CN116286801A

CN116286801A - 一种探针组、检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组及其试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN116286801A
Application number: CN202111474483.5A
Authority: CN
Inventors: 刘小龙; 许海坡; 赵必星; 蔡志雄; 曾永毅; 孙宇鹏; 张晓龙
Original assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Current assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本发明公开了一种探针组、检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组及其试剂盒及检测方法。本发明基于反转录环介导等温扩增(RT‑LAMP)技术，结合核酸内切酶和媒介‑通用探针(报告探针)信号报告模式，实现90分钟内在不依赖于靶标序列设计的荧光探针体系里达到新型冠状病毒双重靶基因特异分析。体系双基因灵敏度均达到100拷贝数/反应，体系特异性良好，无交叉信号。该方法有助于准确快速筛查新型冠状病毒感染患者，对新冠肺炎诊治和疫情防控具有重要意义。

Description

一种探针组、检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组及其试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，主要涉及一种探针组、检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组及其试剂盒及检测方法。

技术背景

新冠肺炎(COVID-19)肆虐全球，严重威胁公共卫生安全与公众健康，给世界各国造成严重的经济社会负担。

目前新型冠状病毒感染的确诊主要通过实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)进行病毒核酸载量检测或通过二代测序进行病毒核酸序列分析。然而RT-qPCR病毒核酸检测需要使待测DNA模板、特异性引物、荧光染料、PCR扩增缓冲液在PCR扩增反应条件下扩增循环一定的次数，使荧光信号达到设定阈值；二代测序需要在生成新DNA互补链时，加入dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号，通过捕获光信号转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息，因此RT-qPCR与二代测序存在检测时间和周期长、环境要求高、技术力量要求高、硬件设备要求高、价格昂贵等一系列问题，只能在省/市级疾控中心、较大规模的三甲医院等指定的新冠核酸检测点开展。密切接触人员或疑似病例的标本，需前/送往各大检测点进行相关检测，不仅耗时耗力，增加疫情防控难度，而且也可能造成二次感染，加剧传播。此外，部分潜伏早期的感染人群，不仅无症状，而且容易出现核酸检测假阴性的结果，容易造成传染源的忽视，不利于疫情的防控。若能够在海关、机场、火车\地铁站、监狱等公共或特殊场所，就能便捷、快速、准确、低成本的对SARS-CoV-2病毒核酸进行初筛和反复监测，则能有效的筛选与鉴定被感染人群(尤其是潜伏期的无症状感染人群)、分离出隐形的传染源，进而高效的隔离被感染人群、阻断传播途径，将病毒感染的防控端口前移，这将极大的推进SARS-CoV-2病毒感染的有效和及时防控。

近年来，等温扩增技术在病原体核酸检测中得到广泛应用。其中，反转录/环介导等温扩增RT-/LAMP因其使用环境要求低、不需要昂贵热循环仪、反应时间短、灵敏度和特异度高、成本低等特点应用最为突出。LAMP通过至少六个靶标引物区(四条引物)以恒定的温度(60～65℃)对靶标进行高效扩增，检测灵敏度可达到100拷贝数/反应，反应时间在 20～45min左右。同时，LAMP使用的Bst DNA聚合酶对反应抑制剂有较好的耐受性，可通过样本简单处理—如加热等，就可以进行扩增检测。目前，LAMP方法应用于新冠病毒的检测已有诸多报道，但多数属于单靶标检测模式。而新冠病毒属于单链RNA冠状病毒属，存在易变异(如B1.1.7、B1.351等)等特点，单靶标检测容易产生假阴性结果。

目前针对SARS-CoV-2病毒环介导等温扩增检测方法包括中国专利：CN202010150878.9、CN202011429713.1、CN202011167529.4、CN202010312576.7、CN202011045783.7、 CN202010150527.8介绍的LAMP引物组，已知的引物组仅是针对SARS-CoV-2病毒的靶基因的六个靶标引物区设计的四～六条引物，LAMP方法灵敏度高，反应时间短(30～60min就能完成反应)，临床使用不需要特殊的仪器(试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪)，操作简单(不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果)，除了浊度法检测外，还有在反应体系中加入钙黄绿素，LAMP反应后，Mn²⁺与反应产物焦磷酸根结合，释放钙黄绿素从而使淬灭态被解除，呈黄绿荧光，但是由于加入了Mn²⁺使检测灵敏度降低了一个数量级；也有人向反应液中加入核酸染料SYBR Green I，但由于SYBR Green I对LAMP反应有一定的抑制作用；在对其他目的基因的LAMP检测方法的改进方案中，还有Ball等人提出简单的 RT-LAMP终点检测技术，实现了西尼罗病毒和基孔肯雅病毒RNA的检测，该方法首先在环引物或者内引物上标记荧光染料，再用一条标记了淬灭基团的短链与之杂交，于是在整个反应体系未进行LAMP扩增时，体系中没有很强的荧光信号，在目标模板存在的情况下， LAMP扩增开始，标记荧光染料的引物与目标模板的特定部位结合，从而使淬灭基团的短链游离于溶液中，于是反应体系呈现强烈的荧光信号，但该方法需要在LAMP扩增后反应结束后再加入阳离子聚合物PEI，PEI与LAMP产物形成沉淀，除去所有含环引物或内引物的扩增产物，避免其与标记了淬灭基团的短链互补杂交，将淬灭基团的短链与有荧光染料的 LAMP产物分离，然后检测荧光强度。因此，目前基于LAMP检测SARS-CoV-2病毒的方法，由于实时浑浊仪昂贵不适于现场检测，而已尝试的荧光定量法因加入指示剂的原因导致灵敏度降低或反应变慢，特异性荧光探针不能实时检测的原因，使普及该方法受到限制。

因此，急需一种简便、灵敏特异、成本低廉、通用的、具备多重靶标快速检测的新冠病毒核酸检测方法。

发明内容

本发明要解决的问题是改进现有的基于LAMP检测SARS-CoV-2病毒的实时荧光定量检测方法，在不降低灵敏度和抑制LAMP反应的情况下，实时荧光定量检测LAMP反应产物。

本发明的构思是基于LAMP通过对SARS-CoV-2病毒的两个靶标基因的各至少六个靶标引物区(六条引物)以恒定的温度(60～65℃)对靶标进行高效扩增，经过扩增之后形成的产物是茎-环结构的DNA链，同时在环介导等温扩增中引入媒介子探针和荧光报告探针，通过激活媒介子并与特定报告探针作用产生信号。媒介子探针包括媒介子序列靶特异性序列，媒介子序列不与茎-环结构的DNA链的任何区域结合，当靶特异性序列与茎-环结构的DNA 链的特定区互补配对，靶特异性序列上的RNA碱基(为核酸内切酶切割位点(cleavagesite))，在核酸内切酶RNase HII的作用下，媒介子序列被酶切下来，在Bst DNA聚合酶作用下，持续产生的带有3’羟基自由活性的媒介子序列与特定报告探针结合，置换出相应荧光通道信号。而在无模板DNA或RNA存在情况下，无法实现靶标基因进行LAMP扩增，也就无法产生茎-环结构的DNA链和使茎-环结构的DNA链与靶特异性序列互补成双链，从而也就无法酶切媒介子序列，无法形成荧光通道信号(阳性信号)。

本发明的技术方案是：一种探针组，其包含一种报告探针，及至少一种媒介子探针，其中，所述媒介子探针从5’至3’方向包含媒介子序列、靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与新型冠状病毒的核酸靶标序列的部分对照序列互补的序列，所述核酸靶标序列的部分对照序列是：新型冠状病毒的核酸靶标序列在环介导等温扩增反应中与环状引物或内侧引物互补配对后沿伸扩增出的序列，所述媒介子序列包含不与所述核酸靶标序列或对照序列互补的序列，所述靶特异性序列中的一个碱基被修饰成RNA碱基其余为DNA碱基，所述RNA碱基位于所述靶特异性序列5’端第2或3个碱基处；

所述报告探针从3’至5’方向包含，与所述媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列，并且RNA碱基及RNA碱基端的靶特异性序列不与所述报告探针互补配对，所述报告探针5’端标记报告基团，而3’端标记淬灭基团，所述报告探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

有利地，环形引物或内引物与新型冠状病毒的核酸靶标序列互补配对后沿伸扩增出茎- 环结构的DNA链，靶特异性序列特异性的结合茎-环结构的DNA链形成双链；及靶特异性序列中的一个碱基被修饰成RNA碱基；及媒介子序列包含不与核酸靶标序列或对照序列互补的序列；及RNA碱基与靶特异性序列的5’相距2～3个碱基，并与媒介子序列的3’相距1个碱基；是媒介子序列能被RNase HII酶切下来的必要条件。媒介子序列与报告探针互补后，报告基团发出的信号正相关于茎-环结构的DNA链的拷贝数。

进一步地，所述新型冠状病毒的核酸靶标序列选自新型冠状病毒的保守基因序列。

进一步地，所述新型冠状病毒的核酸靶标序列选自SARS-CoV-2病毒的保守基因序列： N基因、E基因。

具体地，所述探针组为选自下列的探针组：

第一探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的环引物，其包含，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的环媒介子探针E-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的5’至3’方向第16个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基；

第二探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的内引物，其包含，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的内媒介子探针E-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的5’至3’方向第16个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基；

第三探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的环引物，其包含，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的环媒介子探针N-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.17所示的核苷酸序列的5’至3’方向第17个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基。

具体地，如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针5’端的荧光基团可设置为不同荧光基团，SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针的模板序列允许有差异。

本发明还提供了检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组，

包括检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组，或/和检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组包括：权利要求4所述的第一探针组和第二探针组，及E基因外侧引物N-WF/N-WR，E基因内侧引物N-FIP/N-BIP，E基因环状引物N-LF/N-LB；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组包括：权利要求4所述的第三探针组，及N基因外侧引物N-WF/N-WR，N基因内侧引物N-FIP/N-BIP，N基因环状引物N-LF/N-LB。

进一步地，N基因外侧引物：引物N-WF：核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；引物N-WR：核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

N基因内侧引物：引物N-FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；引物N-BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

N基因环状引物：引物N-LF：核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；引物N-LB：核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

进一步地，E基因外侧引物：引物E-WF：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；引物E-WR：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

E基因内侧引物：引物E-FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；引物E-BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

E基因环状引物：引物E-LF：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；引物E-LB：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供一种检测新型冠状病毒多重核酸靶标的试剂盒，包括含有上述引物组中的探针组的溶液，所述引物组的溶液为将引物组中的每项引物或探针稀释到0.05～1.6μmol/L 的溶液。

上述试剂盒，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal AmplificationBuffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

进一步地，检测新型冠状病毒多重核酸靶标的试剂盒，包括含有上述引物组中检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液，所述引物组的溶液为0.2μmol N-WF，0.2μmol N-WR，1.6μmol N-FIP，1.6μmol N-BIP，0.8μmol N-LF，0.4μmol N-LB，0.4μmol N-LMP，0.2μmol UP1或UP2，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA 聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal AmplificationBuffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

进一步地，检测新型冠状病毒多重核酸靶标的试剂盒，包括含有上述引物组中检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液，所述引物组的溶液为0.2μmol E-WF，0.2μmol E-WR，1.6μmol E-FIP，0.8μmol E-BIP，0.8μmol E-LF，0.8μmol E-LB，0.8μmol E-LMP，0.2μmol UP1或UP2，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA 聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal AmplificationBuffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

进一步地，检测新型冠状病毒多重核酸靶标的试剂盒，包括含有上述引物组中检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液和检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液为：0.05μmol N-WF，0.05μmol N-WR，0.4μmol N-FIP，0.4μmol N-BIP，0.2μmol N-LF，0.1μmol N-LB，0.1μmol N-LMP，0.2μmol UP1或UP2；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液为：0.2μmol E-WF，0.2μmolE-WR，1.6μmol E-FIP，1.6μmol E-BIP，0.8μmol E-LF，0.4μmol E-LB，0.4μmol E-LMP， 0.2μmol UP1或UP2；

还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μ L反转录酶，0.04U/μL RNase HII，40mmol盐酸胍，5μL模板基因，1×IsothermalAmplification Buffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

本发明还提供一种检测新型冠状病毒多重核酸靶标的检测方法，包括以下步骤：

S1.取样；

S2.利用上述的试剂盒和将取得的样品配置LAMP反应体系，置入反应管，混匀离心；

S3.将反应管放置在具有恒温功能的荧光仪上进行60～65℃反应，每隔1min收集一次荧光，收集60～90个循环；

S4.读取Ct值，检测结果判断标准如下：样本Ct值≤60，判断样本为阳性； 60＜样本Ct值≤75，若扩增曲线为对数扩增曲线，判断为可疑阳性样本，否则判断样本为阴性；

对可疑阳性样本进行复检，若复检样本Ct值≤60，判断可疑阳性样本为阳性，否则判断样本为阴性；

样本无Ct值或Ct值＞75，判断样本为阴性。

进一步地，步骤S3中，若步骤S2的试剂盒仅含检测N或E基因的引物组时，为65℃恒温扩增；若步骤S2的试剂盒同时含检测N和E基因的引物组时，为60℃恒温扩增。

本发明具有以下有益效果：

本发明的探针组的检测原理是首次公布的，与现有RT-LAMP检测方法所用的引物在检测原理上差别巨大。

探针组包括针对SARS-CoV-2病毒的N靶标基因、E靶标基因各自的至少六个靶标引物区分别设计的六条引物，六条引物可与N靶标基因、E靶标基因的特定部位互补配对，然后沿伸形成靶标基因的互补序列。

还包括针对六条引物中的内引物、环引物设计不同类型的媒介子探针，媒介子探针包括媒介子序列、靶特异性序列，靶特异性序列能与靶标基因的互补序列的特定部位互补配对，形成带有内切酶切割位点(cleavage site)的特异结合序列的双链。

混合上述的两组LAMP引物、不同类型的媒介子探针及通用型报告探针、模板DNA或RNA、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、核酸内切酶RNase HII，并以恒定的温度(60～65℃) 对靶标基因进行高效扩增，经过扩增之后形成茎-环结构的DNA链，媒介子探针的靶特异性序列与茎-环结构的DNA链的特定部位结合，靶特异性序列5’端第2或3个碱基被修饰成 RNA碱基其余为DNA碱基(为核酸内切酶切割位点(cleavage site))，媒介子序列不与茎-环结构的DNA链的任何区域结合，因此翘起来，在核酸内切酶RNase HII的作用下，媒介子序列被酶切下来，在DNA聚合酶Bst DNA作用下，持续产生的带有3’羟基自由活性的媒介子序列与特定报告探针结合，置换出相应荧光通道信号。每经过一个扩增循环，荧光信号也和媒介子序列一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度对应茎-环结构的DNA链的拷贝数，荧光信号强度可由光电倍增管读出。而在无模板DNA或RNA存在情况下，无法实现靶标基因进行LAMP扩增，也就无法产生茎-环结构的DNA链和媒介子探针上的酶切位点，从而也就无法产生荧光通道信号(阳性信号)。

结合核酸内切酶和媒介子探针-通用探针(报告探针)信号报告模式，实现90分钟内在不依赖于靶标序列设计的荧光探针体系里达到新型冠状病毒双重靶基因特异分析。本发明的检测新型冠状病毒N基因、E基因的外侧引物、内侧引物、环状引物不限于本发明提供的序列。新型冠状病毒N基因、E基因为保守基因序列，不同类型的新型冠状病毒的N基因、E基因的同源性高，本发明提供的探针组也可与不同类型的新型冠状病毒的N基因、E基因的部分对照序列互补配对。

由本发明设计的探针组组成的试剂盒能够将新型冠状病毒与每年春冬季流行的前三种呼吸道病毒进行快速准确区分，反应条件温和，恒温条件单一，检测设备简单，仅需恒温水浴设备和荧光仪，能在一管里实现灵敏、快速反应达到检测目的，报告探针和媒介子探针的 5’端可适用于其它不同混合引物组里，因此本发明的检测方法适于现场检测，灵敏度高，反应快、能实时检测。

附图说明

图1是本发明的基于LAMP的通用型核酸靶标实时荧光定量检测方法的原理图；

图2是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP E基因检测体系不同媒介子探针类型效果对比，图2 中Pos表示阳性实验，Neg表示阴性，即不加媒介子探针；

图3是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系检测载有N基因的质粒时的灵敏度；

图4是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系检测N基因的RNA时的灵敏度

图5是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系检测E基因的RNA时的灵敏度

图6是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系使用具有FAM荧光基团的报告探针时的特异度；

图7是通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系使用具有HEX荧光基团的报告探针时的特异度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，首先对本发明所设计的试剂和术语解释如下：

RNase HII为核糖核酸内切酶，适用于在双链DNA内部切刻核糖核酸的5末端，产生5磷酸和3羟基末端。RNase HII还可以在冈崎片段的RNA部分进行多处切割。

Bst DNA聚合酶它具有5′→3′聚合酶活性和双链特异的5′→3′核酸外切酶活性，但缺失3′→5′核酸外切酶活性。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV和MERS-CoV病毒类似，SARS-CoV-2(2019-nCoV)的基因组也分为非结构基因和结构基因两个部分。其中约占SARS-CoV-2全基因组总长度三分之二的非结构基因含有两段编码蛋白质的序列，称为ORF1a和ORF1b。而紧随其后的结构基因区域则编码S蛋白、orf3a蛋白、E蛋白、M蛋白、orf6蛋白、orf7a 蛋白、orf8蛋白、N蛋白等结构蛋白。

新型冠状病毒的E基因表达E蛋白，E蛋白包含疏水结构域和跨膜α螺旋结构域，是病毒包膜组成部分，并参与病毒颗粒组装和释放，2019-nCoV的E蛋白序列与SARS CoV 相比，同源性高达95％，是保守基因序列。新型冠状病毒的N基因表达N蛋白，N蛋白序列保守程度高，与病毒颗粒内的RNA结合，与2019-nCoV的N蛋白同源性高达90％。另外N蛋白的变异频率相对较低，不同型之间都比较接近[1]，所以常用作免疫学检测的抗原。

新型冠状病毒的开放读码框1ab(ORF1ab)，也是保守基因序列，可作为检测靶标。

[1]Ruan YJ,WeiCL,Ee AL，etal Comparative full-length genome sequenceanalysis of 14 SARS coronavirus isolates and common mutation sassociated withputative origins of infection[J]. Lancet,2003，361(9371):1779-1785.

本发明的基于LAMP的通用型核酸靶标实时荧光定量检测方法的反应原理见图1。针对 SARS-CoV-2病毒的N靶标基因、E靶标基因各自的至少六个靶标引物区分别设计的六条引物，六条引物可与N靶标基因、E靶标基因的特定部位互补配对，然后延伸形成靶标基因的互补序列。

针对六条引物中的内引物、环引物设计不同类型的媒介子探针，媒介子探针包括媒介子序列、靶特异性序列，靶特异性序列能与靶标基因的互补序列的特定部位互补配对，形成带有内切酶切割位点(cleavage site)的特异结合序列的双链。

混合上述的两组LAMP引物、不同类型的媒介子探针及通用型报告探针、模板DNA或RNA、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、核酸内切酶RNase HII，并以恒定的温度(60～65℃) 对靶标基因进行高效扩增，经过扩增之后形成茎-环结构的DNA链，媒介子探针的靶特异性序列与茎-环结构的DNA链的特定部位结合，靶特异性序列5’端第2或3个碱基被修饰成 RNA碱基其余为DNA碱基(为核酸内切酶切割位点(cleavage site))，媒介子序列不与茎-环结构的DNA链的任何区域结合，因此翘起来，在核酸内切酶RNase HII的作用下，媒介子序列被酶切下来，在DNA聚合酶Bst DNA作用下，持续产生的带有3’羟基自由活性的媒介子序列与特定报告探针结合，置换出相应荧光通道信号。每经过一个扩增循环，荧光信号也和媒介子序列一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度对应茎-环结构的DNA链的拷贝数，荧光信号强度可由光电倍增管读出。

而在无模板DNA或RNA存在情况下，无法实现靶标基因进行LAMP扩增，也就无法产生茎-环结构的DNA链和媒介子探针上的酶切位点，从而也就无法产生荧光通道信号(阳性信号)。

本发明因此提供了一种多重靶基因在一管里实现灵敏、快速反应达到检测目的的方法。由于特异结合环引物的环媒介子探针、特异结合内引物的内媒介子探针与报告探针在不同的多基因引物组里可适用，又称为通用型多重靶基因检测方法，即报告探针和媒介子探针的5’端可适用于其它不同混合引物组里。

下载SARS-CoV-2基因组(GenBank:MN908947.3)，得到特异性的N片段和E片段序列，并以此设计RT-LAMP引物组。

实施例1

本发明的一个典型实施方式的具体实施过程如下：

对特异性E片段的6个区域设计RT-LAMP引物，包括2条针对F3/B3区域设计的外引物E-WF/E-WR，2条内引物E-FIP/E-BIP，在F2和F1C区域之间以及B2和B1C区域之间设计环引物E-Loop-F/E-Loop-B(E-LF/E-LB)，针对六条引物中的环引物E-LF/E-LB的扩增序列设计环媒介子探针Loop MP，针对环媒介子探针Loop MP的序列设计报告探针。

实施例2

本发明的一个典型实施方式的具体实施过程如下：

对特异性E片段的6个区域设计RT-LAMP引物，包括2条针对F3/B3区域设计的外引物E-WF/E-WR，2条内引物E-FIP/E-BIP，在F2和F1C区域之间以及B2和B1C区域之间设计环引物E-Loop-F/E-Loop-B(E-LF/E-LB)。

实施例3

本发明的一个典型实施方式的具体实施过程如下：

对特异性E片段的6个区域设计RT-LAMP引物，包括2条针对F3/B3区域设计的外引物E-WF/E-WR，2条内引物E-FIP/E-BIP，在F2和F1C区域之间以及B2和B1C区域之间设计环引物E-Loop-F/E-Loop-B(E-LF/E-LB)，针对六条引物中的内引物E-FIP/E-BIP的扩增序列设计内媒介子探针Inner MP，针对内媒介子探针Inner MP的序列设计报告探针。

实施例4

本发明的一个典型实施方式的具体实施过程如下：

实施例5通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系不同媒介子探针类型检测效率比较

为考察实施例1～实施例4提供的不同类型的环媒介子探针与内媒介子探针与对特异性 E片段的6个区域设计的RT-LAMP引物组用于通用型SARS-CoV-2-LAMP检测体系的检测效率，选择了一定浓度的SARS-CoV-2RNA标准品(翊圣生物,货号：11900ES03)，即10⁴拷贝数/微升，做体系反应模板，考察不同类型的媒介子探针用于通用型SARS-CoV-2-LAMP E基因检测体系的扩增效率(Ct值)。具体地，通用型SARS-CoV-2-LAMP E基因检测体系总体积25μL，环媒介子探针体系中具体成分包括：1×Isothermal Amplification Buffer，6mMMgSO₄，1.4mM dNTP(A/G/C/T)，0.2μM E-WF，0.2μM E-WR，1.6μM E-FIP，1.6μM E-BIP， 0.8μM E-LF，0.4μM E-LB，0.4μM E-LMP，0.2μM UP2，0.32U/μL Bst 2.0

DNAPolymerase，0.5μL WarmStart RTx Reverse Transcriptase(反转录酶)，0.04U/μL RNaseHII，5 μL基因组，其余部分用无核酸酶水补足25μL。体系在具有恒温功能的荧光仪上进行65℃反应，每隔1min收集一次荧光，收集60～90个循环。其中UP2为通用型报告探针：TaqMan荧光探针，U/μL表示每微升药品中含有多少单位药物。

实施例1～4中E基因的引物序列如下表1：

表1

用环媒探针检测E基因时的LAMP反应体系用到的引物序列如下表2：

表2

通用型SARS-CoV-2-LAMP E基因检测体系总体积25μL，内媒介子探针体系中具体成分包括：1×Isothermal Amplification Buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP(A/G/C/T)，0.2μM E-WF，0.2μM E-WR，0.8μM E-LF，0.8μM E-LB，1.6μM E-FIP，0.8μM E-BIP，0.8μM E-IMP，0.2μM UP2，0.32U/μL Bst 2.0

DNA Polymerase，0.5μL WarmStart RTx ReverseTranscriptase(反转录酶)，0.04U/μL RNase HII，5μL基因组，其余部分用无核酸酶水补足25μL。体系在具有恒温功能的荧光仪上进行65℃反应，每隔1min收集一次荧光，收集60～90个循环。其中UP2为通用型报告探针：TaqMan荧光探针，U/μL表示每微升药品中含有多少单位药物。

用内媒探针检测E基因时的LAMP反应体系用到的引物序列如下表3：

表3

检测结果如图2所示，观察并比较四种媒介子探针与E基因的引物组合时qPCR最低检出模板拷贝浓度：发现用四种媒介子探针进行荧光定量PCR时，对相同浓度的SARS-CoV-2RNA标准品进行检测时，环媒探针Loop MP与E基因的引物组合时检测效率较内媒探针Inner MP与E基因的引物组合时检测效率好。

实施例6通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系灵敏度考察

本发明的一个典型实施方式的具体实施过程如下：

对特异性N片段的6个区域设计RT-LAMP引物，包括2条针对F3/B3区域设计的外引物N-WF/N-WR，2条内引物N-FIP/N-BIP，在F2和F1C区域之间以及B2和B1C区域之间设计环引物N-Loop-F/N-Loop-B(N-LF/N-LB)，N基因序列如SEQ ID No.10所示。针对六条引物中的环引物N-Loop-F/N-Loop-B的扩增序列设计内媒介子探针Loop MP-Pos。在对载有 N基因的质粒(pUC57载体)做一系列梯度稀释后进行检测，考察不同在梯度稀释后环媒介子探针用于通用型SARS-CoV-2-LAMP N基因检测体系的扩增效率(Ct值)。具体地，通用型SARS-CoV-2-LAMP N基因检测体系总体积25μL，环媒介子探针体系中具体成分包括： 1×IsothermalAmplification Buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP(A/G/C/T)，0.2μM N-WF， 0.2μM N-WR，1.6μM N-FIP，1.6μM N-BIP，0.8μM N-LF，0.4μM N-LB，0.4μM N-LMP， 0.2μM UP1，0.32U/μLBst 2.0

DNA Polymerase，0.5μL WarmStart RTx Reverse Transcriptase(反转录酶)，0.04U/μL RNase HII，5μL基因组，其余部分用无核酸酶水补足 25μL。体系在具有恒温功能的荧光仪上进行65℃反应，每隔1min收集一次荧光，收集60～90 个循环。其中UP1为报告探针：TaqMan荧光探针，U/μL表示每微升药品中含有多少单位药物。N基因的引物序列如下表4：

表4

如图3，当载有N基因的质粒梯度稀释成10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、5×10¹拷贝数/微升，并以无核酸酶水为阴性对照Neg，采用至少三个平行进行检测，读取Ct值，检测结果判断标准如下：样本Ct值≤60，判断样本为阳性；60＜样本Ct值≤75，若扩增曲线为对数扩增曲线，判断为可疑阳性样本，否则判断样本为阴性；对可疑阳性样本进行复检，若复检样本Ct值≤60，判断可疑阳性样本为阳性，否则判断样本为阴性；样本无Ct值或Ct值＞75，判断样本为阴性。

结果发现，观察并比较五种稀释度qPCR的检出灵敏度，结果显示：RT-LAMP检测方法检测N基因质粒检测下限为50拷贝数/反应。

为考察RNA标准品在通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系的灵敏度，选择了一定浓度的SARS-CoV-2RNA标准品(翊圣生物,货号：11900ES03)，即10⁵、10⁴、 10³、10²、10¹拷贝数/微升做体系反应模板，做了一系列10倍梯度稀释，并以无核酸酶水为阴性对照，采用至少三个平行进行检测，检测N基因RNA时反应体系如表4，检测E基因 RNA时反应体系如表2的组1，结果发现，如图4和图5，通用型SARS-CoV-2RT-LAMP 双重靶基因检测体系检测N基因RNA和E基因RNA最低检测下限均为100拷贝数/反应。

实施例7通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系特异度考察

为考察通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系特异度，选择了人呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)等作为体系特异度考察对象，并以SARS-CoV-2RNA标准品为阳性对照(Pos)，无核酸酶水为阴性对照(Neg)，采用至少三个平行进行检测，检测N基因RNA时反应体系如表4，检测E基因RNA时反应体系如表 2的组1，结果发现，如图6和图7，通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系检测不同对象未出现交叉信号，体系特异度良好。

本发明的RT-LAMP检测方法方便临床应用，即能够与每年春冬季流行的前三种呼吸道病毒进行快速准确区分。

本发明的RT-LAMP的通用型SARS-CoV-2核酸靶标检测方法，主要原理是在核酸内切酶RNase HII与DNA聚合酶Bst DNA相互协同作用下，在有靶标存在情况下，实现通用型媒介子的激活并与特定报告探针作用产生信号。

实施例8

通用型SARS-CoV-2RT-LAMP双重靶基因检测体系总体积25μL，成分包括： 1×Isothermal Amplification Buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP(A/G/C/T)；

0.05μM N-WF(SEQ ID No.13)，0.05μM N-WR(SEQ ID No.14)，0.4μM N-FIP(SEQID No.15)，0.4μM N-BIP(SEQ ID No.16)，0.2μM N-LF(SEQ ID No.17)，0.1μM N-LB(SEQID No.18)，0.1μM N-LMP(SEQ ID No.19)，0.2μM UP1(SEQ ID No.20)；

0.2μM E-WF(SEQ ID No.1)，0.2μM E-WR(SEQ ID No.2)，1.6μM E-FIP(SEQ IDNo.3)， 1.6μM E-BIP(SEQ ID No.4)，0.8μM E-LF(SEQ ID No.5)，0.4μM E-LB(SEQ IDNo.6)，0.4μM E-LMP(SEQ ID No.7)，0.2μM UP2(SEQ ID No.8)；

0.32U/μL Bst 2.0

DNA Polymerase，0.5μL WarmStart RTx ReverseTranscriptase，0.04U/μL RNase HII，40mM盐酸胍，5μL基因组，其余部分用无核酸酶水补足25μL。体系在具有恒温功能的荧光仪上进行60℃反应，每隔1min收集一次荧光，收集60～90个循环。

以上实施例中结合核酸内切酶和媒介子探针-通用探针(报告探针)信号报告模式，实现90分钟内在不依赖于靶标序列设计的荧光探针体系里达到新型冠状病毒双重靶基因特异分析。以上实施例中的检测新型冠状病毒N基因、E基因的外侧引物、内侧引物、环状引物不限于本发明提供的序列。

序列表

<110> 福建医科大学孟超肝胆医院（福州市传染病医院）

<120> 一种探针组、检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组及其试剂盒及检测方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcggaaga gacaggtac 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggaactcta gaagaattca ga 22

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcagtaagg atggctagtg tagcgtactt ctttttcttg ctt 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgattgtgt gcgtactgct gtttttaaca cgagagtaaa cgt 43

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actagcaaga ataccacga 19

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caatattgtt aacgtgagtc ttgtaaa 27

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggctctac gacctattgt taacgtgagt cttgtaaa 38

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgccggaac caggtcgtag agcccaccgg cgg 33

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgggctctac gacctcgatt gtgtgcgtac tgctgttttt aacacgagag taaacgt 57

<210> 10

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaaaaggc ttctacgca 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgctctcaa gctggttcaa 20

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcccctactg ctgcctggag gcagtcaagc ctcttctcg 39

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctcctgcta gaatggctgg catctgtcaa gcagcagcaa ag 42

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaatttctt gaactgttgc gactacg 27

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggcggtga tgctgctctt g 21

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgggctcatc gtgctgcggt gatgctgctc ttg 33

Claims

1.一种探针组，其包含一种报告探针，及至少一种媒介子探针，其中，

所述媒介子探针从5’至3’方向包含媒介子序列、靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与新型冠状病毒的核酸靶标序列的部分对照序列互补的序列，所述核酸靶标序列的部分对照序列是：新型冠状病毒的核酸靶标序列在环介导等温扩增反应中与环状引物或内侧引物互补配对后沿伸扩增出的序列，所述媒介子序列包含不与所述核酸靶标序列或对照序列互补的序列，所述靶特异性序列中的一个碱基被修饰成RNA碱基其余为DNA碱基，所述RNA碱基位于所述靶特异性序列5’端第2或3个碱基处；

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述新型冠状病毒的核酸靶标序列选自新型冠状病毒的保守基因序列。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述新型冠状病毒的核酸靶标序列选自SARS-CoV-2病毒的保守基因序列：N基因、E基因。

4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组为选自下列的探针组：

第一探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的环引物，其包含，核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示的环媒介子探针E-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的5’至3’方向第16个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基；

第二探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的内引物，其包含，核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示的内媒介子探针E-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的5’至3’方向第16个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基；

第三探针组，靶向新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的环引物，其包含，核苷酸序列如SEQ IDNo.17所示的环媒介子探针N-LMP，以及，分别如SEQ ID No.8、18所示的2种报告探针UP1/UP2中的一种，报告探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团，SEQ ID No.17所示的核苷酸序列的5’至3’方向第17个碱基被修饰为RNA碱基，其余为DNA碱基。

5.检测新型冠状病毒多重核酸靶标的探针组，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的探针组，其特征在于，

N基因外侧引物：引物N-WF：核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；引物N-WR：核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

7.根据权利要求5所述的探针组，其特征在于，

E基因外侧引物：引物E-WF：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；引物E-WR：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

8.一种检测新型冠状病毒多重核酸靶标的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求5～8任一项中的引物组的溶液，所述引物组的溶液为将引物组中的每项引物或探针稀释到0.05～1.6μmol/L的溶液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal Amplification Buffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求5中检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液，所述引物组的溶液为0.2μmol N-WF，0.2μmol N-WR，1.6μmol N-FIP，1.6μmol N-BIP，0.8μmol N-LF，0.4μmol N-LB，0.4μmol N-LMP，0.2μmolUP1或UP2，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal Amplification Buffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求5中检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液，所述引物组的溶液为0.2μmol E-WF，0.2μmol E-WR，1.6μmol E-FIP，0.8μmol E-BIP，0.8μmol E-LF，0.8μmol E-LB，0.8μmol E-LMP，0.2μmolUP1或UP2，还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，5μL模板基因，1×Isothermal Amplification Buffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

12.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求5中检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液和检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的N基因的引物组的溶液为：0.05μmol N-WF，0.05μmolN-WR，0.4μmol N-FIP，0.4μmol N-BIP，0.2μmol N-LF，0.1μmol N-LB，0.1μmol N-LMP，0.2μmol UP1或UP2；

所述检测新冠病毒SAR-CoV-2的E基因的引物组的溶液为：0.2μmol E-WF，0.2μmol E-WR，1.6μmol E-FIP，1.6μmol E-BIP，0.8μmol E-LF，0.4μmol E-LB，0.4μmol E-LMP，0.2μmol UP1或UP2；

还包括6mmol MgSO₄，1.4mmol dNTP(A/G/C/T)，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，0.5μL反转录酶，0.04U/μL RNase HII，40mmol盐酸胍，5μL模板基因，1×Isothermal AmplificationBuffer，所述试剂盒检测体系总体积25μL，剩余部分用无核酸酶水补足至25μL。

13.一种检测新型冠状病毒多重核酸靶标的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.取样；

S2.利用权利要求8～12任一项所述的试剂盒和将取得的样品配置LAMP反应体系，置入反应管，混匀离心；

S4.读取Ct值，检测结果判断标准如下：样本Ct值≤60，判断样本为阳性；

60＜样本Ct值≤75，若扩增曲线为对数扩增曲线，判断为可疑阳性样本，否则判断样本为阴性；

样本无Ct值或Ct值＞75，判断样本为阴性。

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，若步骤S2的试剂盒仅含检测N或E基因的引物组时，为65℃恒温扩增；若步骤S2的试剂盒同时含检测N和E基因的引物组时，为60℃恒温扩增。