CN116322760A

CN116322760A - 冠状病毒抗原组合物及其用途

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Publication number: CN116322760A
Application number: CN202180061078.2A
Authority: CN
Inventors: 阿瓦克·卡维吉安; 亚历山德拉·索菲·德波尔; 亚恩·保罗·盖伊·雷吉斯·埃克拉德; 尼古拉斯·麦卡特尼·普拉吉斯; 罗杰·约瑟夫·哈贾; 迈克尔·多纳托·梅尔菲; 詹尼弗·A·纳尔逊
Original assignee: Flagship Venture & Innovation No6 Co ltd
Current assignee: Flagship Venture & Innovation No6 Co ltd
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2023-06-23
Also published as: CA3179420A1; WO2021236980A1; EP4153224A1; MX2022014653A; JP2023526422A; TW202206097A; WO2021236980A8; AU2021275223A1; IL298362A

Abstract

本披露提供了包含含有编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸的组合物和方法，以及包含含有编码冠状病毒抗原的序列的线性多核糖核苷酸的组合物和方法。提供了与例如使用所披露的环状多核糖核苷酸或所披露的线性多核糖核苷酸生成多克隆抗体有关的组合物和方法。

Description

冠状病毒抗原组合物及其用途

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过援引以其全文并入。创建于2021年5月20日的所述ASCII副本名称为51509-020WO6_Sequence_Listing_5.20.21_ST25并且大小是207,385字节。

背景

迫切需要对冠状病毒有活性的疫苗和治疗剂。

概述

本披露总体上涉及包含编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸和包含该环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露进一步涉及使用包含编码冠状病毒抗原的序列的该环状多核糖核苷酸和该免疫原性组合物的方法。在一些实施例中，本披露的环状多核糖核苷酸和免疫原性组合物用于生成多克隆抗体的方法中。所产生的多克隆抗体可用于受试者(例如，人类受试者)的预防方法中或治疗具有冠状病毒感染的受试者(例如，人类受试者)的方法中。所产生的多克隆抗体可以施用给处于暴露于冠状病毒感染的高风险中的受试者。

本披露还涉及包含编码选自表3的SEQ ID NO的序列的线性多核糖核苷酸和包含该线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露进一步涉及使用包含编码冠状病毒抗原的序列的该线性多核糖核苷酸和包含该线性多核糖核苷酸的该免疫原性组合物的方法。在一些实施例中，本披露的线性多核糖核苷酸和免疫原性组合物用于生成多克隆抗体的方法中。所产生的多克隆抗体可用于受试者(例如，要治疗的人类受试者)的预防方法中或治疗具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的人类受试者)的方法中。所产生的多克隆抗体可以施用给处于暴露于冠状病毒感染的高风险中的要治疗的受试者。

一方面，本发明的特征在于一种组合物(例如免疫原性组合物)，该组合物包含(a)环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原的序列，例如选自表1或表2中的SEQ ID NO.的序列，或(b)线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含选自表3中的SEQ ID NO.的序列。

在一个实施例中，该组合物进一步包含来自非人类动物(例如，包含人源化免疫系统的非人类动物)或人类受试者(例如，在要免疫接种的受试者进行免疫接种之后)的血浆。

在一个实施例中，该组合物进一步包含来自非人类动物(例如，包含人源化免疫系统的非人类动物)的血浆和冠状病毒抗原(例如，在要免疫接种的非人类动物受试者进行免疫接种之后)。在一个实施例中，该组合物进一步包含来自人类受试者的血浆(例如，在要免疫接种的人类受试者进行免疫接种之后)和冠状病毒抗原。

在一些实施例中，该组合物进一步包含含有人源化免疫球蛋白基因座和人源化B细胞受体的非人B细胞，其中该人源化B细胞受体与该冠状病毒抗原结合。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含多个非人B细胞，其中该多个非人B细胞中的非人B细胞包含人源化免疫球蛋白基因座，其中该多个非人B细胞包含与冠状病毒抗原的第一表位结合的第一B细胞和与冠状病毒抗原的第二表位结合的第二B细胞。

在一些实施例中，该冠状病毒抗原来自β冠状病毒或其片段，或来自沙贝科病毒(sarbecovirus)或其片段。在一些实施例中，该冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒或其片段。在一些实施例中，该冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其片段、严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)或其片段、或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或其片段。

在一些实施例中，该冠状病毒抗原是膜蛋白或其变体或片段、病毒的包膜蛋白或其变体或片段、病毒的刺突蛋白或其变体或片段、病毒的核衣壳蛋白或其变体或其片段、病毒的辅助蛋白或其变体或片段。在一些实施例中，该冠状病毒抗原是刺突蛋白或其变体或片段的受体结合结构域。在一些实施例中，该刺突蛋白缺乏裂解位点。在一些实施例中，冠状病毒的辅助蛋白选自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何变体或片段组成的组。在一些实施例中，该冠状病毒抗原包含与选自表1的序列或选自表2的SEQ ID NO.的序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含与选自表2的SEQ ID NO.的序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

在一些实施例中，该多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列均编码抗原，并且该多个序列中的至少一个序列编码冠状病毒抗原。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含两个或更多个ORF。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含至少五个序列，每个序列均编码抗原并且这些抗原中的至少一种抗原是冠状病毒抗原。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含至少两个ORF，例如至少2、3、4或5个ORF。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含5至20个序列，每个序列均编码抗原并且这些抗原中的至少一种抗原是冠状病毒抗原。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含5至10个序列，每个序列均编码抗原并且这些抗原中的至少一种抗原是冠状病毒抗原。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含编码来自至少两种不同微生物的抗原的序列，并且至少一种微生物是冠状病毒。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含编码两种或更多种抗原的序列并且至少一种抗原是由表3中的SEQ ID NO.的序列编码的冠状病毒抗原。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含编码至少2、3、4或5种抗原的序列，并且至少一种抗原是由表3中的SEQ ID NO.的序列编码的冠状病毒抗原。在一些实施例中，该冠状病毒抗原包含表位。在一些实施例中，该冠状病毒抗原包含被B细胞识别的表位。在一些实施例中，该冠状病毒抗原包含至少两个表位。

在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的组合物或免疫原性组合物进一步包含含有编码第二抗原的序列的第二环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含含有第二ORF的第二环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含含有编码第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含含有编码第二抗原的序列的第二线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，包含该线性多核糖核苷酸的该组合物或免疫原性组合物进一步包含含有第二ORF的第二线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含含有编码第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原是不同的抗原。

在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，该多核糖核苷酸在没有载剂的情况下施用(“裸露”)。在其他实施例中，该多核糖核苷酸与载剂例如LNP、VLP、脂质体等一起配制。

在一些实施例中，该组合物进一步包含佐剂。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含稀释剂。在一些实施例中，该组合物或免疫原性组合物进一步包含鱼精蛋白。

另一方面，本发明的特征在于包括以下步骤的方法：(a)向非人类动物或向人类受试者施用本文所述的组合物(例如，包含以下的组合物：(i)环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原的序列，例如选自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或(ii)线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含选自表3中的SEQ ID NO.的序列)(例如，以诱导针对该抗原的免疫反应或在要免疫接种的非人类动物或人类受试者中产生针对该抗原的多克隆抗体)以及(b)任选地，从该非人类动物或该人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)收集针对该抗原的抗体。

在一些实施例中，该方法进一步包括向非人类动物或向人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用佐剂(例如，Addavax^TM佐剂、MF59、AS03、弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant))。该佐剂可以与该多核糖核苷酸共同配制和共同施用，或者它可以分开配制和施用。

在一些实施例中，该方法进一步包括用药剂(例如抗原)对非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)预先施用(初免)以改善免疫原性反应。例如，该方法包括在施用包含编码该抗原的序列的多核糖核苷酸之前(例如，1-7天，例如，1、2、3、4、5、6、7天之前)向非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用蛋白质抗原。该蛋白质抗原可以作为蛋白质制剂施用，或在质粒(pDNA)中编码，或存在于病毒样颗粒(VLP)中，以脂质纳米颗粒(LNP)的形式配制等。

在一些实施例中，该方法进一步包括为受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用或免疫接种鱼精蛋白。

在一些实施例中，该多核糖核苷酸在没有载剂的情况下施用(“裸露”)。在其他实施例中，该多核糖核苷酸与载剂例如LNP、VLP、脂质体等一起配制。

在一些实施例中，该方法进一步包括为受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用或免疫接种多核糖核苷酸(例如，环状或线性多核糖核苷酸)至少两次，例如2、3、4、5次。

在一些实施例中，该方法进一步包括从受试者收集血浆(例如，在要免疫接种的受试者进行免疫接种之后)。在一些实施例中，该方法进一步包括从受试者中纯化多克隆抗体(例如，在要免疫接种的受试者进行免疫接种之后)。在一些实施例中，该方法进一步包括为受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用或免疫接种疫苗。在一些实施例中，该疫苗是肺炎球菌多糖疫苗(例如，PCV13或PPSV23)。在一些实施例中，该疫苗用于细菌感染。在一些实施例中，该受试者(例如，要免疫接种的受试者)通过注射免疫接种环状RNA。在一些实施例中，该受试者(例如，要免疫接种的受试者)通过注射免疫接种线性RNA。

在实施例中，受试者是人类受试者(例如，要免疫接种的人类受试者)。在一些实施例中，人类受试者(例如，要免疫接种的人类受试者)是处于冠状病毒相关疾病风险中的受试者，例如，50岁以上的人；免疫受损的人；患有诸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病状的人；卫生保健工作者。

在实施例中，受试者是非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)。在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是农业动物，例如牛、猪、绵羊、马、山羊；宠物，例如猫或狗；或动物园动物，例如猫科动物。

在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是哺乳动物，例如啮齿动物(例如，兔、大鼠或小鼠)，或有蹄类动物(例如，猪、牛、山羊或绵羊)。在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是包含人源化免疫球蛋白基因座的转染色体非人类动物。在一些实施例中，该非人类动物是包含人类人工染色体(HAC)载体的转染色体牛，该载体包含人源化免疫球蛋白基因座。在一些实施例中，该人源化免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链。在一些实施例中，该人源化免疫球蛋白重链包含IgG同种型重链。在一些实施例中，该人源化免疫球蛋白重链包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型重链。

在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)包含具有B细胞受体的B细胞，该B细胞受体与冠状病毒抗原结合。在一些实施例中，该非人类动物包含多个B细胞，该多个B细胞包括与冠状病毒抗原的第一表位结合的第一B细胞和与冠状病毒抗原的第二表位结合的第二B细胞。

在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)包含T细胞，其中该T细胞包含与冠状病毒抗原结合的T细胞受体。在一些实施例中，在活化后，该T细胞增强与该抗原结合的抗体的产生。在一些实施例中，在活化后，该T细胞增强与该冠状病毒抗原结合的B细胞的抗体产生。在一些实施例中，在活化后，该T细胞增强与冠状病毒抗原结合的B细胞的存活、增殖、浆细胞分化、体细胞超突变、免疫球蛋白类别转换或其组合。

在一些实施例中，该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)产生与冠状病毒抗原特异性结合的抗体。在一些实施例中，该抗体是人源化抗体或全人抗体。在一些实施例中，该抗体是IgG、IgA或IgM同种型抗体。在一些实施例中，该抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型抗体。在一些实施例中，该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)包含特异性结合至少两个由环状多核糖核苷酸编码的表位的多种多克隆抗体。在一些实施例中，该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)包含特异性结合至少两个由线性RNA编码的表位的多种多克隆抗体。在一些实施例中，该多种抗体包括人源化抗体。在一些实施例中，该多种多克隆抗体包含全人抗体。在一些实施例中，该多种多克隆抗体包括IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、IgM抗体、IgA抗体或其组合。在一些实施例中，免疫球蛋白重链包括IgM或IgA同种型重链。在一些实施例中，该人源化免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白轻链。在一些实施例中，免疫球蛋白轻链包括κ轻链或λ轻链。

在一些实施例中，该方法进一步包括从非人类动物或人类受试者中收集血液(例如，在对要免疫接种的非人类动物或人类受试者进行免疫接种之后)，并从血液中纯化针对该抗原的抗体。

另一方面，本发明的特征在于一种抗冠状病毒抗体制剂(例如，多克隆抗体制剂)，该制剂通过以下方式产生：(a)将包含本文所述的多核糖核苷酸的组合物施用给本文所述的非人类动物(例如，具有如本文所述的人源化免疫系统的牛)或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)，以及(b)从该非人类动物或人类受试者收集针对该抗原的抗体(例如，在对要免疫接种的非人类动物或人类受试者进行免疫接种之后)。

在实施例中，该多核糖核苷酸是(a)环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原的序列，例如选自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或(b)线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含选自表3中的SEQ ID NO.的序列。

在实施例中，将抗体制剂配制成药物组合物。

另一方面，本发明的特征在于一种将针对冠状病毒的抗体递送至具有冠状病毒感染、处于暴露于冠状病毒感染的风险中或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)的方法，例如，预防或治疗受试者(例如，要治疗的受试者)的冠状病毒感染的方法。该方法包括向具有冠状病毒感染、处于暴露于冠状病毒感染的风险中或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)施用从具有人类或人源化免疫系统的动物(例如，哺乳动物)产生的多克隆抗体，该动物已经免疫接种了本文所述的多核糖核苷酸，例如(a)环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原的序列，例如选自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或(b)线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含选自表3中的SEQ ID NO.的序列。

在某些实施例中，该方法进一步包括以下一项或多项：为已经遗传修饰以产生人抗体的非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)免疫接种本文披露的多核糖核苷酸，从该非人类动物中收集血液，从该非人类动物中纯化抗体，配制抗体作药物用途，并将配制的抗体施用给人类受试者(例如，要治疗的人类受试者)。

在一些实施例中，具有人类或人源化免疫系统的哺乳动物是人(例如，要免疫接种的人类受试者)。

在一些实施例中，具有人类或人源化免疫系统的哺乳动物是已经遗传修饰以产生人抗体的非人类动物，例如包含人源化免疫球蛋白基因座的非人类动物，例如包含含有人免疫球蛋白基因座的人类人工染色体(HAC)载体的转染色体牛。

在实施例中，具有冠状病毒感染或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)是诊断患有冠状病毒相关疾病，例如Covid-19、SARS、MERS的人类受试者。在一些实施例中，处于暴露于冠状病毒感染的风险中或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)是处于冠状病毒相关疾病风险中的受试者，例如50岁以上的人；免疫受损的人；患有诸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病状的人；卫生保健工作者。

在一些实施例中，施用或免疫接种是在暴露于冠状病毒的风险之前、之后或同时进行。

在一些实施例中，该方法进一步包括例如在施用之前和/或之后监测人类受试者(例如，要治疗的受试者)是否存在针对冠状病毒的抗体。

在下面列举的段落中描述了本发明的示例性实施例。

E1.一种免疫原性组合物，其包含：

a)包含编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸；或

b)包含选自SEQ ID NO:13、15和12中的任一个的序列的线性多核糖核苷酸。

E2.一种免疫原性组合物，其包含含有编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸，其中该冠状病毒抗原包含与选自SEQ ID NO:1-10、13、15、17、19、21、23、25-30、48和49中的任一个的冠状病毒抗原具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列，或该环状多核糖核苷酸包含与选自SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22和24的环状多核糖核苷酸具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

E3.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含来自非人类动物(例如，包含人源化免疫系统的非人类动物；例如，要免疫接种的非人类动物)或人类受试者(例如，要免疫接种的人类受试者)的血浆。

E4.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含该冠状病毒抗原。

E5.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该组合物进一步包含含有人源化免疫球蛋白基因座和人源化B细胞受体的非人B细胞，其中该人源化B细胞受体与该冠状病毒抗原结合。

E6.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该组合物进一步包含多个非人B细胞，其中该多个非人B细胞中的非人B细胞包含人源化免疫球蛋白基因座，其中该多个B细胞包含与该冠状病毒抗原的第一表位结合的第一B细胞和与该冠状病毒抗原的第二表位结合的第二B细胞。

E7.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原来自β冠状病毒或其片段，或来自沙贝科病毒或其片段。

E8.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征相关冠状病毒或其片段。

E9.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒或其片段。

E10.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其片段、严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)或其片段、或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或其片段。

E11.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原是膜蛋白或其变体或片段、病毒的包膜蛋白或其变体或片段、病毒的刺突蛋白或其变体或片段、病毒的核衣壳蛋白或其变体或其片段、病毒的辅助蛋白或其变体或片段。

E12.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原是刺突蛋白或其变体或片段的受体结合结构域。

E13.如实施例8所述的免疫原性组合物，其中该刺突蛋白缺乏裂解位点。

E14.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中冠状病毒的辅助蛋白选自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何变体或片段组成的组。

E15.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列均编码抗原，并且至少一个序列编码冠状病毒抗原。

E16.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含两个或更多个ORF。

E17.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含至少五个序列，每个序列均编码抗原，并且至少一个抗原是冠状病毒抗原。

E18.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含至少两个ORF(例如，至少2、3、4或5个)。

E19.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含编码来自至少两种不同微生物的抗原的序列，并且至少一种微生物是冠状病毒。

E20.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含编码两种或更多种抗原的序列并且至少一种抗原是该冠状病毒抗原。

E21.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该线性多核糖核苷酸包含编码至少2、3、4或5种抗原的序列，并且至少一种抗原是由表3中的SEQ ID NO.的序列编码的冠状病毒抗原。

E22.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原包含表位。

E23.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原包含被B细胞识别的表位。

E24.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该冠状病毒抗原包含至少两个表位。

E25.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第二抗原的序列的第二环状多核糖核苷酸。

E26.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有第二ORF的第二环状多核糖核苷酸。

E27.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五环状多核糖核苷酸。

E28.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第二抗原的序列的第二线性多核糖核苷酸。

E29.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有第二ORF的第二线性多核糖核苷酸。

E30.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五线性多核糖核苷酸。

E31.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原是不同的抗原。

E32.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。

E33.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载剂。

E34.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或免疫原性组合物与载剂(例如，脂质纳米颗粒、病毒样颗粒或脂质体)一起配制。

E35.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含佐剂。

E36.如实施例35所述的免疫原性组合物，其中该佐剂是皂苷或油乳剂。

E37.如实施例36所述的免疫原性组合物，其中该油乳剂是角鲨烯-水乳剂(例如，Addavax^TM佐剂、MF59或AS03)。

E38.如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含稀释剂。

E40.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物。

E41.如实施例40所述的LNP，其包含可电离脂质。

E42.如实施例40所述的LNP，其包含阳离子脂质。

E43.如实施例42所述的LNP，其中该阳离子脂质具有根据以下的结构：

E44.如实施例40至43中任一项所述的LNP，其进一步包含一种或多种中性脂质，例如，DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM，类固醇，例如胆固醇，和/或一种或多种聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质，例如PEG-DAG、PEG-PE、PEG-S-DAG、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯。

E45.一种向非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)递送免疫原性组合物的方法，该方法包括：a)向该非人类动物或人类受试者施用如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，以及b)任选地，从该非人类动物或人类受试者收集针对该冠状病毒抗原的抗体。

E46.一种在非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)中诱导针对冠状病毒抗原的免疫反应的方法，该方法包括：a)向该非人类动物或人类受试者施用如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物，以及b)任选地，从该非人类动物或人类受试者收集针对该冠状病毒抗原的抗体。

E47.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用佐剂。

E48.如实施例47所述的方法，其中该佐剂与该免疫原性组合物共同配制和共同施用，或者与该免疫原性组合物分开配制和施用。

E49.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在施用该免疫原性组合物之前用该冠状病毒抗原对该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用(例如，预先施用或初免)。

E50.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在施用该免疫原性组合物1至7天前(例如，1、2、3、4、5、6或7天前)向该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用该冠状病毒抗原。

E51.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该冠状病毒抗原作为蛋白质制剂施用，在质粒(pDNA)中编码，存在于病毒样颗粒(VLP)中，或以脂质纳米颗粒(LNP)的形式配制等。

E52.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在没有载剂的情况下施用该环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸。

E53.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括用载剂(例如，脂质纳米颗粒、病毒样颗粒或脂质体)配制该免疫原性组合物。

E54.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用或免疫接种该环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸至少两次(例如，2、3、4或5次)。

E55.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括从该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)收集血浆。

E56.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括从非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)的血浆中纯化多克隆抗体。

E57.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括为该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用或免疫接种疫苗。

E58.如实施例51所述的方法，其中该疫苗是肺炎球菌多糖疫苗(例如，PCV13或PPSV23)。

E59.如实施例57所述的方法，其中该疫苗用于细菌感染。

E60.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)通过注射免疫接种该环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸。

E61.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人类受试者(例如，要免疫接种的人类受试者)处于患冠状病毒相关疾病的风险中。

E62.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该人类受试者(例如，要免疫接种的人类受试者)是50岁以上的人、免疫受损的人、患有慢性健康病状(例如，肥胖症、糖尿病、癌症)的人或卫生保健工作者。

E63.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物受试者)是农业动物(例如，猪、牛、山羊、鸡、绵羊)。

E64.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物受试者)是宠物(例如，狗或猫)、动物园动物(例如，猫科动物)、哺乳动物(例如有蹄类动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊)、啮齿动物(例如兔子、大鼠、小鼠)。

E65.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物是包含人源化免疫球蛋白基因座的转染色体非人类动物。

E66.如实施例65所述的方法，其中该非人类动物是包含人类人工染色体(HAC)载体的转染色体牛，该载体包含人源化免疫球蛋白基因座。

E67.如实施例65或66中任一项所述的方法，其中该人源化免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链。

E68.如实施例67所述的方法，其中该人源化免疫球蛋白重链包含IgG同种型重链。

E69.如实施例67或68中任一项所述的方法，其中该人源化免疫球蛋白重链包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型重链。

E70.如实施例65-69中任一项所述的方法，其中该人源化免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白轻链。

E71.如实施例70所述的方法，其中该免疫球蛋白轻链包含κ轻链或λ轻链。

E72.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物包含具有B细胞受体的B细胞，并且其中该B细胞受体与该抗原结合。

E73.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物包含多个B细胞，该多个B细胞包括与冠状病毒抗原的第一表位结合的第一B细胞和与冠状病毒抗原的第二表位结合的第二B细胞。

E74.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物包含T细胞，并且其中该T细胞包含与该冠状病毒抗原结合的T细胞受体。

E75.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在活化后，该T细胞增强与该冠状病毒抗原结合的抗体的产生。

E76.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在活化后，该T细胞增强与该冠状病毒抗原结合的B细胞的抗体产生。

E77.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在活化后，该T细胞增强与冠状病毒抗原结合的B细胞的存活、增殖、浆细胞分化、体细胞超突变、免疫球蛋白类别转换或其组合。

E78.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括从该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)的血浆中纯化针对该冠状病毒抗原的多克隆抗体。

E79.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些多克隆抗体中的一种抗体与该冠状病毒抗原特异性结合。

E80.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些多克隆抗体中的一种抗体是人源化抗体或全人抗体。

E81.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些多克隆抗体中的一种抗体是IgG、IgG、IgA或IgM同种型抗体。

E82.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些多克隆抗体中的一种抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型抗体。

E83.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物包含特异性结合至少两个由该环状多核糖核苷酸编码的表位的多种多克隆抗体。

E84.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该非人类动物包含特异性结合至少两个由该线性多核糖核苷酸编码的表位的多种多克隆抗体。

E85.如实施例81或82中任一项所述的方法，其中该多种多克隆抗体包含人源化抗体。

E86.如实施例83或84中任一项所述的方法，其中该多种多克隆抗体包含全人抗体。

E87.如实施例83-86中任一项所述的方法，其中该多种多克隆抗体包含IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、IgM抗体、IgA抗体或其组合。

E88.如实施例83-86中任一项所述的方法，其中该多种多克隆抗体包含含有IgM或IgA同种型重链的人源化免疫球蛋白基因座。

E89.如实施例83-88中任一项所述的方法，其中该多种多克隆抗体包含编码免疫球蛋白轻链的人源化免疫球蛋白基因座。

E90.如实施例89所述的方法，其中这些免疫球蛋白轻链包含κ轻链或λ轻链。

E91.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括从该非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)收集血液并且从该血液中纯化针对该冠状病毒抗原的抗体。

E92.一种产生针对冠状病毒抗原的多克隆抗体制剂(例如，抗冠状病毒抗体制剂)的方法，该方法包括：

a)向非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)施用如前述实施例中任一项所述的免疫原性组合物；以及

b)从该非人类动物或人类受试者中收集血液或血浆。

E93.如实施例92所述的方法，其中该多克隆抗体制剂配制成药物组合物或兽用组合物。

E94.一种将针对冠状病毒的多克隆抗体制剂递送至具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)的方法，该方法包括向具有冠状病毒感染的受试者施用如前述实施例中任一项所述的多克隆抗体制剂。

E95.一种将多克隆抗体制剂递送至处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)的方法，该方法包括向处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者施用如前述实施例中任一项所述的多克隆抗体制剂。

E96.一种预防或治疗有需要的受试者(例如，要治疗的受试者)的冠状病毒感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用如前述实施例中任一项所述的多克隆抗体制剂。

E97.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

a)为已经遗传修饰以产生人抗体的非人类动物免疫接种前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸或前述实施例中任一项所述的线性多核糖核苷酸；

b)从该非人类动物中收集血液；

c)从该非人类动物中纯化抗体；

d)配制这些抗体作药物用途；以及

e)向人类受试者施用所配制的抗体。

E98.如实施例97所述的方法，其中该非人类动物具有人源化免疫系统。

E99.如实施例97所述的方法，其中该非人类动物具有人源化免疫球蛋白基因座。

E100.如实施例97所述的方法，其中该非人类动物是包含人类人工染色体(HAC)载体的转染色体牛，该载体包含人免疫球蛋白基因座。

E101.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该施用或免疫是在有此需要的受试者处于暴露于冠状病毒的风险之前、之后或同时进行。

E102.如前述实施例中任一项所述的方法，其中具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者或有此需要的受试者是人类受试者。

E103.如实施例102所述的方法，其中该人类受试者(例如，要治疗的人类受试者)是50岁以上的人、免疫受损的人、患有慢性健康病状(例如，肥胖症、糖尿病或癌症)的人或卫生保健工作者。

E104.如前述实施例中任一项所述的方法，其中处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)或有此需要的受试者是处于冠状病毒相关疾病的风险中的人类受试者。

E105.如前述实施例中任一项所述的方法，其中具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者或有此需要的受试者是被诊断患有冠状病毒相关疾病(例如，Covid-19、SARS、MERS)的人类受试者。

E106.如前述实施例中任一项所述的方法，其中具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)是非人类动物受试者。

E107.如前述实施例中任一项所述的方法，其中具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)或有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)是农业动物(例如，牛、猪、绵羊、马、山羊)、宠物(例如，猫或狗)或动物园动物(例如，猫科动物)。

E108.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括监测具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)或有此需要的受试者是否存在这些多克隆抗体。

E109.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该监测是在施用这些多克隆抗体之前和/或施用这些多克隆抗体之后。

定义

本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其共识来理解。

如本文所用，术语“circRNA”、“环状多核糖核苷酸”和“环状RNA”可互换使用，并且意指具有无游离末端的结构(即，没有游离3'末端和/或5'末端)的多核糖核苷酸分子，例如通过共价键或非共价键形成环状或无末端结构的多核糖核苷酸。

如本文所用，术语“circRNA制剂”、“环状多核糖核苷酸制剂”和“环状RNA制剂”可互换使用，并且意指包含circRNA分子和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合的组合物。“免疫原性”circRNA制剂是当引入动物体内时使动物的免疫系统变得对circRNA表达的抗原有反应性的制剂。

如本文所用，术语“线性RNA”、“线性多核糖核苷酸”和“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用并且意指具有5'末端和3’末端的单核糖核苷酸分子或多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中的一个或两个可以是游离末端或者可以与另一部分连接。在一些实施例中，线性RNA具有经修饰或受保护免于降解(例如，通过5'末端保护剂或3'末端保护剂保护)的5'末端或3'末端。在一些实施例中，线性RNA具有非共价连接的5'或3'末端。线性RNA可以用作起始材料通过例如夹板连接或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化。

如本文所用，术语“线性RNA制剂”和“线性多核糖核苷酸制剂”可互换使用，并且意指包含线性RNA分子和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合的组合物。“免疫原性”线性RNA制剂是当引入动物体内时使动物的免疫系统变得对circRNA表达的抗原有反应性的制剂。

如本文所用，术语“总核糖核苷酸分子”意指通过核糖核苷酸分子的总质量所测量的任何核糖核苷酸分子的总量，包括线性多核糖核苷酸分子、环状多核糖核苷酸分子、单体核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其经修饰的变体。

如本文所用，术语“片段”意指比核苷酸分子短至少一个核苷酸的核苷酸分子的任何部分。例如，核苷酸分子可以是线性多核糖核苷酸分子并且其片段可以是单核糖核苷酸或作为线性多核糖核苷酸分子的一部分的任意数量的连续多核糖核苷酸。再如，核苷酸分子可以是环状多核糖核苷酸分子并且其片段可以是多核糖核苷酸或作为环状多核糖核苷酸分子的一部分的任意数量的连续多核糖核苷酸。核苷酸分子的片段包括至少10个核酸残基，例如至少20个核酸残基、至少50个核酸残基和至少100个核酸残基。片段还意指比多肽分子短至少一个肽的多肽分子的任何部分。例如，多肽的片段可以是多肽或作为全长多肽分子的一部分的任意数量的连续氨基酸。多肽的片段包括至少5个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基。

如本文所用，术语“表达序列”是编码产物，例如肽或多肽或调控核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包含多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并被称为“密码子”。

如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”是具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。

如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。

如本文所用，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。

如本文所用，术语“调控元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。

如本文所用，术语“重复核苷酸序列”是一段DNA或RNA内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG(UG)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。

如本文所用，术语“复制元件”是可用于复制或起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。

如本文所用，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如丙三醇、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。

如本文所用，术语“基本上对……有抗性”可以指相较于参考物对效应物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。

如本文所用，术语“化学计量翻译”是由环状多核糖核苷酸翻译获得的表达产物的基本上相等的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状多核糖核苷酸，环状多核糖核苷酸的化学计量翻译意指两个表达序列的表达产物可具有基本相等的量，例如两个表达序列之间的量差(例如摩尔差)可以为约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％或之间的任何百分比。

如本文所用，术语“翻译起始序列”是在环状多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。

如本文所用，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。

如本文所用，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统中，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)。

如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。

如本文所用，术语“适应性免疫反应”是指体液或细胞介导的免疫反应。体液免疫反应(也称为抗体免疫反应)由B淋巴细胞介导，B淋巴细胞会释放与抗原特异性结合的抗体。细胞介导的免疫反应(也称为细胞免疫反应)涉及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与外来或受感染的细胞的结合，然后裂解这些细胞。

如本文所用，术语“佐剂”是指当与环状RNA分子组合使用时，增大或以其他方式改变或修改所产生的免疫反应的化合物。免疫反应的修改包括强化或扩大抗体和细胞免疫反应中的任一者或两者的特异性。免疫反应的修改还可以意指降低或阻遏某些抗原特异性免疫反应。

如本文所用，术语“人抗体”、“人免疫球蛋白”和“人多克隆抗体”可互换使用并且意指在非人类动物中产生的一种或多种抗体，在其他方面与接种了相同环状RNA制剂的人中产生的抗体无法区分。这与“人源化抗体”形成对比，“人源化抗体”经修饰为具有人类特征(诸如通过生成嵌合体)，但保持产生它们的宿主动物的属性。因为根据本文披露的方法制备的人抗体由全人的IgG组成，不需要酶处理来消除与异源物种IgG相关的过敏反应和血清病的风险。

如本文所用，术语“线性对应物”是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列相似性)并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列相似性)和相同或相似的核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列相似性)和不同的核酸修饰或没有核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的比该线性对应物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5'帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’UTR。

如本文所用，术语“载剂”意指通过经由部分或完全包封剂或其组合对环状多核糖核苷酸的共价修饰而利于将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)运输或递送到细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒，诸如脂质纳米颗粒或LNP)、脂质体、融合体(fusosome)、离体分化的网织红细胞、外泌体、蛋白质载剂(例如，与环状多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。

如本文所用，术语“裸”、“裸递送”及其同源词意指无需借助于载剂且没有对有助于递送至细胞的部分进行共价修饰的情况下将配制品递送至细胞。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂、或蛋白质载剂。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含没有共价修饰的环状多核糖核苷酸且不含载剂的配制品。裸递送配制品可以包含非载剂药物赋形剂或稀释剂。

术语“稀释剂”意指包含非活性溶剂的媒介物(vehicle)，本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解在其中。稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲剂、等渗剂或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、丙三醇、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。

如本文所用，“要免疫接种的受试者”是施用免疫原性组合物(例如，包含含有编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸的组合物，或包含含有选自表3中的SEQ ID NO.的序列的线性多核糖核苷酸的组合物)的受试者。要免疫接种的受试者是非人类动物(“要免疫接种的非人类动物受试者”)(例如，农业动物、宠物、动物园动物等)或人类受试者(“要免疫接种的人类受试者”)。

如本文所用，“要治疗的受试者”是施用针对冠状病毒的多克隆抗体(例如，针对冠状病毒的多克隆抗体制剂)作为预防性治疗或治疗冠状病毒感染的受试者。预防性治疗包括将针对冠状病毒的多克隆抗体施用给处于暴露于冠状病毒的风险中的受试者(例如，卫生保健工作者)或处于患冠状病毒相关疾病的风险中的受试者(例如，50岁以上的人；免疫受损的人；患有诸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病状的人)。要治疗的受试者是非人类动物(“要治疗的非人类动物受试者”)(例如，农业动物、宠物、动物园动物等)或人类受试者(“要治疗的人类受试者”)。

如本文所用，“变体”是指与亲本或野生型多肽相比在一个或多个残基位置包括至少一个改变，例如取代、插入、缺失和/或融合的多肽。变体可以包括1至10个、10至20个、20至50个、50至100个或更多个改变。

通过援引并入

本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指明将各篇公开、专利或者专利申请通过援引并入本文。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参考下面的详细描述和附图，将获得对本发明特征和优点的更好理解，下面的详细描述阐述了说明性实施例，其中利用了本发明的原理，并且附图中：

图1示出了包含编码冠状病毒抗原(例如，刺突蛋白、刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)蛋白)的序列的示例性环状多核糖核苷酸。

图2示出了生成与冠状病毒抗原结合的人多克隆抗体以施用给人类受试者的示意图。

图3示出了由环状RNA编码的RBD抗原在BJ成纤维细胞和HeLa细胞中检测到，而在用媒介物对照的BJ成纤维细胞和HeLa细胞未检测到。

图4示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA后，获得可持续的抗RBD抗体反应。

图5示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA后，获得抗刺突反应。

图6示出了在小鼠模型中，施用经阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA后获得的抗-RBD IgG2a和IgG1同种型水平。

图7示出了在肌内注射环状RNA制剂(Trans-IT配制的、鱼精蛋白配制的、未配制的)、仅鱼精蛋白媒介物后和在未注射的对照小鼠中，长期从体内环状RNA表达蛋白质。

图8示出了在同时肌内递送Addavax^TM佐剂与(i)未配制的环状RNA制剂(左图)，(ii)经TransIT配制的环状RNA(中间图)，和(iii)经鱼精蛋白配制的环状RNA(右图)后，长期从体内环状RNA表达蛋白质。在每种情况下，Addavax^TM佐剂均在0和24小时以单独注射的形式递送。

图9示出了在(i)经鱼精蛋白配制的环状RNA、(ii)经鱼精蛋白配制的环状RNA(在24小时注射Addavax^TM佐剂)、(iii)仅鱼精蛋白媒介物的皮内递送后，和(iv)未注射的对照小鼠，长期从体内环状RNA表达蛋白质。

图10是包括两个表达序列的示例性环状RNA的示意图，其中每个表达序列编码一种抗原并且其中一个或两个表达序列编码冠状病毒抗原。环状RNA包含两个开放阅读框(ORF)，每个ORF均编码表达序列，其中每个ORF与IRES可操作地连接。

图11是包括两个表达序列的示例性环状RNA的示意图，其中每个表达序列是一种抗原，并且其中一个或两个表达序列编码冠状病毒抗原。环状RNA包含两个被2A序列隔开的表达序列，所有表达序列均与IRES可操作地连接。

图12示出了多个多核糖核苷酸的示意图，其中每个多核苷酸均包括编码抗原的ORF，并且其中一个或两个ORF编码冠状病毒抗原。

图13A示出了环状多核糖核苷酸的多抗原表达。从编码SARSs-CoV-2RBD抗原和GLuc多肽的环状RNA中检测到RBD抗原表达。

图13B示出了环状多核糖核苷酸的多抗原表达。从编码SARSs-CoV-2RBD抗原和GLuc多肽的环状RNA中检测到GLuc活性。

图14A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA和编码GLuc多肽的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD抗体。

图14B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA和编码GLuc多肽的第二环状RNA为小鼠接种。注射后2天检测到GLuc活性。

图15A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)抗原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD抗体。

图15B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)抗原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗HA抗体。

图16A证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2刺突抗原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)抗原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗RBD(刺突结构域)抗体。

图16B证明了小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性。用编码SARS-CoV-2刺突抗原的第一环状RNA和编码流感病毒血凝素(HA)抗原的第二环状RNA为小鼠接种。注射后17天获得抗HA抗体。

图17证明了施用了编码多种抗原的环状RNA的小鼠中的抗HA抗体反应。向小鼠施用编码以下的环状RNA：SARS-CoV-2RBD抗原、SARS-CoV-2刺突抗原、流感HA抗原、SARS-CoV-2RBD抗原和流感HA抗原、SARS-CoV-2RBD抗原和GLuc多肽、或SARS-CoV-2RBD抗原和SARS-CoV-2刺突抗原。使用血凝抑制测定法(HAI)测量抗流感HA抗体。图24示出了当单独施用或与SARS-CoV-2抗原例如RBD或刺突组合施用时，施用编码流感HA抗原的环状RNA制剂的样品中出现了HAI滴度。

具体实施方式

本披露总体上涉及包含编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列的环状多核糖核苷酸、包含编码冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、以及用于产生编码冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸的方法和包含编码冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸的组合物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸和/或免疫原性组合物用于通过向受试者施用环状多核糖核苷酸和/或免疫原性组合物或为受试者免疫接种包含编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的环状多核糖核苷酸和/或包含该环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物而生成针对来自冠状病毒的抗原和/或表位的免疫反应的方法中。受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以是哺乳动物，诸如有蹄类动物。要免疫接种的受试者可以是人。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是具有人源化免疫系统的非人类动物。

本披露总体上还涉及包含编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列的线性多核糖核苷酸、包含编码冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、以及用于产生编码冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸的方法和包含编码冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸的组合物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸和/或免疫原性组合物用于通过向受试者施用线性多核糖核苷酸和/或免疫原性组合物或为受试者免疫接种包含编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的线性多核糖核苷酸和/或包含该线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物而生成针对来自冠状病毒的抗原和/或表位的免疫反应的方法中。受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以是哺乳动物，诸如有蹄类动物。要免疫接种的受试者可以是人。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是具有人源化免疫系统的非人类动物。

本披露总体上还涉及使用本文所述的环状多核糖核苷酸或免疫原性组合物生成或产生与来自受试者中冠状病毒的抗原和/或表位结合的多克隆抗体的方法。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是人。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是非人类动物(例如，有蹄类动物)。在一些实施例中，非人类动物具有人源化免疫系统。在一个特定实施例中，将编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸和/或包含编码冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给具有人源化免疫系统的非人类动物，从而刺激与来自冠状病毒的抗原和/或表位结合的人多克隆抗体的产生。

本披露总体上还涉及使用本文所述的线性多核糖核苷酸或免疫原性组合物生成或产生与来自受试者中冠状病毒的抗原和/或表位结合的多克隆抗体的方法。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是人。在一些实施例中，要免疫接种的受试者是非人类动物(例如，有蹄类动物)。在一个实施例中，将编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸和/或包含编码冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给具有人源化免疫系统的非人类动物，从而刺激与来自冠状病毒的抗原和/或表位结合的人多克隆抗体的产生。

在进一步的实施例中，纯化所产生的多克隆抗体。纯化的多克隆抗体适合用作针对冠状病毒的预防剂或冠状病毒感染的治疗。纯化的多克隆抗体可以施用给要治疗的受试者。图2中提供了本文所述的方法的示意性实例。

环状多核糖核苷酸

如本文所披露的环状多核糖核苷酸包含编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列。这种环状多核糖核苷酸在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中表达编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列。在一些实施例中，包含冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸用于在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中产生免疫反应。在一些实施例中，包含冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸用于产生如本文所述的多克隆抗体。

冠状病毒抗原和表位

环状多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原或表位的序列。本文披露的抗原和/或表位与冠状病毒相关。在一些实施例中，这些抗原和/或表位是由冠状病毒表达的，或源自冠状病毒所表达的抗原和/或表位。

抗原是含有一个或多个表位(线性表位、构象表位或两者)的分子，将会在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中引发适应性免疫反应。表位可以是被给定抗体或T细胞受体识别、靶向或结合的抗原的一部分。表位可以是线性表位，例如氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。通常，表位将包括约3-15个，通常约5-15个氨基酸。B细胞表位通常为约5个氨基酸，但也可以小至3-4个氨基酸。T细胞表位(诸如CTL表位)将包括至少约7-9个氨基酸，而辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位将包括约7至15个氨基酸，诸如9、10、12或15个氨基酸。

冠状病毒抗原或表位可以是或可以包含蛋白质、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物(例如，多糖)、脂质(例如，磷脂或三酸甘油酯)或核酸(例如，DNA、RNA)的全部或一部分。

冠状病毒抗原或表位可以包含蛋白质抗原或表位(例如，来自蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽抗原或肽表位)。抗原或表位可以包括氨基酸、糖、脂质、磷酰基或磺酰基或其组合。

冠状病毒蛋白抗原或表位可以包含翻译后修饰，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂化。

在一些实施例中，冠状病毒是病原性冠状病毒。在一些实施例中，冠状病毒是呼吸道病原体。在一些实施例中，冠状病毒是血源性病原体。在一些实施例中，冠状病毒是肠道病原体。

本披露的冠状病毒的非限制性实例包括严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、蝙蝠冠状病毒、可感染人类或其他动物的人畜共患冠状病毒、新出现或新发现的冠状病毒以及其他冠状病毒。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含SARS-CoV-1抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含SARS-CoV-2抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含可感染人类或其他动物的人畜共患冠状病毒抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自新出现的冠状病毒的抗原和/或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含冠状病毒科(Coronaviridae)抗原和/或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自α冠状病毒(Alphacoronavirus)、β冠状病毒(Betacoronavirus)、γ冠状病毒(Gammacoronavirus)、δ冠状病毒(Deltacoronavirus)、美贝科病毒(Mebecovirus)或沙贝科病毒(Sarbecovirus)的属或亚属的抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含β冠状病毒抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含沙贝科病毒抗原和/或表位。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含美贝科病毒抗原和/或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自是生物安全2级(BSL-2)病原体的冠状病毒的抗原的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自是生物安全3级(BSL-3)病原体的冠状病毒的序列。在一些实施例中，冠状病毒是生物安全4级(BSL-4)病原体。在一些实施例中，没有批准的药物(例如，抗病毒或抗生素药物)可用于治疗冠状病毒感染，环状多核糖核苷酸所表达的抗原就源自该冠状病毒。在一些实施例中，没有批准的疫苗可用于预防或降低冠状病毒感染的风险，环状多核糖核苷酸所表达的抗原就源自该冠状病毒。

抗原和/或表位可以来自冠状病毒表面蛋白、冠状病毒膜蛋白、冠状病毒包膜蛋白、冠状病毒衣壳蛋白、冠状病毒核衣壳蛋白、冠状病毒刺突蛋白、刺突的冠状病毒受体结合结构域(RBD)蛋白、冠状病毒进入蛋白、冠状病毒膜融合蛋白、冠状病毒结构蛋白、冠状病毒非结构蛋白、冠状病毒调节蛋白、冠状病毒辅助蛋白、分泌型冠状病毒蛋白、冠状病毒聚合酶蛋白、冠状病毒RNA聚合酶、冠状病毒蛋白酶、冠状病毒糖蛋白、冠状病毒融合原、冠状病毒螺旋衣壳蛋白、冠状病毒二十面体衣壳蛋白、冠状病毒基质蛋白、冠状病毒复制酶、冠状病毒转录因子或冠状病毒酶。

来自许多冠状病毒的抗原和/或表位是由该环状多核糖核苷酸表达的。在一些情况下，抗原和/或表位与本文披露的一种冠状病毒相关或由其表达。在一些实施例中，抗原和/或表位与本文披露的两种或更多种冠状病毒相关或由其表达。

在一些情况下，两种或更多种冠状病毒在表型上有关。例如，本披露的组合物和方法可以利用来自以下冠状病毒的抗原和/或表位：作为呼吸道病原体的两种或更多种冠状病毒、与严重疾病相关的两种或更多种冠状病毒、与免疫受损受试者(例如，要免疫接种的受试者)中的不良结果相关的两种或更多种冠状病毒的、与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相关的两种或更多种冠状病毒、与严重急性呼吸综合征(SARS)相关的两种或更多种冠状病毒、与中东呼吸综合征(MERS)相关的两种或更多种冠状病毒或这些的组合。

环状多核糖核苷酸可以包含或编码例如来自至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种或更多种冠状病毒的抗原和/或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含或编码来自至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种或更少的冠状病毒的抗原和/或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含或编码来自约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100种冠状病毒的抗原和/或表位。

在一些实施例中，抗原和/或表位来自冠状病毒，例如严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或另一种冠状病毒。在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自冠状病毒基因组的预测开放阅读框。

可以通过新病毒特定基因组区域的多核苷酸序列与已知SARS病毒特定基因组区域的多核苷酸序列的99％、98％、97％、95％、92％、90％、85％或80％同源性的同源性百分比来鉴定新的SARS分离株。另外，可以通过新SARS病毒的特定基因组区域的多核苷酸所编码的多肽序列与已知SARS病毒特定区域的多核苷酸所编码的多肽序列的99％、98％、97％、95％、92％、90％、85％或80％同源性的同源性百分比来鉴定新的SARS分离株。这些基因组区域可以包括在众多冠状病毒中通常共有的区域(例如，基因产物或ORF)，以及组特异性区域(例如，抗原组)，例如本领域熟练的病毒学家可以容易地鉴定的以下基因组区域中的任何一个：5'非翻译区(UTR)、前导序列、ORF1a、ORF1b、非结构蛋白2(NS2)、血凝素酯酶糖蛋白(HE)(也称为E3)、刺突糖蛋白(S)(也称为E2)、ORF3a、ORF3b、非结构蛋白4(NS4)、包膜(小膜)蛋白(E)(也称为sM)、膜糖蛋白(M)(也称为E1)、ORF5a、ORF5b、核衣壳磷蛋白(N)、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、ORF10、基因间序列、刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、3'UTR或RNA依赖性RNA聚合酶(pol)。SARS病毒可具有可鉴定的基因组区域和一个或多个以上鉴定的基因组区域。SARS病毒抗原包括由这些基因组区域中的任何一个编码的蛋白质。SARS病毒抗原可以是与冠状病毒高度保守的蛋白质或其片段。SARS病毒抗原可以是对SARS病毒具有特异性(与已知冠状病毒相比)的蛋白质或其片段。

在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自SARS-CoV基因组的预测转录物。在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自由来自SARS-CoV基因组的开放阅读框编码的蛋白质。SARS-CoV基因组中开放阅读框的非限制性实例可以包括ORF1a、ORF1b、刺突(S)、ORF3a、ORF3b、包膜(E)、膜(M)、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣壳(N)和ORF10。

ORF1a和ORF1b编码16种非结构蛋白(nsp)，例如nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、nsp13、nsp14、nsp15和nsp16。例如，非结构蛋白有助于病毒复制、病毒组装、免疫反应调节或其组合。在一些实施例中，抗原是非结构蛋白或者是编码非结构蛋白的抗原序列。在一些实施例中，表位来自冠状病毒非结构蛋白。

刺突(S)编码刺突蛋白，在一些实施例中刺突蛋白有助于与宿主细胞受体的结合、病毒与宿主细胞膜的融合、病毒进入宿主细胞或其组合。刺突蛋白可以是抗原。在一些实施例中，本披露的表位来自刺突蛋白。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的受体结合结构域。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的ACE2结合结构域。

包膜(E)编码包膜蛋白，在一些实施例中包膜蛋白有助于病毒组装和形态发生。包膜蛋白可以是抗原。在一些实施例中，本披露的表位来自冠状病毒包膜蛋白。

膜(M)编码膜蛋白，在一些实施例中膜蛋白有助于病毒组装。膜蛋白可以是抗原。在一些实施例中，本披露的表位来自冠状病毒膜蛋白。

核衣壳(N)编码核衣壳蛋白，在一些实施例中核衣壳蛋白可与基因组RNA形成复合物并有助于病毒组装，和/或与M蛋白相互作用。核衣壳蛋白可以是抗原。在一些实施例中，本披露的表位来自冠状病毒核衣壳蛋白。

ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b和ORF10编码辅助蛋白。在一些实施例中，辅助蛋白可以调节宿主细胞信号传导，调节宿主细胞免疫反应，作为次要结构蛋白并入成熟病毒粒子中，或这些的组合。辅助蛋白可以是抗原。在一些实施例中，本披露的表位来自冠状病毒辅助蛋白。

本披露的组合物和方法可以利用由SARS-CoV基因组的一个或多个开放阅读框编码或源自该一个或多个开放阅读框的抗原和/或表位。例如，抗原和/或表位可由ORF1a、ORF1b、刺突(S)、ORF3a、ORF3b、包膜(E)、膜(M)、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣壳(N)、ORF10或其任何组合编码或源自这些或其任何组合。

在一些实施例中，本披露的表位来自刺突蛋白。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的ACE2结合结构域。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的S1亚基、刺突蛋白的S2亚基或其组合。在一些实施例中，本披露的表位包含刺突蛋白的胞外域。在一些实施例中，本披露的表位包含来自冠状病毒刺突蛋白的Gln498、Thr500、Asn501或其组合。在一些实施例中，本披露的表位包含来自冠状病毒刺突蛋白的Lys417、Tyr453或其组合。在一些实施例中，本披露的表位包含来自冠状病毒刺突蛋白的Gln474、Phe486或其组合。在一些实施例中，本披露的表位包含来自冠状病毒刺突蛋白的刺突蛋白变体或衍生物或其组合的Gln498、Thr500、Asn501、Lys417、Tyr453、Gln474、Phe486、一个或多个等效氨基酸。在一些实施例中，本披露的刺突蛋白包含D614G突变，即在614位置具有氨基酸甘氨酸(G)而不是天冬氨酸(D)。在一些实施例中，本披露的表位包含来自冠状病毒刺突蛋白的刺突蛋白变体或衍生物或其组合的Gly614。在一些情况下，D614G突变可导致S1脱落减少和冠状病毒传染性增加。

在一些实施例中，抗原和/或表位由ORF1a编码或源自ORF1a。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF1b编码或源自SARS-CoV ORF1b。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV刺突编码或源自SARS-CoV刺突。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF3a编码或源自SARS-CoV ORF3a。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoVORF3b编码或源自SARS-CoV ORF3b。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV包膜(E)编码或源自SARS-CoV包膜(E)。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV膜(M)编码或源自SARS-CoV膜(M)。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF6编码或源自SARS-CoVORF6。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF7a编码或源自SARS-CoV ORF7a。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF7b编码或源自SARS-CoV ORF7b。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF8编码或源自SARS-CoV ORF8。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF8a编码或源自SARS-CoV ORF8a。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF9a编码或源自SARS-CoV ORF9a。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF9b编码或源自SARS-CoV ORF9b。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV核衣壳(N)编码或源自SARS-CoV核衣壳(N)。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoVORF10编码或源自SARS-CoV ORF10。在一些实施例中，抗原和/或表位由SARS-CoV刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)编码或源自SARS-CoV刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)。

在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF1a编码或不是源自SARS-CoV ORF1a。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF1b编码或不是源自SARS-CoV ORF1b。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV刺突编码或不是源自SARS-CoV刺突。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF3a编码或不是源自SARS-CoV ORF3a。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF3b编码或不是源自SARS-CoV ORF3b。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV包膜(E)编码或不是源自SARS-CoV包膜(E)。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV膜(M)编码或不是源自SARS-CoV膜(M)。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF6编码或不是源自SARS-CoV ORF6。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF7a编码或不是源自SARS-CoV ORF7a。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF7b编码或不是源自SARS-CoV ORF7b。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF8编码或不是源自SARS-CoV ORF8。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF8a编码或不是源自SARS-CoV ORF8a。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF9a编码或不是源自SARS-CoV ORF9a。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF9b编码或不是源自SARS-CoV ORF9b。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV核衣壳(N)编码或不是源自SARS-CoV核衣壳(N)。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF10编码或不是源自SARS-CoV ORF10。在一些实施例中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)编码或不是源自SARS-CoV刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)。

抗原和/或表位可由SARS-CoV2编码或源自SARS-CoV2。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在DB来源登录号MN908947.3中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。DB来源登录号MN908947.3:21563-25384对应于S蛋白，其内容通过援引以其全文并入本文。GenBank序列中提供了SARS-CoV-2刺突蛋白的非限制性实例：QHD43416.1，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株的刺突蛋白的序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列NCBI参考序列登录号NC_045512，版本NC_045512.2中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株Wuhan-Hu-1的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列NCBI参考序列登录号MW450666中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列NCBI参考序列登录号MW487270中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2谱系B.1.1.7病毒的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列GISAID参考序列登录号EPI_ISL_792683中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2谱系P.1病毒的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列GISAID参考序列登录号EPI_ISL_678615中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2谱系B.1.351病毒的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列NCBI参考序列登录号MW972466-MW974550中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2谱系B.1.427和B.1.429病毒的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

SARS-CoV-2基因组的非限制性实例在序列NCBI参考序列登录号MZ156756-MZ226428中提供，这是严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒的完整基因组序列，其内容通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，SAR-CoV-2基因组在www.gisaid.org.的GISAID数据库中提供。在一些实施例中，SARS-CoV-2基因组在www.insdc.org的国际核苷酸序列数据库协作(International Nucleotide Sequence Database Collaboration，INSDC)中提供。

在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自SARS-CoV-2基因组的预测转录物。在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自由来自SARS-CoV-2基因组的开放阅读框编码的蛋白质，或其衍生物。SARS-CoV-2基因组中开放阅读框的非限制性实例包括ORF1a、ORF1b、刺突(S)、ORF3a、包膜(E)、膜(M)、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、核衣壳(N)和ORF10。在一些实施例中，SARS-CoV-2基因组编码ORF3b、ORF9a、ORF9b或其组合。在一些实施例中，SARS-CoV-2基因组不编码ORF3b、ORF9a、ORF9b或其任何组合。

表1中提供了氨基酸序列的非限制性实例。在一些实施例中，抗原包含与来自表1的序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

表1：由SARS-CoV-2基因组编码的蛋白质的氨基酸序列的实例。

由SARS-CoV-2基因组编码的蛋白质的其他非限制性实例包括具有以下NCBI登录号的内容的那些：MT334522、MT334523、MT334524、MT334525、MT334526、MT334527、MT334528、MT334529、MT334530、MT334531、MT334532、MT334533、MT334534、MT334535、MT334536、MT334537、MT334538、MT334539、MT334540、MT334541、MT334542、MT334543、MT334544、MT334545、MT334546、MT334555、MT334547、MT334548、MT334549、MT334550、MT334551、MT334552、MT334553、MT334554、MT334556、MT334557、MT334558、MT334559、MT334560、MT334561、MT334562、MT334563、MT334564、MT334565、MT334566、MT334567、MT334568、MT334569、MT334570、MT334571、MT334572、MT334573、MT326097、MT326106、MT326107、MT326116、MT326117、MT326124、MT326125、MT326126、MT326127、MT326134、MT326135、MT326136、MT326137、MT326138、MT326139、MT326140、MT326141、MT326142、MT326143、MT326144、MT326145、MT326146、MT326148、MT326149、MT326150、MT326151、MT326152、MT326158、MT326159、MT326160、MT326161、MT326162、MT326168、MT326169、MT326170、MT326171、MT326172、MT326178、MT326179、MT326180、MT326181、MT326182、MT326183、MT326188、MT326189、MT326190、MT326191、MT326129、MT326121、MT326120、MT326119、MT326118、MT326111、MT326023、MT326025、MT326033、MT326035、MT326036、MT326040、MT326043、MT326045、MT326053、MT326055、MT326056、MT326063、MT326066、MT326070、MT326071、MT326072、MT326075、MT326076、MT326078、MT326079、MT326089、MT325563、MT325565、MT325566、MT326155、MT326163、MT326177、MT326130、MT326128、MT326110、MT326109、MT326108、MT326101、MT326100、MT326099、MT326098、MT326094、MT326093、MT326092、MT325568、MT325569、MT325590、MT325640、MT325606、MT325607、MT325608、MT325609、MT325610、MT325611、MT325616、MT325618、MT325619、MT325620、MT325622、MT325623、MT325624、MT325599、MT325600、MT325601、MT325602、MT325612、MT325613、MT325615、MT325617、MT325625、MT324062、MT324684、MT325573、MT325574、MT325577、MT325579、MT325586、MT325592、MT325593、MT325594、MT325598、MT325605、MT325626、MT325627、MT325633、MT325634、MT326028、MT326031、MT326091、MT326090、MT326085、MT326084、MT326083、MT326082、MT326081、MT326080、MT326077、MT326067、MT326057、MT326024、MT326026、MT326027、MT326032、MT326034、MT326037、MT326039、MT326041、MT326042、MT326044、MT326046、MT326047、MT326049、MT326050、MT326051、MT326052、MT326054、MT326059、MT326060、MT326061、MT326062、MT326064、MT326065、MT326068、MT326069、MT326073、MT326074、MT326088、MT327745、MT324679、MT325561、MT325571、MT325572、MT325575、MT325583、MT325587、MT325588、MT325589、MT325596、MT325597、MT325603、MT325604、MT325614、MT325621、MT325629、MT325630、MT325631、MT325632、MT325635、MT325636、MT325637、MT325638、MT325639、MT326086、MT326096、MT326102、MT326104、MT326105、MT326112、MT326113、MT326114、MT326115、MT326122、MT328034、MT325564、MT325567、MT326164、MT326165、MT326173、MT326174、MT326184、MT326185、MT326186、MT326187、MT325584、MT325585、MT326087、MT326095、MT326103、MT326123、MT326131、MT326132、MT326133、MT328033、MT325562、MT326147、MT326153、MT326154、MT326156、MT326157、MT326166、MT326167、MT326175、MT326176、MT324680、MT325570、MT325576、MT325578、MT325580、MT325581、MT325582、MT325591、MT325595、MT325628、MT326029、MT326030、MT326038、MT326048、MT326058、MT324681、MT324682、MT324683、MT328032、MT328035、MT322404、MT039874、MT322398、MT322409、MT322421、MT322423、MT322408、MT322413、MT322417、MT322394、MT322407、MT322418、MT322424、MT322411、MT077125、MT322395、MT322396、MT322397、MT322399、MT322400、MT322401、MT322402、MT322403、MT322405、MT322406、MT322414、MT322416、MT322419、MT322420、MT322410、MT322412、MT322415、MT322422、MT320538、MT320891、MT308692、MT308693、MT308695、MT308696、MT308698、MT308699、MT308701、MT308703、MT308704、MT308694、MT308697、MT308700、MT308702、MT293547、MT304476、MT304474、MT304475、MT304477、MT304478、MT304479、MT304481、MT304482、MT304484、MT304485、MT304486、MT304487、MT304488、MT304491、MT304480、MT304483、MT304489、MT304490、MT300186、MT292571、MT292576、MT292578、MT293186、MT292570、MT292573、MT293173、MT292575、MT293179、MT293180、MT293184、MT293189、MT293192、MT293193、MT293194、MT293201、MT293202、MT292572、MT292577、MT293185、MT293187、MT293188、MT291826、MT291832、MT291833、MT291835、MT291836、MT291831、MT293170、MT292574、MT293178、MT293181、MT293183、MT293195、MT293196、MT293197、MT293203、MT293204、MT293223、MT293212、MT293214、MT293215、MT293216、MT293219、MT293224、MT293225、MT293206、MT293208、MT293209、MT293221、MT295464、MT293160、MT293166、MT293171、MT293190、MT293161、MT293167、MT293168、MT293174、MT293175、MT293182、MT293191、MT293158、MT293162、MT293163、MT293164、MT293156、MT293157、MT293159、MT291834、MT291829、MT291827、MT291830、MT291828、MT293169、MT293200、MT293210、MT293211、MT293217、MT293218、MT295465、MT293198、MT293205、MT293207、MT293213、MT293220、MT293222、MT292581、MT292569、MT293172、MT293177、MT293176、MT293199、MT292580、MT292582、MT293165、MT292579、MT273658、MT281577、MT281530、MT276597、MT276598、MT276323、MT276328、MT276331、MT276329、MT276330、MT276324、MT276325、MT276327、MT276326、MT263388、MT263392、MT262900、MT262902、MT262906、MT262908、MT262912、MT262913、MT262914、MT262993、MT263074、MT263381、MT263391、MT262901、MT262903、MT262907、MT262909、MT262911、MT262899、MT262904、MT262915、MT262916、MT262897、MT262898、MT262905、MT262910、MT263400、MT263382、MT263383、MT263384、MT263385、MT262896、MT263407、MT263415、MT263406、MT263408、MT263422、MT263469、MT263439、MT263457、MT263459、MT263432、MT263450、MT263458、MT263467、MT263401、MT263411、MT263413、MT263426、MT263421、MT263443、MT263412、MT263416、MT263417、MT263423、MT263431、MT263461、MT263410、MT263424、MT263425、MT263427、MT263442、MT263402、MT263405、MT263409、MT263418、MT263419、MT263398、MT263399、MT263403、MT263404、MT263414、MT263430、MT263390、MT263434、MT263436、MT263446、MT263448、MT263452、MT263453、MT263456、MT263462、MT263463、MT263386、MT263387、MT263389、MT263428、MT263429、MT263433、MT263435、MT263437、MT263438、MT263440、MT263447、MT263449、MT263455、MT263444、MT263445、MT263451、MT263466、MT263420、MT263441、MT263454、MT263464、MT263465、MT263468、MT263460、MT263393、MT263394、MT263395、MT263396、MT263397、MT259226、MT259275、MT259276、MT259279、MT259247、MT258377、MT258378、MT258379、MT259231、MT259228、MT259238、MT259248、MT256917、MT259227、MT259236、MT256918、MT258380、MT259235、MT259237、MT259239、MT259281、MT259282、MT259283、MT259240、MT259243、MT259249、MT259250、MT259251、MT259256、MT259258、MT259266、MT259267、MT259274、MT259286、MT259287、MT259241、MT259242、MT258381、MT259257、MT259261、MT259262、MT259263、MT259264、MT259268、MT259269、MT259270、MT259271、MT259272、MT259273、MT259277、MT259278、MT259280、MT258383、MT258382、MT259246、MT256924、MT259244、MT259245、MT259252、MT259253、MT259254、MT259255、MT259259、MT259284、MT259229、MT259230、MT259265、MT259260、MT259285、LC534419、LC534418、MT253710、MT253709、MT253705、MT253708、MT253701、MT253702、MT253703、MT253704、MT253706、MT253707、MT251972、MT251974、MT251975、MT251973、MT251976、MT251979、MT253697、MT253699、MT253696、MT253698、MT253700、MT251977、MT251978、MT251980、MT246451、MT246461、MT246471、MT246472、MT246474、MT246483、MT246450、MT246453、MT246454、MT246462、MT246463、MT246464、MT246470、MT246473、MT246480、MT246484、MT246449、MT246455、MT246456、MT246478、MT246485、MT246488、MT246452、MT246460、MT246465、MT246481、MT246482、MT246490、MT246459、MT246468、MT246475、MT246477、MT246479、MT246457、MT246458、MT246466、MT246467、MT246469、MT246476、MT246486、MT246487、MT246489、MT233526、MT246667、MT240479、MT232870、MT232871、MT233523、MT232869、MT232872、MT233519、MT233521、MT233522、MT233520、MT226610、MT198653、MT198651、MT198652、MT192773、MT192758、MT192772、MT192765、MT192759、MT188341、MT188340、MT188339、MT186676、MT186681、MT186677、MT186678、MT187977、MT186680、MT186682、MT186679、MT184909、MT184911、MT184912、MT184913、MT184910、MT184907、MT184908、CADDYA000000000、MT163718、MT163719、MT163720、MT163714、MT163715、MT163721、MT163717、MT163737、MT163738、MT163712、MT163716、MT159706、MT159716、MT159719、MT159707、MT159717、MT159709、MT159715、MT159718、MT159722、MT159708、MT161607、MT159705、MT159710、MT159711、MT159712、MT159713、MT159714、MT159720、MT159721、MT121215、MT159778、MT066156、LC529905、MT050493、MT012098、MT152900、MT152824、MT135044、MT135042、MT135041、MT135043、MT126808、MT127113、MT127114、MT127116、MT127115、LC528232、LC528233、MT123293、MT123291、MT123290、MT123292、MT118835、MT111896、MT111895、MT106052、MT106053、MT106054、MT093571、MT093631、MT081061、MT081063、MT081066、MT081062、MT081064、MT081065、MT081067、MT081059、MT081060、MT081068、MT072667、MT072668、MT072688、MT066157、MT066176、MT066159、MT066175、MT066158、LC523809、LC523807、LC523808、MT044258、MT044257、MT050416、MT050417、MT042773、MT042774、MT042775、MT042776、MT049951、MT050414、MT050415、MT042777、MT042778、MT039887、MT039888、MT039890、MT039873、LC522350、MT027062、MT027063、MT027064、MT020881、MT019530、MT019531、MT019533、MT020880、MT019532、MT019529、MT020781、LR757995、LR757998、LR757996、LR757997、MT007544、MT008022、MT008023、MN996531、MN996530、MN996527、MN996528、MN996529、MN997409、MN988668、MN988669、MN994467、MN994468、MN988713、MN938384、MN975262、MN985325、MN938386、MN938388、MN938385、MN938387、MN938390、MN938389、MN975263、MN975267、MN975268、MN975265、MN975264、MN975266、MN970004、MN970003、MN908947，其中每一个通过援引以其全文并入本文。

在特定实施例中，环状多核糖核苷酸包含表2中描述的SARS-CoV-2抗原。在一些实施例中，抗原包含与来自表2的序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

表2.构建体和SARS-CoV-2ORF的描述

在表2中，“脯氨酸取代”表示残基986和987处的脯氨酸取代，以及弗林蛋白酶裂解位点(残基682-685)处的“GSAS”取代。对于“克隆优化”，在坐标2541处进行单碱基取代以破坏BsaI位点，以协助质粒DNA模板的金门克隆构建(Golden Gate Cloning construction)。对于“环化优化”：四个单核苷酸-在位置2307、2790、159和315处-被取代以破坏可潜在结合夹板核酸序列环化元件的位点，从而潜在地抑制有效连接。对于去除了II型终止子的构建体(例如，p33、p35、p36、p39、p41、p44和p45)：两个单核苷酸-在位置1047、1049处，被取代以破坏II型终止子位点。对于具有GC优化的构建体(例如，p39和p41)，进行GC优化以使GC含量为大约50％。所有单碱基对取代都被设计为翻译沉默。此外，在表2中，IRES是EMCV(SEQ IDNO:31)或CVB3(SEQ ID NO:45)。

在一些实施例中，抗原或表位来自宿主受试者(例如，要免疫接种的受试者)细胞。例如，可以通过使用来自于病毒用作进入因子的宿主细胞组分的抗原或表位来产生阻断冠状病毒进入的抗体。

在一些实施例中，冠状病毒表位包含或含有至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸，或更多个氨基酸。在一些实施例中，冠状病毒表位包含或含有至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多21个、至多22个、至多23个、至多24个、至多25个、至多26个、至多27个、至多28个、至多29个或至多30个氨基酸，或更少的氨基酸。在一些实施例中，冠状病毒表位包含或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。在一些实施例中，冠状病毒表位含有5个氨基酸。在一些实施例中，冠状病毒表位含有6个氨基酸。在一些实施例中，表位含有7个氨基酸。在一些实施例中，冠状病毒表位含有8个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约8至约11个氨基酸。在一些实施例中，表位可以是约9至约22个氨基酸。

冠状病毒抗原可以包括被B细胞识别的抗原、被T细胞识别的抗原或其组合。在一些实施例中，抗原包括被B细胞识别的抗原。在一些实施例中，冠状病毒抗原是被B细胞识别的抗原。在一些实施例中，冠状病毒抗原包括被T细胞识别的抗原。在一些实施例中，抗原是被T细胞识别的抗原。

冠状病毒表位包括被B细胞识别的抗原、被T细胞识别的抗原或其组合。在一些实施例中，冠状病毒表位包括被B细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被B细胞识别的表位。在一些实施例中，冠状病毒表位包括被T细胞识别的表位。在一些实施例中，冠状病毒表位是被T细胞识别的表位。

例如，用于经由电脑模拟鉴定抗原和表位的技术例如在Sanchez-Trincado等人(2017),Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction[T细胞和B细胞表位预测的基本原理和方法],Journal of immunology research[免疫学研究杂志]；Grifoni,Alba等人,A Sequence Homology and Bioinformatic Approach Can PredictCandidate Targets for Immune Responses to SARS-CoV-2[序列同源性和生物信息学方法可以预测SARS-CoV-2免疫反应的候选靶标].Cell host&microbe[细胞宿主与微生物](2020)；Russi等人,In silico prediction of T-and B-cell epitopes in PmpD:Firststep towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine[PmpD中T细胞和B细胞表位的电脑模拟预测：设计沙眼衣原体疫苗的第一步],biomedical journal[生物医学杂志]41.2(2018):109-117；Baruah等人,Immunoinformatics-aided identificationof T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of 2019-nCoV[免疫信息学辅助鉴定2019-nCoV表面糖蛋白中的T细胞和B细胞表位].Journal of MedicalVirology[医学病毒学杂志](2020)中已经披露；其中每一个通过援引以其全文并入本文。

本披露的环状多核糖核苷酸可以包含许多冠状病毒抗原和/或表位的序列。环状多核糖核苷酸包含例如至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种冠状病毒抗原或表位的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含例如至多1种、至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种或更少的冠状病毒抗原或表位的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种冠状病毒抗原或表位的序列。

环状多核糖核苷酸可以包含来自冠状病毒抗原的一个或多个冠状病毒表位的序列。例如，冠状病毒抗原可以包含氨基酸序列，其中可以含有多个冠状病毒表位(例如，被B细胞和/或T细胞识别的表位)，并且环状多核糖核苷酸可以包含或编码那些冠状病毒表位中的一个或多个表位。

环状多核糖核苷酸包含来自一种冠状病毒抗原的例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多个表位的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自一种冠状病毒抗原的例如至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个、至多200个、至多250个、至多300个、至多350个、至多400个、至多450个、或至多500个或更少的冠状病毒表位的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含来自一种冠状病毒抗原的例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个冠状病毒表位的序列。

环状多核糖核苷酸可以编码冠状病毒抗原或表位的变体。变体可以是天然存在的变体(例如，在来自不同的冠状病毒属、种、分离株或准种的序列数据中鉴定的变体)，或者可以是如本文所披露的已经经由电脑模拟生成的衍生序列(例如，与野生型抗原或表位相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合的抗原或表位)。

环状多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种变体的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种、或更少的变体的序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种变体的序列。

环状多核糖核苷酸的冠状病毒抗原和/或表位序列也可称为冠状病毒表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个冠状病毒表达序列，其中每一个都可以可编码冠状病毒多肽。冠状病毒多肽可以大量产生。冠状病毒多肽可以是从细胞分泌的或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜隔室的冠状病毒多肽。一些冠状病毒多肽包括但不限于如本文所披露的抗原、如本文所披露的表位、冠状病毒蛋白的至少一部分(例如，病毒包膜蛋白、病毒基质蛋白、病毒刺突蛋白、病毒刺突蛋白的病毒受体结合结构域(RBD)、病毒膜蛋白、病毒核衣壳蛋白、病毒辅助蛋白、其片段或其组合)。在一些实施例中，由本披露的环状多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含本文披露的冠状病毒抗原的片段。在一些实施例中，由本披露的环状多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含融合蛋白，该融合蛋白包含两种或更多种本文披露的冠状病毒抗原或其片段。在一些实施例中，由本披露的环状多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含冠状病毒表位。在一些实施例中，由本披露的环状多核糖核苷酸编码的多肽包含融合蛋白，该融合蛋白包含两个或更多个本文披露的冠状病毒表位，例如包含来自本披露的一种或多种冠状病毒的多个预测表位的人工肽序列。

在一些实施例中，从本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性冠状病毒蛋白包括分泌型蛋白，例如天然包括信号肽的蛋白(例如抗原和/或表位)，或通常不编码信号肽，但是经修饰含有信号肽的蛋白。

在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌性冠状病毒蛋白，该分泌性冠状病毒蛋白在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的跨膜结构域，该跨膜结构域在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌肽的蛋白。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个冠状病毒表达序列，并被配置用于在受试者(例如，要免疫接种的受试者)体内的细胞中持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得该一个或多个冠状病毒表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，该一个或多个冠状病毒表达序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。在一些实施例中，冠状病毒表达序列的表达长期相对稳定。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中，例如瞬时或长期表达一种或多种冠状病毒抗原和/或表位。在某些实施例中，冠状病毒表达序列的表达持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或介于之间的任何时间。在某些实施例中，冠状病毒抗原和/或表位的表达持续不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天、60天、75天、90天或介于之间的任何时间。

在一些实施例中，冠状病毒表达序列的长度小于5000bp(例如，小于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或更小)。在一些实施例中，冠状病毒表达序列独立地或额外地具有大于10bp的长度(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。

衍生物和片段

本披露的抗原或表位可以包含野生型序列。当描述抗原或表位时，术语“野生型”是指天然存在的且由基因组(例如，冠状病毒基因组)编码的序列(例如，氨基酸序列)。冠状病毒可以具有一个野生型序列或者具有两个或更多个野生型序列(例如，在参考冠状病毒基因组中存在一个规范的野生型序列，并且存在由突变产生的其他变体的野生型序列)。

当描述抗原或表位时，术语“衍生物”和“源自”是指与野生型序列的不同之处在于一个或多个氨基酸，例如相对于野生型序列含有一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代的序列(例如，氨基酸序列)。

抗原或表位衍生物序列是与野生型序列(例如，野生型蛋白质、抗原或表位序列)具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的序列。

“序列同一性”和“序列相似性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列(例如，通过程序GAP或BESTFIT使用默认参数进行最佳比对时)至少具有某个最小百分比的序列同一性时，则可以将它们称为“基本上相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用GAP默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna而对于蛋白质，使用的默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff,1992,PNAS[美国国家科学院院刊]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分可以使用计算机程序来确定，诸如可从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,SanDiego,CA)获得的GCG Wisconsin软件包10.3版或EmbossWin 2.10.0版(使用程序“needle”)确定。替代性地或另外，通过使用诸如FASTA、BLAST等的算法对数据库进行搜索来确定相似性或同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。

在一些实施例中，抗原或表位含有影响所编码的蛋白质的结构的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，抗原或表位含有影响所编码的蛋白质的功能的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。在一些实施例中，抗原或表位含有影响细胞对所编码的蛋白质的表达或加工的一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合。

氨基酸的插入、缺失、取代或其组合可以引入翻译后修饰的位点(例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合去除翻译后修饰的位点(例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或靶向进行裂解的序列)。在一些实施例中，氨基酸的插入、缺失、取代或其组合修饰翻译后修饰的位点(例如，修饰位点以改变糖基化、泛素化、磷酸化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、酰胺化、羟基化、硫酸化或脂质化位点，或裂解的效率或特征)。

氨基酸取代可以是保守性或非保守性取代。保守性氨基酸取代可以是一个氨基酸被具有类似生物化学性质(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一氨基酸取代。非保守性氨基酸取代可以是一个氨基酸被具有不同生物化学性质(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一氨基酸取代。保守性氨基酸变化可以是例如对多肽的二级或三级结构影响最小的取代。保守性氨基酸变化可以是从一种亲水性氨基酸到另一种亲水性氨基酸的氨基酸变化。亲水性氨基酸可以包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。保守性氨基酸变化可以是从一种疏水性氨基酸到另一种亲水性氨基酸的氨基酸变化。疏水性氨基酸可以包括Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)、Tyr(Y)和Pro(P)。保守性氨基酸变化可以是从一种酸性氨基酸到另一种酸性氨基酸的氨基酸变化。酸性氨基酸可以包括Glu(E)和Asp(D)。保守性氨基酸变化可以是从一种碱性氨基酸到另一种碱性氨基酸的氨基酸变化。碱性氨基酸可以包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。保守性氨基酸变化可以是从一种极性氨基酸到另一种极性氨基酸的氨基酸变化。极性氨基酸可以包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。保守性氨基酸变化可以是从一种非极性氨基酸到另一种非极性氨基酸的氨基酸变化。非极性氨基酸可以包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。保守性氨基酸变化可以是从一种芳族氨基酸到另一种芳族氨基酸的氨基酸变化。芳族氨基酸可以包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。保守性氨基酸变化可以是从一种脂族氨基酸到另一种脂族氨基酸的氨基酸变化。脂族氨基酸可以包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。在一些实施例中，保守性氨基酸取代是以下各类之一的一个氨基酸到另一氨基酸的氨基酸变化：I类：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；II类：cys、ser、tyr、thr；III类：val、ile、leu、met、ala、phe；IV类：lys、arg、his；V类：phe、tyr、trp、his；和VI类：asp、glu。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸缺失。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸取代。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸取代。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸取代。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。

这一个或多个氨基酸取代可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸取代可以是连续的、非连续的或其组合。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个或至多200个氨基酸缺失。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200个氨基酸缺失。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸缺失。

这一个或多个氨基酸缺失可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸缺失可以是连续的、非连续的或其组合。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入。

在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入。

在一些实施例中，本披露的抗原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸插入。

在一些实施例中，本披露的免疫原衍生物或表位衍生物相对于本文披露的序列(例如，野生型序列)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸插入。

这一个或多个氨基酸插入可以处于N端、C端、氨基酸序列内，或为其组合。这些氨基酸插入可以是连续的、非连续的或其组合。

环状多核糖核苷酸

环状多核糖核苷酸包含如下所述的元件以及本文所述的冠状病毒抗原或表位。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸为至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受任何特定理论的束缚，有可能RNA的多个区段可以从DNA产生并且其5'游离末端和3'游离末端退火以产生一“串”RNA，当只留有一个5'游离末端和一个3'游离末端时，该“串”RNA最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽(诸如本披露的抗原和/或表位)的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少70个核苷酸的长度可能是有用的。

环状多核糖核苷酸元件

在一些实施例中，除了包含编码冠状病毒抗原和/或表位的序列之外，环状多核糖核苷酸还包含如本文所述的元件中的一种或多种。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏聚A序列，缺乏游离的3'末端，缺乏RNA聚合酶识别基序，或它们的任何组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如特此通过援引以其全文并入本文的WO 2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合。例如，环状多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一种调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指选择性地起始或激活环状多核糖核苷酸中的表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码产生目标人多克隆抗体的抗原并包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。在WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。包括在环状多核糖核苷酸中的合适的IRES元件可以是能够接合真核核糖体的RNA序列。在WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，编码抗原)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

本披露的环状多核糖核苷酸可以包含交错元件。术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x＝任何氨基酸(SEQ ID NO:52)。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如丙三醇、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且该一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，交错元件阻止(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单个多肽。在一些实施例中，交错元件是与该一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。

在WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包含与调控核酸像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反义的序列。

在WO 2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性的调控核酸，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于参考物的翻译效率至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率300％。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上相等的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上相等的比率产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。

在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译得出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非翻译区(UTR)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。

在WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性的非翻译区，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A序列。在WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性的聚A序列，该专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。在WO 2019/118919的段落[0232]-[0252]中描述了示例性的核糖开关，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。在WO 2019/118919的段落[0253]-[0259]中描述了示例性适体酶，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA结合位点。微小RNA(或miRNA)抗原是短非编码RNA，可与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包含一种或多种微小RNA靶标序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可以对应于任何已知的微小RNA，如在美国公开US2005/0261218和美国公开US 2005/0059005中传授的那些，其内容通过援引以其全文并入本文。在WO 2019/118919的段落[0206]-[0215]中描述了RNA结合位点的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。在WO 2019/118919的段落[0218]-[0221]中描述了蛋白质结合位点的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含间隔序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸的元件可以通过间隔区序列或接头彼此隔开。在WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的间隔区序列，该专利特此通过援引以其全文并入。

本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包含非核酸接头。在WO 2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸接头，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸还包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸中存在的基因表达产物不同的基因表达产物。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'帽。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，siRNA、lncRNA、shRNA)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。

作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包含某些使其区别于线性RNA的特征。例如，与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸作为产生多肽(例如，引发抗体反应的抗原和/或表位)的细胞转化试剂更加有用。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸与线性RNA相比，更易储存更长时间。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，该方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。

此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包含特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)富集区。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个AU富集区或元件(ARE)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括本文其他处所述的一个或多个重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的修饰。

环状多核糖核苷酸相对于参考序列可以包括一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，相对于亲本多核糖核苷酸具有一个或多个插入、添加、缺失和/或共价修饰的环状多核糖核苷酸包括在本披露的范围内。在WO 2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性的修饰，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或RNA结合位点。在一些实施例中，基本上单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而结合或增加蛋白质或核酸结合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸序列基本上是双链的。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包括此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。

有16种可能的碱基对，但是其中的六种(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可能形成实际的碱基对。其余的称为不匹配，以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，不影响其功能且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富U和/或富A序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一个。在一些实施例中，富C和/或富G序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含具有一个或多个基序的三级结构，例如假结、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。

在WO 2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的结构的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

稳定性和半衰期

在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列，未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对降解(例如核酸外切酶的降解)有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在WO 2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的稳定性和半衰期的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

生产方法

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。

在本披露的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包括多种免疫原的融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。

环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。

制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下中，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC出版社(2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具和应用],(第一版),学术出版社(Academic Press)(2013)；和Egli&Herdewijn,Chemistry andBiology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH(2012)。

多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号US 6210931、美国专利号US 5773244、美国专利号US 5766903、美国专利号US5712128、美国专利号US 5426180、美国公开号US 20100137407、国际公开号WO 1992001813和国际公开号WO 2010084371；其中每一个的内容通过援引以其全文并入本文)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是纯化的，例如，去除了游离核糖核酸、线性或带切口的RNA、DNA、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域通常使用的任何已知方法纯化环状多核糖核苷酸。纯化方法的非限制性实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。

环化

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在细胞内环化。

a.细胞外环化

在一些实施例中，使用化学方法环化或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸的5'-端和3'-端(例如，线性环状多核糖核苷酸)包括化学反应性基团，当基团彼此靠近时，可在分子的3'-端和5'-端之间形成新的共价键。5'-端可以含有NHS酯反应性基团，且3'-端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'-端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5'-/3'-酰胺键。

在一些实施例中，使用DNA或RNA连接酶将5'-磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性环状多核糖核苷酸与1-10单位的T4 RNA连接酶(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs,Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'-和3'-区域碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，夹板连接酶，如

连接酶，可用于夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)，如单链RNA，可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，DNA或RNA连接酶用于环状多核苷酸的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5'-或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够将线性环状多核糖核苷酸的5'-末端连接至线性环状多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1小时至24小时。

在一些实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，至少一个非核酸部分可与线性环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近线性环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，如疏水键、离子键、生物可降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，如本文所述的适体或非核酸接头。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸由于非核酸部分而被环化或连环化，造成位于、邻近或连接至环状多核糖核苷酸的5'和3'端的原子、分子表面之间的吸引。作为一个非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，肽共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列可以彼此联系，引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，肽共价地连接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于本发明的线性初级构建体或线性RNA中的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号US 20030082768中描述，该专利内容通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸，例如通过使5'三磷酸与RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可通过两步反应完成，该两步反应包括：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以除去所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单个磷酸酯的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。

在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约40％。在一些实施例中，所提供的环化方法的环化效率介于约10％至约100％之间；例如，环化效率可为约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和约99％。在一些实施例中，环化效率介于约20％至约80％之间。在一些实施例中，环化效率介于约30％至约60％之间。在一些实施例中，环化效率为约40％。

b.剪接元件

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在WO 2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性的剪接元件，该专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在本文提供的环状多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介导环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。例如，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可介导导致线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，从而所得的环状多核糖核苷酸包含来自此类剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可以介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，该剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例可以包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，如AluSq2、AluJr和AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplice site)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自Alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白可以调控环状多核糖核苷酸的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括隆起-螺旋-隆起基序，包含两个3-核苷酸隆起侧接的4-碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯的特征片段。通过将5'-OH基团亲核攻击到形成3',5'-磷酸二酯桥的同一分子的2',3'-环状磷酸酯上来进行环化。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括具有HPR元件的多聚重复RNA序列。HPR包含2',3'-环状磷酸酯和5'-OH端。HPR元件自加工用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端和3'-末端，从而将这些末端连接在一起。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自剪接元件。例如，环状多核糖核苷酸可以包括来自蓝细菌鱼腥藻(Anabaena)的内含子。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUA CUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC(SEQ ID NO:61)或GGCUAGAGGCGGCAGU CCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACU CGCCGCCCGAGCC(SEQ ID NO:62))，以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括环E序列(例如在PSTVd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自环化内含子，例如5'和3'剪接接合，或自环化催化内含子，如I型、II型或III型内含子。I型内含子自剪接序列的非限制性实例可以包括源自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列和四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。

其他环化方法

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于线性环状多核糖核苷酸的5'端和3'端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。

在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半亚胺-亚胺交联、碱基修饰及其任何组合。

在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶，例如DNA或RNA连接酶，可用于生成环状多核糖核苷酸或互补物的模板、环状多核糖核苷酸的互补链或环状多核糖核苷酸。

环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，Petkovic和Muller,“RNAcircularization strategies in vivo and in vitro[体内外核糖核酸环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，和Muller和Appel,“Invitro circularization ofRNA[核糖核酸的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。

环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。在WO 2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性的复制元件，该专利特此通过援引以其全文并入。

线性多核糖核苷酸

如本文所披露的线性多核糖核苷酸包含编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列。这种线性多核糖核苷酸在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中表达编码来自冠状病毒的抗原和/或表位的序列。在一些实施例中，包含冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸用于在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中产生免疫反应。在一些实施例中，是mRNA并且包含冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸用于在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中产生免疫反应。在一些实施例中，包含冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸用于产生如本文所述的多克隆抗体。

冠状病毒抗原和表位

线性多核糖核苷酸包含编码冠状病毒抗原或表位的序列。本文披露的抗原和/或表位与冠状病毒相关。在一些实施例中，这些抗原和/或表位是由冠状病毒表达的，或源自冠状病毒所表达的抗原和/或表位。

抗原是含有一个或多个表位(线性表位、构象表位或两者)的分子，在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中引发适应性免疫反应。表位可以是被给定抗体或T细胞受体识别、靶向或结合的抗原的一部分。表位可以是线性表位，例如氨基酸的连续序列。表位可以是构象表位，例如，含有在蛋白质的折叠构象中形成表位的氨基酸的表位。构象表位可以含有来自一级氨基酸序列的非连续氨基酸。通常，表位将包括约3-15个，通常约5-15个氨基酸。B细胞表位通常为约5个氨基酸，但也可以小至3-4个氨基酸。T细胞表位(诸如CTL表位)将包括至少约7-9个氨基酸，而辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位将包括约7至15个氨基酸，诸如9、10、12或15个氨基酸。

抗原和/或表位可以来自冠状病毒表面蛋白、冠状病毒膜蛋白、冠状病毒包膜蛋白、冠状病毒衣壳蛋白、冠状病毒核衣壳蛋白、冠状病毒刺突蛋白、刺突的冠状病毒受体结合结构域蛋白、冠状病毒进入蛋白、冠状病毒膜融合蛋白、冠状病毒结构蛋白、冠状病毒非结构蛋白、冠状病毒调节蛋白、冠状病毒辅助蛋白、分泌型冠状病毒蛋白、冠状病毒聚合酶蛋白、冠状病毒RNA聚合酶、冠状病毒蛋白酶、冠状病毒糖蛋白、冠状病毒融合原、冠状病毒螺旋衣壳蛋白、冠状病毒二十面体衣壳蛋白、冠状病毒基质蛋白、冠状病毒复制酶、冠状病毒转录因子或冠状病毒酶。

在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自SARS-CoV基因组的预测转录物。在一些实施例中，本披露的抗原和/或表位来自由来自SARS-CoV基因组的开放阅读框编码的蛋白质。SARS-CoV基因组中开放阅读框的非限制性实例可以包括ORF1a、ORF1b、刺突(S)、ORF3a、ORF3b、包膜(E)、膜(M)、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣壳(N)和ORF10。在一些实施例中，来自SARS-CoV基因组的开放阅读框包括SEQ ID NO:11。

在特定实施例中，线性多核糖核苷酸包含表3中描述的SARS-CoV-2抗原。

表3：设计的线性构建体的描述。

在表3中，“脯氨酸取代”表示处于残基986和987处的脯氨酸取代，以及弗林蛋白酶裂解位点(残基682-685)处的“GSAS”取代。对于克隆优化，在坐标2541处进行单碱基取代以破坏BsaI位点，以协助质粒DNA模板的金门克隆构建。对于环化优化，四个单核苷酸-在位置2307、2709、159和315处-被取代以破坏可潜在结合夹板核酸序列环化元件的位点，从而潜在地抑制有效连接。所有单碱基对取代都被设计为翻译沉默。此外，在表3中，5’元件是珠蛋白(SEQ ID NO:32)；并且3’元件是：珠蛋白(SEQ ID NO:33)。

冠状病毒表位包括被B细胞识别的表位、被T细胞识别的表位或其组合。在一些实施例中，冠状病毒表位包括被B细胞识别的表位。在一些实施例中，表位是被B细胞识别的表位。在一些实施例中，冠状病毒表位包括被T细胞识别的表位。在一些实施例中，冠状病毒表位是被T细胞识别的表位。

本披露的线性多核糖核苷酸可以包含许多冠状病毒抗原和/或表位的序列。线性多核糖核苷酸包含例如至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种冠状病毒抗原或表位的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如至多1种、至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种或更少的冠状病毒抗原或表位的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种冠状病毒抗原或表位的序列。

线性多核糖核苷酸可以包含来自冠状病毒抗原的一个或多个冠状病毒表位的序列。例如，冠状病毒抗原可以包含氨基酸序列，其中可以含有多个冠状病毒表位(例如，被B细胞和/或T细胞识别的表位)，并且线性多核糖核苷酸可以包含或编码那些冠状病毒表位中的一个或多个表位。

线性多核糖核苷酸包含例如来自一种冠状病毒抗原的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多个表位的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如来自一种冠状病毒抗原的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个、至多200个、至多250个、至多300个、至多350个、至多400个、至多450个、至多500个或更少的冠状病毒表位的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如来自一种冠状病毒抗原的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个冠状病毒表位的序列。

线性多核糖核苷酸可以编码冠状病毒抗原或表位的变体。变体可以是天然存在的变体(例如，在来自不同的冠状病毒属、种、分离株或准种的序列数据中鉴定的变体)，或者可以是如本文所披露的已经经由电脑模拟生成的衍生序列(例如，与野生型抗原或表位相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合的抗原或表位)。

线性多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种变体的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种、或更少的变体的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含例如冠状病毒抗原或表位的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种变体的序列。

线性多核糖核苷酸的冠状病毒抗原和/或表位序列也可称为冠状病毒表达序列。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含一个或多个冠状病毒表达序列，其中每一个都可以可编码冠状病毒多肽。冠状病毒多肽可以大量产生。冠状病毒多肽可以是从细胞分泌的或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜隔室的冠状病毒多肽。一些冠状病毒多肽包括但不限于如本文所披露的抗原、如本文所披露的表位、冠状病毒蛋白的至少一部分(例如，病毒包膜蛋白、病毒基质蛋白、病毒刺突蛋白、病毒膜蛋白、病毒核衣壳蛋白、病毒辅助蛋白、其片段或其组合)。在一些实施例中，由本披露的线性多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含本文披露的冠状病毒抗原的片段。在一些实施例中，由本披露的线性多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含融合蛋白，该融合蛋白包含两种或更多种本文披露的冠状病毒抗原或其片段。在一些实施例中，由本披露的线性多核糖核苷酸编码的冠状病毒多肽包含冠状病毒表位。在一些实施例中，由本披露的线性多核糖核苷酸编码的多肽包含融合蛋白，该融合蛋白包含两个或更多个本文披露的冠状病毒表位，例如包含来自本披露的一种或多种冠状病毒的多个预测表位的人工肽序列。

在一些实施例中，从本文披露的线性多核糖核苷酸表达的示例性冠状病毒蛋白包括分泌型蛋白，例如天然包括信号肽的蛋白(例如抗原和/或表位)，或通常不编码信号肽，但是经修饰含有信号肽的蛋白。

线性多核糖核苷酸

线性多核糖核苷酸包含如下所述的元件以及本文所述的冠状病毒抗原或表位。

本文所述的线性多核糖核苷酸是具有5'末端和3'末端的多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性RNA具有游离的5'末端或3'末端。在一些实施例中，线性RNA具有经修饰或受保护免于降解的5'末端或3'末端。在一些实施例中，线性RNA具有非共价连接的5'或3'末端。在一些实施例中，线性RNA是mRNA。

线性RNA可以在其末端进行修饰以提高稳定性和/或减少降解。例如，5'游离末端和/或3'游离末端包括帽、聚A尾、G-四链体、假结、稳定的末端茎环、富含U的表达、核保留元件(ENE)或结合部分。例如，5'游离末端和/或3'游离末端包括末端保护剂，诸如帽、聚A尾、g-四链体、假结、稳定的末端茎环、富含U的表达、核保留元件(ENE)或结合部分。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸为至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的最大尺寸可以与产生线性多核糖核苷酸和/或使用线性多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受任何特定理论的束缚，有可能RNA的多个区段可以从DNA产生并且其5'游离末端和3'游离末端退火以产生一“串”RNA。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽(诸如本披露的免疫原或其表位)的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸、或至少70个核苷酸的长度可能是有用的。

线性多核糖核苷酸元件

在一些实施例中，除了包含编码冠状病毒抗原和/或表位的序列之外，线性多核糖核苷酸还包含如本文所述的元件中的一种或多种。例如，线性多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一种调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指选择性地起始或激活线性多核糖核苷酸中的表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始线性多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸编码产生目标多克隆抗体的抗原并包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为线性多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在线性多核糖核苷酸的单链区域内。

在一些实施例中，本文所述的线性多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。包括在线性多核糖核苷酸中的合适的IRES元件可以是能够接合真核核糖体的RNA序列。

线性多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，编码抗原)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。

在一些实施例中，线性多核苷酸包含5’帽，其中mRNA的5’帽结构增加mRNA稳定性。5'帽与mRNA帽结合蛋白(MBP)结合，通过CBP与聚A结合蛋白缔合形成成熟的RNA种类，有助于细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。

在一些实施例中，线性多核苷酸是5'末端加帽的并且在线性多核苷酸的末端鸟苷帽残基与5'末端转录的有义核苷酸之间包含5'-ppp-5'三磷酸键。这种5'鸟苷帽，也称为5'鸟苷酸化帽，可以被甲基化以生成N7-甲基鸟苷酸帽。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含非翻译区(UTR)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些实施例中，聚A序列的长度大于10个核苷酸。在一些实施例中，聚A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，聚A序列是约10个至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000)。

在一些实施例中，相对于整个线性多核糖核苷酸的长度设计聚A序列。该设计可以基于编码区的长度、特定特征或区域(如第一或侧翼区)的长度，或者基于线性多核糖核苷酸表达的最终产物的长度。在本文中，聚A序列的长度可以比线性多核糖核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。还可将聚A序列设计为线性多核糖核苷酸的一部分。在本文中，聚A序列可以是构建体的总长度的或构建体总长度减去聚A序列后的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。进一步，工程化的结合位点和线性多核糖核苷酸与聚A结合蛋白的缀合可以增强表达。

在一些实施例中，将线性多核糖核苷酸设计为包括聚A-G四分体(quartet)。G-四分体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA中的富含G的序列形成。在一些实施例中，G-四分体可被掺入聚A序列的端部。可以测定所得的线性多核糖核苷酸构建体的稳定性、蛋白产量和/或其他参数，包括在不同时间点的半衰期。在一些实施例中，聚A-G四分体产生的蛋白产量可以等于单独使用120个核苷酸的聚A序列所得的蛋白产量的至少75％。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。AU富集签名可增加表达产物的转化率。

UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节线性多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。工程化特定的线性多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入以使线性多核糖核苷酸不稳定，并且ARE的这些拷贝可以减少翻译和/或减少表达产物的产量。同样，可以鉴定和去除ARE或对其进行突变以增加细胞内稳定性，从而增加翻译和所得蛋白的产量。

可以将来自任何基因的UTR并入线性多核糖核苷酸的相应侧翼区域(例如，在5'末端或3'末端)。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。在一些实施例中，可以使用不是野生型基因的变体的人工UTR。这些UTR或其部分可以放置在与选择它们的转录物中相同的方向，或者可以改变方向或位置。因此，可以将5'-或3'-UTR反向、缩短、加长、或与一个或多个其他5'-UTR或3'-UTR制成嵌合体。如本文使用的，与UTR序列有关时，术语“改变的”是指UTR已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，3'-或5'-UTR可以通过如上所传授的方向或位置的更改相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过额外核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变。这些产生“改变的”UTR的任何更改(无论是3'还是5')都包含变体UTR。

在一些实施例中，可以使用双UTR、三UTR或四UTR，如5'-或3'-UTR。如本文所用，“双”UTR是其中相同UTR的两个拷贝被串联或基本上串联地编码的一种情况。例如，在本发明的一些实施例中可以使用双β-珠蛋白3'-UTR。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的线性多核糖核苷酸的表达序列可以包含与调控核酸像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反义的序列。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上相等的比率产生。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包含适体酶。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸缺少5’帽。

生产方法

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。

在本披露的范围内，用于产生RNA的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包括多种免疫原的融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。

线性多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可以连环化以产生本文所述的线性多核糖核苷酸。连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。

制备本文所述的线性多核糖核苷酸的方法描述于以下中，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC出版社(2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具和应用],(第一版),学术出版社(Academic Press)(2013)；和Egli&Herdewijn,Chemistry andBiology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH(2012)。

多种合成线性多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号US 6210931、美国专利号US 5773244、美国专利号US 5766903、美国专利号US5712128、美国专利号US 5426180、美国公开号US 20100137407、国际公开号WO 1992001813和国际公开号WO 2010084371；其中每一个的内容通过援引以其全文并入本文)。

产生免疫反应的方法

本披露提供了包含上述环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露提供了包含上述线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物可以包含稀释剂或载剂、佐剂或其任何组合。本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂，例如一种或多种佐剂。佐剂可以包括下面进一步讨论的TH1佐剂和/或TH2佐剂。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者(例如，要免疫接种的受试者)。在一些实施例中，免疫原性组合物包含不含任何载剂的稀释剂，并且用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者。

本发明的免疫原性组合物用于在受试者(例如，要免疫接种的受试者)中产生免疫反应。免疫反应可以包括抗体反应(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫反应。在一些实施例中，免疫原性组合物用于产生如本文所述的多克隆抗体。例如，为受试者免疫接种包含含有冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物，以刺激与冠状病毒抗原和/或表位结合的多克隆抗体的产生。在另一个实例中，为受试者免疫接种包含含有冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物，以刺激与冠状病毒抗原和/或表位结合的多克隆抗体的产生。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是非人类动物。在一些实施例中，非人类动物具有人源化免疫系统。在一些实施例中，受试者进一步用佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。任选地，在用包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种后，从受试者收集并纯化所产生的多克隆抗体。任选地，在用包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种后，从受试者收集并纯化所产生的多克隆抗体。在一些实施例中，组合物包含在施用本文所述的免疫原性组合物后收集的血浆。

免疫接种

在一些实施例中，本披露的方法包括为受试者(例如，要免疫接种的受试者)免疫接种包含如本文所披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。在一些实施例中，冠状病毒抗原和/或表位由环状多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由环状多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种诱导与环状多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位结合的多克隆抗体的产生。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。

在一些实施例中，本披露的方法包括为受试者(例如，要免疫接种的受试者)免疫接种包含如本文所披露的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。在一些实施例中，冠状病毒抗原和/或表位由线性多核糖核苷酸表达。在一些实施例中，免疫接种在受试者中诱导针对由线性多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位的免疫反应。在一些实施例中，免疫接种诱导与线性多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位结合的多克隆抗体的产生。在一些实施例中，免疫原性组合物在单一组合物中包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一些实施例中，受试者进一步用第二佐剂免疫接种。在一些实施例中，受试者进一步用疫苗免疫接种。

如本文所披露的环状多核糖核苷酸通过在受试者(例如，要免疫接种的受试者)免疫接种后刺激适应性免疫反应来刺激人多克隆抗体的产生。在一些实施例中，受试者的适应性免疫反应包括刺激B淋巴细胞释放与环状多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原特异性结合的多克隆抗体。如本文所披露的线性多核糖核苷酸通过在受试者免疫接种后刺激适应性免疫反应来刺激人多克隆抗体的产生。在一些实施例中，受试者的适应性免疫反应包括刺激B淋巴细胞释放与线性多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原特异性结合的多克隆抗体。在一些实施例中，受试者的适应性免疫反应包括刺激细胞介导的免疫反应。

受试者(例如，要免疫接种的受试者)免疫接种一种或多种包含任意数量的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。受试者用例如包含至少1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的环状多核糖核苷酸或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的环状多核糖核苷酸或少于21种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的环状多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的抗原和/或表位、重叠的抗原和/或表位、相似的抗原和/或表位或相同的抗原和/或表位(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给相同的解剖位置或不同的解剖位置。

这两种或更多种不同的环化多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同冠状病毒、不同冠状病毒或本文披露的冠状病毒的不同组合的抗原和/或表位。这两种或更多种不同的环状多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同冠状病毒或来自不同冠状病毒(例如，不同分离株)的抗原和/或表位。

受试者(例如，要免疫接种的受试者)免疫接种一种或多种包含任意数量的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。受试者用例如包含至少1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。具有非人源化免疫系统的非人动物用例如包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种不同的线性多核糖核苷酸或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含至多1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物用包含至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多11种、至多12种、至多13种、至多14种、至多15种、至多20种不同的线性多核糖核苷酸或少于21种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人动物用包含约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种或约20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用包含约1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。不同的线性多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它们可以包括或编码不同的抗原和/或表位、重叠的抗原和/或表位、相似的抗原和/或表位或相同的抗原和/或表位(例如，具有相同或不同的调控元件、起始序列、启动子、终止元件或本披露的其他元件)。在受试者用包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种的情况下，这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以处于相同或不同的免疫原性组合物中并且同时或在不同时间免疫接种。可以将包含两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给相同的解剖位置或不同的解剖位置。

这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同冠状病毒、不同冠状病毒或本文披露的冠状病毒的不同组合的抗原和/或表位。这两种或更多种不同的线性多核糖核苷酸可以包括或编码来自相同冠状病毒或来自不同冠状病毒(例如，不同分离株)的抗原和/或表位。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)用如本文所披露的包含任何数量的环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物和包含任何数量的线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，本文披露的免疫原性组合物包含如本文所披露的一种或多种环状多核糖核苷酸和一种或多种线性多核糖核苷酸。

在一些实施例中，免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将环状多核糖核苷酸裸递送至受试者。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第一佐剂。

在某些实施例中，进一步向受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用第二佐剂。佐剂增强先天免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应以产生多克隆抗体。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与环状多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。

在一些实施例中，免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合。在一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包含线性多核糖核苷酸与不含任何载剂的稀释剂的免疫原性组合物用于将线性多核糖核苷酸裸递送至受试者(例如，要免疫接种的受试者)。在另一个特定实施例中，免疫原性组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和第一佐剂。

在某些实施例中，进一步向受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用第二佐剂。佐剂增强先天免疫反应，继而增强受试者中的适应性免疫反应以产生多克隆抗体。佐剂可以是如下所讨论的任何佐剂。在某些实施例中，佐剂作为免疫原性组合物的一部分与线性多核糖核苷酸一起配制。在某些实施例中，佐剂不是包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物的一部分。在某些实施例中，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物分开施用。在这方面，佐剂与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用佐剂。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用佐剂。将佐剂施用到与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物相同的解剖位置或不同的解剖位置。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)用第二药剂，例如不是环状多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用疫苗。例如，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用疫苗。在一些实施例中，在包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用疫苗。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)用第二药剂，例如不是线性多核糖核苷酸的疫苗(如下所述)进一步免疫接种。该疫苗与包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物共同施用(例如同时施用)或在不同的时间施用给受试者。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，或介于之间的任何分钟数或小时数，施用该疫苗。例如，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之后1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用疫苗。在一些实施例中，在包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介于之间的任何天数，施用该疫苗。

受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以用免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种任何合适的次数，以实现所需的反应。例如，可利用初免-加强免疫接种策略来生成含有高浓度的与本披露的抗原和/或表位结合的抗体的超免疫血浆。受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，例如至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种一次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种两次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种三次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种四次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种五次。在一些实施例中，受试者可以用本披露的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种七次。

可以选择合适的时间间隔以间隔两次或更多次免疫接种。该时间间隔可以适用于用相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合进行多次免疫接种，例如，相同免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如蛋白质亚基疫苗)或其组合可以经由相同的免疫接种途径或不同的免疫接种途径以相同的量或不同的量施用。该时间间隔可适用于用不同药剂，例如，包含第一环状多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二环状多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物进行免疫接种。该时间间隔可以适用于包含第一线性多核糖核苷酸的第一免疫原性组合物和包含第二线性多核糖核苷酸的第二免疫原性组合物。对于包括三次或更多次免疫接种的方案，免疫接种的时间间隔可以相同或不同。在一些实例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小时。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8周。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过约1、2、3、4、5、6、7或8个月。

在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时或至少72小时或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多15小时、至多20小时、至多24小时、至多36小时或至多72小时或更少时间。

在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少时间。

在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2周、至多3周、至多4周、至多5周、至多6周、至多7周、至多8周或更少时间。

在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月或至少8个月或更长时间。在一些实施例中，两次免疫接种之间经过至多2个月、至多3个月、至多4个月、至多5个月、至多6个月、至多7个月、至多8个月或更少时间。

在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物以3-4周的间隔免疫接种3次。

在一些实施例中，该方法进一步包括向非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的非人类动物)或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)预先施用药剂以提高免疫反应。在一些实施例中，该药剂是如本文所披露的抗原(例如，蛋白质抗原)。例如，该方法包括在施用包含编码蛋白质抗原的序列的环状多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质抗原。在一些实施例中，在施用包含编码蛋白质抗原的序列的环状多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质抗原。例如，该方法包括在施用包含编码蛋白质抗原的序列的线性多核糖核苷酸前1至7天施用蛋白质抗原。在一些实施例中，在施用包含编码蛋白质抗原的序列的线性多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天施用蛋白质抗原。蛋白质抗原可以作为蛋白质制剂施用，在质粒(pDNA)中编码，存在于病毒样颗粒(VLP)中，以脂质纳米颗粒的形式配制等。

受试者(例如，要免疫接种的受试者)可以在任何合适数目的解剖部位用免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合免疫接种。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给多个解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给不同的解剖部位，可以将包含相同或不同的环状多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给两个不同的解剖部位，和/或可以将包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给一个解剖部位，并且可以将佐剂施用给不同的解剖部位。可以将相同的免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给多个解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给不同的解剖部位，可以将包括相同或不同的线性多核糖核苷酸的不同免疫原性组合物、佐剂、疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合施用给相同的解剖部位，或其任何组合。例如，可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给两个不同的解剖部位，和/或可以将包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物施用给一个解剖部位，并且可以将佐剂施用给不同的解剖部位。

任何两个或更多个解剖途径的免疫接种可以经由相同的免疫接种途径(例如，肌内)或通过两个或更多个免疫接种途径来进行。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物、佐剂或疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)或其组合向受试者的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个解剖部位或更少解剖部位免疫接种。在一些实施例中，将本披露的包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物或佐剂向受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个解剖部位免疫接种。

免疫接种可以经由任何合适的途径。免疫接种途径的非限制性实例包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或实质内，例如注射和输注。在一些情况下，免疫接种可以经由吸入进行。可以通过相同或不同的途径进行两次或更多次免疫接种。

可以向本披露的受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用任何适量的环状多核糖核苷酸。例如，受试者可以用至少约1ng、至少约10ng、至少约100ng、至少约1μg、至少约10μg、至少约100μg、至少约1mg、至少约10mg、至少约100mg或至少约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用至多约1ng、至多约10ng、至多约100ng、至多约1μg、至多约10μg、至多约100μg、至多约1mg、至多约10mg、至多约100mg或至多约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用约1ng、约10ng、约100ng、约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg、约100mg或约1g的环状多核糖核苷酸免疫接种。

可以向本披露的受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用任何适量的线性多核糖核苷酸。例如，受试者可以用至少约1ng、至少约10ng、至少约100ng、至少约1μg、至少约10μg、至少约100μg、至少约1mg、至少约10mg、至少约100mg或至少约1g的线性多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用至多约1ng、至多约10ng、至多约100ng、至多约1μg、至多约10μg、至多约100μg、至多约1mg、至多约10mg、至多约100mg或至多约1g的线性多核糖核苷酸免疫接种。在一些实施例中，受试者可以用约1ng、约10ng、约100ng、约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg、约100mg或约1g的线性多核糖核苷酸免疫接种。

在一些实施例中，该方法进一步包括评价非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的受试者)对抗原的抗体反应。在一些实施例中，评价是在施用包含编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸之前和/或之后。在一些实施例中，评价是在施用包含编码冠状病毒抗原的序列的线性多核糖核苷酸之前和/或之后。

稀释剂

在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和稀释剂。在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂。

稀释剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。非载剂赋形剂可以是适于施用给非人类动物(例如，适合兽医用途)的任何非活性成分。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)来设计和/或进行此类修饰。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以以裸递送配制品的形式递送，诸如包含稀释剂。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对环状多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。

裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含经修饰的磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸可以以裸递送配制品的形式递送，诸如包含稀释剂。裸递送配制品将线性多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对线性多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。

裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中线性多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对线性多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的线性多核糖核苷酸是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的线性多核糖核苷酸不含经修饰的磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的线性多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。

在一些实施例中，裸递送配制品不含以下任何或全部：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。在一些实施例中，裸递送配制品不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DO^TMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。

在某些实施例中，裸递送配制品包含非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂包含不表现出细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂包含缓冲剂，例如PBS。在一些实施例中，非载剂赋形剂是溶剂、非水溶剂、稀释剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂或油。

在一些实施例中，裸递送配制品包含稀释剂。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂是RNA增溶剂、缓冲剂或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。

载剂

在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和载剂。在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和载剂。

在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的环状多核糖核苷酸。在某些实施例中，免疫原性组合物包含在囊泡或其他基于膜的载剂中的如本文所述的线性多核糖核苷酸。

在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的环状多核糖核苷酸。在其他实施例中，免疫原性组合物包含在或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的线性多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的环状多核糖核苷酸。在一个实施例中，免疫原性组合物包含在脂质体或其他类似囊泡中的线性多核糖核苷酸。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，避免其货物被血浆酶降解，并将其负载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(有关综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。

囊泡可由几种不同类型的脂质制成；然而，最常使用磷脂生成作为药物载剂的脂质体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过援引并入文中)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(有关综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，其关于挤出脂质制备的教导通过援引并入文中。

在某些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含环状多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒，例如本文所述的脂质纳米颗粒配制品。在某些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含线性多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒是为如本文所述的环状多核糖核苷酸分子提供生物相容性和生物可降解的递送系统的载剂的另一个实例。脂质纳米颗粒是为如本文所述的线性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和生物可降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，其保留了SLN的特性，提高了药物的稳定性和载药量，并防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶标并改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，其是一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分提高了药物包封有效率，促进了表面修饰，并防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。

载剂的其他非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载剂(例如，与环状多核糖核苷酸共价连接的蛋白质或与线性多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。碳水化合物载剂的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。阳离子载剂的非限制性实例包括脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三甲基亚胺)、聚(四甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、二-十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)。蛋白质载剂的非限制性实例包括人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。

外泌体也可用作本文所述的环状多核糖核苷酸分子的载剂或药物递送媒介物。外泌体也可用作本文所述的线性多核糖核苷酸分子的载剂或药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报]第6卷第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。

离体分化的红细胞也可以用作本文所述的环状多核糖核苷酸分子的载剂。离体分化的红细胞也可以用作本文所述的线性多核糖核苷酸分子的载剂。参见，例如，WO2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.NatureCommunications[自然通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。

例如WO 2018208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。例如WO 2018208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的环状多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的线性多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。

例如国际专利公开号WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526或WO2020041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸。植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子

微泡也可以用作载剂递送本文所述的环状多核糖核苷酸分子。微泡也可以用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸。参见，例如，US 7115583；Beeri,R.等人，Circulation.[循环]2002年10月1日；106(14):1756-1759；Bez,M.等人，Nat Protoc.[自然实验手册]2019年4月；14(4):1015-1026；Hernot,S.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2008年6月30日；60(10):1153-1166；Rychak,J.J.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2014年6月；72:82-93。在一些实施例中，微泡是白蛋白包被的全氟化碳微泡。

脂质纳米颗粒

本发明提供的组合物、方法和递送系统可以采用任何合适的载剂或递送形式，在某些实施例中包括脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合的脂质(诸如WO 2019217941的表5中描述的PEG缀合的脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过援引以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)。

可用于形成纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质包括例如WO 2019217941(通过援引并入)的表4中描述的那些—例如，含脂质的纳米颗粒可包含WO 2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的要素，诸如聚合物，诸如WO 2019217941(通过援引并入)的表5中描述的聚合物。

在一些实施例中，缀合的脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些(通过援引并入)和前述的组合。

在一些实施例中，可以掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，如W02009/127060或US 2010/0130588(通过援引并入)中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过援引并入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。

在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含：可电离脂质，其量是总脂质的约20mol％至约90mol％(在其他实施例中，它可以是存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)；约50mol％至约90mol％)；非阳离子脂质，其量是总脂质的约5mol％至约30mol％；缀合脂质，其量是总脂质的约0.5mol％至约20mol％，以及甾醇，其量是总脂质的约20mol％至约50mol％。总脂质与核酸的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。

在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在以下范围中：约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比率，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比率。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。

可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：

在一些实施例中，包含式(i)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(ii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(iii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(v)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(vi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(viii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(ix)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

其中

X¹是O、NR¹或直接键，X²是C2-5亚烷基，X³是C(＝O)或直接键，R¹是H或Me，R³是C1-3烷基，R²是C1-3烷基，或R²与它所附接的氮原子和X²的1-3个碳原子一起形成4-元、5-元或6-元环，或X¹是NR¹，R¹和R²与它们所附接的氮原子一起形成5-元或6-元环，或R²与R³和它们所附接的氮原子一起形成5-元、6-元或7-元环，Y¹是C2-12亚烷基，Y²选自

(在任一取向上)，(在任一取向上)，(在任一取向上)，

n为0至3，R⁴为C1-15烷基，Z¹为C1-6亚烷基或直接键，

Z²是

(在任一取向上)或不存在，条件是如果Z¹是直接键，则Z²不存在；

R⁵是C5-9烷基或C6-10烷氧基，R⁶是C5-9烷基或C6-10烷氧基，W是亚甲基或直接键，并且R⁷是H或Me，或其盐，条件是如果R³和R²是C2烷基，X¹是O，X²是直链C3亚烷基，X³是C(＝0)，Y¹是直链Ce亚烷基，(Y²)n-R⁴是

，R⁴是直链C5烷基，Z¹是C2亚烷基，Z²不存在，W是亚甲基，并且R⁷是H，则R⁵和R⁶不是Cx烷氧基。

在一些实施例中，包含式(xii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(xi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

其中

在一些实施例中，LNP包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。

在一些实施例中，包含式(xv)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。

其中

在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制成：

在一些实施例中，本文所述的组合物(例如，核酸或蛋白质)在包含可电离脂质的LNP中提供。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)；例如，如US 9,867,888的实例1中所述(通过援引以其全文并入本文)。在一些实施例中，可电离脂质是9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯(LP01)，例如，如WO 2015/095340(通过援引以其全文并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，例如如US 2012/0027803(通过援引以其全文并入本文)的实例7、实例8或实例9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)，例如，如WO 2010/053572(通过援引以其全文并入本文)的实例14和实例16中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如来自WO 2020/106946(通过援引以其全文并入本文)的结构(I)。

在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含与中性脂质、可电离含胺脂质、生物可降解的炔脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如固醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质中的一种或多种配制的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pKa。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pKa(例如，大于第一有效pKa)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包含40摩尔％至60摩尔％的包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如RNA(例如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。核酸可以吸附到LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，LNP配制品是生物可降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的RNA分子。

可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于通过援引并入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W02013/016058的A；W02012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210的；W02009/132131的I、II、III或IV；US2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269的；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I。

在一些实施例中，可电离脂质是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烷-6,9,28,3l-四烯-l9-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)，例如，如WO 2019051289 A9(通过援引以其全文并入本文)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质ATX-002，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入本文)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3,l6-二烯-l-胺(化合物32)，例如，如WO 2019051289 A9(通过援引以其全文并入本文)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289 A9(通过援引以其全文并入本文)的实例12中所述。

示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、l8-l-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、神经鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反油烯酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为源自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于通过援引并入本文的Kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。在一些实施例中，此类脂质包括发现会改善用mRNA进行肝脏转染的植物脂质(例如DGTS)。

适合用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在WO2017/099823或美国专利公开US 2018/0028664(它们的内容通过援引以其全文并入本文)中描述。

在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或通过援引以其全文并入的US 2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0-30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％-20％(摩尔)或10％-15％(摩尔)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。

在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a-胆甾烷醇、53-粪甾烷醇、胆甾醇基-(2,-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a-胆甾烷、胆甾烯酮、5a-胆甾烷酮、5p-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。示例性的胆固醇衍生物在PCT公开W02009/127060和美国专利公开US 2010/0130588中描述，其中每个通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，提供膜完整性的组分，诸如固醇，可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-50％(摩尔)(例如，0-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或40％-50％)。在一些实施例中，这种组分占脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％-50％(摩尔)、30％-40％(摩尔)。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。

示例性的PEG-脂质缀合物包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物例如在US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904和US/099823中描述，所有这些的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质是US 2018/0028664(其内容通过援引以其全文并入本文)的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物。在一些实施例中，PEG-脂质具有US 20150376115或US 2016/0376224(两者的内容通过援引以其全文并入本文)的式II。在一些实施例中，PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂质可以是以下的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂酰胺、PEG-二棕榈酰甘油脂酰胺、PEG-二硬脂基甘油脂酰胺、PEG-胆固醇(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含选自以下的结构：

在一些实施例中，与PEG以外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(GPL)缀合物可用于代替PEG-脂质或与PEG-脂质一起使用。

示例性的缀合脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS专利申请中描述，所有这些的内容通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，PEG或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-20％(摩尔)。在一些实施例中，PEG或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(摩尔)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0-60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0-30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％-40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％-50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，该组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％-75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计20％-40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。该组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计60％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％-35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％-10％的非阳离子脂质。该组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％-30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0-20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％-20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。

在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20至70摩尔％的范围内，目标为40-60摩尔％，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30摩尔％的范围内，目标为0至15摩尔％，固醇的摩尔百分比在20至70摩尔％的范围内，目标为30至50摩尔％，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6摩尔％的范围内，目标为2至5摩尔％。

在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。

在一个方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。

在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。

在一些实施例中，LNP包含生物可降解的可电离脂质。在一些实施例中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340、和WO 2014/136086，以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在LNP脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据pH是阳离子的。

在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)测量的。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在特定实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径范围为约l mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm，或约38mm至约42mm。

在一些情况下，LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。LNP的多分散性指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施例中，LNP的多分散性指数可为约0.10至约0.20。

LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，LNP的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。

蛋白质和/或核酸的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与LNP缔合的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如RNA)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。

LNP可以任选地包含一层或多层包衣。在一些实施例中，LNP可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。

另外的示例性脂质、配制品、方法和LNP表征由WO 2020061457传授，其通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))或TransIT-mRNA转染试剂(米卢斯生物公司(Mirus Bio))进行体外或离体细胞脂质转染。在某些实施例中，使用GenVoy_ILM可电离脂质混合物(精密纳米系统(PrecisionNanoSystems))配制LNP。在某些实施例中，使用2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)配制LNP，其配制和体内用途在Jayaraman等人,Angew Chem Int Ed Engl[德国应用化学]51(34):8529-8533(2012)(通过援引以其全文并入本文)中教导。

优化用于递送CRISPR-Cas系统(例如Cas9-gRNARNP、gRNA、Cas9mRNA)的LNP配制品在两者均通过援引并入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，并且可用于递送本文所述的环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸。

可用于递送核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的另外的特定LNP配制品在两者均通过援引并入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称ONPATTRO销售的配制品。

多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)LNP的示例性给药可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(RNA)。包含本文所述的多聚核糖核苷酸的AAV的示例性给药可以包括约10¹¹、10¹²、10¹³、和10¹⁴vg/kg的MOI。

佐剂

佐剂会增强在接受佐剂和/或包含该佐剂的免疫原性组合物的受试者(例如，要免疫接种的受试者)中引发的免疫反应(体液和/或细胞免疫反应)。在一些实施例中，向受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用佐剂以从如本文所披露的环状多核糖核苷酸产生多克隆抗体。在一些实施例中，向受试者施用佐剂以从如本文所披露的线性多核糖核苷酸产生多克隆抗体。在一些实施例中，佐剂用于本文所述的方法中以产生如本文所述的多克隆抗体。在一个特定实施例中，佐剂用于促进受试者中针对由环状多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位的多克隆抗体的产生。在一些实施例中，佐剂和环状多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与环状多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物以获得免疫原性组合物，将该免疫原性组合物施用给受试者。在一个特定实施例中，佐剂用于促进受试者中针对由线性多核糖核苷酸表达的冠状病毒抗原和/或表位的多克隆抗体的产生。在一些实施例中，佐剂和线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。在一些实施例中，将佐剂与线性多核糖核苷酸混合或配制为单一组合物以获得免疫原性组合物，将该免疫原性组合物施用给受试者。

佐剂可以是TH1佐剂和/或TH2佐剂。优选的佐剂包括但不限于以下的一种或多种：

含矿物质的组合物。适于在本发明中用作佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，诸如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，诸如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，或不同矿物化合物的混合物，其中化合物呈任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形形式等)。钙盐包括磷酸钙(例如，“CAP”)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等。

油乳剂组合物。适于在本发明中用作佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，诸如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％ Span，使用微流化器配制为亚微米颗粒)、AS03(水包油乳剂中的α-生育酚、角鲨烯和聚山梨醇酯80)、Montanide配制品(例如MontanideISA51、Montanide ISA 720)、不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

小分子。适于在本发明中用作佐剂的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或R848、或嘎德莫特。

聚合物纳米颗粒。适于在本发明中用作佐剂的聚合物纳米颗粒包括聚(a-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚对二氧环己酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯-酰胺及其组合。

皂苷(即，糖苷，附接至一条或多条糖侧链的多环苷元)。适于在本发明中用作佐剂的皂苷配制品包括纯化配制品，诸如QS21，以及脂质配制品，诸如ISCOM和ISCOM基质。QS21作为STIMULON(TM)在市场上销售。皂苷配制品也可以包含固醇，诸如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。任选地，ISCOM可以不含另外的洗涤剂。

脂多糖。适于在本发明中使用的佐剂包括肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物。此类衍生物包括单磷酰基脂质A(MPLA)、吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)和3-O-去酰化MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱氧-酰化单磷酰基脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖胺磷酸盐衍生物，例如RC-529。

脂质体。适于在本发明中用作佐剂的脂质体包括病毒体和CAF01。

脂质纳米颗粒。适于在本发明中使用的佐剂包括脂质纳米颗粒(LNP)及其组分。

脂肽(即，包含一个或多个脂肪酸残基和两个或更多个氨基酸残基的化合物)。适于在本发明中用作佐剂的脂肽包括Pam2(Pam2CSK4)和Pam3(Pam3CSK4)。

糖脂。适于在本发明中用作佐剂的糖脂包括索状因子(海藻糖二霉菌酸酯)。

从革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌衍生(合成或纯化)的肽和肽聚糖，诸如MDP(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)适于在本发明中用作佐剂。

适于用作佐剂的碳水化合物(含碳水化合物)或多糖包括右旋糖酐(例如，支链微生物多糖)、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和几丁质。

基于RNA的佐剂。适于在发明中使用的基于RNA的佐剂是聚IC、聚IC:LC、带有或不带5'三磷酸的发夹RNA、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA天然或合成RNA序列及核酸类似物(例如，环状GMP-AMP或其他环状二核苷酸(例如环状二-GMP)、免疫刺激性碱基类似物(例如C8-取代的和N7,C8-二取代的鸟嘌呤核糖核苷酸))。

基于DNA的佐剂。适于在本发明中使用的基于DNA的佐剂包括CpG、dsDNA和天然或合成的免疫刺激DNA序列。

蛋白质或肽。适于在本发明中用作佐剂的蛋白质和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、MBL(甘露糖结合凝集素)、细胞因子和趋化因子。

病毒颗粒。适于用作佐剂的病毒颗粒包括病毒体(磷脂细胞膜双层)。

在本发明中使用的佐剂可以是细菌来源的，诸如鞭毛蛋白、LPS或细菌毒素(例如肠毒素(蛋白质)，例如热不稳定毒素或霍乱毒素)。在本发明中使用的佐剂可以是杂交分子，诸如缀合至咪喹莫特的CpG。在本发明中使用的佐剂可以是真菌或卵菌MAMP，诸如几丁质或β-葡聚糖。在一些实施例中，佐剂是无机纳米颗粒，诸如金纳米棒或基于二氧化硅的纳米颗粒(例如介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN))。在一些实施例中，佐剂是用糖脂免疫调节剂(海藻糖6,6-二山嵛酸酯(TDB)，这可以是位于分枝杆菌细胞壁上的索状因子的合成变体)稳定的多组分佐剂或佐剂体系，诸如AS01、AS03、AS04(MLP5+明矾)、CFA(完全弗氏佐剂：IFA+肽聚糖或海藻糖二霉菌酸酯)、CAF01(阳离子脂质体媒介物的两组分体系(二甲基双十八烷基铵(DDA))。

细胞因子。佐剂可以是编码细胞因子的部分或全长DNA，该细胞因子诸如促炎细胞因子(例如，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β)、Th-1诱导细胞因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18)或Th-2诱导细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13)。

趋化因子。佐剂可以是编码趋化因子的部分或全长DNA，趋化因子诸如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、Rantes或TCA-3。

佐剂可以是编码共刺激分子的部分或全长DNA，共刺激分子诸如CD80、CD86、CD40-L、CD70或CD27。

佐剂可以是编码先天免疫前哨(部分、全长或突变)或组成型活性(ca)先天免疫前哨的部分或全长DNA，这些前哨诸如caTLR4、casting、caTLR3、caTLR3、caTLR9、caTLR7、caTLR8、caTLR7、caRIG-I/DDX58或caMDA-5/IFIH1。

佐剂可以是编码适体或信号传导分子的部分或全长DNA，该适体或信号传导分子诸如STING、TRIF、TRAM、MyD88、IPS1、ASC、MAVS、MAPK、IKK-α、IKK复合物、TBK1、β-连环蛋白和半胱天冬酶1。

佐剂可以是编码转录激活因子的部分或全长DNA，该转录激活因子诸如可以上调免疫反应的转录激活因子(例如，AP1、NF-κB、IRF3、IRF7、IRF1或IRF5)。佐剂可以是编码细胞因子受体诸如IL-2β、IFN-γ或IL-6的部分或全长DNA。

佐剂可以是编码细菌组分诸如鞭毛蛋白或MBL的部分或全长DNA。

佐剂可以是编码先天免疫系统的任何组分的部分或全长DNA。

在一个特定实施例中，本发明中使用的佐剂是SAB的专有佐剂配制品，SAB-adj-1或SAB-adj-2。

疫苗

在本文所述的方法的一些实施例中，还向受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用第二药剂，例如，还向受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用第二疫苗。在一些实施例中，施用给受试者的组合物包含本文所述的环状多核糖核苷酸和第二疫苗。在一些实施例中，疫苗和环状多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与环状多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在环状多核糖核苷酸免疫接种之前或在环状多核糖核苷酸免疫接种之后施用。

例如，在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)用非环状多核糖核苷酸冠状病毒疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文所披露的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如PCV13或PPSV23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是RSV疫苗(例如，帕利珠单抗)。

在一些实施例中，施用给受试者的组合物包含本文所述的线性多核糖核苷酸和疫苗。在一些实施例中，疫苗和线性多核糖核苷酸在分开的组合物中共同施用。该疫苗与线性多核糖核苷酸免疫接种同时施用，在线性多核糖核苷酸免疫接种之前或在线性多核糖核苷酸免疫接种之后施用。

例如，在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)用多核糖核苷酸(例如，非线性多核糖核苷酸)冠状病毒疫苗(例如，蛋白质亚基疫苗)和包含如本文所披露的包含编码冠状病毒抗原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。在一些实施例中，受试者用第一微生物(例如，肺炎球菌)的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文所披露的包含编码冠状病毒抗原的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种。疫苗可以是任何细菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一个特定实施例中，疫苗是肺炎球菌多糖疫苗，诸如PCV13或PPSV23。在一些实施例中，疫苗是流感疫苗。在一些实施例中，疫苗是RSV疫苗(例如，帕利珠单抗)。

要免疫接种的受试者

本披露提供为受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用或免疫接种包含含有编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露提供为受试者(例如，要免疫接种的受试者)施用或免疫接种包含含有编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是动物。在一个特定实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是哺乳动物。在某些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是人。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是非人类动物。在一些实施例中，非人类动物具有人源化免疫系统。受试者的血浆或血液用于生成超免疫血浆，例如具有高浓度的与目标冠状病毒抗原和/或表位结合的抗体的血浆。

要免疫接种的非人类动物

本披露提供为非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)施用或免疫接种包含含有编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物。本披露提供为非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)施用或免疫接种包含含有编码冠状病毒抗原和/或表位的序列的线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物。

在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是宠物。在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是家畜动物。在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是农场动物。在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是动物园动物(例如，老虎、狮子、狼等)。

在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是哺乳动物。非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)包括有蹄类动物，例如驴、山羊、马、牛或猪。非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)还包括兔、大鼠或小鼠。在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是牛(牛科)。在其他实施例中，非人类动物是山羊。

在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)是鸡。

在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)具有人源化免疫系统并用于产生人多克隆抗体。

人源化免疫系统

具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)包括有蹄类动物，例如驴、山羊、马、牛或猪。具有人源化免疫系统的非人类动物还包括兔、大鼠或小鼠。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物是牛(牛科)。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物是山羊。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物是鸡。

具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)是产生人抗体或其抗体变体、片段和衍生物的动物。人源化免疫系统包含一个人源化免疫球蛋白基因座，或多个人源化免疫球蛋白基因座。

在一些实施例中，人源化免疫球蛋白基因座包含人免疫球蛋白的种系序列，从而允许非人类动物产生人源化抗体(例如，全人抗体)。

在一些实施例中，本披露的具有人源化免疫系统的非人类动物包含具有人源化免疫球蛋白基因座的非人B细胞。人源化免疫球蛋白基因座在B细胞发育过程中经历VDJ重组，从而允许生成具有多种抗原结合特异性的B细胞。

抗体的结合特异性通过VDJ重组过程生成。编码抗原结合部分(可变区)的外显子通过发育中的B细胞中的染色体断裂和重新连接进行组装。编码抗原结合结构域的外显子由所谓的V(可变)、D(多样性)和J(连接)基因区段通过“切割和粘贴”DNA重排组装而成。称为V(D)J重组的这一过程选择一对区段，在每个区段附近引入双链断裂，删除(或在选定的情况下，倒置)插入的DNA，并将这些区段连接在一起。重排可以有序的方式发生，进行D与J连接之后将V区段连接到重排的DJ区段。这种组合组装过程—从几种(有时是多种)可能性中选择每种类型的一个区段是在哺乳动物中驱动抗原受体多样性的基本引擎。不同区段之间连接处的特征变异性(少量核苷酸的丢失或增加)极大地扩大了多样性。该过程利用对生殖系编码能力的相对较小的投资，将其转化为几乎无限的潜在抗原结合特异性。

在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物包含通过例如人源化免疫球蛋白基因座的VDJ重组生成的具有不同特异性的多个B细胞。编码与本披露的抗原和/或表位特异性结合的B细胞受体(和抗体)的B细胞在遇到同源抗原时被激活，例如，在遇到从本披露的环状多核糖核苷酸表达的抗原和/或表位之后被激活。编码与本披露的抗原和/或表位特异性结合的B细胞受体(和抗体)的B细胞在遇到同源抗原时被激活，例如，在遇到从本披露的线性多核糖核苷酸表达的抗原和/或表位之后被激活。活化的B细胞产生特异性结合本披露的抗原和/或表位的抗体。活化的B细胞发生增殖。在一些实施例中，活化的非人B细胞分化成记忆B细胞和/或浆细胞。在一些实施例中，活化的非人B细胞经历类别转换以生成如本文所披露的不同同种型的抗体。在一些实施例中，非人B细胞经历体细胞超突变以生成以更高亲和力与抗原和/或表位结合的抗体。

在用包含表达多种抗原和/或表位的本披露的一种或多种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种后，多种B细胞克隆物对其各自的同源抗原反应，导致生成具有多种结合特异性的多克隆抗体。在一些实施例中，用包含本披露的一种或多种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物为本披露的非人类动物免疫接种激活至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种或至少100种非人B细胞克隆物。在一些实施例中，用包含本披露的一种或多种环状多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物为本披露的非人类动物免疫接种导致多克隆抗血清的产生，该多克隆抗血清包含特异性结合至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种或至少100种本披露的抗原和/或表位的抗体。

在用包含表达多种抗原和/或表位的本披露的一种或多种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物免疫接种后，多种B细胞克隆物对其各自的同源抗原反应，导致生成具有多种结合特异性的多克隆抗体。在一些实施例中，用包含本披露的一种或多种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物为本披露的非人类动物免疫接种激活至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种或至少100种非人B细胞克隆物。在一些实施例中，用包含本披露的一种或多种线性多核糖核苷酸的一种或多种免疫原性组合物为本披露的非人类动物免疫接种导致多克隆抗血清的产生，该多克隆抗血清包含特异性结合至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种或至少100种本披露的抗原和/或表位的抗体。

可以采用各种用于修饰非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物)的基因组的技术来开发能够产生人源化抗体的动物。非人类动物可以是转基因动物，例如，包含一个或多个人源化免疫球蛋白基因座的全部或大部分的转基因动物。非人类动物可以是转染色体动物，例如包含人类人工染色体或酵母人工染色体的非人类动物。

人源化免疫球蛋白基因座可以存在于载体上，例如人类人工染色体或酵母人工染色体(YAC)。可以将包含人源化免疫球蛋白基因座的人类人工染色体(HAC)引入动物中。载体(例如，HAC)可以含有人抗体重链基因(来自人14号染色体)和人抗体轻链基因(例如κ轻链基因(来自人2号染色体)和λ轻链基因(来自人22号染色体)中的一者或两者)的种系库。HAC可以转移到非人类动物物种的细胞中，并且可以通过体细胞核转移产生转基因动物。还可以培育转基因动物以产生包含人源化免疫球蛋白基因座的非人类动物。

在一些实施例中，将人源化免疫球蛋白基因座整合到非人类动物的基因组中。例如，可以采用包括同源重组或同源定向修复的技术来修饰动物基因组以引入人类核苷酸序列。可以使用诸如CRISPR/Cas、TALEN和锌指核酸酶等工具以靶向整合。

已经披露了生成具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)的方法。例如，可以生成人类人工染色体并将其转移到包含其他目标基因组修饰(例如，内源性非人类免疫系统基因的缺失)的细胞中，并且该细胞可以用作核供体以生成转基因非人类动物。

在一些实施例中，人源化免疫系统包含一条或多条人抗体重链，其中编码抗体重链的每个基因均与类别转换调控元件可操作地连接。可操作地连接可以意指第一DNA分子(例如，重链基因)与第二DNA分子(例如，类别转换调控元件)连接，其中第一和第二DNA分子排列成使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。这两种DNA分子可能是或者可能不是单个连续DNA分子的一部分，并且可能相邻或者可能不相邻。例如，如果启动子能够影响可转录DNA分子的转录或翻译，则启动子与可转录DNA分子可操作地连接。

在一些实施例中，人源化免疫系统包含一条或多条人抗体轻链。在一些实施例中，人源化免疫系统包含一条或多条人抗体替代轻链。

在一些实施例中，人源化免疫系统包含源自非人类动物的氨基酸序列，例如恒定区，诸如重链恒定区或其一部分。在一些实施例中，人源化免疫系统包含来自非人类动物的IgM重链恒定区(例如，有蹄类动物来源的IgM重链恒定区)。在一些实施例中，将编码该一条或多条人抗体重链的基因的至少一种类别转换调控元件置换为非人(例如，有蹄类动物来源的)类别转换调控元件，例如，以在非人类动物体内产生针对本披露的抗原和/或表位的抗体时允许抗体类别转换。

人源化免疫球蛋白基因座可以包含为了与非人类动物相容而并入的非人类元件。在一些实施例中，非人类元件可以存在于人源化免疫球蛋白基因座中以减少被非人类动物免疫系统的任何其余元件的识别。在一些实施例中，免疫球蛋白基因(例如，IgM)可以部分置换为来自非人类动物的氨基酸序列。在一些实施例中，非人调控元件存在于人源化免疫球蛋白基因座中以利于该基因座在非人类动物体内的表达和调节。

人源化免疫球蛋白基因座可以包含人DNA序列。可以对人源化免疫球蛋白基因座进行密码子优化以利于所包含的基因(例如，抗体基因)在非人类动物中的表达。

具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)可以包含或可缺少内源性非人免疫系统组分。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物可缺少非人抗体(例如，缺少产生非人抗体的能力)。具有人源化免疫系统的非人类动物可缺少例如一种或多种非人免疫球蛋白重链基因、一种或多种非人免疫球蛋白轻链基因或其组合。

具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)可以保留例如非人免疫细胞。具有人源化免疫系统的非人类动物可以保留非人类先天免疫系统组分(例如，细胞、补体、抗菌肽等)。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物可以留保非人T细胞。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物可以保留非人B细胞。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物可以保留非人抗原呈递细胞。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物可以保留非人抗体。

在一些实施例中，人源化免疫系统包含人先天免疫蛋白，例如补体蛋白。

在一些实施例中，人源化免疫系统包含人源化T细胞和/或抗原呈递细胞。

在一些实施例中，本披露的组合物和方法包含T细胞。例如，本披露的环状多核糖核苷酸可以包含被B细胞和T细胞识别的抗原，并且在非人类动物用人源化免疫系统免疫接种后，T细胞可以提供T细胞帮助，从而增加非人类动物体内抗体的产生。在另一个实例中，本披露的线性多核糖核苷酸可以包含被B细胞和T细胞识别的抗原，并且在非人类动物用人源化免疫系统免疫接种后，T细胞可以提供T细胞帮助，从而增加非人类动物体内抗体的产生。

在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)包含如US20170233459中披露的任何特征或特征的任何组合或任何制备方法，该专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物(例如，具有人源化免疫系统的要免疫接种的非人类动物)包含如以下披露的任何特征或特征的任何组合或任何制备方法：Kuroiwa,Y等人，Nat Biotechnol[自然生物技术],2009年2月；27(2):173-81；Matsushita,H.等人PLos ONE[公共科学图书馆：综合],2014年3月6日；9(3):e90383；Hooper,J.W.等人Sci Transl Med[科学转化医学],2014年11月26日；6(264):264ra162；Matsushit,H.等人,PLoS ONE[公共科学图书馆：综合]2015年6月24日；10(6):e0130699；Luke,T.等人Sci Transl Med[科学转化医学],2016年2月17日；8(326):326ra21；Dye,J.等人,Sci Rep.[科学报告]2016年4月25日；6:24897；Gardner,C.等人J Virol.[病毒学杂志]2017年6月26日；91(14)；Stein,D.等人,Antiviral Res[抗病毒研究]2017年10月；146:164-173；Silver,J.N.,Clin Infect Dis.[临床传染病]2018年3月19日；66(7):1116-1119；Beigel,J.H.等人,Lancet Infect Dis[柳叶刀传染病],2018年4月；18；(4):410-418；Luke,T.等人,J Inf Dis.[传染病杂志]2018年11月33；218(增刊5):S636-S648，其中每一个特此通过援引以其全文并入。

血浆收集

可以从用环状多核糖核苷酸免疫接种的受试者(例如，在要免疫接种的受试者免疫接种后)收集包含由免疫原性组合物产生的多克隆抗体的血浆，该免疫原性组合物包含编码冠状病毒抗原和/或表位的环状多核糖核苷酸，冠状病毒抗原和/或表位由如本文所披露的环状多核糖核苷酸表达。这些多克隆抗体可用于预防或治疗与由环状多核糖核苷酸表达的抗原和/或表位相关的冠状病毒。可以从用线性多核糖核苷酸免疫接种的受试者(例如，在要免疫接种的受试者免疫接种后)收集包含由免疫原性组合物产生的多克隆抗体的血浆，该免疫原性组合物包含编码冠状病毒抗原和/或表位的线性多核糖核苷酸，冠状病毒抗原和/或表位从如本文所披露的线性多核糖核苷酸表达。这些多克隆抗体可用于预防或治疗与由线性多核糖核苷酸表达的抗原和/或表位相关的冠状病毒。血浆可以经由血浆去除术收集。可以从同一受试者(例如，在要免疫接种的受试者免疫接种后)收集血浆一次或多次，例如，在免疫接种后的给定时间段内各自多次、免疫接种后多次、免疫接种之间多次，或其任何组合。

可以在免疫接种(例如第一次免疫接种、最近一次免疫接种或中间免疫接种)后任何适当的时间，从受试者(例如，在要免疫接种的受试者免疫接种后)收集血浆。可以在免疫接种后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更多天从受试者收集血浆。在一些实施例中，在免疫接种后至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多35天、至多42天、至多49天或至多56从受试者收集血浆。在一些实施例中，在免疫接种后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42天或更长时间从受试者收集血浆。在一些实施例中，组合物包含在施用本文所述的免疫原性组合物后收集的血浆。

血浆可以冷冻(例如，冷冻储存或运输)。在一些实施例中，将血浆保持新鲜，或从新鲜血浆中纯化抗体。

在一些实施例中，组合物包含收集的血浆。例如，组合物包含来自受试者的血浆和含有编码抗原的序列的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，组合物包含来自受试者的血浆和含有编码抗原的序列的环状多核糖核苷酸，以及抗原。在一个实例中，组合物包含来自受试者的血浆和含有编码抗原的序列的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，组合物包含来自受试者的血浆和含有编码抗原的序列的线性多核糖核苷酸，以及抗原。

多克隆抗体纯化

本披露提供了对本发明的冠状病毒抗原和/或表位具有特异性的多克隆抗体，以及通过向受试者施用有效量的多克隆抗体(例如，受试者治疗)来治疗或预防冠状病毒相关疾病或感染的方法。多克隆抗体如本文所披露的那样产生并在从用包含环状多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种的受试者(例如，要免疫接种的受试者)收集血浆后纯化。多克隆抗体如本文所披露的那样产生并在从用包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物免疫接种的受试者(例如，要免疫接种的受试者)收集血浆后纯化。

使用本领域技术人员熟知的技术从血浆中纯化多克隆抗体。例如，将血浆pH调节至4.8(例如，滴加20％乙酸)，以1.0的辛酸/总蛋白比率用辛酸进行分级分离，然后离心澄清(例如，在室温下10,000g离心20min)。将含有多克隆抗体(例如，IgG多克隆抗体)的上清液用1M tris中和至pH 7.5，0.22μM过滤，并用抗人免疫球蛋白特异性柱(例如，抗人IgG轻链特异性柱)进行亲和力纯化。多克隆抗体通过特异性结合杂质(例如来自非人类动物的非人抗体)的亲和柱进一步纯化。将多克隆抗体储存在合适的缓冲液，例如由10mM谷氨酸单钠盐、262mM D-山梨糖醇和吐温(Tween)(0.05mg/ml)(pH 5.5)组成的无菌过滤缓冲液中。测定纯化的多克隆抗体的量和浓度。进行HPLC尺寸排阻色谱法以确定是否存在聚集物或多聚体。

在一些实施例中，人多克隆抗体从具有人源化免疫系统的非人类动物根据Beigel,JH等人(Lancet Infect.Dis.[柳叶刀传染病],18:410-418(2018)，包括补充附录)而纯化，该文献通过援引以其全文并入本文。简言之，使用色谱法纯化来自具有人源化免疫系统的非人类动物的人源化IgG多克隆抗体。作为捕获步骤使用人IgGκ链特异性亲和柱(例如，来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的KappaSelect)，将全人IgG与非人类动物IgG分开。人IgGκ链特异性亲和柱特异性结合全人IgG，对非人类动物IgG Fc和IgG的交叉反应最小。使用与非人类动物IgG特异性结合的IgG Fc特异性亲和柱(例如，对于牛科而言，是来自通用电气医疗集团的Capto HC15)去除另外的非人类动物IgG，其用作负亲和步骤以特异性清除非人类动物IgG。也可以使用阴离子交换色谱步骤进一步减少污染物，诸如宿主DNA、内毒素、IgG聚集物和浸出的亲和配体。

多克隆抗体

如所披露那样产生的多克隆抗体与冠状病毒抗原和/或表位(例如，SARS-CoV-2抗原和/或表位)结合。这些多克隆抗体用于治疗或预防冠状病毒相关疾病或感染(例如，COVID-19或SARS-CoV-2感染)的方法中，例如，这些抗体可以提供针对表达这些抗原和/或表位或类似抗原和/或表位的冠状病毒的保护。

本披露的多克隆抗体与例如至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种冠状病毒抗原或表位结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与例如至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种或更少的冠状病毒抗原或表位结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种冠状病毒抗原或表位结合。

本披露的多克隆抗体与来自冠状病毒抗原的一个或多个表位结合。例如，冠状病毒抗原包含氨基酸序列，其中含有多个表位(例如，被B细胞和/或T细胞识别的表位)，并且抗体克隆物与那些表位中的一个或多个结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与来自一种冠状病毒抗原的例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多个表位结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与来自一种冠状病毒抗原的例如至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多120个、至多140个、至多160个、至多180个、至多200个、至多250个、至多300个、至多350个、至多400个、至多450个、或至多500个或更少的表位结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与来自一种冠状病毒抗原的例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个表位结合。

本披露的多克隆抗体与冠状病毒抗原或表位的变体结合。变体可以是天然存在的变体(例如，在来自不同的冠状病毒种、分离株或准种的序列数据中鉴定的变体)，或者可以是如本文所披露的已经经由电脑模拟生成的衍生序列(例如，与野生型抗原或表位相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失、取代或其组合的抗原或表位)。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与一种冠状病毒抗原或表位的例如至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少120种、至少140种、至少160种、至少180种、至少200种、至少250种、至少300种、至少350种、至少400种、至少450种、至少500种或更多种变体结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与一种冠状病毒抗原或表位的例如至多2种、至多3种、至多4种、至多5种、至多6种、至多7种、至多8种、至多9种、至多10种、至多15种、至多20种、至多25种、至多30种、至多40种、至多50种、至多60种、至多70种、至多80种、至多90种、至多100种、至多120种、至多140种、至多160种、至多180种、至多200种、至多250种、至多300种、至多350种、至多400种、至多450种、至多500种、或更少的变体结合。

在一些实施例中，本披露的多克隆抗体与一种冠状病毒抗原或表位的例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500种变体结合。

在一个特定实施例中，本披露的抗体是中和抗体、非中和抗体或其组合。

人源化抗体或其变体、片段和衍生物可以是可以配制用于施用给人的抗体。人源化抗体可以是嵌合人源化抗体或全人抗体。

人源化抗体可以是嵌合人源化抗体，例如，包含来自人抗体氨基酸序列或与人抗体氨基酸序列具有相似性的氨基酸序列和非人氨基酸序列。例如，嵌合人源化抗体的重链和/或轻链的一部分可以与人抗体中的相应序列相同或相似，而该一条或多条链的其余部分可以是非人的，例如与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或相似。可以将非人序列人源化以降低免疫原性的可能性，同时保留靶标特异性，例如，通过将人DNA并入在非人类动物中产生抗体的基因的基因序列中。

人源化抗体可以是全人抗体，例如，含有作为人抗体氨基酸序列的氨基酸序列。

在一些实施例中，具有人源化免疫系统的非人类动物仅产生全人抗体。

本披露的抗体可以是包含基本四链抗体单元的抗体。基本四链抗体单元可以包含两个重链(H)多肽序列和两个轻链(L)多肽序列。每条重链可以包含一个N端可变(V_H)区和三个或四个C端恒定区(C_H1、C_H2、C_H3和C_H4)区。每条轻链可以包含一个N端可变(V_L)区和一个C端恒定(C_L)区。轻链可变区与重链可变区对齐，且轻链恒定区与第一重链恒定区C_H1对齐。重链可变区和轻链可变区配对一起形成单个抗原结合位点。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接。根据重链同种型，两条重链通过一个或多个二硫键相互连接。每条重链和轻链还可以包含规律间隔的链内二硫桥。重链的C端恒定区包含抗体的Fc区，它可以例如通过与Fc受体或补体蛋白的相互作用介导效应子功能。

基于恒定区的氨基酸序列，轻链可以命名为κ或λ。基于恒定区的氨基酸序列，重链可以命名为α、δ、ε、γ或μ。抗体基于重链分为五种免疫球蛋白类别或同种型。IgA包含α重链，IgD包含δ重链，IgE包含ε重链，IgG包含γ重链，并且IgM包含μ重链。IgG、IgD和IgE类的抗体包含上述四链单元的单体(两条重链和两条轻链)，而IgM和IgA类可以包含四链单元的多聚体。基于重链恒定区序列和功能的差异，α和γ类进一步分为亚类。人类表达的IgA和IgG亚类包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

表4中提供了人恒定结构域序列的说明性氨基酸序列。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgG1恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:34或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgG2恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:35或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgG3恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:36或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgG4恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:37或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgE恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:38或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgA1恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:39或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgA2恒定结构域序列，例如，包含SEQ IDNO:40或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgM恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:41或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgD恒定结构域序列，例如，包含SEQID NO:42或其变体、衍生物或片段。

表4:人恒定结构域序列的说明性氨基酸序列。

本披露的抗体可以包含人轻链恒定结构域序列，例如κ(IgK)或λ(IgL)链。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgK恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:43或其变体、衍生物或片段。在一些实施例中，本披露的抗体、非人类动物或非人B细胞包含人IgL恒定结构域序列，例如，包含SEQ ID NO:44或其变体、衍生物或片段。

表5提供了示例轻链恒定结构域序列。

信号肽可导致细胞更高的蛋白质表达和/或分泌。在一些实施例中，本披露的抗体包含信号肽。信号肽酶可以从蛋白质上裂解信号肽，例如，在分泌过程中，生成不包含信号肽序列的成熟蛋白质。在一些实施例中，信号肽从本披露的化合物或抗体上裂解下来。在一些实施例中，本披露的成熟化合物或抗体不包含信号肽。

恒定区可以介导各种效应子功能，并且可以最低限度地参与抗原结合。不同的IgG同种型或亚类可以与不同的效应子功能或治疗特征相关，例如，这是因为与不同的Fc受体和/或补体蛋白的相互作用。包含接合活化Fc受体的Fc区的抗体可参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、通过基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)进行的信号传导的诱导和细胞因子分泌的诱导。例如，包含接合抑制性Fc受体的Fc区的抗体可以通过基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)诱导信号传导。

不同的抗体亚类包含不同的引发免疫效应子功能的能力。例如，IgG1和IgG3可以有效地募集补体以激活CDC，IgG2引发最小的ADCC。IgG4具有较低的触发免疫效应子功能的能力。对恒定区的修饰也可以影响抗体特征，例如，Fc受体连接的增强或减少、ADCC的增强或减少、ADCP的增强或减少、CDC的增强或减少、通过ITAM进行的信号传导的增强或减少、细胞因子诱导的增强或减少、通过ITIM进行的信号传导的增强或减少、半衰期的增强或减少、或抗原与Fc受体的共同接合的增强或减少。修饰可以包括例如氨基酸突变、改变翻译后修饰(例如糖基化)、组合来自不同同种型或亚类的结构域、或其组合。

本披露的抗体可以包含经选择或修饰以提供合适的抗体特征，例如用于治疗如本文所披露的疾病或病状的合适特征的恒定区或Fc区。在一些实施例中，IgG1可用于例如促进炎症、免疫活化和免疫效应子功能以治疗感染。在一些实施例中，例如，在需要具有降低的免疫效应子功能的抗体的拮抗特性(例如，为了中和冠状病毒抗原并抑制病毒进入细胞而不促进炎症和免疫激活)的情况下，可以使用IgG4。

表6中提供了抗体修饰及其作用的非限制性实例。

可变(V)区可以介导抗原结合并限定特定抗体对抗原的特异性。可变区包括称为框架区的相对不变的序列和高变区，高变区在不同结合特异性的抗体之间在序列上差异很大。每条抗体重链或轻链的可变区包含由三个高变区隔开的四个框架区。重链和轻链的可变区以使高变区紧密靠近在一起的方式折叠以产生抗原结合位点。四个框架区主要呈f3-折叠构型，而三个高变区形成环，这些环连接f3-折叠结构，而在一些情况下形成f3-折叠结构的一部分。

在高变区内的是主要决定抗体结合特异性的氨基酸残基。包含这些残基的序列称为互补决定区(CDR)。抗体的一个抗原结合位点可以包含六个CDR，三个位于轻链的高变区，三个位于重链的高变区。轻链中的CDR可以称为LCDR1、LCDR2、LCDR3，而重链中的CDR可以称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施例中，本披露的抗体包括其变体、衍生物和抗原结合片段。例如，可以对非人类动物进行遗传修饰以产生抗体变体、衍生物及其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体可以是单结构域抗体(sdAb)，例如，仅重链的抗体(HCAb)VHH，或纳米抗体。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab缀合物的二聚体和三聚体、Fv、scFv、微型抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体、以及线性抗体。Fab和Fab’是可以包含经由二硫键连接到轻链V_L和C_L结构域的重链V_H和C_H1结构域的抗原结合片段。F(ab’)₂可以包含两个通过二硫键连接的Fab或Fab’。Fv可以包含通过非共价相互作用保持在一起的V_H和V_L结构域。scFv(单链可变片段)是可以包含通过肽接头连接的V_H和V_L结构域的融合蛋白。对V_H和V_L结构域的方向以及接头长度的操纵可用于产生不同形式的分子，这些分子可以是单体、二聚体(双链抗体)、三聚体(三链抗体)或四聚体(四链抗体)。微型抗体是组装成二价二聚体的scFv-C_H3融合蛋白。

在一些实施例中，本披露的抗体是通过将如本文所披露的免疫原性组合物施用给非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)产生的抗冠状病毒抗体。在一些实施例中，本披露的多种抗体是通过用如本文所披露的免疫原性组合物为非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)免疫接种而产生的多种抗冠状病毒多克隆抗体。在一些实施例中，该抗冠状病毒抗体或该多种抗冠状病毒多克隆抗体进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，非人类动物(例如，要免疫接种的非人类动物受试者)是具有人源化免疫系统的非人类动物。

药物组合物

在一些实施例中，施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)的免疫原性组合物是药物组合物。本发明所考虑的药物组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。

本披露还提供了药物组合物，这些药物组合物包含本文披露的多种针对冠状病毒的多克隆抗体或多克隆抗体制剂以及药学上可接受的赋形剂。

药学上可接受的赋形剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药学制剂的配制和/或生产中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过援引并入本文)。

本披露的药物组合物可以包含本披露的多克隆抗体、本披露的环状多核糖核苷酸或其组合。本披露的药物组合物可以包含本披露的多克隆抗体、本披露的线性多核糖核苷酸或其组合。本披露的药物组合物可以包含本披露的多克隆抗体、本披露的环状多核糖核苷酸、本披露的线性多核糖核苷酸或其组合。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物适合施用给人类。在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸，或如本文所述的免疫原性组合物)适合施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)，其中该受试者是人。在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含多种多克隆抗体或如本文所述的多克隆抗体制剂)适合施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)，其中该受试者是人。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸，或如本文所述的免疫原性组合物)适合施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)，其中该受试者是非人类动物，例如适合兽用。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用给人类的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于任何动物，诸如人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，诸如鹦鹉、家禽、鸡、鸭、鹅、母鸡或公鸡和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含多种多克隆抗体或如本文所述的多克隆抗体制剂)适合施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)，其中该受试者是非人类动物，例如，适合于兽用。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用给人类的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于任何动物，诸如人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，诸如鹦鹉、家禽、鸡、鸭、鹅、母鸡或公鸡和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。

考虑施用药物组合物的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)包括任何有蹄类动物。

本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。

药物组合物在制造和储存条件下可以是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性组合物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯，诸如油酸乙酯。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情况下通过维持所要求的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如，药剂，诸如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或抗体)掺入例如以上枚举的成分中的一种或组合(根据需要)的适当溶剂中，接着进行灭菌微过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)产生活性成分加上来自于先前无菌过滤溶液中的任何其他所需成分的粉末。

本披露的药剂(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或抗体)可以制备成将会避免它们快速释放的组合物，诸如控释平日食品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法通常为本领域技术人员已知。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释药物递送系统],J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],New York[纽约],1978。本披露的组合物可以是例如立即释放形式或控释配制品。可以配制立即释放配制品以允许化合物(例如，药剂，诸如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或抗体)迅速起作用。立即释放配制品的非限制性实例包括易溶解的配制品。控释配制品可以是下述药物配制品，其经过调整使得活性剂的释放速率和释放曲线可以与生理和时间治疗要求相匹配，或者，已经配制为以程序化速率实现活性剂的释放。控释配制品的非限制性实例包括颗粒剂、延迟释放颗粒剂、水凝胶(例如，合成或天然来源的)、其他胶凝剂(例如，形成凝胶的膳食纤维)、基于基质的配制品(例如，包含有至少一种活性成分分散于其中的聚合物材料的配制品)、基质内的颗粒剂、聚合物混合物和颗粒团。

用于施用的药物配制品可以包括水溶性形式的活性化合物(例如，药剂，诸如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或抗体)的水溶液。活性化合物的悬浮液可以制备成油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加药剂溶解度以允许制备高浓缩的溶液的试剂。活性成分可以呈粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如灭菌无热原水)复原。

制备包含本文所述药剂的组合物的方法包括将药剂与一种或多种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载剂配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉末、可分散颗粒剂和扁囊剂。液体组合物包括例如药剂溶解在其中的溶液、包含药剂的乳液、或含有包含如本文所披露的药剂的脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。组合物可以是液体溶液或悬浮液、适合在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或作为乳液形式。这些组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其他药学上可接受的添加剂。

适合用于本披露的剂型的非限制性实例包括液体、粉末、凝胶、纳米混悬剂、纳米颗粒、微凝胶、水性或油性混悬剂、乳液及其任何组合。

在一些实施例中，本披露的配制品含有热稳定剂，诸如糖或糖醇，例如蔗糖、山梨糖醇、丙三醇、海藻糖或甘露糖醇，或其任何组合。在一些实施例中，稳定剂是糖。在一些实施例中，糖是蔗糖、甘露醇或海藻糖。

如本文所述的药物组合物可配制为例如包括药物赋形剂或载剂。药物载剂可以是膜、脂质双层和/或聚合物载剂，例如脂质体或颗粒(诸如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒)，并通过已知方法，诸如经由部分或完全包封环状多核糖核苷酸，递送至有此需要的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。

递送方法

如本文所述的环状多核糖核苷酸或如本文所述的其药物组合物可以在如本文所述的囊泡或其他基于膜的载剂中施用给细胞。如本文所述的线性多核糖核苷酸或如本文所述的其药物组合物可以在如本文所述的囊泡或其他基于膜的载剂中施用给细胞。

在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是有蹄动物细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，组织是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些实施例中，组织是器官(例如，肝、肺、脾、肾等)。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是哺乳动物。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者)是有蹄类动物。

在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，环状多核糖核苷酸或抗体)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品可以包含：(i)本文披露的化合物(例如，线性多核糖核苷酸或抗体)；(ii)缓冲剂；(iii)非离子型洗涤剂；(iv)张度剂；和(v)稳定剂。在一些实施例中，本文披露的药物配制品是稳定的液体药物配制品。

治疗方法

本披露提供可用作治疗或预防剂的组合物和方法，例如包含可用于避免受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)受冠状病毒感染影响的抗体的组合物和方法。例如，可以将本披露的环状多核糖核苷酸施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)以刺激与预期冠状病毒抗原/和或表位结合的抗体(例如，人多克隆抗体)的产生。可以将本披露的线性多核糖核苷酸施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者)以刺激与预期冠状病毒抗原/和或表位结合的抗体(例如，人多克隆抗体)的产生。可以从受试者获得抗体(例如，在要免疫接种的受试者免疫接种之后)并配制用于施用给受试者(例如，要治疗的受试者，例如要治疗的人类受试者)，例如作为治疗或预防剂。抗体可以提供针对例如表达抗原和/或表位的冠状病毒的保护。在另一个实例中，可以将环状多核糖核苷酸施用给人类受试者(例如，要免疫接种的受试者)以刺激人类受试者中与预期抗原/和或表位结合的抗体的产生。在另一个实例中，可以将线性多核糖核苷酸施用给人类受试者(例如，要免疫接种的受试者)以刺激人类受试者中与预期抗原/和或表位结合的抗体的产生。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物。

可以通过本披露的组合物和方法治疗的病状和疾病的非限制性实例包括由本文披露的冠状病毒引起的或与之相关的那些，例如冠状病毒感染。在一些实施例中，病状由SARS-CoV引起或与之相关。在一些实施例中，病状由SARS-CoV-2引起或与之相关。在一些实施例中，病状是2019冠状病毒疾病(COVID-19)。在一些实施例中，病状由MERS-CoV引起或与之相关。

在一些实施例中，通过用本披露的环状多核糖核苷酸为非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)免疫接种产生多克隆抗体，从非人类动物或人类受试者(例如，在要免疫接种的非人类动物或人类受试者免疫接种后)收集血浆，并且从血浆中纯化出多克隆抗体。在一些实施例中，通过用本披露的线性多核糖核苷酸为非人类动物或人类受试者(例如，要免疫接种的非人类动物或人类受试者)免疫接种产生多克隆抗体，从非人类动物或人类受试者(例如，在要免疫接种的非人类动物或人类受试者免疫接种后)收集血浆，并且从血浆中纯化出多克隆抗体。任选地，从一种以上的非人类动物或人类受试者纯化的多克隆抗体(例如，在要免疫接种的一种以上非人类动物或人类受试者免疫接种后)、从同一非人类动物或人类受试者纯化的多份多克隆抗体样品(例如，在要免疫接种的非人类动物或人类受试者免疫接种后)或其组合，合并在一起并施用给有此需要的受试者(例如，要治疗的受试者)，例如有此需要的人类受试者(例如，要治疗的人类受试者)。在一些实施例中，将多克隆抗体配制成多克隆抗体制剂，例如针对冠状病毒的多克隆抗体制剂。一种产生针对冠状病毒的人多克隆抗体制剂的方法，该方法包括(a)向能够产生抗体的动物(例如，要免疫接种的动物)施用包含含有编码冠状病毒抗原的序列的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸)的免疫原性组合物，(b)从哺乳动物中收集血液或血浆，(c)从血液或血浆中纯化针对冠状病毒的多克隆抗体，并且(d)将多克隆抗体配制为供人类使用(例如，施用给要治疗的人类受试者)的治疗或药物制剂或供非人类动物使用(例如，施用给要治疗的非人类动物受试者)的兽医制剂。

在一些实施例中，该方法进一步包括监测具有冠状病毒感染的受试者(例如，要治疗的受试者)、处于暴露于冠状病毒感染的风险中的受试者(例如，要治疗的受试者)或有此需要的受试者例如，要治疗的受试者)是否存在冠状病毒抗原的多克隆抗体。在一些实施例中，该监测是在施用这些多克隆抗体之前和/或施用这些多克隆抗体之后。

在实践本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文所述的化合物(例如药剂，诸如环状多核糖核苷酸或抗体)以药物组合物的形式施用给患有有待治疗的疾病或病状或需要预防的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)。在实践本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文所述的化合物(例如药剂，诸如线性多核糖核苷酸或抗体)以药物组合物的形式施用给患有有待治疗的疾病或病状或需要预防的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)是哺乳动物，诸如人。治疗有效量可根据疾病的严重程度、受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力、给定冠状病毒的特征以及其他因素而广泛变化。

施用方法和途径

本文披露的组合物(例如，药物组合物)可以通过各种形式和途径(包括例如口服或局部施用)以治疗有效量施用。在一些实施例中，组合物可以通过以下方式施用：肠胃外、静脉内、皮下、肌肉内、皮内、腹膜内、脑内、蛛网膜下、眼内、胸骨内、眼、内皮、局部、鼻内、肺内、直肠、动脉内、鞘内、吸入、病灶内、皮内、硬膜外、囊内、囊下、心内、经气管、皮下、蛛网膜下或椎管内施用(例如注射或输注)。在一些实施例中，组合物可以通过上皮或皮肤粘膜衬里吸收来施用(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜施用)。在一些实施例中，组合物经由多种施用途径递送。

在一些实施例中，组合物通过静脉输注施用。在一些实施例中，组合物通过长时间(诸如超过24小时)缓慢连续输注来施用。在一些实施例中，组合物作为静脉注射或短时间输注施用。

药物组合物可以以局部方式施用，例如，经由将药剂直接注射到器官中，任选地以贮库或持续释放配制品或植入物的形式施用。药物组合物可以以快速释放配制品的形式，以缓释配制品的形式或以中间释放配制品的形式提供。快速释放形式可以提供立即释放。缓释配制品可以提供控释或延迟缓释。在一些实施例中，泵可用于递送药物组合物。在一些实施例中，笔式递送装置可用于例如皮下递送本披露的组合物。

本文提供的药物组合物可以与其他疗法联合施用，例如抗病毒疗法、抗生素、细胞疗法、细胞因子疗法或抗炎剂。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸或抗体可单独使用或与一种或多种治疗剂组合作为混合物的组分使用。在一些实施例中，本文所述的线性多核糖核苷酸或抗体可单独使用或与一种或多种治疗剂组合作为混合物的组分使用。

剂量和频率

可以在疾病或病状发生之前、期间或之后施用本文所述的治疗剂，并且施用含有治疗剂的组合物的时间可以变化。在一些情况下，组合物可用作预防剂并且可连续施用给具有冠状病毒易感性或对冠状病毒相关的病状或疾病有倾向的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)。预防性施用可减小感染、疾病或病状发生的可能性，或者可降低感染、疾病或病状的严重程度。

组合物可以在症状发作之后(例如，之后尽快)施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)。可以在测试结果之后(例如，之后尽快)将组合物施用给受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)，该测试结果例如提供诊断的测试结果，显示受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)中存在冠状病毒的测试，或显示病状进展(例如血氧水平降低)的测试。可以在检测或怀疑的疾病或病状的发作之后(例如，之后切实可行地尽快)施用治疗剂。治疗剂可以在潜在暴露于冠状病毒之后(例如，之后切实可行地尽快)施用，例如在受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)与受感染的受试者接触之后，或得知他们接触过可能具有传染性的受感染的受试者之后。

本文所述的环状多核糖核苷酸、抗体或治疗剂以任何期望的间隔施用。本文所述的线性多核糖核苷酸、抗体或治疗剂以任何期望的间隔施用。

本披露的药剂(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸、抗体或治疗剂)的实际剂量水平可以变化以便获得一定量的药剂以对特定受试者、组合物和施用模式实现期望的治疗反应，而对受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)没有毒性。选择的剂量水平可取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性，施用途径，施用时间，排泄速率，治疗持续时间，其他药物，与所采用的特定组合物组合使用的化合物和/或材料，受治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。

可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗和/或预防反应)。例如，如治疗情境的紧急情况所示，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几个分剂量或按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和实现剂量均一性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算会产生所需治疗作用的预定量的活性剂以及所需的药物载剂。本披露的剂量单位形式的规格可由以下方面决定并且直接依赖于以下方面：(a)活性剂的独特特征和待实现的特定疗效，以及(b)本领域中配制此类活性剂用于治疗个体敏感性的固有局限性。剂量可以通过参考环状多核糖核苷酸或抗体的血浆浓度或局部浓度来确定。剂量可以通过参考线性多核糖核苷酸或抗体的血浆浓度或局部浓度来确定。

本文所述的药物组合物可以是适合单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，配制品可以分成含有适量的一种或多种环状多核糖核苷酸、抗体和/或治疗剂的单位剂量。在单位剂型中，配制品可以分成含有适量的一种或多种线性多核糖核苷酸、抗体和/或治疗剂的单位剂量。单位剂量可以是包含离散量的配制品的包装形式。非限制性实例是包装的注射剂、小瓶和安瓿。本文披露的水性悬浮液组合物可以包装在单剂量的不可重新封闭的容器中。可以将多剂量的可重新封闭的容器例如与防腐剂一起使用或不与防腐剂一起使用。本文披露的注射用配制品能以单位剂型存在，例如在安瓿中或在具有防腐剂的多剂量容器中。

剂量可以基于每千克受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)体重对应的药剂的量。药剂(例如，抗体)的剂量在10-3000mg/kg，例如100-2000mg/kg，例如300-500mg/kg/天的范围内，持续1-10天或1-5天；例如，400mg/kg/天，持续3-6天；例如，1g/kg/天，持续2-3天。

受试者

提供了一种组合物，用于治疗或预防本文披露的病状，诸如冠状病毒感染。该组合物可以施用给具有冠状病毒感染或相关疾病或病状的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)。该组合物可以作为预防剂施用给具有冠状病毒感染倾向或相关病装或疾病易感性的受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)以便减小感染、疾病或病状的可能性，或降低感染、疾病或病状的严重程度。

受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是感染了冠状病毒的受试者。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是冠状病毒测试呈阳性的受试者。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是已经暴露于冠状病毒的受试者。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是可能已经暴露于冠状病毒的受试者。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是表现出与冠状病毒感染一致的一种或多种体征和/或症状的受试者。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)是处于与本披露的冠状病毒接触的高风险中的受试者。例如，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可能是卫生保健工作者、实验室工作人员或更可能接触本披露的冠状病毒(例如，SARS-CoV2)的现场急救员。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以在医疗保健机构工作，例如，医院、诊疗室、住院机构、门诊机构、紧急护理机构、养老院、老年护理机构或疗养院。

在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)是如果感染了本披露的冠状病毒则处于并发症的高风险中的受试者。例如，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可患有共病，年龄超过50岁，患有1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗，或其组合。在一些实施例中，受试者是免疫受损的受试者。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)正在服用免疫抑制药物。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)是正在服用免疫抑制药物的移植受者。在一些实施例中，受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)正在接受可能降低免疫系统功能的癌症疗法，例如化学疗法。

受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是哺乳动物。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是人。受试者(例如，要免疫接种的受试者或要治疗的受试者)可以是非人类动物。非人类动物可以是农业动物，例如牛、猪、绵羊、马或山羊；宠物，例如猫或狗；或动物园动物，例如猫科动物。

实例

将以下实施例包括在内仅仅是为了说明的目的，并非旨限制本发明的范围。

实例1：环状RNA构建体

该实例描述了新型SARS-CoV-2开放阅读框(ORF)和circRNA构建体的设计。

在该实例中，SARS-CoV-2ORF和编码SARS-CoV-2ORF的环状RNA构建体的设计如表2所述。

实例2：编码SARS-CoV-2抗原的环状RNA的体外产生

该实例展示了环状RNA的体外产生。

将环状RNA设计成包括一个IRES、一个编码经修饰的SARS-CoV-2刺突抗原或RBD抗原的ORF(如实例1中所述)和两个位于IRES-ORF侧翼的间隔区元件。环化能够实现滚环翻译，具有交替交错元件以用于离散的ORF表达和受控的蛋白质化学计量的多个ORF，以及靶向RNA以用于核糖体进入的IRES。图1中示出了包含编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸的示例图。

在该实例中，环状RNA如下生成。使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用RNA5'磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。使用夹板DNA将RppH处理的线性RNA环化。替代性地或除了用5'RppH处理之外，使RNA在GMP超过GTP的条件下转录。

夹板连接如下进行：通过使用T4 DNA连接酶1(新英格兰生物学实验室公司，M0437M)处理转录的线性RNA和DNA夹板(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)(SEQID NO:47)来生成环状RNA。为了纯化环状RNA，在4％变性PAGE上解析连接混合物，并切除对应于环状RNA中的每一个的RNA。碾碎切除的RNA凝胶片段，并用凝胶洗脱缓冲剂(0.5M乙酸钠、0.1％ SDS、1mM EDTA)在37℃下洗脱RNA一小时。收获洗脱的缓冲剂，并通过向碾碎的凝胶中添加凝胶洗脱缓冲剂再次洗脱RNA，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片并用乙醇沉淀RNA。使用琼脂糖凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。另外或替代性地，通过柱色谱法纯化环状RNA。

实例3：mRNA构建体

该实例描述了编码SARS-CoV-2ORF的新型mRNA构建体的设计。

在本实例中，如表3所述设计编码SARS-CoV-2ORF的线性RNA构建体。

实例4：编码SARS-CoV-2抗原的mRNA的体外产生

该实例展示了mRNA的体外产生。

在该实例中，如实例3所述，设计的mRNA具有编码经修饰的SARS-CoV-2刺突抗原或RBD的ORF。

在该实例中，经修饰的mRNA是通过体外转录制备的。将RNA用伪尿苷和5-甲基-C完全取代，用CleanCap^TMAG加帽，包括5'和3'人α-珠蛋白UTR，并且聚腺苷酸化。mRNA经尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M醋酸钠、0.1％ SDS、1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，目录号AM7000)中。使用琼脂糖凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。

实例5：哺乳动物细胞中来自环状RNA的分泌型SARS-CoV-2抗原的表达

该实例证明了在哺乳动物细胞中从环状RNA表达病毒抗原的能力。

在该实例中，通过本文所述的方法设计、和生产和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA。

通过免疫沉淀联合蛋白质印迹法(IP-Western)测试编码RBD的环状RNA的表达。简言之，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)，将编码RBD的环状RNA(0.1皮摩尔)转染到BJ成纤维细胞和HeLa细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。使用单独的MessengerMax作为对照。在24小时时收集上清液，并使用对与蛋白G-戴诺磁珠(Protein G-Dynabeads)(英杰公司，10003D)偶联的SARS-CoV-2RBD-刺突糖蛋白(义翘神州生物技术有限公司(Sino Biologicals)，目录号：40592-T62)具有特异性的兔抗体进行免疫沉淀并使用相同抗体检测通过PAGE解析的免疫沉淀产物。使用重组RBD(42ng)免疫沉淀作为对照并定量细胞蛋白的表达。使用Image Studio^TMLite蛋白质印迹定量软件(Li-COR生物科学公司)对膜化学发光进行定量。

在BJ成纤维细胞和HeLa细胞上清液中检测到由环状RNA编码的RBD抗原，而在对照中则未检测到(图3)。

该实例表明，SAR-CoV-2RBD抗原(是分泌型蛋白)在哺乳动物细胞中由环状RNA表达。

实例6：哺乳动物细胞中来自RNA的非分泌型SARS-CoV-2抗原的表达

在该实例中，通过本文所述的方法设计、生产和纯化编码SARS-CoV-2刺突抗原的环状RNA或mRNA。将环状RNA和mRNA配制在MessengerMax中，并根据制造商的说明将0.1皮摩尔的环状RNA转染到HEK293细胞(每孔10 000个细胞)中。

在24、48和72小时使用SARS-CoV-2刺突抗原特异性ELISA测量刺突抗原表达。为了测量表达，在适当的时间点在每个孔中使用裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂裂解细胞。回收细胞裂解液，并以12,000rpm离心10分钟。收集上清液。在该实例中，根据制造商的说明使用SARS-CoV-2 2019刺突抗原检测夹心ELISA试剂盒(SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突检测ELISA试剂盒，义翘神州生物技术有限公司，KIT40591)。

实例7：用于向非人类动物施用的RNA的配制

在该实例中，通过本文所述的方法设计、和生产和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA或mRNA。

纯化后，如下配制环状RNA或mRNA：

A.将环状RNA或mRNA在PBS中稀释到50μL中为2.5皮摩尔或25皮摩尔的最终浓度，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂(未配制)。

B.根据制造商的说明(15％ TransIT、5％ Boost)，用脂质载剂(例如TransIT(米卢斯生物公司(Mirus Bio)))和mRNA加强试剂(米卢斯生物公司)配制环状RNA或mRNA，以获得50μL中2.5皮摩尔或25皮摩尔的最终RNA浓度，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。

C.将环状RNA或mRNA用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制。简言之，将环状RNA或mRNA在纯净水中稀释。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/μL)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半环状RNA或mRNA溶液中，直到RNA:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状RNA或mRNA(即，将剩余的环状RNA添加到环状RNA溶液中，将剩余的mRNA添加到mRNA溶液中)，并短暂搅拌该溶液。使用林格氏乳酸溶液调节混合物(即，环状RNA混合物或mRNA混合物)的最终浓度，以获得最终RNA浓度为每50μL中2.5皮摩尔或25皮摩尔的环状RNA制剂或线性RNA制剂。

D.用脂质纳米颗粒配制环状RNA或mRNA。简言之，将环状RNA或mRNA在pH＝4的25mM乙酸盐缓冲液中稀释(通过0.2μm过滤器过滤)到0.2μg/μL的浓度。首先通过将可电离脂质(例如ALC0315)、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000以50/38.5/10/1.5mol％的摩尔比溶解在乙醇中(通过0.2μm无菌过滤器过滤)来配制脂质纳米颗粒(LNP)。最终可电离的脂质/RNA重量比为8/1w/w。使用微流体系统将脂质和RNA溶液在微混合器芯片中混合，流量比为3/1缓冲液/乙醇且总流量为1ml/min。然后将LNP在pH＝7.4的PBS中透析3小时以去除乙醇。使用Ribogreen测定法测量LNP内部的RNA浓度和包封效率。如有必要，可使用截止值为100kDa的Amicon离心过滤器将LNP浓缩至所需的RNA浓度。使用Zetasizer Ultra(马尔文帕纳科(Malvern Pananaytical))测量颗粒的大小、浓度和电荷。用PBS将RNA浓度调节至0.1或0.2μg/μl的最终浓度。对于含有两种RNA序列的配制品，在LNP中配制之前或在单独配制每种RNA之后将RNA混合。对于体内实验，通过无菌的0.2μm再生纤维素过滤器过滤LNP中配制的最终RNA。

实例8：将RNA施用给非人类动物

在该实例中，小鼠经由后腿单次肌肉注射或背部单次皮内注射接受各50μL环状RNA制剂或线性RNA制剂的注射。

实例9：检测血液中的分泌型抗原

通过颧骨下抽吸从每只小鼠收集血样(～25μL)进行分析。在环状RNA给药后0小时、6小时、24小时、48小时和7天，将血液收集到EDTA试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟来分离血浆。使用ELISA或蛋白质印迹评估分泌型抗原的表达，例如对于RBD抗原而言，使用如实例5中所述的方法。

实例10：对针对抗原的抗体的检测

该实例描述了如何确定针对抗原的抗体的存在。

如Chen X等人所述使用ELISA(medRxiv,doi:doi.org/10.1101/2020.04.06.20055475(2020))。简言之，将每孔100uL PBS中的SARS-CoV-2蛋白于4℃包被在ELISA板上过夜。然后用封闭缓冲液(5％ FBS加上0.05％吐温20)将ELISA板封闭1小时。然后在1小时内将10倍稀释的血浆添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中。用含

洗涤剂的1X磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤后，将结合的抗体与抗小鼠IgG HRP检测抗体(英杰公司)一起孵育30分钟，接着用PBST洗涤，然后用PBS洗涤，并添加四甲基苯。使ELISA板反应5分钟，然后使用1M HCl终止缓冲液淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。

A.对于针对SARS-CoV-2RBD抗原的抗体，所用的SARS-CoV-2蛋白质是SARS-CoV-2RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B)。

B.对于针对SARS-CoV-2刺突抗原的抗体，所用的SARS-CoV-2蛋白质是SARS-CoV-2刺突蛋白(义翘神州生物技术有限公司，40591-V08H)。

实例11：SARS-CoV-2的中和抗体的评价

使用SARS-CoV-2病毒中和测定法测试针对SARS-CoV-2感染的抗体的中和能力。Okba NMA等人描述了此类测定法的实例(Emerg Infect Dis.[新发传染病],doi:10.3201/eid2607.200841(2020))。该测定法检测功能性抑制病毒感染的抗体的产生，这通过病毒斑块数目的减少得以证明。在Gauger PC和Vincent AL(在Animal Influenza Virus:Methodsand Protocols[动物流感病毒：方法和方案],第3版，E.Spackman编辑，第311-320页(2014))和Wilson HL等人(J.Clin.Microbiol.[临床微生物学杂志],55(10):3104-3112(2017))中描述了这种测定法的轻微变型。简言之，SARS-CoV-2病毒中和测定法确定小鼠响应于用编码SARS-CoV-2抗原的环状RNA进行免疫接种而产生含有抗SARS-CoV-2抗体的血浆的中和能力。来自仅注射媒介物(无环状RNA)的原初小鼠的血浆用作对照。

实例12：SARS-CoV-2RBD抗原在小鼠模型中的免疫原性

在小鼠模型中评价了用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制的编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA的免疫原性。在小鼠模型中还评价了用阳离子聚合物配制的针对SARS-CoV-2RBD抗原的抗体的产生。

在该实例中，将环状RNA设计成具有IRES和通过本文所述的方法编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF。以过量的5’单磷酸鸟苷，使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。按照制造商的说明，用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的RNA。使用夹板DNA将纯化的线性RNA环化。

通过分裂连接生成环状RNA，如下：将转录的线性RNA和DNA夹板(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)(SEQ ID NO:47)混合并退火，并用RNA连接酶处理。为了纯化环状RNA，通过反相色谱法解析连接混合物。通过增加流动相的有机物含量，从线性RNA中选择性洗脱环状RNA。分级收集洗脱的RNA，并测定其环状RNA的纯度。合并选择的级分并交换缓冲液以去除流动相盐和溶剂。使用丙烯酰胺凝胶电泳作为验证纯度和环化的质量控制测量。

将纯化的环状RNA在纯净水中稀释至1100ng/μL的浓度。将硫酸鱼精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液(4000ng/μL)中。在搅拌的同时，将鱼精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半环状RNA溶液中，直到RNA:鱼精蛋白的重量比为2:1。将该溶液再搅拌10分钟以确保形成稳定的复合物。然后添加剩余的环状RNA(即，将剩余的环状RNA添加到环状RNA:鱼精蛋白溶液中)，并短暂搅拌该溶液。使用林格氏乳酸溶液调节混合物(即，环状RNA混合物)的最终浓度，以获得环状RNA制剂，其最终RNA浓度为50μL中2μg或10μg RNA。

每组三只小鼠在第0天和第21天经肌内或皮内接种2μg或10μg剂量的环状RNA制剂或鱼精蛋白媒介物对照。在第0天和第21天施用环状RNA制剂后24小时，经肌内或皮内向每只小鼠施用Addavax^TM佐剂(英威杰公司(Invivogen))一次。按照制造商的说明，Addavax^TM佐剂按1X PBS中50％的浓度以50μL给药。

通过颧骨下抽吸从每只小鼠收集血液。在环状RNA给药后第7、14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天，将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过56℃加热1小时使血清热灭活。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定各个热灭活的血清样品中是否存在RBD特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司(Nunc))在4℃下用在100μL PBS中的SARS-CoV-2RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％ FBS和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含

洗涤剂的1X Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(Jackson115-035-071)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(Pierce 34021)。使ELISA板反应5分钟，然后使用2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。

将每个血清样品的光密度除以背景(包被有RBD，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。

结果显示，在注射环状RNA制剂后第14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天获得抗RBD抗体(图4)。注射鱼精蛋白媒介物后未获得抗RBD抗体。这些结果还显示，编码RBD抗原的环状RNA在小鼠中诱导抗原特异性免疫反应。

使用类似的ELISA测定血清样品中是否存在刺突特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp442404 96孔，能肯公司)在4℃下用在100μL PBS中的SARS-CoV-2刺突(义翘神州生物技术有限公司，40589-V08B1；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％ FBS和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含

洗涤剂的1X Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(Jackson 115-035-071)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(Pierce 34021)。使ELISA板反应5分钟，然后使用2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(OD)值。

结果显示，在注射环状RNA制剂后35天获得抗刺突抗体(图5)。注射媒介物后未获得抗刺突抗体。

在给药后第14天，使用测量相对IgG1与IgG2a同种型的测定法来表征血清抗体(图6)，并且使用PRNT中和测定法来表征血清抗体中和病毒的能力。结果显示，随佐剂一起肌内给药2μg RBD eRNA具有中和能力。实例13：使用定时佐剂递送调节小鼠体内由环状RNA产生高斯(Gaussia)荧光素酶

该实例证实在递送佐剂以刺激免疫反应的同时，体内由环状RNA表达蛋白质。

在该实例中，将环状RNA设计成具有IRES和编码高斯荧光素酶(GLuc)多肽的ORF。在该实例中，通过本文所述的方法产生并纯化环状RNA。如实例7中所述配制环状RNA，以获得环状RNA制剂(例如，TransIT配制的，鱼精蛋白配制的，PBS/未配制的)。如实例8中所述，经肌内向小鼠施用每种环状RNA制剂。

为了刺激免疫反应，在0小时或24小时将Addavax^TM佐剂(英威杰公司)(一种基于角鲨烯的水包油纳米乳剂，其配方类似于

佐剂)注射至小鼠后腿(与环状RNA制剂同时递送)。根据制造商的说明，Addavax^TM佐剂以50μL给药。

通过颧骨下抽吸从每只小鼠收集血样(～25μL)。在环状RNA给药后0、6、24和48小时，将血液收集到EDTA试管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟分离血浆，并使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(Thermo Scientific Pierce))测试了高斯荧光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1x GLuc底物添加到5μL血浆中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。

该实例证明使用以下方法可在长时间内在体内从环状RNA成功表达蛋白质：(a)肌内注射TransIT配制的、鱼精蛋白配制的和未配制的环状RNA制剂，不递送佐剂(图7)和在0和24小时递送佐剂(图8)；以及(b)皮内注射鱼精蛋白配制的环状RNA制剂，不递送佐剂和在24小时递送佐剂(图9)。

实例14：将编码SARS-CoV-2抗原的RNA施用给转染色体(Tc)牛

本实例描述了在具有人源化免疫系统的非人类哺乳动物中从编码冠状病毒抗原的环状RNA产生冠状病毒抗原的全人中和多克隆抗体。

在该实例中，通过本文所述的方法设计、生产和纯化编码SARS-CoV-2抗原的环状RNA或mRNA。

在该实例中，在一种方法中，如实例7中所述配制RNA(例如，用脂质载剂(例如，TransIT)配制，用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制或未配制)，以获得第一组环状RNA制剂或第一组线性RNA制剂。在第二种方法中，将Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂、完全弗氏佐剂、AS03或SAB专有佐剂配制品(SAB-adj-1)与RNA-脂质载剂混合物或未配制的RNA制剂(例如，环状RNA制剂或线性RNA制剂)一起配制，如Beigel JH等人所述(LancetInfect.Dis.[柳叶刀传染病],18:410-418(2018))，以获得第二组环状RNA制剂或第二组线性RNA制剂，其最终RNA浓度为100uL中有25皮摩尔。对于每种方法，生成的总体积为8mL，对应于2纳摩尔的环状RNA或线性RNA。在注射到动物体内前不久配制环状RNA或线性RNA以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。

在该实例中，Tc牛用环状RNA制剂(即，第一环状RNA制剂或第二环状RNA制剂)、线性RNA制剂(即，第一环状RNA制剂或第二环状RNA制剂)或仅媒介物的对照(即无RNA的对照)经由肌内或皮内注射进行免疫接种。

A.肌内注射：在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：每只耳后注射一次2mL(各自)；并在颈部两侧注射一次2mL(各自)。

B.皮内注射：在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：向颈肩边界的各个部位注射四次2mL。

总共使用以下8个时间点：0、3、6、9、12、15、18和21周。

在施用第一组RNA制剂(例如，环状RNA制剂或线性RNA制剂)时，将Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂、完全弗氏佐剂、AS03或SAB的SAB-adj-1分别邻近(1-2cm)前3个时间点的每个注射部位(总共2mL)施用。在第一次注射(V1)之前，从每头研究Tc牛收集一定体积的注射前血浆，用作阴性对照。在注射后第8、9、10、11、12和14天的每个时间点和最终注射后60天的其他时间点，经由颈静脉穿刺收集高达牛体重2.1％的血样。使用自动血浆置换系统(百特保健公司，Autopheresis C型号200)收集血浆。然后使用基于抗原的ELISA检验血浆中的抗原特异性抗体。如下面实例21)中所述，对于抗原特异性多克隆抗体，使用Cohn-Oncley纯化和辛酸盐分级分离法从血浆中纯化人多克隆抗体。

实例15：从施用给Tc牛的环状RNA表达的分泌型抗原的检测

为了检测SARS-CoV-2RBD抗原的表达，在注射后第1、3、5、7、14和21天经由颈静脉穿刺从高达牛体重2.1％的血样中收集来自环状RNA的分泌型蛋白。使用自动血浆置换系统(百特保健公司，Autopheresis C型号200)收集血浆。然后检验血浆中SARS-CoV-2RBD抗原的表达。如实例5中所述评估RBD抗原的表达。对于这些测定，使用抗人IgG HRP检测抗体(英杰公司)。

实例16：从施用给Tc牛的环状RNA表达的非分泌型抗原的检测

为了检测SARS-CoV-2刺突抗原(一种来自环状RNA的非分泌型蛋白)的表达，收获组织用于分析蛋白质表达。在给药后0、2、5、7和21天，将Tc牛处死并收获肝脏、脾脏和肌肉(来自注射部位)。如实例6中所述对从每个组织中提取的蛋白质评估刺突抗原的表达。在这些ELISA中，使用抗人IgG HRP检测抗体(英杰公司)代替抗小鼠IgG HRP检测抗体。

实例17：从施用给Tc牛的环状RNA产生对SARS-CoV-2抗原具有特异性的人多克隆抗体

为了确定针对SARS-CoV-2抗原的抗体的存在，在注射后第8、9、10、11、12、14、20、40和60天经由颈静脉穿刺收集高达牛科受试者体重2.1％的血样。使用自动血浆置换系统(百特保健公司，Autopheresis C型号200)收集血浆。然后检验血浆中的抗原特异性抗体。如实例10中所述确定针对SARS-CoV-2抗原的抗体的存在。在这些测定中，使用抗人IgG HRP检测抗体(英杰公司)。

实例18：从施用给Tc牛的环状RNA产生针对SARS-CoV-2的人中和多克隆抗体

在注射后第8、9、10、11、12和14天的每个时间点和最终注射后60天的其他时间点，经由颈静脉穿刺收集高达牛科受试者体重2.1％的血样。使用自动血浆置换系统(百特保健公司，Autopheresis C型号200)收集血浆。然后检验血浆中的抗原特异性抗体。如实例11中所述，进行SARS-CoV-2病毒中和测定以确定血浆中抗体的中和能力。

实例19：随着佐剂施用将编码SARS-CoV-2抗原的RNA施用给转染色体(Tc)牛

环状RNA和mRNA在有或没有佐剂的情况下配制，如下：

A.RNA(例如，环状RNA或mRNA)和佐剂独立施用。如实例7中所述配制RNA(例如，用脂质载剂(例如，TransIT)配制，用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制或未配制)，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。最终RNA浓度为100μL中有25皮摩尔。生成的总体积为8mL，对应于2纳摩尔的环状RNA或mRNA。环状RNA或mRNA在注射到动物体内前不久配制。对于总共8次注射，配制总共64mL的环状RNA或mRNA。在该实例中，Tc牛用环状RNA制剂、线性RNA制剂或仅媒介物的对照(即无RNA的对照)经由肌内注射或皮内注射进行免疫接种。

(i)肌内注射：在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：每只耳后注射一次2mL(各自)；并向每条后腿注射一次2mL(各自)。

(ii)皮内注射：在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：向颈肩边界的各个部位注射4次2mL。

总共使用以下8个时间点：0、3、6、9、12、15、18和21周。Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂、完全弗氏佐剂、AS03或SAB的专有佐剂配制品(SAB-adj-1)邻近(1-2cm)前3个时间点的每个疫苗接种部位施用(共2mL)。

B.RNA(例如，环状RNA或mRNA)和佐剂共同施用。如实例7中所述配制RNA(例如，用脂质载剂(例如，TransIT)配制，用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制或未配制)。然后将Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂、完全弗氏佐剂、AS03或SAB的专有佐剂配制品(SAB-adj-1)与RNA载剂配制品、RNA-聚合物配制品或未配制的RNA一起配制，如Beigel JH等人所述(Lancet Infect.Dis.[柳叶刀传染病],18:410-418(2018))，以获得环状制剂或线性RNA制剂，其最终RNA浓度为100uL中有25皮摩尔。生成的总体积为8mL，对应于2纳摩尔的RNA。环状RNA和mRNA在注射到动物体内前不久配制。对于总共8次注射，配制总共64mL的环状RNA和总共64mL的mRNA。

在该实例中，Tc牛用环状RNA制剂、线性RNA制剂或仅媒介物的对照(即无RNA的对照)经由肌内注射或皮内注射进行免疫接种。

A.肌内注射。在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：每只耳后注射一次2mL(各自)；并向每条后腿注射一次2mL(各自)。

B.皮内注射。在每个时间点在以下部位总共进行4次注射：向颈肩边界的各个部位注射4次2mL。

实例20：在Tc山羊中从环状RNA产生对SARS-CoV-2具有特异性的中和多克隆抗体

如实例7中所述配制环状RNA和mRNA(例如，用脂质载剂(例如，TransIT)配制，用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制或未配制)，以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。最终RNA浓度为100μL中有25皮摩尔。生成的总体积为1mL，对应于0.25纳摩尔的环状RNA或0.25纳摩尔的mRNA。在注射到动物体内前不久配制环状RNA和mRNA以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。对于总共4次注射，配制总共4mL的环状RNA和总共4mL的线性RNA。

在该实例中，使用转染色体山羊(Tc山羊)，其中将包含生殖系构型的整个人免疫球蛋白(Ig)基因库的人类人工染色体(HAC)引入家养山羊的基因组成中。Tc山羊在其血清中产生人多克隆抗体(参见Wu H等人(Sci Rep[科学报告],9(1):366,doi:doi.org/10.1038/s41598-018-36961-5(2019))。

在该实例中，Tc山羊用环状RNA制剂、线性RNA制剂或仅媒介物的对照(即无RNA的对照)经由肌内或皮内注射进行免疫接种。

A.肌内注射。在每个时间点在以下部位总共进行2次注射：向颈部两侧注射一次0.5mL(各自)。

B.皮内注射。在每个时间点在以下部位总共进行2次注射：向下颈肩部相对侧注射一次0.5mL(各自)。

总共使用以下4个时间点：0、3、6和9周。

Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂、完全弗氏佐剂、AS03或SAB的专有佐剂配制品(SAB-adj-1)邻近(1-2cm)前3个时间点的每个注射部位施用(共0.5mL)。

在注射后第8和14的每个时间点和最终注射后60天的其他时间点，经由颈静脉穿刺收集血样(40mL)。使用自动血浆置换系统(百特保健公司，Autopheresis C型号200)收集血浆。然后检验血浆中的抗原特异性抗体。

实例21：多克隆抗体分级分离纯化

该实例描述了从具有人源化免疫系统的非人哺乳动物血浆中纯化人多克隆抗体。

为了从收集的血浆中纯化人抗SARS-CoV-2多克隆抗体并随后在人类受试者中使用，需要对蛋白质抗原进行灭活和去除。在该实例中，使用Cohn-Oncley方法从血浆中纯化人多克隆抗SARS-CoV-2抗体，如(Ofosu等人FA(Thromb.Haemost.[血栓形成与止血],99(5):851-862(2008))；Buchacher A和Iberer G(Biotechnol.J.[生物技术杂志],1(2):148-163(2006))；Buchacher A和Curling JM(Biopharm.Process.[生物制药工艺],第42章,第857-876页,doi:https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100623-8.00043-8(2018))。收集通过Cohn-Oncley方法获得的级分(I+)II+III，并使用Lebing等人(Vox Sanguinis[血液之声],84(3):193-201(2003))描述的方法从该级分中纯化人多克隆抗SARS-CoV-2抗体。简言之，将级分II+III悬浮在12体积的pH 4.2的注射用水(WFI)中。添加辛酸钠(20mM)，并用氢氧化钠将pH调节至pH 5.1。在该步骤中，脂蛋白、白蛋白和部分辛酸盐沉淀。在助滤剂的存在下通过布过滤去除沉淀物。过滤后，将辛酸盐浓度重新调整至20mM，并将溶液在pH5.1和25℃下孵育1小时，以灭活包膜病毒。通过用助滤剂进行深度过滤，使溶液澄清。然后使滤液在pH 5.2下通过两个连续的阴离子交换色谱柱(Q Sepharose FF，然后是ANXSepharose FF)。通过超滤(BioMax 50KDa盒，密理博公司(Millipore))浓缩洗脱液，并使用相同的系统用WFI进行渗滤。将纯化的IgG溶液调节至pH 4.25、0.2M甘氨酸和100mg/mL蛋白质。将散装IVIG无菌过滤并用于填装10、50、100或200mL的小瓶。将最终产品在23-27℃下孵育21天以灭活病毒，然后在2-8℃下储存。

为了检验IVIG的富集，使用醋酸纤维素电泳。对于临床使用，95％的纯度是典型的并且预计是这种纯化程序的结果。

实例22：用于治疗人类受试者的全人多克隆抗体的配制

在该实例中，将纯化的抗体配制为中性pH(pH 7.2)，并稀释于含有氯化钠的离子溶液中。使用美国药典(USP)级输注溶液即0.9％的氯化钠。

临床配制可以基于一些溶液组合物，这些组合物包含：

1.海藻糖、柠檬酸钠、柠檬酸、聚山梨醇酯80。

2.琥珀酸钠、蔗糖、聚山梨醇酯20。

3.氯化钠、氨丁三醇、聚山梨醇酯80。

4.蔗糖、氯化钠、磷酸钠、葡聚糖40。

实例23：感染了SARS-CoV-2的人类受试者的治疗

该实例描述了向患有SARS-CoV-2的人类受试者施用全人抗SARS-CoV-2多克隆抗体。

在该实例中，患有COVID-19的成年人类受试者通过输注静脉施用单剂量(400mg/kg)的配制的多克隆抗体。以1.0mg/kg/min的速率开始输注，20分钟后增加到1.5-2.5mg/kg/min。也可以使用本领域已知的其他合适的输注速率。

通过评价COVID-19的标志物来评估多克隆抗体对COVID-19的影响，例如在人类受试者输注前和输注后的病毒载量、血清抗体滴度、体温变化、序贯器官衰竭评估(SOFA)评分(范围0-24，分数越高表明疾病越严重)、Pao2/Fio2、血常规生化指标、ARDS以及通气和体外膜肺氧合(ECMO)支持。

实例24：健康人类受试者针对SARS-CoV-2感染的被动免疫

该实例描述了用在具有人源化免疫系统的非人类哺乳动物中产生的针对SARS-CoV-2的全人多克隆抗体对人类受试者进行被动免疫而免受SARS-CoV-2感染。

在该实例中，健康人类受试者通过输注静脉施用单剂量(400mg/kg)的配制的多克隆抗体或安慰剂(生理盐水对照)。以1.0mg/kg/min的速率开始输注，20分钟后增加到1.5-2.5mg/kg/min。可以使用本领域已知的其他合适的输注速率。3天后，从治疗的受试者中抽取血液并如实例11中所述使用蚀斑减少中和测定法测试血浆中抗体的中和能力。

在该实例中，在施用配制的多克隆抗体后14天对人类受试者进行血清学测试。SARS-CoV-2的血清学测试是本领域已知的，包括例如Gonzalez JM等人medRxiv，(doi:doi.org/10.1101/2020.04.10.20061150(2020))。

实例25：健康人类受试者的预防性治疗

该实例描述了用在具有人源化免疫系统的非人类哺乳动物中产生的针对SARS-CoV-2的全人多克隆抗体对人类受试者进行针对SARS-CoV-2感染的预防性治疗。

对于该实例，如实例21中所述获得针对SARS-CoV-2的纯化人多克隆抗体。如实例22中所述配制纯化的多克隆抗体，随后如实例24中所述将其施用给健康人类受试者。

3天后，从施用了配制的多克隆抗体或安慰剂(生理盐水对照)的健康人类受试者中抽取血液，并如实例11中所述使用蚀斑减少中和测定法测试血浆中抗体的中和能力。

实例26：非人灵长类动物的预防性治疗

该实例描述了用在具有人源化免疫系统的非人类哺乳动物中产生的针对SARS-CoV-2的全人多克隆抗体对非人灵长类动物进行针对SARS-CoV-2感染的预防性治疗。

在该实例中，如实例21中所述获得针对SARS-CoV-2的纯化人多克隆抗体。如实例22中所述配制纯化的多克隆抗体，随后将其施用给成年恒河猴。简言之，将多克隆抗体配制品以10mg/kg的剂量静脉内施用给恒河猴。作为对照，使用来自仅注射了媒介物(无环状RNA)的转染色体牛的多克隆抗体。

然后以1×10⁶ 50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)用SARS-CoV-2对恒河猴进行气管内攻击，并且如Bao L等人(bioRxiv,doi:doi.org/10.1101/2020.03.13.990226(2020))所述，按时进行体重、体温、X射线、血清采样、鼻/喉拭子和所有初生组织测试。攻击后至多30天取样并评估病毒载量。

实例27：将编码SARS-CoV-2抗原的RNA施用给人类受试者

该实例描述了向人类受试者施用编码SARS-CoV-2抗原的环状RNA。

在该实例中，在一种方法中，如实例7中所述配制RNA(例如，用脂质载剂(例如，TransIT)配制，用阳离子聚合物(例如，鱼精蛋白)配制，用脂质纳米颗粒配制或未配制)，以获得第一组环状RNA制剂或第一组线性RNA制剂。在第二种方法中，Addavax^TM佐剂(英威杰公司)、

佐剂或完全弗氏佐剂与RNA-脂质载剂混合物或未配制的RNA制剂(例如，环状RNA制剂或线性RNA制剂)一起配制，如Beigel JH等人所述(Lancet Infect.Dis.[柳叶刀传染病],18:410-418(2018))，以获得第二组环状RNA制剂或第二组线性RNA制剂。在注射到人类受试者体内前不久配制环状RNA或线性RNA以获得环状RNA制剂或线性RNA制剂。

在该实例中，人类受试者用环状RNA制剂(即，第一环状RNA制剂或第二环状RNA制剂)、线性RNA制剂(即，第一环状RNA制剂或第二环状RNA制剂)经由肌内或皮内注射进行免疫接种。向人类受试者施用环状RNA制剂或线性RNA制剂至少一次、至少两次、至少3次或更多次以在人类受试者中引发免疫原性反应。

实例28：在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种抗原

该实例证明在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种抗原。图12中示出了这些构建体的示例性示意图。

实验1

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:56；氨基酸SEQ ID NO:55)。通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2刺突抗原的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:54；氨基酸SEQ ID NO:53)。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。

在24小时时使用SARS-CoV-2RBD抗原特异性ELISA测量RBD抗原的表达。在24小时时通过流式细胞术测量刺突抗原表达。

通过用该混合物转染，在HeLa细胞上清液中检测到SARS-Co-V-2RBD抗原，并且在HeLa细胞的细胞表面检测到SARS-CoV-2刺突抗原。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2RBD抗原，但未检测到SARS-CoV-2刺突抗原。通过用第二环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2刺突抗原，但未检测到SARS-CoV-2RBD抗原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2RBD和SARS-CoV-2刺突抗原两者。

实验2

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:56；氨基酸SEQ ID NO:55)。设计具有IRES和编码作为模型抗原的高斯荧光素酶(GLuc)多肽的ORF的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:58；氨基酸SEQ ID NO.57)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA单独与LipofectamineMessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)复合，然后混合在一起以获得混合物。将混合物(各0.1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(96孔板中每孔20,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。

在24小时时使用SARS-CoV-2RBD抗原特异性ELISA测量RBD抗原的表达。在24小时时使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测量GLuc活性。

通过用该混合物转染，在24小时时在HeLa细胞上清液中检测到SARS-CoV-2RBD抗原和GLuc活性。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2RBD抗原，但未检测到GLuc活性。通过用第二环状RNA转染，检测到GLuc活性，但未检测到SARS-CoV-2RBD抗原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2RBD和GLuc抗原两者。

实验3

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:56；氨基酸SEQ ID NO:55)。将第二环状RNA设计为包括IRES，接着是编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)抗原的ORF(核酸SEQ ID NO:60；氨基酸SEQ ID NO:59)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。

在24小时时使用SARS-CoV-2RBD抗原特异性ELISA测量RBD抗原的表达。在24小时时使用免疫印迹法测量HA抗原表达。简言之，对于免疫印迹法，在转染后24小时，裂解细胞并使用甲型H1N1流感HA(A/加利福尼亚/07/2009)单克隆抗体(MA5-29920(赛默飞世尔公司))作为一抗并使用山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)作为二抗(艾博抗公司(Abcam)，ab 97023)进行蛋白质印迹法以检测HA抗原。为了负载对照，将α微管蛋白与作为一抗的α微管蛋白(DM1A)小鼠抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)，CST#3873)和作为二抗的山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(艾博抗公司，ab 97023)一起使用。

通过用混合物转染，检测到SARS-CoV-2RBD和流感HA抗原两者。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2RBD，但未检测到流感HA抗原。通过用第二环状RNA转染，检测到流感HA抗原，但未检测到SARS-CoV-2RBD抗原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2RBD和流感HA抗原两者。

实验4

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2刺突抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:45；氨基酸SEQ ID NO:53)。将第二环状RNA设计为包括IRES，接着是编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的HA的ORF(核酸SEQ ID NO:60；氨基酸SEQ IDNO:59)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将混合物(各1皮摩尔的环状RNA)转染到HeLa细胞(24孔板中每孔100,000个细胞)中。作为对照，使用MessengerMax也将第一环状RNA和第二环状RNA单独转染到HeLa细胞中。

在24小时时通过流式细胞术测量刺突抗原表达。如上文实验3中所述，在24小时时通过免疫印迹法测量HA抗原表达。

通过用混合物转染，检测到SARS-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原两者。通过用第一环状RNA转染，检测到SARS-CoV-2刺突抗原，但未检测到流感HA抗原。通过用第二环状RNA转染，检测到流感HA抗原，但未检测到SARS-CoV-2刺突抗原。这证明在哺乳动物细胞中由环状RNA的组合混合物表达SAR-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原两者。

该实例显示，在哺乳动物细胞中从包含环状RNA的不同组合的环状RNA制剂表达了多种抗原。

实例29：从环状RNA表达多种抗原

该实例证明在哺乳动物细胞中由环状RNA表达多种抗原。图10和图11中示出了这些构建体的示例性示意图。

实验1

在该实例中，将环状RNA设计成包括IRES，其后是编码GLuc多肽的ORF、终止密码子、间隔区、IRES、编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF和终止密码子。通过本文所述的方法产生并纯化环状RNA。作为对照，如上所述产生以下环状RNA：(i)具有IRES和编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF的环状RNA；(ii)具有IRES和编码GLuc多肽的ORF的环状RNA。

使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)将环状RNA(0.1皮摩尔)转染到HeLa细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。

从编码SARS-CoV-2RBD抗原和GLuc多肽的环状RNA中检测到RBD抗原的表达(图13A)。从编码GLuc多肽的环状RNA中检测到GLuc活性(图13B)。这证明哺乳动物细胞中从编码SARS-CoV-2RBD和GLuc抗原的环状RNA表达SAR-CoV-2RBD和GLuc抗原。

实验2

在该实例中，将环状RNA设计为包括IRES，其后是编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF、终止密码子、间隔区、编码中东呼吸综合征(MERS)RBD抗原的ORF和终止密码子。通过本文所述的方法产生并纯化环状RNA。

使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015)以各种浓度将环状RNA转染到HeLa细胞(96孔板中每孔10,000个细胞)中。

在24小时时使用SARS-CoV-2RBD抗原特异性ELISA测量SARS-CoV-2RBD抗原的表达。在24小时时使用能够检测的MERS RBD抗原特异性抗体测量MERS RBD抗原表达。

实例30：小鼠模型中来自环状RNA的多种抗原的免疫原性

该实例描述了通过施用多个环状RNA分子在受试者中表达多种抗原。

实验1

在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA以及(b)编码作为模型抗原的GLuc多肽的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2RBD抗原的抗体的产生和GLuc活性。

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:56；氨基酸SEQ ID NO:55)。设计具有IRES和编码GLuc多肽的ORF的第二环状RNA(核酸SEQ ID NO:58；氨基酸SEQ ID NO.57)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例7中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例7中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。

三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg GLuc)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg GLuc)。另外的小鼠(每组3只或4只)也在第0天和第12天肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。

通过下颌下抽吸从每只小鼠收集血液。用第一环状RNA制剂初免后2天和17天将血液收集到干燥的无抗凝剂的试管中。通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定各血清样品中是否存在RBD特异性IgG。将ELISA板(MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司)在4℃下用在100μL的1X包被缓冲液(百进生技公司(Biolegend)，421701)中的SARS-CoV-2RBD(义翘神州生物技术有限公司，40592-V08B；100ng)包被过夜。然后用封闭缓冲液(含2％ BSA和0.05％吐温20的TBS)将板封闭1小时。然后将血清稀释液(1:500、1:1500、1:4500和1:13,500)添加到每个孔的100μL封闭缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含

洗涤剂的1X Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP检测抗体(艾博抗公司，ab97023)孵育1小时，接着用TBS-T洗涤三次，然后添加四甲基苯(百进生技公司，421101)。使ELISA板反应10-20分钟，然后使用0.2N硫酸淬灭。在450nm下测定光密度(O.D.)值。

使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试GLuc的活性。将50μL1x GLuc底物添加到10μL血清中，以进行GLuc荧光素酶活性测定。在发光检测仪(普洛麦格公司)中混合后立即读取平板。

结果显示在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD抗体(图14A)，并且在初免后2天(即，注射第一环状RNA制剂后2天)检测到GLuc活性(图14B)。

这些结果显示，包含两种编码不同抗原的环状RNA的环状RNA制剂在小鼠中诱导抗原特异性反应。

实验2

在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2RBD抗原的环状RNA以及(b)编码流感血凝素(HA)抗原的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2RBD和流感HA抗原的抗体的产生。

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2RBD抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:56；氨基酸SEQ ID NO:55)。将第二环状RNA设计为包括IRES，接着是编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的ORF(核酸SEQ ID NO:60；氨基酸SEQ ID NO:59)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例7中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例7中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。

三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg HA)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg RBD+10μg HA)。另外的小鼠(每组3只或4只)也在第0天和第12天肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。

如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过ELISA确定RBD特异性IgG的存在。

通过ELISA测定各血清样品中是否存在HA特异性IgG。将ELISA板在4℃下用HA重组蛋白(义翘神州生物技术有限公司，11085-V08B；100ng)包被过夜，并将板如实验1中所述进行处理。将每个血清样品的光密度除以背景(包被有HA，仅与二抗孵育的板)的光密度。绘制每个样品相对于背景的倍数。

结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD和抗HA抗体(图16A和图16B)。

结果还显示，包含两种编码不同抗原的环状RNA的环状RNA制剂在小鼠中诱导抗原特异性免疫反应。

实验3

在小鼠模型中评价配制于脂质纳米颗粒中的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA制剂包含(a)编码SARS-CoV-2刺突抗原的环状RNA以及(b)编码流感血凝素(HA)抗原的环状RNA。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2刺突和流感HA抗原的抗体的产生。

通过本文所述的方法设计、生产、和纯化编码SARS-CoV-2刺突抗原的第一环状RNA(核酸SEQ ID NO:54；氨基酸SEQ ID NO:53)。将第二环状RNA设计为包括IRES，接着是编码来自甲型H1N1流感A/加利福尼亚/07/2009的血凝素(HA)的ORF(核酸SEQ ID NO:60；氨基酸SEQ ID NO:59)，并通过本文所述的方法产生和纯化。将第一环状RNA和第二环状RNA混合在一起以获得混合物。然后如实例7中所述用脂质纳米颗粒配制该混合物，以获得第一环状RNA制剂。还如实例7中所述用脂质纳米颗粒单独配制第一环状RNA和第二环状RNA，然后混合在一起以获得第二环状RNA制剂。

三只小鼠在第0天肌内接种第一环状RNA制剂(总剂量为10μg刺突+10μg HA)并且在第12天接种第二环状RNA制剂(总剂量为10μg刺突+10μg HA)。另外的小鼠(每组3只或4只)也在第0天和第12天肌内接种：(i)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第一环状RNA；(ii)10μg剂量的用脂质纳米颗粒配制的第二环状RNA；或(iii)PBS。

如实验1中所述采集血液，通过在4℃下以1200g离心30分钟从全血中分离血清。如实验1中所述，通过ELISA测定各血清样品中是否存在RBD(即刺突的RBD)特异性IgG。

结果显示，在初免后17天(即，注射第一环状RNA制剂后17天)获得抗RBD抗体和抗HA抗体(图15A和图15B)。

实例31：包含多种抗原的环状RNA在小鼠模型中的免疫原性

该实例描述了包含多种抗原的环状RNA的免疫原性。该实例还描述了在小鼠模型中针对由单个环状RNA编码的多种抗原的抗体的产生。

实验1

在该实例中，将环状RNA设计成包括IRES，其后是编码GLuc多肽(作为模型抗原)的ORF、终止密码子、间隔区、IRES、编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF和终止密码子，如实例29中所述产生和纯化。作为对照，如上所述产生以下环状RNA：(i)具有IRES和编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF的环状RNA；(ii)具有IRES和编码GLuc多肽的ORF的环状RNA。

如实例7中所述用脂质纳米颗粒配制环状RNA，以获得环状RNA制剂。

每组三只小鼠在第0天和第12天肌内接种10μg或20μg总剂量的环状RNA制剂。

如实例30中所述采集血液。如实例30中所述，通过ELISA确定RBD特异性IgG的存在。如实例30中所述测量GLuc活性。

实验2

在小鼠模型中评价包含配制在脂质纳米颗粒中的环状RNA的环状RNA制剂的免疫原性，该环状RNA设计为包括IRES，其后是编码SARS-CoV-2RBD抗原的ORF、终止密码子、间隔区、IRES、编码MERS RBD抗原的ORF和终止密码子。还在小鼠模型中评价了针对SARS-CoV-2RBD和MERS RBD抗原的抗体的产生。

然后如实例7中所述用脂质纳米颗粒配制该环状RNA，以获得环状RNA制剂。

在第0天和初始施用后至少一天，以5μg、10μg、20μg或50μg的量用环状RNA制剂对小鼠进行肌内或皮内接种。

如实验1中所述采集血液。如实验1中所述，通过ELISA确定SARS-CoV-2RBD特异性IgG的存在。还通过ELISA确定MERS RBD特异性IgG的存在。

测定各血清样品中是否存在抗SARS-CoV-2RBD结合抗体、抗MERS RBD结合抗体、针对SARS-CoV-2RBD抗原的中和抗体、针对MERS RBD抗原的中和抗体、对SARS-CoV-2抗原的细胞反应以及对MERS RBD抗原的细胞反应。

实例32：对T细胞反应的评价

使用ELISpot测定法检测SARS-CoV-2刺突或RBD特异性T细胞或流感HA特异性T细胞的存在。对来自实例30的以下几组小鼠进行该项测定：

1.RBD

2.GLuc

3.HA

4.刺突

5.RBD+HA

6.刺突+HA

7.PBS

在加强后第30天(即，注射第一环状RNA制剂后30天)收获小鼠脾脏，并将其加工成单细胞悬液。将脾细胞以每孔0.5M细胞接种在IFN-g或IL-4ELISpot板(ImmunoSpot)上。脾细胞不受刺激或用SARS CoV-2和HA肽库(JPT、PM-WCPV-SRB和PM-IFNA_HACal)刺激。将ELISPOT板根据制造商的方案进行处理。

实例33：施用了编码多种抗原的环状RNA的小鼠中的抗体反应的评价

本实例证明由编码多种抗原表达的环状RNA的施用产生抗体反应。

使用血凝抑制测定法(HAI)测量来自小鼠的血清中妨碍血凝的抗流感HA抗体。向小鼠施用环状RNA的制剂，每种环状RNA通过本文所述的方法设计和产生，并且编码以下物质的表达：SARS-CoV-2RBD抗原、SARS-CoV-2刺突抗原、流感HA抗原、SARS-CoV-2RBD抗原和流感HA抗原、SARS-CoV-2RBD抗原和GLuc多肽、或SARS-CoV-2RBD抗原和SARS-CoV-2刺突抗原。血液采集如实例30实验1所述，并在注射后第2天和第17天进行。

制备在第2天和第17天从小鼠收集的样品的两倍连续稀释液。将固定量的具有已知血凝素(HA)滴度的流感病毒添加到96孔板的每个孔中，达到相当于4个血凝素单位的浓度，血清对照孔除外，其中不添加病毒。将板在室温下静置60分钟，之后添加红细胞样品并使其在4℃下孵育30分钟。妨碍血凝的最高血清稀释度经确定为血清的HAI滴度。第17天收集的样品显示，当单独施用或与SARS-CoV-2抗原例如RBD或刺突组合施用时，施用了编码流感HA抗原的环状RNA制剂的样品中出现HAI滴度(图17)。在未施用HA抗原(例如单独的SARS-CoV-2RBD抗原或单独的SARS-CoV-2刺突抗原)的样品中，在第17天未见HAI滴度。

虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，现在本领域技术人员将想到许多改变、变化和取代。应该理解的是，本文所述的本发明的实施例的各种替代方案可用于实践本发明。其意图是以下权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同项范围内的方法和结构。

序列表

<110> 旗舰创业创新第六有限责任公司（FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS VI,LLC）

<120> 冠状病毒抗原组合物及其用途

<130> 51509-020WO6

<150> US 63/125,778

<151> 2020-12-15

<150> US 63/074,442

<151> 2020-09-03

<150> US 63/068,936

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<150> US 63/034,704

<151> 2020-06-04

<150> US 63/027,932

<151> 2020-05-20

<160> 62

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

<400> 1

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

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<210> 13

<211> 3708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

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atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

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<210> 14

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gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 1020

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agccgaaaaa caaaaaacaa aaaaaacaaa aaaaaaacca aaaaaacaaa acacaacgtt 1680

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<210> 15

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

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cctggcagcg ccagcagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

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tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

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gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

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cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

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ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

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aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

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tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

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<210> 16

<211> 7038

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 60

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttatt agaaaaattc atccagcaga 120

cgataaaacg caatacgctg gctatccggt gccgcaatgc catacagcac cagaaaacga 180

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ccctcagggt ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac 2940

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attaaaatat aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct 3120

ctcagaaaca aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct atcaaacttc 3180

taactttaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg 3240

cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa 3300

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aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg 3540

gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt 3600

taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg 3660

tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg 3720

tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga 3780

acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa 3840

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caaaaagttt ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt gctgacacta ctgatgctgt 3960

ccgtgatcca cagacacttg agattcttga cattacacca tgttcttttg gtggtgtcag 4020

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tatgtcactt ggtgcagaaa attcagttgc ttactctaat aactctattg ccatacccac 4380

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ctatgagaac caaaaattga ttgccaacca atttaatagt gctattggca aaattcaaga 5040

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acaagcttta aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt 5160

tttaaatgat atcctttcac gtcttgaccc tcccgaggct gaagtgcaaa ttgataggtt 5220

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<210> 17

<211> 3711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

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tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

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<210> 18

<211> 7035

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

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atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttatt agaaaaattc atccagcaga 120

cgataaaacg caatacgctg gctatccggt gccgcaatgc catacagcac cagaaaacga 180

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gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 1020

cctaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 1080

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cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 2160

ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat 2220

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taatcttaca accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt 2340

ttattaccct gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg atttgttctt 2400

acctttcttt tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac 2460

taagaggttt gataaccctg tcctaccatt taatgatggt gtttattttg cttccactga 2520

gaagtctaac ataataagag gctggatctt tggtactact ttagattcga agacccagtc 2580

cctacttatt gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg 2640

taatgatcca tttttgggtg tttattacca caaaaacaac aaaagttgga tggaaagtga 2700

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tatggacctt gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt agggaatttg tgtttaagaa 2820

tattgatggt tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct attaatttag tgcgtgatct 2880

ccctcagggt ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac 2940

taggtttcaa actttacttg ctttacatag aagttatttg actcctggtg attcttcttc 3000

aggttggaca gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat cttcaaccta ggacttttct 3060

attaaaatat aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct 3120

ctcagaaaca aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct atcaaacttc 3180

taactttaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg 3240

cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa 3300

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ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta 3420

tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg 3480

aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg 3540

gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt 3600

taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg 3660

tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg 3720

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ccgtgatcca cagacacttg agattcttga cattacacca tgttcttttg gtggtgtcag 4020

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tatgtcactt ggtgcagaaa attcagttgc ttactctaat aactctattg ccatacccac 4380

aaattttact attagtgtta ccacagaaat tctaccagtg tctatgacca agacatcagt 4440

agattgtaca atgtacattt gtggtgattc aactgaatgc agcaatcttt tgttgcaata 4500

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cggccttact gttttgccac ctttgctcac agatgaaatg attgctcaat acacttctgc 4860

actgttagcg ggtacaatca cttctggttg gacctttggt gcaggtgctg cattacaaat 4920

accatttgct atgcaaatgg cttataggtt taatggtatt ggagttacac agaatgttct 4980

ctatgagaac caaaaattga ttgccaacca atttaatagt gccattggca aaattcaaga 5040

ctcactttct tccacagcaa gtgcacttgg aaaacttcaa gatgtggtca accaaaatgc 5100

acaagcttta aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt 5160

tttaaatgat atcctttcac gtcttgaccc tcccgaggct gaagtgcaaa ttgataggtt 5220

gatcacaggc agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact caacaattaa ttagagctgc 5280

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agtttatgat cctttgcaac ctgaattaga ctcattcaag gaggagttag ataaatattt 5700

taagaatcat acatcaccag atgttgattt aggtgacatc tctggcatta atgcttcagt 5760

tgtaaacatt caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc 5820

tctcatcgat ctccaagaac ttggaaagta tgagcagggg tatatccctg aagcccccag 5880

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gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 6660

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 6720

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<210> 19

<211> 3708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggatt tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

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tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

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ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

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caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

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cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

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aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

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<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

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<210> 21

<211> 3822

<212> DNA

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<220>

<223> 合成构建体

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gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

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agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactgggata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

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acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

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cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

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atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

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<211> 7038

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 60

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttatt agaaaaattc atccagcaga 120

cgataaaacg caatacgctg gctatccggt gccgcaatgc catacagcac cagaaaacga 180

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ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 960

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cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 1140

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agattgtaca atgtacattt gtggtgattc aactgaatgc agcaatcttt tgttgcaata 4500

tggcagtttt tgtacacaat taaaccgtgc tttaactggg atagctgttg aacaagacaa 4560

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ttttggtggt tttaattttt cacaaatatt accagatcca tcaaaaccaa gcaagaggtc 4680

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acctcatggt gtagtcttct tgcatgtgac ttatgtccct gcacaagaaa agaacttcac 5460

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agtttatgat cctttgcaac ctgaattaga ctcattcaag gaggagttag ataaatattt 5700

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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 6420

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<210> 23

<211> 3711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

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gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

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tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

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cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

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cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

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caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtta a 3711

<210> 24

<211> 4044

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

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ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 960

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cctaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 1080

cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 1140

agatagggtt gagtggccgc tacagggcgc tcccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 1200

tgggaagggc gtttcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg 1260

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agccgaaaaa caaaaaacaa aaaaaacaaa aaaaaaacca aaaaaacaaa acacaacgtt 1680

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atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 1800

attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 1860

gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 1920

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acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 2040

gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 2100

cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 2160

ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat 2220

gataatagcc accatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtag 2280

agtccaacca acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg 2340

tgaagttttt aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag 2400

caactgtgtt gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg 2460

ttatggagtg tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc 2520

atttgtaatt agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc 2580

tgattataat tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa 2640

caatcttgat tctaaggttg gtggtaatta taattacctg tatagattgt ttaggaagtc 2700

taatctcaaa ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc 2760

ttgtaatggt gttgaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc 2820

cactaatggt gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca 2880

tgcaccagca actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt 2940

caatttctaa aaaaaacaaa aaacaaaacg gctattatgc gttaccggcg agacgctacg 3000

gacttaaata attgagcctt aaagaagaaa ttctttaagt ggatgctctc aaactcaggg 3060

aaacctaaat ctagttatag acaaggcaat cctgagccaa gccgaagtag taattagtaa 3120

gaccagtgga caatcgacgg ataacagcat atctagctgg gcctcatggg ccttcctttc 3180

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaacatg gtcatagctg 3240

tttccttgcg tattgggcgc tctccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 3300

tcgggtaaag cctggggtgc ctaatgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 3360

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 3420

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 3480

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 3540

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 3600

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 3660

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 3720

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 3780

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 3840

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 3900

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 3960

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4020

tcacgttaag ggattttggt catg 4044

<210> 25

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtagagt ccaaccaaca 60

gaatctattg ttagatttcc taatattaca aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac 120

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<210> 26

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

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<210> 27

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

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<210> 28

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

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<210> 29

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

atgttcgttt tccttgtttt actgcccctc gtgtcttcac agtgtgtgaa cctcaccact 60

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tcacctgatg tggacctagg tgacatatct ggcataaatg ctagcgtggt taacattcag 3540

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caggagttgg gaaaatatga acagtacatc aaatggccat ggtacatctg gctgggcttc 3660

atagcaggcc tgatcgccat cgtcatggtg actattatgc tgtgctgcat gacatcctgt 3720

tgtagctgtt tgaaggggtg ttgctcctgc ggctcatgct gcaaattcga cgaggacgat 3780

tcagaacctg tgctgaaggg agtgaagctg cattacacat aa 3822

<210> 30

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

atgttcgttt tccttgtttt actgcccctc gtgtcttcac agtgtagggt tcagcctact 60

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cctaccaagc tcaatgacct gtgcttcact aatgtgtatg ccgactcttt tgtcattcgc 300

ggcgacgagg tccgacaaat cgcaccgggc caaaccggta aaattgccga ctacaactac 360

aagctgcctg acgacttcac cggctgcgta atcgcctgga acagcaataa cctggatagc 420

aaagtgggcg gaaactacaa ctacctgtac cggctcttta gaaagtccaa cctgaaacca 480

ttcgagcgcg atatctcgac cgaaatctac caggcgggca gcaccccctg taatggtgta 540

gaagggttca attgttactt tccactccag agttatgggt tccagccgac caatggcgtc 600

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gtgtgcgggc caaagaaaag cacaaatctt gtcaagaaca aatgcgttaa cttttaa 717

<210> 31

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60

ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120

cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

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<212> PRT

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cacggtacct ttgtgcgcct gttttatacc ccctccccca actgtaactt agaagtaaca 120

cacaccgatc aacagtcagc gtggcacacc agccacgttt tgatcaagca cttctgttac 180

cccggactga gtatcaatag actgctcacg cggttgaagg agaaagcgtt cgttatccgg 240

ccaactactt cgaaaaacct agtaacaccg tggaagttgc agagtgtttc gctcagcact 300

accccagtgt agatcaggtc gatgagtcac cgcattcccc acgggcgacc gtggcggtgg 360

ctgcgttggc ggcctgccca tggggaaacc catgggacgc tctaatacag acatggtgcg 420

aagagtctat tgagctagtt ggtagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaactgc 480

ggagcacaca ccctcaagcc agagggcagt gtgtcgtaac gggcaactct gcagcggaac 540

cgactacttt gggtgtccgt gtttcatttt attcctatac tggctgctta tggtgacaat 600

tgagagatcg ttaccatata gctattggat tggccatccg gtgactaata gagctattat 660

atatcccttt gttgggttta taccacttag cttgaaagag gttaaaacat tacaattcat 720

tgttaagttg aatacagcaa a 741

<210> 46

<211> 1229

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

cgcggatcct aatacgactc actataggga atagccgaaa aacaaaaaac aaaaaaaaca 60

aaaaaaaaac caaaaaaaca aaacacaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc 120

ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg 180

cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca 240

aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa 300

gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt 360

gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt 420

gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca 480

acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc 540

ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca 600

cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatag ccaccatggg agtcaaagtt 660

ctgtttgccc tgatctgcat cgctgtggcc gaggccaagc ccaccgagaa caacgaagac 720

ttcaacatcg tggccgtggc cagcaacttc gcgaccacgg atctcgatgc tgaccgcggg 780

aagttgcccg gcaagaagct gccgctggag gtgctcaaag agatggaagc caatgcccgg 840

aaagctggct gcaccagggg ctgtctgatc tgcctgtccc acatcaagtg cacgcccaag 900

atgaagaagt tcatcccagg acgctgccac acctacgaag gcgacaaaga gtccgcacag 960

ggcggcatag gcgaggcgat cgtcgacatt cctgagattc ctgggttcaa ggacttggag 1020

cccatggagc agttcatcgc acaggtcgat ctgtgtgtgg actgcacaac tggctgcctc 1080

aaagggcttg ccaacgtgca gtgttctgac ctgctcaaga agtggctgcc gcaacgctgt 1140

gcgacctttg ccagcaagat ccagggccag gtggacaaga tcaagggggc cggtggtgac 1200

taaaaaaaac aaaaaacaaa acggctatt 1229

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

gtttttcggc tattcccaat agccgttttg 30

<210> 48

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 48

atgtaccgga tgcagttgtt gtcctgtata gctctttccc ttgcattggt cactaattct 60

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 120

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tccgtgtatg cttggaacag gaagagaatc 180

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 240

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 300

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 360

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 420

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 480

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 540

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 600

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 660

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 720

gtcaatttct aa 732

<210> 49

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagagagtc 60

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 120

gtttttaacg ccaccagatt tgcatccgtg tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 180

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 240

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 300

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 360

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 420

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 480

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 540

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 600

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 660

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 720

ttctaa 726

<210> 50

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

atgtaccgga tgcagttgtt gtcctgtata gctctttccc ttgcattggt cactaattct 60

<210> 51

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 51

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caag 54

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Val或Ile

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 52

Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 53

<211> 1273

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

<400> 53

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 54

<211> 3819

<212> DNA

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

<400> 54

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggatt tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatctttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatccgtg tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactgggata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag ggacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgcc attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgaccctcc cgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacaca 3819

<210> 55

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 55

Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu

1 5 10 15

Ala Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

35 40 45

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

50 55 60

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

85 90 95

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

100 105 110

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

115 120 125

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

130 135 140

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

145 150 155 160

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

165 170 175

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

180 185 190

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

195 200 205

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

210 215 220

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

225 230 235 240

Phe

<210> 56

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 56

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcattgctg tggccgaggc caagagagtc 60

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 120

gtttttaacg ccaccagatt tgcatccgtg tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 180

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 240

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 300

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 360

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 420

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 480

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 540

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 600

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 660

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 720

ttc 723

<210> 57

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 57

Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu

1 5 10 15

Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala

20 25 30

Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro

35 40 45

Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile

65 70 75 80

Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr

85 90 95

Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile

100 105 110

Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu

115 120 125

Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys

130 135 140

Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp

145 150 155 160

Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val

165 170 175

Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp

180 185

<210> 58

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 58

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60

gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120

gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180

gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240

aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300

aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360

ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420

acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480

ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540

ggggccggtg gtgactaa 558

<210> 59

<211> 566

<212> PRT

<213> 甲型流感病毒

<400> 59

Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val

50 55 60

Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe

100 105 110

Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp

130 135 140

Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser

145 150 155 160

Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro

165 170 175

Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val

180 185 190

Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu

195 200 205

Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser

210 215 220

Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln

225 230 235 240

Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys

245 250 255

Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe

260 265 270

Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro

275 280 285

Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn

290 295 300

Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys

305 310 315 320

Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg

325 330 335

Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

340 345 350

Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr

355 360 365

His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser

370 375 380

Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile

385 390 395 400

Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His

405 410 415

Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe

420 425 430

Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn

435 440 445

Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu

450 455 460

Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly

465 470 475 480

Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val

485 490 495

Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu

500 505 510

Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr

515 520 525

Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val

530 535 540

Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu

545 550 555 560

Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 60

<211> 1698

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒

<400> 60

atgaaagcaa tactagtagt tcttctatat acatttgcaa ccgctaacgc tgatacattg 60

tgtataggat atcacgcgaa caactccacc gatacagtag atacagtact agagaagaac 120

gtaacagtaa cacattctgt taatcttcta gaagacaagc ataacggcaa actgtgcaaa 180

ctaagaggtg tagccccatt gcatctagga aagtgtaata tagctggctg gattttggga 240

aatccagagt gtgaatcatt aagtacagca agctcctggt cctatatagt ggaaacacct 300

agtagtgata acggaacgtg ttacccagga gattttatag attacgagga gctaagagag 360

cagctgtcgt cagtatcatc atttgaaagg tttgaaattt tcccgaaaac atcctcctgg 420

cccaatcacg atagtaacaa aggagtaaca gcagcctgtc ctcacgctgg agcaaaaagc 480

ttctataaaa atttaatctg gctagtgaag aagggaaatt catatccaaa gctaagtaaa 540

agttatataa acgataaggg caaggaagta ctcgtactgt ggggcattca tcatccatct 600

actagtgctg atcaacaaag tttatatcaa aacgcagacg catacgtttt tgtggggtca 660

agtagatata gcaagaaatt taaaccagaa atagcaataa gacctaaagt aagggatcaa 720

gaaggcagaa tgaactatta ttggacacta gtagaaccgg gagataaaat aacttttgaa 780

gcaacaggaa atctagtggt tcccaggtac gcatttgcaa tggaaagaaa cgctggatca 840

ggcatcatta tatctgatac accagtccac gattgtaata caacttgtca aacacctaaa 900

ggagctataa acaccagctt accatttcaa aatattcatc ctatcacaat tggaaagtgt 960

ccaaaatacg taaaaagtac aaaattgaga ttggccacag gattacgaaa tattccatca 1020

attcaatcta gaggactttt tggtgcaatt gcaggtttca tagaaggagg ctggactggg 1080

atggtagacg gctggtacgg ttatcatcat caaaacgaac agggaagtgg atacgcagct 1140

gatcttaaaa gtacacaaaa cgcaattgac gagattacta ataaagtaaa ttctgtaatt 1200

gaaaaaatga atactcagtt tacagcagta gggaaagagt ttaaccacct ggaaaaaaga 1260

atagaaaatt taaataaaaa agtagacgac ggatttcttg acatttggac ttataacgcc 1320

gaactattgg tattactaga aaacgaaaga actctagatt atcacgattc aaacgtaaaa 1380

aatttatacg aaaaagtaag aagccaactt aaaaataacg caaaagaaat aggaaacggc 1440

tgttttgaat tttatcacaa gtgtgataat acctgcatgg aaagtgttaa aaacgggaca 1500

tacgattatc caaaatactc agaagaagca aaattaaata gagaagaaat agacggcgta 1560

aaattagaat caacaaggat atatcaaata ttagcaatat attcaactgt cgcttcttca 1620

ttggtactgg tagtttctct aggtgcaata tcattttgga tgtgctctaa cggctcccta 1680

cagtgtagaa tttgtata 1698

<210> 61

<211> 96

<212> RNA

<213> 丁型肝炎病毒

<400> 61

ggcucaucuc gacaagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag 60

acugcuggac ucgccgccca aguucgagca ugagcc 96

<210> 62

<211> 74

<212> RNA

<213> 丁型肝炎病毒

<400> 62

ggcuagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag acugcuggac 60

ucgccgcccg agcc 74

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含含有编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸。

2.一种免疫原性组合物，其包含含有编码冠状病毒抗原的序列的环状多核糖核苷酸，其中所述冠状病毒抗原包含与选自SEQ ID NO:1-10、13、15、17、19、21、23、25-30、48和49中的任一个的冠状病毒抗原具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列，或所述环状多核糖核苷酸包含与选自SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22和24的环状多核糖核苷酸具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

3.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含所述冠状病毒抗原。

4.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原来自β冠状病毒或其片段，或来自沙贝科病毒或其片段。

5.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其片段、严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)或其片段、或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或其片段。

6.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原是膜蛋白或其变体或片段、病毒的包膜蛋白或其变体或片段、病毒的刺突蛋白或其变体或片段、病毒的核衣壳蛋白或其变体或其片段、病毒的辅助蛋白或其变体或片段。

7.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原是刺突蛋白或其变体或片段的受体结合结构域。

8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述刺突蛋白缺乏裂解位点。

9.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中冠状病毒的辅助蛋白选自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何变体或片段组成的组。

10.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含多个序列，每个序列均编码抗原，并且至少一个序列编码冠状病毒抗原。

11.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含两个或更多个ORF。

12.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含编码来自至少两种不同微生物的抗原的序列，并且至少一种微生物是冠状病毒。

13.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原包含表位。

14.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒抗原包含被B细胞识别的表位。

15.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第二抗原的序列的第二环状多核糖核苷酸。

16.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有第二ORF的第二环状多核糖核苷酸。

17.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含含有编码第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五环状多核糖核苷酸。

18.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原是不同的抗原。

19.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。

20.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载剂。

21.一种包含线性多核糖核苷酸的免疫原性组合物，所述线性多核糖核苷酸包含选自SEQ ID NO:13、15和12中的任一个的序列。

22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述线性多核糖核苷酸包含编码两种或更多种抗原的序列，并且至少一种抗原是所述冠状病毒抗原。

23.如权利要求21或权利要求22所述的免疫原性组合物，其中所述线性多核糖核苷酸包含编码至少2、3、4或5种抗原的序列，并且至少一种抗原是由SEQ ID NO:13、15和12的序列编码的冠状病毒抗原。

24.一种将免疫原性组合物递送至人类受试者的方法，所述方法包括：a)向所述人类受试者施用如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物。

25.一种在非人类动物或人类受试者中诱导针对冠状病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括：a)向所述非人类动物或人类受试者施用如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物。

26.一种将免疫原性组合物递送至人类受试者的方法，所述方法包括：a)向所述人类受试者施用如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，以及b)从所述非人类动物或人类受试者收集针对所述冠状病毒抗原的抗体。

27.一种在非人类动物或人类受试者中诱导针对冠状病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括：a)向所述非人类动物或人类受试者施用如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，以及b)从所述非人类动物或人类受试者收集针对所述冠状病毒抗原的抗体。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述非人类动物或人类受试者施用佐剂。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述佐剂与所述免疫原性组合物共同配制和共同施用，或者与所述免疫原性组合物分开配制和施用。

30.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用载剂配制所述免疫原性组合物。

31.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述非人类动物或人类受试者施用或免疫接种所述环状多核糖核苷酸至少两次。

32.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述非人类动物或人类受试者施用或免疫接种疫苗。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述疫苗是肺炎球菌多糖疫苗。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述疫苗用于细菌感染。

35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非人类动物或人类受试者通过注射免疫接种所述环状多核糖核苷酸。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多克隆抗体中的一种抗体与所述冠状病毒抗原特异性结合。

37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多克隆抗体中的一种抗体是人源化抗体或全人抗体。