中所述抗体包含三个结合结构域。

双特异性抗体形式包含IgG样和非IgG样抗体(Fan等人(2015)Journal of Hematology&Oncology.8:130)。最常见的IgG样抗体类型包含两个Fab区域和一个Fc区域,每个Fab的重链和轻链可以来自单独的单克隆抗体。非IgG样双特异性抗体缺乏Fc区域，其每一个抗原或靶标结合结构域可以是Fab，也可以是单链可变片段(scFv)，还可以是模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白，不同的结合结构域通过肽接头、化学偶联、非共价键连接或者其他方式连接到一起。这些形式包含双特异性T-细胞衔接子(BiTE)。

可以使用任何双特异性抗体形式或技术来制备本发明的双特异性抗体。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以与如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段等一种或多种其它分子实体功能性连结(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)，以产生双特异性抗体。可以在本发明的背景下使用的具体示例性双特异性形式包含但不限于以下：基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变域(DVD)-Ig、四杂交瘤(Quadroma)、杵臼(knobs-into-holes)、普通轻链(例如，具有旋钮入孔的普通轻链等)、CrossMab、CrossFab，(SEED)body、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG以及Mab ²双特异性形式。

如本文所用的术语“接头”是指使得能够直接连接双特异性抗体的不同部分的任何分子。在不同抗体部分之间建立共价连接的接头的实例包括肽接头和非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。

根据本发明的术语“肽接头”是指氨基酸的序列，其中所述序列将抗体的第一部分的氨基酸序列连接至抗体的第二部分。例如，肽接头可以将抗体的第一(可变和/或结合)结构域连接至第二可变和/或结合)结构域。例如，肽接头也可以将抗体的一部分连接至抗体的另一部分，诸如将抗原结合结构域连接至Fc结构域或其片段。优选地，所述肽接头具有这样的长度，其足以连接两个实体，其方式使得它们维持它们相对于彼此的构象，使得不妨碍期望的活性。

肽接头可以主要包括或可以不主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS) _n、(GSGGS) _n、(GGGGS) _n、(GGGS) _n和(GGGGS) _nG，其中n是至少1(且优选2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整数。有用的接头还包括甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。

根据本发明的术语“价”表示在抗体分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语二价、三价、四价分别表示在抗体构建物中存在两个、三个或四个结合位点。根据本发明的双特异性抗体是至少二价的并且可以是多价的，例如二价、三价、四价或六价的。

如本文所用的术语“结合结构域”是指双特异性抗体的结合特定靶标或抗原的任何部分。结合结构域是抗原结合位点。结合结构域可以是例如抗体或免疫球蛋白本身或抗体片段。这种结合结构域可以具有或可以不具有独立于BsAB的剩余部分的三级结构，并且可以作为单独实体结合或不结合其靶标。

在本发明的某些示例性实施例中，双特异性抗体的每个抗原结合域包括重链可变区VH和轻链可变区VL。在包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域域的双特异性抗体中，第一抗原结合结构域的VH、VL或CDR可以用前缀“A1”表示，并且第二抗原结合结构域的VH、VL或CDR可以用前缀“A2”表示。例如，第一抗原结合结构域的重链CDR(HCDR)在本文中可以称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；并且第二抗原结合结构域的重链CDR在本文中可以称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。类似的，第一抗原结合结构域的重链可变区VH在本文中称为A1-VH，第二抗原结合结构域的重链可变区VH在本文中称为A2-VH。第一抗原结合结构域的轻链CDR(HCDR)在本文中可以称为A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；并且第二抗原结合结构域的轻链CDR在本文中可以称为A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。类似的，第一抗原结合结构域的轻链可变区VL在本文中称为A1-VL，第二抗原结合结构域的轻链可变区VL在本文中称为A2-VL。

术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。

“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’) ₂；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。

术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，CLDN18.2)中与抗体分子特异性相互作用的部分。

与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。

与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定。

抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。

与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)), AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。

例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定:

VH CDR1按照AbM规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定。

在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。

在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定：VH CDR1按照AbM规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定；且轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。

应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在同一指派系统下)。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的CH2和CH3的恒定区域，该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然Fc区域能够和免疫细胞表面的不同的Fc受体结合，从而能够引起CDC\ADCC\ADCP效应功能。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合。在一些实施方案中，Fc区被突变以增强其CDC\ADCC\ADCP效应功能。在一些实施方案中，Fc区被突变以削弱或删除其CDC\ADCC\ADCP效应功能。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4，或者IgG1形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG1。

“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

“人抗体”或“全人抗体”或“全人源抗体”可以互换使用，其指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。

“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学化合物。

术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。

本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。在一些实施方案中，本发明的免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂或免疫检查点激动剂。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤体积)至少约40％、甚至更优选地至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％。

“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。

“分离的编码抗CLDN18.2xCD3双特异抗体或其片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重链或轻链(或其片段，例如重链可变区或轻链可变区)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本文所用，术语“在严格条件下(例如在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下)杂交”描述了杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指导可以在通过引用方式并入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。参考文献中描述了含水方法和非含水方法并且可以使用任一方法。本文中提及的优选的杂交条件如下：1)低严格性杂交条件是在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃(对于低严格性条件，可以增加洗涤的温度至55℃)于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严格性杂交条件是在约45℃于6X SSC中、随后在60℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件是在约45℃在6X SSC中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；并且优选地4)极高严格性杂交条件是在65℃于0.5M磷酸钠、7％SDS中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件和除非另外说明，否则应当使用的一个条件。

术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和血液肿瘤。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括胃癌、胰腺癌或胃食管交界癌，包括那些癌症的转移性形式。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的抗CLDN18.2xCD3双特异性抗体或其片段、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的本发明的抗CLDN18.2xCD3双特异性抗体或其片段和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。

术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。

用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。

II.抗体

在一些实施方案中，本发明的抗CLDN18.2xCD3双特异性抗体以高亲和力结合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)。在一些实施方案中，本发明的抗体特异性结合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)，而不结合CLDN18.1(例如人CLDN18.1)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与人CLDN18.2的结合亲和力高于已知的CLDN18.2抗体，例如Zolbetuximab(简称Zmab)抗体。在一些实施方案中，本发明的抗CLDN18.2 x CD3双特异性抗体以所需的亲和力(例如较低)结合CD3(例如人CD3或食蟹猴CD3)。在一些实施方案中，本发明的抗体能够既结合人CD3，又结合食蟹猴CD3。在一些实施方案中，通过生物膜薄层干涉测定技术或表面等离子共振法测定抗体的亲和力。

在一些实施方案中，本发明的抗CLDN18.2 x CD3双特异性抗体能够结合肿瘤细胞表面的CLDN18.2，以及效应细胞表面的CD3。在一些实施方案中，利用流式细胞术检测所述结合。

在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性杀伤肿瘤细胞，例如表达CLDN18.2的肿瘤细胞。在一些实施方案中，本发明的抗体能够介导细胞因子，例如IL-2、TNFα和/或IFNgamma的释放。在一些实施方案中，本发明的抗体能够激活效应细胞，例如T细胞。

在一些实施方案中，效应细胞为T细胞，例如T淋巴细胞，例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够用于治疗癌症。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段，能够有效抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率大于或等于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，甚至100％。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域特异性结合CLDN18.2，第二抗原结合结构域特异性结合CD3。

在本发明优选的实施方案中，第一抗原结合结构域包含3个来自重链可变区的互补决定区(A1-HCDR)，A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3。

在本发明优选的实施方案中，第一抗原结合结构域包含3个来自轻链可变区的互补决定区(A1-LCDR)，A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含3个来自重链可变区的互补决定区(A1-HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(A1-LCDR)。

在一些方面中，第一抗原结合结构域包含重链可变区(A1-VH)。在一些方面中，第一抗原结合结构域包含轻链可变区(A1-VL)。在一些方面中，第一抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(A1-HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(A1-LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，A1-VH

(iii)包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，A1-VL

在一些实施方案中，本发明的3个来自A1-VH的互补决定区(A1-HCDR)，A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3为

(i)如SEQ ID NO:4所示的VH中所含的三个互补决定区域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，或者

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个A1-HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，本发明的3个来自A1-VL的互补决定区(A1-LCDR)，A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3为

(i)如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3，

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个A1-LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，A1-HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-HCDR1包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A1-HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-HCDR2包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A1-HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-HCDR3包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A1-LCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-LCDR1包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A1-LCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-LCDR2包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A1-LCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A1-LCDR3包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在本发明优选的实施方案中，第二抗原结合结构域包含3个来自重链可变区的互补决定区(A2-HCDR)，A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。

在本发明优选的实施方案中，第二抗原结合结构域包含3个来自轻链可变区的互补决定区(A2-LCDR)，A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含3个来自重链可变区的互补决定区(A2-HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(A2-LCDR)。

在一些方面中，第二抗原结合结构域包含重链可变区(A2-VH)。在一些方面中，第二抗原结合结构域包含轻链可变区(A2-VL)。在一些方面中，第二抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(A2-HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(A2-LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，A2-VH

(i)包含与选自SEQ ID NO:22、30或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:22、30或32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:22、30或32的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，A2-VL

在一些实施方案中，本发明的3个来自A2-VH的互补决定区(A2-HCDR)，A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3为

(i)如SEQ ID NO:22、30或32所示的VH中所含的三个互补决定区域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，或者

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个A2-HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，本发明的3个来自A2-VL的互补决定区(A2-LCDR)，A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3为

(i)如SEQ ID NO:27所示的A2-VL中所含的三个互补决定区域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3，

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个A2-LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，A2-HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-HCDR1包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A2-HCDR2包含SEQ ID NO:20或31的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-HCDR2包含与SEQ ID NO:20或31的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A2-HCDR3包含SEQ ID NO:21或29的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-HCDR3包含与SEQ ID NO:21或29的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A2-LCDR1包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-LCDR1包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A2-LCDR2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-LCDR2包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，A2-LCDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者A2-LCDR3包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体还包含重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体还包含轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含2个重链恒定区，其中一个重链恒定区A1-HC与第一抗原结构域的重链可变区A1-VH相连构成与CDLN18.2结合部分的重链，且另一个重链恒定区A2-HC与第二抗原结合结构域的重链可变区A2-VH相连构成与CD3结合部分的重链。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含2个轻链恒定区，其中一个轻链恒定区A1-LC与第一抗原结构域的轻链可变区A1-VL相连构成与CLDN18.2结合部分的轻链，且另一个轻链恒定区A2-LC与第二抗原结合结构域的轻链可变区A2-VL相连构成与CD3结合部分的轻链。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含A1-HC、A1-LC、A2-HC和A2-LC。在一些实施方案中，A1-HC可以与A2-HC相同或不同。在一些实施方案中，A1-LC可以与A2-LC相同或不同。在一些实施方案中，A1-HC与A2-HC不同，且A1-LC与A2-LC不同。

在一些实施方案中，本发明的重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选的IgG1的重链恒定区，例如野生型IgG1重链恒定区或突变的IgG1重链恒定区(例如IgG1LALA)。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区LC为lambda或Kappa轻链恒定区。

在一些优选的实施方案中，本发明的重链恒定区HC

(i)包含与选自SEQ ID NO:5或23的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:5或23的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:5或23的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些优选的实施方案中，本发明的重链恒定区HC

(i)包含与选自SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区LC

(i)包含与选自SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中

第一抗原结合结构域特异性结合CLDN18.2，第二抗原结合结构域特异性结合CD3，其中第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:4所示的A1-VH中所含的三个互补决定区域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，和如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；

第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:22、30或32所示的A2-VH中所含的三个互补决定区域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的A2-VL中所含的三个互补决定区域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域特异性结合CLDN18.2，第二抗原结合结构域特异性结合CD3，其中

第二抗原结合结构域包含

(i)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、20和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(ii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3： SEQ ID NO:19、20和29，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(iii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、31和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26。

第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的A1-VH，和包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的A1-VL；

第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:22、30或32所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的A2-VH，和包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的A2-VL。

在本发明的一些具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体是IgG-样结构的双特异性抗体，即其包含与CLDN18.2结合部分的重链和轻链，以及与CD3结合部分的重链和轻链。在一些实施方案中，在两条重链的CH3区具有Knob-into-Hole的序列(Shane Atwell等，Journal of Molecular Biology,1997；A.Margaret Merchant等，Nature Biotechnology，1998)，因此形成杵臼结构。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体的结构参见图8。

在一些实施方案中，与CLDN18.2结合部分的重链

(iii)包含与选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，与CLDN18.2结合部分的轻链

在一些实施方案中，与CD3结合部分的重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:39、41或42的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:39、41或42的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:39、41或42的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，与CD3结合部分的轻链

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在抗体重链恒定区的Fc区上，在优选的实施方案中，所述Fc区上的氨基酸改变削弱或删除了抗体的ADCC和/或CDC作用。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表所示：

在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合和/或抗体依赖性细胞毒性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸改变(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体中，与CLDN18.2特异性结合的第一抗原结合结构域，或重链和轻链组合是全人源的，且与CD3结合的第二抗原结合结构域或重链和轻链组合是人源化的。

III.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何双特异抗体的可变区或重链或轻链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如pcDNA3.1。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞(例如CHO-S)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

在一方面，本发明的核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。

例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:4、9、22、27、30、32、37-42 中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:4、9、22、27、30、32、37-42中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸具有一个或多个置换(例如保守性置换)、缺失或插入的核酸：包含编码选自SEQ ID NO:4、9、22、27、30、32、37-42中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO:4、9、22、27、30、32、37-42中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pcDNA3.1。

在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞、CHO-S细胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。

IV.本发明的抗体分子的生产和纯化

在一个实施方案中，提供了制备本发明抗体分子的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生本发明抗体分子，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体，例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

V.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CLDN18.2和/或CD3的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术测量。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何双特异性抗体竞争对CLDN18.2和/或CD3的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的双特异性抗体所结合表位相同或重叠的表位(例如线性或构象表位)。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合CLDN18.2和/或CD3(例如结合人CLDN18.2和/或CD3)，对表达CLDN18.2和/或CD3的细胞的结合，对T细胞的激活作用、对细胞因子的分泌刺激作用、对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用等。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达CLDN18.2和/或CD3或经改造而表达或过表达CLDN18.2和/或CD3细胞系。此类细胞还包括表达CLDN18.2和/或CD3和并非正常情况下表达CLDN18.2和/或CD3的编码DNA转染的细胞系。在一些实施方案中，这类细胞是胃癌细胞或胰腺癌细胞。在一些实施方案中，这些细胞是表达CLDN18.2的CHO细胞。在一些实施方案中，这些细胞是细胞系NUGC-4、KATO III和DAN-G细胞系，例如过表达CLDN18.2的KATO III和DAN-G细胞系。在一些实施方案中，这类细胞是T细胞，例如人T淋巴细胞，例如Jurkat细胞。

可以理解的是，能够使用本发明的抗体和别的活性剂的组合来进行任何上述测定法。

VI.药物组合物

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗体或其组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗体或其片段，以及一种或多种其它治疗剂的组合。

本发明还包括包含本发明的双特异性抗体或其组合物(包括药物组合物)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。

对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

VII.药物组合和药盒

在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的抗体，以及一种或多种其它治疗剂(例如治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等)。

本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。

在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：

-含有包含本发明的双特异性抗体的药物组合物的第一容器；

-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。

VIII.用途和方法

本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗CLDN18.2 x CD3的双特异性抗体或其片段 (优选的抗原结合片段)、药物组合物、药物组合或药盒。

在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)CLDN18.2。

在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤以及转移性病灶。在一个实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。

在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的CLDN18.2。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗体能够杀伤肿瘤细胞，和/或抑制肿瘤细胞增殖，例如表达CLDN18.2的肿瘤细胞，例如胃癌细胞或胰腺癌细胞。

在另一个具体的实施方案中，本发明的抗CLDN18.2 x CD3双特异性抗体能够激活T细胞。

因此，本发明的抗体适用于预防或治疗其中需要细胞毒性T细胞的效应器机制的任何肿瘤或癌症，或需要T细胞募集的任何肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。

在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症，例如胃癌或胰腺癌，受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。

在其他方面，本发明提供抗体分子或药物组合物或药物组合或药盒在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子或药物组合物或药物组合或药盒会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子或药物组合物还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。

在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。

示例性的免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。在一些实施方案中，免疫调节剂还包括免疫检查点抑制剂或激动剂。示例性的其他抗体包括特异性结合免疫检查点的抗体。

在一些实施方案中，本文中描述的抗体组合可以分别施用，例如，作为单独的抗体分别施用。

此类组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。

药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。

组合物还可经由植入膜、海绵或其上吸收或胶囊包封所需分子的另一种适当的材料被局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可被植入到任何合适的组织或器官中，并且可经由扩散、定时释放的大丸剂、或连续施用递送所需分子。

IX.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗体可以用于检测CLDN18.2在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶相关病灶。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的双特异性抗体。在另一个方面中，提供检测CLDN18.2在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测CLDN18.2蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，CLDN18.2是人CLDN18.2。在某些实施方案中，CD3是人CD3。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗体在允许其与CLDN18.2结合的条件下接触，并检测在该抗体和CLDN18.2之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在CLDN18.2。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本发明的抗体用于选择适合利用本发明的双特异性抗体治疗的受试者，例如其中CLDN18.2是用于选择所述受试者的生物标记物。

在一个实施方案中，可以使用本发明抗体诊断肿瘤，例如癌症，例如评价(例如，监测)个体中本文所述疾病的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的双特异性抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。

在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用本发明的抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。

在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。

在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测CLDN18.2。

在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验CLDN18.2的存在，因而确定CLDN18.2值，将CLDN18.2值与对照值比较，并且如果CLDN18.2值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的双特异性抗体，因而治疗所述疾病。

本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

实施例

实施例1、稳定表达细胞株的构建

人源CLDN18.2的过表达细胞株的制备

根据制造商的说明书，使用

试剂盒(Invitrogen,A1369601)构建稳定表达人源Claudin18.2(简称CLDN18.2，以下同)的细胞系。首先将人源CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)的全长基因构建到载体pCHO1.0中，形成质粒，采用化学转染法和电转染法将构建好的质粒分别转入CHO-S细胞(Invitrogen,A1369601)和HEK293细胞(Invitrogen,A14527)中，转染后的细胞经过两轮加压筛选得到分别表达CLDN18.2的细胞池(pool)。然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP，Beckman Coulter)将高表达CLDN18.2的细胞分选出来，通过稀释法获得稳定表达CLDN18.2的单克隆细胞系CHO-hCLDN18.2和HEK293-hCLDN18.2。

人源CLDN18.1的过表达细胞株的制备

根据制造商的说明书，使用

试剂盒(Invitrogen,A1369601)构建稳定表达人源Claudin18.1(简称CLDN18.1，以下同)的细胞系。首先将人源CLDN18.1(UniProt ID:P56856-1)全长基因构建到载体pCHO1.0(Invitrogen,A1369601)中，形成质粒，采用化学转染法将构建好的质粒转入CHO-S细胞(Invitrogen,A1369601)中，转染后的细胞经过两轮加压筛选得到分别表达CLDN18.1的细胞池(pool)。然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP,Beckman Coulter)将高表达CLDN18.1的细胞分选出来，通过稀释法获得稳定表达 CLDN18.1的单克隆细胞系CHO-hCLDN18.1。

过表达CLDN18.2的肿瘤细胞系的构建

将人源CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)的全长基因构建到载体pWPT-GFP(Addgene,12255)中，替换其中的GFP序列，与慢病毒的包装载体psPAX2(Addgene,12260)和pMD2.G(Addgene,12259)共同转染到HEK293T(ATCC,CRL-3216)细胞中，进行病毒的包装。分别收集培养了48小时和72小时后的培养上清，使用PEG8000进行慢病毒的浓缩。用浓缩后的病毒转染胰腺癌DAN-G细胞和胃癌KATO III细胞，然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP,Beckman Coulter)将表达CLDN18.2的细胞分选出来，获得稳定转染CLDN18.2的肿瘤细胞系DAN-G-hCLDN18.2和KATO III-hCLDN18.2。

实施例2、CLDN18.2单克隆的产生

本发明采用杂交瘤技术，通过实施例1获得的细胞(CHO-hCLDN18.2)免疫小鼠H2L2全人源抗体转基因小鼠(购自Harbour BioMed)。然后获取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行电融合。之后收集上清液通过流式细胞仪(FACS)筛选出特异性表达抗CLDN18.2抗体的杂交瘤细胞，且分泌的抗体不与CLDN18.1结合。将实施例1获得的待检测细胞(HEK293-hCLDN18.2)计数，并稀释至1×10 ⁶个细胞/ml,向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，离心，去除细胞培养基。将杂交瘤96孔板培养上清加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，冰上静置30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。每孔加入100μl抗鼠Fab的FITC标记的二抗(1:500稀释于PBS中)，阳性对照抗体加入100μl抗人Fab的FITC标记的二抗。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。将阳性克隆，再用上述同样方法进行CHO-hCLDN18.1的复筛。经过两轮筛选，获得了全人源抗体克隆HB37A6。

实施例3、重组CLDN18.2单克隆抗体的制备

将抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6(参见CN202010570517.X)以及对照抗体zolbetuximab(简称Zmab，序列来源于INN117)以全长单克隆抗体的形式表达在HEK293细胞(Invitrogen,A14527)中。

首先构建表达载体，分别将HB37A6和对照抗体的重链可变区和轻链可变区(参见序列信息)放置在人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:5)和轻链kappa恒定区(SEQ ID NO:10)的N端。之后构建到带有N端信号肽的pcDNA3.1表达载体中，获得轻重链表达载体。将所获得的轻、重链表达载体通过PEI(Polysciences Inc,23966)共转染到HEK293细胞中，培养7天后收集培养基上清。上清通过Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)进行纯化，之后超滤并换液到PBS(Gibco，70011-044)中，采用A280法检测浓度并用SEC-HPLC法测定纯度，获得纯度大于95％的抗体溶液，得到重组CLDN18.2单克隆抗体 HB37A6。

具体转染和纯化过程如下：

根据所需转染体积传代Expi293细胞(Invitrogen,A14527)，转染前一天将细胞密度调整至1.5×10 ⁶个细胞/ml。转染当天细胞密度约为3×10 ⁶个细胞/ml。取终体积1/10的Opti-MEM培养基(Gibco，31985-070)作为转染缓冲液，按1.0μg/ml转染细胞加入适当的质粒，混匀。加合适的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，23966)到质粒中(质粒与PEI的比例在293F细胞中为1:3)，混匀后室温孵育20min，获得DNA/PEI混合物。将DNA/PEI混合物缓慢加入细胞中，边加边轻轻晃动摇瓶，然后置于36.5℃，8％的CO ₂培养箱中培养，七天后获得细胞料液，收集细胞上清进行纯化。

将纯化使用的Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE，11-0034-95)使用0.1M NaOH处理2h，玻璃瓶等用蒸馏水洗净后在180℃干烤4h。纯化前将收集的细胞料液4500rpm离心30min，将上清使用0.22μm的滤器过滤。使用10个柱体积的结合缓冲液(磷酸钠20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡Protein A柱。将过滤后的上清加入纯化柱后使用10个柱体积的结合缓冲液平衡。加5ml洗脱缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠0.1M,pH3.5)，收集洗脱液，每1ml的洗脱液加入80μl浓度为2M Tris-HCl。将收集的抗体超滤浓缩交换到PBS(Gibco，70011-044)中，并检测浓度。

实施例4、SPR法测定CLDN18.2抗体亲和力

采用表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定HB37A6结合人CLDN18.2的平衡解离常数(K _D)。根据制造商的说明，使用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，将人Claudin18.2(GenScrip，P50251802)偶联在CM5芯片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶联后注入1M乙醇胺，对剩余的活化位点进行封闭。根据制造商的说明，通过Biacore(GE Healthcare，T200)检测芯片表面抗原与流动相中的抗体之间的结合与解离获得亲和力及动力学常数。将梯度稀释后的抗体(0-100nM)，由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，解离时间600s。最后使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)对芯片进行再生。数据结果使用Biacore T200分析软件，以1:1结合模型进行动力学的分析。如表1所示：HB37A6亲和力均优于对照抗体Zmab。

表1.SPR法检测CLDN18.2抗体的亲和力常数(平衡解离常数)

实施例5、CLDN18.2抗体与CLDN18细胞的结合特异性

通过流式细胞术(FACS)测定上述抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6以及对照抗体Zmab分别与实施例1获得的稳定转染了人源CLDN18.2和人源CLDN18.1的CHO-S细胞系(即如实施例1所述制备的CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)的结合。

具体而言，将实施例1获得的待检测细胞(CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)计数，并稀释至1×10 ⁶个细胞/ml,向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，离心，去除细胞培养基。将抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6以及对照抗体Zmab加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，抗体的起始浓度为900nM，然后依次3倍稀释，共10个浓度点。冰上静置30min。500g5min去除上清，PBS洗细胞1遍。每孔加入100μl山羊抗人Fc的PE标记的二抗(SouthernBiotech,J2815-5H87B)。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。使用GraphPad Prism软件分析实验数据，得到图1和图2。如图1和图2所示，所述抗体均特异地结合人CLDN18.2，而不与人CLDN18.1结合。

实施例6、CLDN18.2抗体与肿瘤细胞系的结合

参照实施例5，通过FACS测定HB37A6与胃癌细胞系NUGC-4(JCRB细胞库，JCRB0834)、胃癌细胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌细胞系DAN-G-hCLDN18.2的结合。图3显示全人源抗体HB37A6均具有较好的肿瘤细胞特异性结合，优于对照抗体Zmab。

实施例7、CLDN18.2抗体的体内抗肿瘤效果

1、抗体对DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型的活性

应用HB37A6抗体测试其在带有人胰腺癌的NOD-SCID小鼠(雌性NOD-SCID小鼠(15-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，数量60只)内的抗肿瘤效果。将实施例1构建的人胰腺癌细胞DAN-G-hCLDN18.2进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散DAN-G-hCLDN18.2，获得细胞密度为12×10^5个/ml的悬液。将细胞悬液与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为6×10^5个/ml细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOD-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型。

肿瘤细胞接种5天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在43.36mm ³～89.47mm ³范围内的小鼠按瘤体积大小蛇形分组(每组8只小鼠)分组。

对每只小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批号160308-02)和HB37A6及对照抗体Zmab，给药剂量为每次10mg/kg，分别在接种后第5、9、12、16天给药，每周2-3次监测小鼠瘤体积。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W ²/2。采用电子天平测定体重。

2、抗体对NUCG-4荷瘤小鼠模型的活性

选取HB37A6抗体测试其在带有人胃癌的NOG小鼠(雌性NOG小鼠(15-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，数量100只)内的抗肿瘤效果。将PBMC细胞(Allcells)复苏，离心收集细胞，以PBS(1×)分散PBMC细胞，细胞密度为2.5×10^6个/ml细胞悬液，在第0天取0.2ml细胞悬液用于NOG小鼠眼静脉注射，建立NOG人源化小鼠模型。

将NUGC-4细胞进行常规复苏传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散NUGC-4细胞，细胞密度为12×10^6个/ml与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为6×10^6个/ml细胞悬液。在第5天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOG人源化小鼠右侧腹部区域中来建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。

肿瘤细胞接种后第1天随机分组，每组7只，对每只小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批号160308-02)和HB37A6及对照抗体Zmab，给药剂量为每次10mg/kg，分别在接种后第1、5、8、12天给药，每周2-3次监测小鼠瘤体积与体重。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W ²/2。采用电子天平测定体重。在接种第26天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：

TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。

3、结果

结果如图4所示，HB37A6及对照抗体Zmab在人胰腺癌DAN-G-CLDN18.2小鼠模型上都能抑制肿瘤生长，HB37A6的TGI为28％，Zmab的TGI为24％。如图5所示，HB37A6在人胃癌NUGC-4小鼠模型上比对照抗体Zmab展示出更佳的抗肿瘤效果，HB37A6的TGI为31％，Zmab的TGI为0％。

实施例8 抗CD3单克隆抗体的制备

将鼠源CD3抗体sp34(U.S.Pat.No.8,236,308；J.Immunol.Methods.,1994,178:195)和sp34经过人源化和亲和力优化的抗CD3单克隆抗体HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和以全长单克隆抗体的形式在HEK293细胞(Invitrogen,A14527)中表达。

将HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97、sp34的重链可变区重链可变区和轻链可变区(参见序列信息)放置在IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:23)和轻链lambda恒定区(SEQ ID NO:28)的N端。之后构建到带有N端信号肽的pcDNA3.1表达载体中，获得轻重链表达载体。将所获得的轻、重链表达载体通过PEI(Polysciences Inc,23966)共转染到HEK293细胞中，培养7天后收集培养基上清。上清通过Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)进行纯化，之后超滤并换液到PBS(Gibco，70011-044)中，采用A280法检测浓度并用SEC-HPLC法测定纯度，获得纯度大于95％的抗体溶液，得到重组抗CD3单克隆抗体HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗体sp34。具体转染和纯化过程参见实施例3。

实施例9.抗CD3单克隆抗体与人CD3的结合

Jurkat细胞是永生化的人T淋巴细胞，其表达人的CD3复合物，利用该细胞系检测本发明的抗体与该细胞的结合情况。

详细操作为：将Jurkat细胞(Promega,J1621)接种于U型96孔板中，每孔2×10 ⁵个，将所要检测的抗体(抗CD3单克隆抗体HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗体sp34)按照一系列的浓度梯度(抗体分子起始浓度为500nM,3倍梯度进行稀释)，加入到对应的细胞孔中，置于4℃孵育30分钟，然后使用PBS清洗未结合的部分，加入羊抗人Fc的PE荧光二抗(SouthernBiotech,J2815-5H87B)，4℃孵育15分钟后，使用流式细胞仪(FACSCELESTA,BD)上机检测。

结果：

如图6显示，人源化CD3抗体HzSP34.24与鼠源抗体sp34在细胞水平上表现出了相当的亲和力，而Hzsp34.87和Hzsp34.97与CD3在细胞水平的亲和力出现了不同程度的弱化。

实施例10.CD3抗体的T细胞激活功能检测

本发明使用Jurkat NFAT(Nuclear Factor of Activated T)报告细胞(Promega,J1621)检测抗CD3单克隆抗体HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗体sp34的T细胞激活功能，该细胞是工程化改造的Jurkat T细胞，当该细胞通过TCR-CD3通路被激活后，通过下游信号NFAT向实验体系中释放荧光素酶底物，从而可以检测T细胞的激活程度。

本实施例的详细操作为：使用白色96孔平底板，每孔将Jurkat NFAT细胞4×10 ⁴个与对应浓度的各个抗体分子(抗体分子起始浓度为500nM,3倍梯度进行稀释)混合，置于37℃培养箱孵育6-8小时，然后每孔加入100微升Bio-Glo(Promega,G7940)，使用酶标仪(Spectra,Molecular Devices)进行波长检测。结果如图7所示，鼠源CD3抗体sp34，人源化CD3抗体HzSP34.24，Hzsp34.87和Hzsp34.97均具有T细胞激活能力。

实施例11.双特异性抗体的构建与制备

按表2组合，将抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6与3个不同抗人CD3单克隆抗体HzSP34.24、HzSP34.87和HzSP34.97的抗原结合区的序列分别构建靶向CLDN18.2×CD3的“1+1”形式的双特异性抗体030、032和033，其抗体结构示意图参见图8。具体而言，特异性靶向CLDN18.2的抗原结合结构域的重链可变区序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区序列为SEQ ID NO:9；特异性靶向CD3的抗原结合结构域的重链可变区序列为：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32，轻链可变区序列为SEQ ID NO:27。抗体的Fc段选取杵臼结构的IgG1LALA序列(A.Margaret Merchant等，Nature Biotechnology，1998)。因此，双特异性抗体CLDN18.2端部分的重链为SEQ ID NO:37，轻链为SEQ ID NO:38。双特异性抗体CD3端部分的重链分别为SEQ ID NO:39、41和42，轻链为SEQ ID NO:40。

双特异性抗体的质粒构建过程为：分别将CLDN18.2的重链序列(SEQ ID NO:37)、CLDN18.2的轻链序列(SEQ ID NO:38)，CD3的重链序列(SEQ ID NO:39、41和42)、CD3的轻链序列(SEQ ID NO:40)插入到载体pcDNA3.1(Invitrogen,V790-20)中，分别得到CLDN18.2端的重链质粒、轻链质粒，CD3端的重链质粒、轻链质粒。然后利用PEI(Polysciences，23966)分别将CLDN18.2端的重链质粒、轻链质粒和CD3端的重链质粒和轻链质粒瞬时转染到Expi293细胞(Invitrogen,A14527)中，表达CLDN18.2端的和CD3端的3个抗体分子。7天后获得细胞发酵液，将其过滤澄清，分别用Hitrap Mabselect Sure的Protein A柱(GE Healthcare，11-0034-95)进行捕获，得到CLDN18.2端和CD3端的抗体。采用A280法检测浓度之后，两端的抗体按摩尔比例1:1混合。加入适量还原剂GSH，室温反应过夜。超滤去除还原剂，终止反应。之后采用MonoS阳离子交换层析(GE Healthcare,17-5168-01)进行精细纯化，A液为20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.6)，B液为含有1M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.6)，洗脱梯度为0-50％(30柱体积)。将洗脱得到的蛋白溶液超滤并换液到PBS(Gibco，70011-044)中，用质谱进行分子量的测定，并用SEC-HPLC进行纯度鉴定。获得的030、032和033双特异性抗体用于以下实施例。

表2.CD3/CLDN18.2双特异性抗体列表

	抗CLDN18.2端	抗CD3端
030	HB37A6	HzSP34.24
032	HB37A6	HzSP34.87
033	HB37A6	HzSP34.97

实施例12.双特异性抗体亲和力测定

采用生物膜薄层干涉测定技术(BLI)测定本发明双特异性抗体结合人CD3蛋白的平衡解离常数(KD)。BLI法亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)进行。

实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AHC(18-5060,Fortebio)传感器浸泡于SD缓冲液(1x PBS，BSA 0.1％，Tween-20 0.05％)中。取100μl的SD缓冲液、各双特异性抗体、人CD3蛋白(CT026H0323H，北京义翘神州)，分别加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。使用Fortebio Octet Red96进行检测，根据样品位置布板，选择传感器位置。仪器设置参数如下：运行步骤：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation；各个步骤运行时间取决于样品结合和解离速度，转速为1000rpm，温度为30℃。使用ForteBio Octet分析软件分析KD值。

双特异性抗体的亲和力如表3所示。其中，030分子CD3端亲和力最高，为7.4nM。032和033分子CD3端亲和力依次降低，分别为89nM和440nM。

表3.双特异性抗体CD3端亲和力

	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
030	6.927E+5	0.005164	7.455E-9
032	8.066E+5	0.07183	8.906E-8
033	3.788E+5	0.1689	4.459E-7

采用表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定结合人CLDN18.2的平衡解离常数(KD)。根据制造商的说明，使用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，将抗原人Claudin18.2(GenScrip，P50251802)偶联在CM5芯片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶联后注入1M乙醇胺，对剩余的活化位点进行封闭。根据制造商的说明，通过Biacore(GE Healthcare，T200)检测芯片表面抗原与流动相中的各个双特异性抗体之间的结合与解离获得亲和力及动力学常数。将梯度稀释后的抗体(0-100nM，2倍稀释)，由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，解离时间600s。最后使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)对芯片进行再生。数据结果使用Biacore T200分析软件，以1:1结合模型进行动力学的分析。结果如表4所示，030,032和033双特异性抗体在CLDN18.2端采用的是同一个克隆HB37A6，CLDN18.2端的亲和力一致，具有非常强的亲和力，为0.57nM。

表4.双特异性抗体CLDN18.2端亲和力

实施例13.体外T细胞杀伤实验

将实施例11获得的030,032和033双特异性抗体进行体外T细胞杀伤实验。用完全培养基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10％胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重悬人外周血单个核细胞(PBMC,Allcells or Saily)，将PBMC调整为2×10 ⁶个/ml。

将NUGC-4或过表达Claudin18.2的DAN-G肿瘤靶细胞DAN-G-hCLDN18.2，非靶细胞L363(DSMZ，ACC49)用Far-Red(Invitrogen)标记10min，洗涤两次后重悬在完全培养基中，细胞浓度调整为2×10 ⁵个/ml。

将PBMC与双特异性抗体030、032和033分别混合(其中030、032使用的初始浓度为1nM，033使用的初始浓度为400nM，所有抗体均5倍稀释，共10个浓度点)，37℃孵育30min，然后按照10:1的效靶比，将50μl肿瘤靶细胞(1×10 ⁴个)加入到50μl PBMC效应细胞中。37℃孵育24小时，离心，用终浓度为10μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide,PI,Invitrogen)重悬细胞，用流式细胞仪(BD，FACSCELESTA)检测Far-Red和PI双阳的细胞。通过FACSDiva software(BD,Celestsa)计算肿瘤靶细胞杀伤比例。

从图9结果显示，030和032分子在胃癌细胞NUGC-4上具有非常强的杀伤活性，EC50值均小于1pM。而从图10结果显示，在CLDN18.2高表达的胰腺癌细胞DAN-G-hCLDN18.2上，两者EC50值甚至小于0.1pM。而033分子在两个肿瘤细胞系上的杀伤活性较弱，弱于030和032，约低1000倍，但是仍能达到最大杀伤(接近100％裂解细胞)。但在CLDN18.2表达阴性的情况下，030,032和033分子均未没有非特异性的杀伤(图11)。这说明030,032和033分子均展示了依赖CLDN18.2表达的肿瘤细胞特异性杀伤。而且，本发明的双特异性抗体的杀伤效果与CLDN18.2在细胞表面的丰度有关，在一定的表达丰度范围内，细胞表面的CLDN18.2表达量越高，则杀伤效果越好。

实施例14.体外细胞因子释放实验

用完全培养基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10％胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重悬人外周血单个核细胞(PBMC,Allcells or Saily)，将 PBMC调整为2×10 ⁶个/ml。将NUGC-4或过表达Claudin18.2的DAN-G肿瘤靶细胞DAN-G-hCLDN18.2浓度调整为2×10 ⁵个/ml。

将PBMC与双特异性抗体030、032和033分别混合，37℃孵育30min，然后按照10:1的效靶比，将50μl肿瘤靶细胞(1×10 ⁴个)加入到50μl PBMC效应细胞中。37℃孵育24小时，离心，取细胞上清。用Human Th1/Th2/Th17Kit试剂盒(BD,货号560484)检测细胞因子，室温孵育3小时，用流式细胞仪(BD，FACSCELESTA)检测，通过FCAP Array software(BD)分析上清中细胞因子的释放。

从图12和图13的结果显示，030，032和033分子在胃癌细胞NUGC-4和胰腺癌细胞DAN-G-hCLDN18.2上均能够介导IL-2、TNFα和IFNgamma细胞因子的大量释放，并且与CD3端的亲和力呈正相关。

实施例15.体外T细胞激活实验

用完全培养基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10％胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重悬人外周血单个核细胞(PBMC,Allcells or Saily)，将PBMC调整为2×10 ⁶个/ml。

将NUGC-4或过表达Claudin18.2的DAN-G肿瘤靶细胞DAN-G-CLDN18.2浓度调整为2×10 ⁵个/ml。将PBMC与双特异性抗体030、032和033分别混合，37℃孵育30min，然后按照10:1的效靶比，将50μl肿瘤靶细胞(1×10 ⁴个)加入到50μl PBMC效应细胞中。37℃孵育24小时，离心，去掉上清，将细胞用BV421抗人CD3(Biolegend,317344),PerCP/Cy5.5小鼠抗人CD4(BD,552838),APC/Cy7抗人CD8a(Biolegend,300926),PE抗人CD25(Biolegend,302606),FITC抗人CD69(Biolegend,310904)4℃孵育一小时，然后用1×PBS洗涤三次，用流式细胞仪(BD，FACSCELESTA)分别检测CD4+和CD8+T细胞中CD25和CD69双阳的细胞比例，通过FACSDiva software(BD,Celestsa)计算CD4+和CD8+T细胞中CD25和CD69双阳的细胞比例，即为CD4和CD8+T细胞激活的比例。

根据图14所示，30，032和033分子在胃癌细胞NUGC-4共培养的情况下能够特异性激活T细胞，并且激活能力与CD3端的亲和力呈正相关。

实施例16.体内药效实验—胃癌模型

本实验研究在NOG雌性小鼠上双特异性抗体对NUGC-4荷瘤的抗肿瘤作用。选取49只NOG雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

将PBMC细胞(Allcells)复苏，离心细胞，以PBS(1×)分散PBMC细胞，获得细胞密度为2×10 ⁷/ml的细胞悬液。取200μl细胞悬液对小鼠进行眼眶静脉注射PBMC细胞，4×10 ⁶/只。

将NUGC-4细胞进行常规复苏传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散NUGC-4细胞，细胞密度为6×10 ⁷个/ml与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为3×10 ⁷个/ml细胞悬液。在第3天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOG人源化小鼠右侧腹部区域中来建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。

细胞接种后第7天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的最大宽轴和最大长轴，计算瘤体积，挑选出瘤体积在53.35mm ³～168.07mm ³内的小鼠，根据小鼠瘤体积进行蛇形分组(每组6只小鼠)。对每只小鼠静脉注射本发明的双特异性抗体030、032和033，以及阴性对照h-IgG(Equitech-Bio，批号160308-02)，给药剂量为0.3mg/kg和1mg/kg，每周给药一次，一共给药4次，测量小鼠肿瘤体积频率为一周两次。同时计算肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：

根据图15所示，在人胃癌NUCG-4荷瘤小鼠模型上，030和032在0.3mg/kg的低剂量能达到TGI 100％，而在高剂量1mg/kg下更是达到50％CR(complete remission，完全缓解)(6只小鼠中有3只达到肿瘤完全消失)。而033分子在低剂量下几乎没有药效，在1mg/kg剂量下，TGI能达到20％。整个实验过程，实验组和对照组小鼠体重没有下降。

实施例17.体内药效实验—胰腺癌模型

本实验研究在NOG雌性小鼠上双特异性抗体对DAN-G-Claudin18.2荷瘤的抗肿瘤作用。将49只NOG小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行眼眶静脉注射PBMC细胞，4×10 ⁶/只，接种体积200ul/只(如实施例18所示)。此时记为第0天。

将实施例1构建的人胰腺癌细胞DAN-G-CLDN18.2进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散DAN-G-CLDN18.2，获得细胞密度为10×10 ⁶个/ml的悬液。将细胞悬液与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为5×10 ⁶个/ml细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOD-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立CLDN18.2过表达的DNA-G胰腺癌人源化模型。

肿瘤细胞接种7天后用游标卡尺测量小鼠肿瘤的最大宽轴和最大长轴，计算瘤体积，根据小鼠瘤体积进行蛇形分组，将瘤体积在46.42mm ³～120.64mm ³范围内的小鼠按瘤体积大小蛇形分组(每组6只小鼠)分组。

对每只小鼠静脉注射本发明的双特异性抗体030、032和033，以及阴性对照h-IgG(Equitech-Bio，批号160308-02)，腹腔给药剂量为0.3mg/kg和1mg/kg，每周给药一次，一共给药4次，测量小鼠肿瘤体积频率为一周两次。同时计算肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：

TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。如图16所示，在CLDN18.2过表达的DNA-G胰腺癌人源化模型中，030和032分子在两个剂量下均能达到TGI 100％。而033分子也分别达到TGI 42％(0.3mg/kg)和TGI 76％(1mg/kg)，这可能与DAN-G-CLDN18.2胰腺癌细胞表达CLDN18.2表达量高有关。整个实验过程，实验组和对照组的小鼠体重没有下降。

实施例18.小鼠PK实验

本研究利用尾静脉给药的方法，向雌性Balb/C小鼠(维通利华)注射10mg/kg的030、032和033，从而研究其在小鼠体内的药代动力学性质。小鼠给药后分别在0.086hr、0.5hr、2hr、6hr、24hr、48hr、4day、7day、14day和21day时间点时经眼球取血，血液于4℃3000rpm离心10min，收集血清。利用ELISA测定血清中抗体含量，计算获得030、032和033在小鼠体内的半衰期。

实验结果如图17所示，030、032和033在小鼠体内的半衰期均达到了与正常单抗类似的PK。进而说明本发明构建的双特异性抗体没有影响抗体的半衰期。

序列信息：

Claims

双特异性抗体，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域特异性结合CLDN18.2，第二抗原结合结构域特异性结合CD3，其中第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:4所示的A1-VH中所含的三个互补决定区域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，和如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:30、22或32所示的A2-VH中所含的三个互补决定区域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的A2-VL中所含的三个互补决定区域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。
权利要求1的双特异性抗体，其中

第一抗原结合结构域包含分别如以下氨基酸序列所示的A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3：SEQ ID NO:1、2和3，以及分别如以下氨基酸序列所示的A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3:SEQ ID NO:6、7和8；以及

第二抗原结合结构域包含

(i)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、20和29，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(ii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、20和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26；或

(iii)分别如以下氨基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO:19、31和21，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:24、25和26。
权利要求1或2的抗体，其中第一抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；和/或

轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
权利要求1-3中任一项的抗体，其中第二抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:30、22或32的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
权利要求1-4中任一项的抗体，其还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
权利要求1-5中任一项的抗体，其为IgG样结构的双特异性抗体。
权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述抗体的重链恒定区来自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4，优选的IgG1。
权利要求1-6中任一项的抗体，其包含2个重链恒定区，其中一个重链恒定区A1-HC与第一抗原结构域的重链可变区A1-VH相连构成与CDLN18.2结合部分的重链，且另一个重链恒定区A2-HC与第二抗原结合结构域的重链可变区A2-VH相连构成与CD3结合部分的重链，且包含2个轻链恒定区，其中一个轻链恒定区A1-LC与第一抗原结构域的轻链可变区A1-VL相连构成与CLDN18.2结合部分的轻链，且另一个轻链恒定区A2-LC与第二抗原结合结构域的轻链可变区A2-VL相连构成与CD3结合部分的轻链。
权利要求8的抗体，其中A1-HC可以与A2-HC相同或不同，和/或A1-LC与A2-LC相同或不同。
权利要求8的抗体，其中与CLDN18.2结合部分的A1-VH和A1-VL是全人源的，且与CD3结合部分的A2-VH和A2-VL是人源化的。
权利要求8的抗体，其中与CLDN18.2结合部分的重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:37的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/ 或

与CLDN18.2结合部分的轻链

(i)包含与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
权利要求8或11的抗体，其中

与CD3结合部分的重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:41、39或42的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

与CD3结合部分的轻链

(i)包含与选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
分离的核酸，其编码权利要求1至12中任一项的抗体的轻链可变区或重链可变区，或轻链或重链。
包含权利要求13的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
包含权利要求13的核酸或权利要求14的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-S细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
制备结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至12中任一项的抗体的核酸的条件下培养权利要求15的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体。
药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，以及任选地一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)，以及任选地药用辅料。
药物组合，其包含权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。
预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段、或权利要求17的药物组合物、或权利要求18的药物组合。
权利要求19的方法，其中所述肿瘤为癌症，优选的，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)CLDN18.2，例如所述癌症为胰腺癌或胃癌或胃食管交界癌。
权利要求19-20中任一项的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。