CN116322684A - 包含阿迪普隆的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含阿迪普隆的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的药物组合物和/或糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的治疗方法。本发明的组合物通过在骨组织中激活脂联素受体1‑AMPK‑Nrf2信号系统及脂联素受体2/PPARα‑PGC‑1α信号系统来控制骨相关因子，改善脂肪毒性，并且可通过生长板促进效果和生长板中软骨细胞增殖效果有用地用作糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的治疗剂。

Description

包含阿迪普隆的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症及绝经 后骨质疏松症的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种包含阿迪普隆的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的药物组合物。

背景技术

韩国的糖尿病患病率为14.4％(2016年糖尿病学会，30岁以上人口)，25％左右的糖尿病患者正在进行适当的糖尿病控制(6.5％以下的糖化血红蛋白)。这种低糖尿病控制率表明，与非糖尿病组相比，骨质疏松症在1型糖尿病中的发生频率增加6.4倍，在2型糖尿病中的发生频率增加2.2倍，发生骨折的可能性在1型糖尿病中增加6.3倍，在2型糖尿病中增加1.7倍。骨质疏松症是一种由于骨量及骨质量的下降导致骨骼减少且在轻微的冲击下也容易发生骨折的疾病，糖尿病性骨质疏松症在1型糖尿病患者中是由于胰岛素缺乏及代谢异常而通过从脂肪中分泌激素等来形成骨的成骨细胞(osteoblast)功能下降导致骨密度下降所致，在2型糖尿病患者中是由于随着年龄增长胰岛素分泌功能下降且活动力下降而引起的，并且骨密度与一般人相似或增加，但主要原因是骨质下降。在糖尿病中引起骨质疏松症的主要原因是由胰岛素缺乏导致的骨细胞功能下降、参与骨生长的成骨细胞功能下降以及参与骨代谢的破骨细胞(osteoclast)功能异常。1型糖尿病以及2型糖尿病的骨质疏松症的详细机制包括高血糖、高血脂、脂肪细胞因子(adipokine)及内分泌变化以及伴随炎症的破骨细胞数量的增加、由此导致的骨吸收(bone resorption)的增加、由成骨细胞数量的减少及功能障碍导致的骨形成(bone formation)的减少、由骨内新生血管的减少、间充质细胞(mesenchymal cell)分化异常导致的骨形成的减少、以及由晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products)增加导致的骨质减少。糖尿病与骨质疏松症的关系成为争论的话题，因为在1型糖尿病中50％以上的骨浓度减少，而在2型糖尿病中可以看到骨浓度增加的现象。尤其，2型糖尿病的骨折风险增加的主要原因是骨组织质量的下降，因此提出了脂联素通过抑制破骨细胞并刺激成骨细胞来增加骨形成，从而对骨质疏松症带来骨保护效果的可能性。在其他研究中报道，脂联素通过刺激破骨细胞中的核因子kB配体受体致活剂(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)并抑制作为RANKL的诱饵(decoy)受体的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)来诱导破骨细胞的生成并抑制骨形成。

糖尿病性骨质疏松症的治疗方法包括糖尿病饮食、补钙、运动、药物治疗，在药物治疗中，对男性以及高龄女性使用双膦酸盐制剂或氟化物制剂或成长激素，当由脊柱压缩性骨折引起疼痛时使用降钙素制剂。最近的一项研究表明，使用过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-γ)配体作为口服糖尿病药剂会对骨代谢产生负面影响，尤其对高龄的女性增加骨折的风险。同时，据报道，作为肠促胰岛素的胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)及葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)制剂以及肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制剂降低骨折的相对风险。问题在于，已知肠促胰岛素治疗即使维持骨量，也还是增加骨质疏松性骨折的风险的因素。

绝经后骨质疏松症与绝经后骨密度下降有关，主要在50岁以后增加且主要导致脊柱以及腰骨骨折，是一种当随着发展为老年性骨质疏松症，导致大腿骨、肱骨近端、脚踝以及骨盆骨折等时，会对患者造成严重的障碍甚至可能死亡的非常重要的保健问题。韩国65岁以上老年人因绝经后骨质疏松症(包括老年性骨质疏松症)造成的包括间接费用在内的社会费用在最近5年高达1兆165亿韩元。调节生活习惯相关因素是重要的治疗方法，例如摄取钙及维生素D、运动、预防跌倒、戒烟、戒酒、营养管理等。药物治疗包括选择性雌激素受体调节剂(雷洛昔芬(Raloxifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)等)、双膦酸盐(阿仑膦酸(Alendronate)、利塞膦酸钠(Risedronate)等)、RANKL单克隆抗体(地诺单抗(Denosumab)等)、甲状旁腺激素(特立帕肽(Teriparatide)等)等，但由于药物导致轻微的消化障碍至严重的电解质代谢异常。现有治疗剂抑制骨损失，但无法恢复损失的骨质量，并且长期服用时会导致致命的并发症，因此努力在传统食品或中药材等天然物中寻找解决方法。

现有专利文献

韩国公开专利第2017-0066476号

发明内容

技术问题

本发明为了解决上述问题而提出，本发明的目的在于提供一种新型的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的药物组合物。

解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明提供一种包含阿迪普隆(adiporon)作为有效成分的用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的药物组合物。

并且，本发明提供一种包含阿迪普隆作为有效成分的用于预防或改善糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的保健功能食品。

并且，本发明提供一种糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的治疗方法，包括将治疗有效量的阿迪普隆给药到需要其的患者的步骤。

以下，对本发明进行说明。

本发明人确认，选择性作用于脂联素受体1/2的作为口服受体配体的阿迪普隆可以通过激活作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK并激活脂联素受体2-PPARα来减少骨中脂肪组织的积累、炎症反应以及氧化应激，从而改善骨中脂质毒性、炎症反应以及细胞凋亡，而与高血糖及异常脂质的改善无关，并且通过生长板促进效果和生长板中软骨细胞增殖效果来预防以及治疗糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症，从而完成本发明。

阿迪普隆是一种具有下述结构的选择性、口服用合成物质，作用于脂联素受体1及脂联素受体2，分别激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及PPARα信号系统以参与胰岛素抵抗、异常脂质以及糖代谢。

AMPK是一种与细胞的能量稳态相关的酶，是调节葡萄糖的吸收在内的各种细胞内系统的核心代谢调节因子。在代谢应激条件下被激活的AMPK阻断如蛋白质以及脂肪酸合成等消耗ATP以及NADPH的过程，并且激活如脂肪酸分解等产生ATP以及NADPH的过程，从而保持能量以及氧化还原反应稳态，最终调节细胞的存活以及凋亡。当AMPK活性对细胞应激的敏感性降低时，代谢调节功能受损、氧化应激增加、自噬作用减少。像这样，AMPK通过线粒体解偶联蛋白1(uncoupling protein-1，UCP-1)在代谢调节过程中发挥重要作用。

如图1所示，上述阿迪普隆可以通过增加脂联素受体1/2的表达来持续激活脂联素受体1/2-AMPK-PPARα信号通路，但不限于此。上述阿迪普隆可以通过激活作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK并激活脂联素受体2-PPARα来减少骨中的脂肪组织并减少炎症反应以及氧化应激，由此降低脂质毒性、炎症反应以及细胞凋亡指标，而与高血糖以及异常脂质的改善无关，但不限于此。

上述阿迪普隆可以通过增加长骨以及脊柱中针对骨体积(bone volume)、骨表面密度(bone surface density)、骨小梁体积(trabecular bone volume)、骨小梁厚度(trabecular thickness)、骨小梁数量(trabecular number)以及骨密度(bone mineraldensity)的指标并减少骨小梁分离度(trabecular separation)来改善针对骨质疏松症的指标，但不限于此。

上述阿迪普隆可以增加并改善长骨中针对生长板(growth plate)厚度的指标，但不限于此。

上述阿迪普隆可以增加以及改善长骨以及脊柱中的脂联素受体1/2、AMPK、PPARα以及PGC-1α的表达，但不限于此。具体地，上述阿迪普隆可以激活脂联素受体1-AMPK-Nrf2信号系统以及脂联素受体2/PPARα-PGC-1α信号系统，但不限于此。

上述阿迪普隆可以减少长骨以及脊柱中的脂肪细胞及RANKL，但不限于此。并且，上述阿迪普隆可以通过减少核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2relatedfactor 2，Nrf2)、超氧化物歧化酶1/2(superoxide dismutase 1/2，SOD1/2)、NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血红素加氧酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)以及NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)的氧化应激，减少核因子kB(nuclear factor-kB，NF-kB)以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)来减少炎症反应，可以减少由末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling，TUNEL)的减少导致的细胞凋亡，但不限于此。

并且，上述阿迪普隆可以增加糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症动物模型中的血清酸性磷酸酶5(acid phosphatase 5，ACP5)(ACP5：抗酒石酸酸性磷酸酶，tartrate-resistant acid phosphatase)以及骨钙素(osterocalcin)浓度，并减少尿液中脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)浓度，但不限于此。

本发明的药物组合物可以以将有效成分混入药学上可接受的载体中的形式制备。其中，药学上可接受的载体包括制药领域中常用的载体、赋形剂以及稀释剂。可用于本发明的药物组合物的药学上可接受的载体可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。

本发明的药物组合物可以按照常规方法分别制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶剂等口服型剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形式来使用。

在配制的情况下，可以使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可以在有效成分中混合至少一种以上如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等赋形剂来制备。并且，除了简单的赋形剂以外还可以使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂包括悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的水、液体石蜡等稀释剂以外可以包含如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等赋形剂。用于肠胃外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水溶性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂以及栓剂。可以使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油等植物油、如油酸乙酯等可注射的酯作为非水溶性溶剂及悬浮剂。可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等作为栓剂的基质。

本发明的药物组合物可以通过各种途径给药到个体。可以预想所有给药的方式，例如，可以通过口服、静脉、肌肉、皮下、腹腔内注射来给药。

本发明的药物组合物的给药量考虑个体的年龄、体重、性别、身体状况等来选择。显然，包含在上述药物组合物中的有效成分的浓度可以根据对象进行不同的选择，优选地，以0.01～5000μg/ml的浓度包含在药物组合物中。当其浓度低于0.01μg/ml时，可能不会出现药物活性，当大于5000μg/ml时，可能对人体产生毒性。

上述药物组合物可以制成各种口服或肠胃外给药形式。

用于口服给药的剂型包括例如，片剂、丸剂、硬质胶囊、软质胶囊、液体剂、悬浮剂、乳化剂、糖浆剂、颗粒剂等，这些剂型除了有效成分以外还可以包含稀释剂(例如：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(例如：二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。并且，上述片剂可以包含如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷等粘合剂，根据情况可以包含如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐等崩解剂或泡腾混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂以及甜味剂。上述剂型可以通过常规的混合、制粒或包衣方法来制备。

并且，用于肠胃外给药的典型剂型为注射用制剂，可以使用水、林格氏液、等渗生理盐水或悬浮液作为注射用制剂的溶剂。上述注射用制剂的无菌不挥发油可用作溶剂或悬浮介质，包含甘油单酯、甘油二酯的任何无刺激性挥发油也可用作此目的。并且，上述注射用制剂可以使用如油酸等脂肪酸。

并且，本发明提供一种包含阿迪普隆作为有效成分的用于预防或改善糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的保健功能食品。

本发明的食品组合物除了有效成分以外如同通常的食品组合物可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。

上述天然碳水化合物的例子包括：如葡萄糖、果糖等单糖；如麦芽糖、蔗糖等双糖；以及如糊精、环糊精等多糖的常规糖，以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。可以有利地使用天然调味剂(奇异果甜蛋白)、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等)以及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)作为上述调味剂。本发明的食品组合物可以通过与上述药物组合物相同的方式配制并用作功能性食品，或者可以添加在各种食品中。可以添加本发明的组合物的食品例如，包括饮料类、肉类、巧克力、食品类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、糖果类、冰淇淋类、酒精饮料类、维生素复合物以及保健辅助食品类等。

并且，上述食品组合物除了作为有效成分的提取物以外可以包含各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、如合成风味剂以及天然风味剂等风味剂、着色剂以及增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。另外，本发明的食品组合物可以包含用于制备天然果汁、果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。

本发明的功能性食品组合物可以制备并加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸等形式。在本发明中，“保健功能食品组合物”是指根据保健功能食品相关法律第6727号，使用对人体具有有益功能性的原料或成分制备并加工的食品，是指为了获得保健用途的有益效果，如调节人体的结构及功能所需的营养素或生理作用等而摄取。本发明的保健功能食品可以包含常规食品添加剂，除非另有规定，否则是否适合作为食品添加剂根据食品医药安全部批准的食品添加剂法典的通则以及常规试验法等，根据相关物品的规范以及标准来判断。上述“食品添加剂法典”中列出的物品可以包括例如，化学合成物，如酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸以及肉桂酸等；天然添加剂，如柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素以及瓜尔胶等；以及混合制剂类，如L-谷氨酸钠制剂、面类用碱添加剂、保存剂以及焦油色素制剂等。例如，片剂形式的保健功能食品可以通过将本发明的有效成分和赋形剂、粘合剂、崩解剂以及其他添加剂混合后的混合物以常规方法制粒，然后添加润滑剂等压缩成型，或者将上述混合物直接压缩成型。并且，上述片剂形式的保健功能食品还可以根据需求包含增味剂等。在胶囊形式的保健功能食品中，硬质胶囊剂可以通过将本发明的有效成分和赋形剂等添加剂混合后的混合物填充至常规硬质胶囊中来制备，软质胶囊剂可以通过将本发明的有效成分和赋形剂等添加剂混合后的混合物填充至如明胶等胶囊基质中来制备。上述软质胶囊剂可以根据需求包含如甘油或山梨糖醇等增塑剂、着色剂、保存剂等。丸形式的保健功能食品可以通过将本发明的有效成分和赋形剂、粘合剂、崩解剂等混合后的混合物用现有已知的方法成型来制备，可以根据需求用白糖或其他包衣剂来进行包衣，或者可以将如淀粉、滑石粉等物质涂在表面上。颗粒形式的保健功能食品可以通过将本发明的有效成分和赋形剂、粘合剂、崩解剂等混合后的混合物用现有已知的方法来制备成颗粒状，可以根据需求包含增香剂、增味剂等。

并且，本发明提供一种抗纤维化免疫治疗方法或用于预防或治疗系统性硬化症的方法，包括将包含上述阿迪普隆作为有效成分的药物组合物给药到需要治疗糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的个体的步骤。

本发明的治疗方法包括向个体给药治疗有效量的上述骨髓来源抑制细胞或包含其作为有效成分的药物组合物的步骤。优选地，对于特定个体的具体治疗有效量根据所要达到的反应的种类及程度、包括是否根据情况使用其他制剂在内的具体组合物、个体的年龄、体重、一般健康状况、性别以及饮食、给药时间、给药途径以及组合物的排泄率、治疗期间、包括与具体组合物一起使用或同时使用的药物在内的各种因素以及医药领域已知的类似因素不同地应用。因此，优选地，考虑到上述事项来确定适合于本发明目的的组合物的有效量。

上述个体可适用于任何哺乳动物，上述哺乳动物不仅包括人类以及灵长类，还包括牛、猪、羊、马、狗及猫等家畜，优选地，可以为人类，尤其可以为成人，但不限于此。

发明的效果

本发明的组合物通过在骨组织中激活脂联素受体1-AMPK-Nrf2信号系统及脂联素受体2/PPARα-PGC-1α信号系统来控制骨相关因子，改善脂肪毒性，并且可通过生长板促进效果和生长板中软骨细胞增殖效果有用地用作糖尿病性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症的治疗剂。

附图说明

图1示出阿迪普隆的作用机制。

图2示出本发明一实施例的动物实验行程。

图3示出本发明一实施例的动物实验行程。

图4至图14为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的长骨的组织变化及微型CT(micro-CT)的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图15至图20为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的长骨中的脂联素受体1/2的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图21至图23为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的长骨中的脂肪细胞以及RANKL的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图24至图31为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的长骨中的氧化应激以及抗氧化酶的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图32至图34为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的长骨中的炎症反应(TNF-α)以及细胞凋亡(TUNEL阳性)的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图35至图42为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5的组织变化以及微型CT的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图43至图49为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5中的脂联素受体1/2的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图50至图52为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5中的脂肪细胞以及RANKL的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图53至图61为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5中的氧化应激以及抗氧化酶的反应。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图62至图64为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5中的炎症反应(TNF-α)以及细胞凋亡(TUNEL阳性)的变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图65至图66为在非糖尿病正常对照组db/m小鼠及2型糖尿病组db/db小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在处理阿迪普隆的情况下的血清的抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5/TRAP)及骨钙素(osterocalcin)的浓度以及尿液中脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)变化。**P<0.01(在非糖尿病组及糖尿病组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图67至图79为在正常对照组及卵巢摘除小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在以2.5mg/kg体重(2.5AdiR)及25mg/kg体重(25AdiR)处理阿迪普隆的情况下的长骨的组织变化以及微型CT的变化。并且，调查卵巢摘除小鼠长骨的生长板厚度的变化(三色(trichrome)染色，x400)。并且，调查卵巢摘除小鼠长骨的生长板厚度以及生长板中软骨细胞变化(三色染色，番红O(Safranin O)染色，x400)。*P<0.05，**P<0.01(在对照组以及卵巢摘除组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图80至图87为在正常对照组及卵巢摘除小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在以2.5mg/kg体重(2.5AdiR)及25mg/kg体重(25AdiR)处理阿迪普隆的情况下的长骨中的脂联素受体1/2、AMPK、RANKL、PGC-1α、OPG的变化。*P<0.05，**P<0.01(在对照组以及卵巢摘除组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图88至图96为在正常对照组及卵巢摘除小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在以2.5mg/kg体重(2.5AdiR)及25mg/kg体重(25AdiR)处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5的组织变化以及微型CT的变化。*P<0.05，**P<0.01(在对照组以及卵巢摘除组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图97至图104为在正常对照组及卵巢摘除小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在以2.5mg/kg体重(2.5AdiR)及25mg/kg体重(25AdiR)处理阿迪普隆的情况下的腰椎L5中的脂联素受体1/2、AMPK、RANKL、PGC-1α、OPG的变化。*P<0.05，**P<0.01(在对照组以及卵巢摘除组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

图105至图107为在正常对照组及卵巢摘除小鼠实验动物中，调查未给药阿迪普隆组以及在以2.5mg/kg体重(2.5AdiR)及25mg/kg体重(25AdiR)处理阿迪普隆的情况下的血清的抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5/TRAP)及骨钙素的浓度以及尿液中脱氧吡啶啉(DPD)变化。*P<0.05，**P<0.01(在对照组以及卵巢摘除组中比较阿迪普隆治疗组与非治疗组)。

具体实施方式

以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例用于更具体地说明本发明，本发明的范围不限制于这些实施例。

实施例

实施例1.实验方法

评价口服用阿迪普隆的糖尿病性骨质疏松症的治疗以及预防效果

<1>动物实验1

如图2所示，进行动物实验。使用瘦素(leptin)受体缺陷型2型糖尿病动物模型(db/db小鼠)以及正常对照组(db/m小鼠)，如下分成4组进行实验：非糖尿病对照组(dmcont，n＝8)、非糖尿病阿迪普隆治疗组(dm+AdipoR，n＝8)、糖尿病对照组(db cont，n＝8)以及糖尿病阿迪普隆治疗组(db+AdipoR，n＝8)。

对照组喂食普通饲料，阿迪普隆治疗组从出生后16周龄开始喂食包含阿迪普隆(30mg/kg/天)的饲料4周。实验期间每周测量体重，从尾静脉采血并每2周使用Accu-Chek血糖仪(meter)(Roche Diagnostics，圣路易斯，密苏里州)测量空腹血糖，并且从尾静脉采血并每4周使用Pfizer 1200自动分析仪(automatic analyzer)(Bayer healthcare LLC，IN)测量糖化血红蛋白(HbA1c)。饲养室的温度以及湿度分别保持在20～25℃以及50～60％，每隔12小时开灯以及关灯。

动物实验2

如图3所示，进行动物实验。在对7周龄的C57BL/6小鼠进行卵巢摘除(ovariectomized)或假(Sham)手术后的7周之后，分成普通饲料组(阿迪普隆未给药组；对照组)给药组，从出生后14周龄开始分别摄取2.5mg/kg天或25mg/kg天的包含阿迪普隆的饲料6周。实验期间每周测量体重，给药6周后进行实验。

<2>血清以及24小时尿液中生化检测

将分别在两个实验的小鼠中采集的血液在室温下放置30分钟，然后通过在3000rpm的转速下离心15分钟来得到血清。通过ELISA方法测定血液中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP/ACP5)及骨钙素的浓度。并且，通过ELISA方法测定由氧化应激产生的DNA损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine)以及由游离脂肪酸导致脂质过氧化(lipidperoxidation)而产生的氧化应激标志物异前列腺素(isoprostane)以及反映破骨细胞功能的脱氧吡啶啉(DPD)在24小时尿液中的浓度。

<3>拍摄微型CT

通过微型CT(Skyscan 1172，比利时)进行拍摄，管电压为60kV，管电流为167uA，使用0.5mm的铝过滤器(filteration)，像素大小为5.9μm。对于拍摄角度，通过Nrecon重建(Reconstruction)(Skyscan，比利时)重建二维图像。使用CTAn(Skyscan，比利时)进行三维图像分析，通过旋转360°获得图像，曝光时间为440ms。用于本研究的指标的种类共7种。以0.25g/cm³及0.75g/cm³密度的体模(phantom)为标准测量骨密度(bone mineral density，BMD)。骨体积分数(BV/TV)(骨体积/总体积(Bone volume/Total volume)，骨体积百分比(percent bone volume)，％)是指通过二值化而浮出的感兴趣体积中存在的总体素(voxel)中用表示实体区域的体素的百分比来表示骨小梁在感兴趣体积中占的百分比，拦截面(Interception surfaces，i.s，mm²)是指新骨的生成。骨表面积骨体积比(骨表面/骨体积(Bone surface/Bone volume)，骨骼比表面积(bone specific surface)，BS/BV，mm^-1)是指用体素数的体素表面积与感兴趣体积中二值化的实体区域的体素数的比值来表示骨小梁表面积与骨小梁体积的比值。意味着值越低骨强度越高。骨小梁厚度(trabecularthickness，Tb.Th，mm)是指骨小梁的平均厚度，即对于感兴趣体积中表示实体区域的每个体素，放置一个包含相应体素的球(sphere)，使该球的大小成为仅包含实体区域的最大的大小，然后求得这些球的直径的平均值。同理，利用骨小梁分离度(trabecularseparation，Tb.Sp，mm)求得骨小梁之间的平均间距，利用骨小梁数量(trabecularnumber，Tb.N，mm^-1)求得骨小梁的平均数量。

<4>组织学检查

取出大腿骨及L5腰椎骨组织后，一部分固定在10％的福尔马林中后脱钙处理以进行免疫染色。然后，用0.5M的磷酸盐(Phosphate)缓冲溶液(pH7.4)中和后清洗(washing)，然后包埋在石蜡中。以5μm厚度薄切组织切片后进行苏木精(hematoxilin)-尹红(Eosin)染色法(H&E staining)、三色染色法、番红O染色法。并且，在骨组织中，使用抗脂联素受体1/2(adiponectin receptor 1/2)抗体、抗脂滴包被蛋白1(perilipin-1)抗体、抗RANKL抗体、抗TNF-α抗体以及ApopTag荧光素原位细胞凋亡检测试剂盒(ApopTag Fluorescein InSitu Apoptosis Detection Kit)(Chemicon International，特曼库拉，加利福尼亚州)进行双重免疫荧光染色法并通过共聚焦显微镜(confocal microscopy)观察其是否表达。

<5>蛋白质印迹分析

使用Pro-Prep蛋白提取液(Pro-Prep Protein Extraction Solution)(IntronBiotechnology，京畿道，韩国)提取蛋白质并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。将如此分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)(Amersham Co.，白金汉郡，英国)并用包含3％的脱脂牛奶(skim milk)的Tris缓冲盐水(Tris buffered saline)(TBS-T：在Tris缓冲盐水中的0.1％吐温-20，pH 7.5)封闭(blocking)1小时，然后将印迹(blot)放入脂联素受体1/2、总AMP活化蛋白激酶(AMPK)、phospho-Thr¹⁷²AMPK、PGC-1α、Nrf-2，SOD1/2、NQO1、HO-1、NOX4、NF-κB以及β肌动蛋白(β-actin)第一抗体溶液中反应后清洗，并与各自的第一抗体对抗的第二抗体反应后通过增强型化学发光试剂(ECL)(Pierce，Rockford IL)进行感光来确认条带。根据β肌动蛋白标准化每个蛋白质的表达水平。

<6>统计处理

所得值表示为平均及标准偏差，使用SPSS 19.0程序测定各组之间的差异(SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及Bonferroni事后多重比较(post hoc multiple comparison)分析来比较各组之间的平均值，在P值为0.05以下的情况下定义为具有显著性。

实施例2.实验结果

实验结果1

阿迪普隆的处理对糖尿病骨质疏松症模型db/m小鼠及db/db小鼠的体重、血液中 生化以及24小时尿液中的氧化应激变化的影响

与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的体重、血糖、糖化血红蛋白、血液中总胆固醇、中性脂肪以及游离脂肪酸显著增加(P<0.001或P<0.05)。并且，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的血液中脂联素浓度显著减少(P<0.001)。这种变化通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的由氧化应激产生的DNA损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷以及由游离脂肪酸导致脂质过氧化而产生的氧化应激标志物异前列腺素在24小时尿液中的浓度显著增加(P<0.001)。经确认，这种变化通过给药阿迪普隆来改善指标的增加(表1)。

表1

阿迪普隆的处理对db/m小鼠及db/db小鼠的长骨(大腿骨)组织变化的影响

通过在小鼠的长骨(大腿骨)组织中的H&E染色、番红0染色结果确认，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的组织中的纤维化(fibrosis)以及脂肪组织显著增加(P<0.01)，并且与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，减少的db/db小鼠的长骨生长板厚度增加(P<0.01)。这种组织中的纤维化及脂肪组织的增加以及长骨生长板的减少通过给药阿迪普隆得以恢复(图4至图14)。并且，通过长骨组织的微型CT结果确认，通过处理阿迪普隆增加并改善db/db小鼠的组织中的骨体积、骨表面(bone surface)、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨密度的指标(图4至图14)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的长骨(大腿骨)组织中的脂联素受体1/2以及 细胞内信号转导系统表达的影响

在小鼠的长骨(大腿骨)组织中的脂联素受体1/2的双重免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的组织中的表达显著减少(P<0.01)。这种减少通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，经确认，通过给药阿迪普隆增加在db/db小鼠中减少的作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK的激活以及脂联素受体2-PPARα及PGC1α的表达(图15至图20)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的长骨(大腿骨)组织中的脂肪细胞以及RANKL 变化的影响

在小鼠的长骨(大腿骨)组织中的作为脂肪细胞标志物的脂滴包被蛋白-1的免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠的组织中的脂肪细胞显著增加(P<0.001)。这种表达的增加通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，在db/db小鼠中RANKL表达的增加通过给药阿迪普隆得以恢复(图21至图23)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的长骨(大腿骨)组织中的氧化应激以及抗氧化 酶变化的影响

在本发明中确认，与db/m小鼠相比，患有糖尿病的db/db小鼠的长骨(大腿骨)中氧化应激标志物NOX4以及NFkB的表达显著增加，并且，抗氧化酶的Nrf2、NQO1、HO-1、SOD1、SOD2的表达减少(图24至图31)，阿迪普隆治疗使糖尿病引起的长骨中氧化应激标志物以及抗氧化酶的表达正常化。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的长骨(大腿骨)中的炎症反应以及细胞凋亡的 影响

在小鼠的长骨(大腿骨)组织中的炎症标志物TNF-α以及TUNEL的双重免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠组织中TNF-α的表达显著增加而导致炎症细胞的侵润增加且TUNEL染色-阳性的细胞凋亡增加(P<0.01)。已知炎症细胞的浸润引起长骨中氧化应激，从而导致组织的炎症反应的恶循环以及细胞凋亡。这种炎症反应以及细胞凋亡的增加通过给药阿迪普隆得以恢复(图32至图34)。

阿迪普隆的处理对db/m小鼠及db/db小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织变化的影响

在小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中的H&E染色以及三色染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠组织中的纤维化(fibrosis)以及脂肪组织增加。这种增加通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，通过长骨组织的微型CT结果确认，通过给药阿迪普隆增加并改善db/db小鼠组织中的骨小梁厚度(图35至图42)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中的脂联素受体1/2以及 细胞内信号转导系统表达的影响

在小鼠的长骨(腰椎5)组织中的脂联素受体1/2的双重免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠组织中的表达显著减少(P<0.01)。这种减少通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，经确认，通过给药阿迪普隆增加在db/db小鼠中减少的作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK的激活以及脂联素受体2-PPARα及PGC1α的表达(图43至图49)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的脊柱骨(腰椎5)中的脂肪细胞以及RANKL变化 的影响

在小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中的作为脂肪细胞标志物的脂滴包被蛋白-1的免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠组织中的脂肪细胞显著增加(P<0.01)。这种表达的增加通过给药阿迪普隆得以恢复。并且，在db/db小鼠中RANKL表达的增加通过给药阿迪普隆得以恢复(图50至图52)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的脊柱骨(腰椎5)中的氧化应激以及抗氧化酶 变化的影响

在本发明确认，与db/m小鼠相比，患有糖尿病的db/db小鼠的脊柱骨中氧化应激标志物NOX4以及NFkB的表达增加，并且，抗氧化酶Nrf2、NQO1、HO-1、SOD1、SOD2的表达减少(图12)，阿迪普隆治疗使糖尿病引起的脊柱骨中氧化应激标志物以及抗氧化酶的表达正常化(图53至图61)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的脊柱骨(腰椎5)中的炎症反应以及细胞凋亡 的影响

在小鼠的脊柱骨组织中的炎症标志物TNF-α及TUNEL的双重免疫荧光染色结果显示，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，db/db小鼠组中TNF-α的表达显著增加而导致炎症细胞的浸润增加且TUNEL染色-阳性的细胞凋亡也增加(P<0.001)。已知炎症细胞的浸润引起脊柱骨中氧化应激，从而导致组织的炎症反应的恶循环以及细胞凋亡。这种炎症反应以及细胞凋亡的增加通过给药阿迪普隆得以恢复(图62至图64)。

阿迪普隆对db/m小鼠及db/db小鼠的血清中ACP5/TRAP及骨钙素浓度以及尿液中 脱氧吡啶啉变化的影响

通过ELISA法确认血清ACP5/TRAP以及骨钙素浓度的结果确认，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，在db/db小鼠中的浓度显著减少(P<0.01)。这种减少通过给药阿迪普隆得以恢复(图65至图66)。并且，与db/m小鼠或db/m+阿迪普隆小鼠相比，在db/db小鼠中的尿液中脱氧吡啶啉浓度显著增加(P<0.001)。这种增加通过给药阿迪普隆得以恢复(P<0.001)。

实验结果2

阿迪普隆的处理对卵巢摘除小鼠的长骨(大腿骨)组织变化的影响

在小鼠的长骨组织中，通过长骨组织的微型CT结果确认，分别给药2.5mg/kg天或25mg/kg天的阿迪普隆的卵巢摘除小鼠组中均增加并改善未给药阿迪普隆的卵巢摘除小鼠的长骨中对于骨体积、骨表面、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨密度的指标(图67至图图79)。

阿迪普隆的处理对卵巢摘除小鼠的长骨(大腿骨)生长板变化的影响

在小鼠的长骨组织中，通过长骨组织的染色结果(三色、番红O)确认，分别给药2.5mg/kg天或25mg/kg天的阿迪普隆的卵巢摘除小鼠组中均增加在卵巢摘除小鼠组中减少的长骨生长板的厚度，从而具有改善长骨生长板的减少的保护效果(图67至图79)。

阿迪普隆的处理对卵巢摘除小鼠的长骨(大腿骨)组织中的脂联素受体1/2以及细 胞中信号转导系统表达的影响

在小鼠的长骨(大腿骨)组织中的脂联素受体1/2的蛋白质印迹结果显示，在卵巢摘除小鼠中，与所有2.5mg/kg天或25mg/kg天的阿迪普隆给药组相比，未给药阿迪普隆的卵巢摘除小鼠的长骨组织中的表达显著减少(P<0.01)。这种减少在阿迪普隆给药组均得以恢复。并且，经确认，通过给药阿迪普隆增加在db/db小鼠中减少的作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK的激活以及脂联素受体2-PPARα及PGC1α的表达(图80至图87)。

阿迪普隆的处理对卵巢摘除小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织变化的影响

在小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中，通过脊柱骨组织的微型CT结果确认，分别给药2.5mg/kg天或25mg/kg天的阿迪普隆的卵巢摘除小鼠组中均增加并改善未给药AdipoRon的卵巢摘除小鼠的脊柱骨中对于骨体积、骨表面、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨密度的指标(图88至图96)。

阿迪普隆的处理对卵巢摘除小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中的脂联素受体1/2以及 细胞中信号转导系统表达的影响

在小鼠的脊柱骨(腰椎5)组织中的脂联素受体1/2的蛋白质印迹结果显示，在卵巢摘除小鼠中的所有2.5mg/kg天以及25mg/kg天的阿迪普隆给药组中，未给药阿迪普隆的卵巢摘除小鼠的脊柱骨组织中的表达显著减少(P<0.01)。这种减少在阿迪普隆给药组均得以恢复。并且，经确认，通过给药阿迪普隆增加在db/db小鼠中减少的作为细胞代谢调节因子的脂联素受体1-AMPK的激活以及脂联素受体2-PPARα及PGC1α的表达(图97至图104)。

阿迪普隆对卵巢摘除小鼠的血清中ACP5/TRAP以及骨钙素浓度变化的影响

通过ELISA法确认血清中ACP5/TRAP以及骨钙素浓度的结果确认，在卵巢摘除小鼠中，与未给药阿迪普隆的卵巢摘除小鼠相比，2.5mg/kg天以及25mg/kg天的阿迪普隆给药组的血清中骨钙素浓度显著减少(P<0.01)。这种减少通过给药阿迪普隆得以恢复(图105至图107)。然而，血清中ACP5/TRAP浓度没有发生这种变化。并且，与假手术对照组相比，卵巢摘除小鼠的尿液中脱氧吡啶啉浓度显著增加(P<0.05)，与未给药阿迪普隆的卵巢摘除小鼠相比，这种增加在2.5mg/kg天以及25mg/kg天的阿迪普隆给药组均显著减少(P<0.05)。

以上，本发明着眼于优选实施例进行了说明。本发明所属技术领域的普通技术人员可理解，本发明可以在不脱离其本质特征的范围内进行变更。因此，应当从说明性而非限制性的观点来考虑所公开的实施例。因此，本发明的范围由包含上述说明的发明要求保护范围表示，并应解释为等同范围内的所有区别包含在本发明中。

Claims (3)

1.一种用于预防或治疗糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，包含阿迪普隆作为有效成分。

2.一种用于预防或改善糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的保健功能食品，其特征在于，包含阿迪普隆作为有效成分。

3.一种糖尿病性骨质疏松症或绝经后骨质疏松症的治疗方法，其特征在于，包括将治疗有效量的阿迪普隆给药到需要其的患者的步骤。

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