CN116286722B - 一种全遗传编码的光控dna合成酶、核酸与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种全遗传编码的光控DNA合成酶、核酸与应用。所述光控DNA合成酶包括DNA合成酶和感光蛋白，所述感光蛋白嵌于所述DNA合成酶中，所述DNA合成酶为TdT酶，所述感光蛋白为cpLOV2。本发明光控DNA合成酶能在不同光照条件下呈现出显著差异化的酶活性，实现催化活性的可逆光学调控，且具有催化效率高、稳定性高、可控性强的特点。本发明改善了传统DNA合成酶合成可控性差、合成反应多步骤、依赖去保护过程的局限。本发明利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，初步代替了传统的人工紫外或化学试剂去保护步骤，减少了反应步骤，提高了合成效率，同时降低了合成成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种全遗传编码的光控DNA合成酶、核酸与应用。
背景技术
目前，寡聚核苷酸的合成法技术可主要分为化学合成法和生物酶促合成法。
(1)基于柱式的化学合成法：该方法是通过传统的人工化学合成法，进行化学合成的循环反应。具体循环周期为：
第一步：脱三苯甲基作用
用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。
第二步：偶联反应
通过弱碱-四唑催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相上的核苷酸暴露的5’-OH缩合。
第三步：封端反应
加入乙酸酐激发的乙酰化作用，将所有没有参与偶联反应的5’-OH基团全部封闭起来。
第四步：氧化作用
利用碘液催化作用，将核苷酸间的3’5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’-5’磷酸三酯键。
(2)芯片化学合成法：该方法是通过亚磷酰胺将DNA寡核苷酸固定在基底上、以四步亚磷酰胺法(去保护、偶联、加帽及氧化)从头合成DNA寡核苷酸链。基于此原理并利用微液滴体系、光化学催化、电化学催化等手段研发的技术平台已经被多家公司成功商业化。
(3)新型的生物酶促合成法：
随着国际上寡核苷酸合成反应技术的进步，新型的生物酶促合成法逐渐受到关注：新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的DNA末端核酸转移酶(TdT)进行体外的寡核苷酸片段合成。前期技术需要使用人工修饰的特异性脱氧核糖核苷酸作为底物，从而使反应可控。其原理是在底物分子上添加了3’-OH基团，其形成的空间位阻有效阻挡了底物单体的连接过程。采用3'末端阻断的方式进行DNA生物合成共分为两个步骤：第一步是TdT酶将具有阻断效应的碱基加到目标片段上；第二步是对3'末端的保护基团进行脱保护处理。
现有上述方法分别存在以下缺点：
(1)传统人工化学合成法反应步骤复杂，对人力和时间消耗较大。反应同时会产生对环境有危害的副产物，并且其必要的试剂体量使得成本难以得到控制。
(2)基于芯片固定的化学合成法虽然实现了基因的高通量合成，但是基于微流控反应和喷墨打印的特殊性，存在寡核苷酸合成产量受限和准确性过低等问题。
(3)新型生物酶合成法的出现，实现了寡核苷酸在体外的高效快速合成，同时该反应对于环境友好，反应步骤仅需2～3步，一定程度上改善了传统化学合成法存在的局限性。尽管如此，由于DNA合成酶反应速率难以控制、底物特异性识别较差等缺陷，导致该酶的催化活性无法被合理掌控。另外，生物酶法合成中底物的脱保护步骤采用的化学试剂脱保护法和紫外光脱保护法对寡核苷酸产物不利。因此现有的生物酶合成法并没有脱离反应中“人为二次干预”这一步骤。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全遗传编码的光控DNA合成酶、核酸与应用，旨在解决传统DNA合成酶合成可控性差、反应步骤多的问题。
本发明的技术方案如下：
一种全遗传编码的光控DNA合成酶，其中，所述光控DNA合成酶包括DNA合成酶和感光蛋白，所述感光蛋白嵌于所述DNA合成酶中，所述DNA合成酶为TdT酶，所述感光蛋白为cpLOV2。
可选地，所述cpLOV2由核心结构域PAS和Jα螺旋构成，在蓝光照射下所述Jα螺旋变成松散的柔性结构，在黑暗状态下所述松散的柔性结构变成Jα螺旋。
可选地，所述cpLOV2来自于藻类或燕麦。
可选地，所述cpLOV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，所述TdT酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，所述cpLOV2嵌入在TdT酶的第379号谷氨酸残基和第380号丝氨酸残基之间。
可选地，所述光控DNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种核酸，其中，所述核酸含有编码本发明所述的全遗传编码的光控DNA合成酶的核苷酸序列。
一种本发明所述的全遗传编码的光控DNA合成酶催化DNA合成反应的应用。
可选地，所述光控DNA合成酶催化脱氧核苷酸重复添加到寡核苷酸、单链和双链DNA的3'羟基端。
有益效果：本发明通过光触可控酶催化反应的形式，构建了一种利用cpLOV2实现TdT酶活性受光学调控的光控DNA合成酶。本发明光控DNA合成酶能在不同光照条件下呈现出显著差异化的酶活性，实现催化活性的可逆光学调控，且具有催化效率高、稳定性高、可控性强的特点。本发明利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，改善了传统DNA合成酶合成可控性差、合成反应多步骤、依赖去保护过程的局限。相比于背景技术中的生物合成法，本发明利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，初步代替了传统的人工紫外或化学试剂去保护步骤，减少了反应步骤，提高了合成效率，同时降低了合成成本。为DNA合成酶的可控合成提供了变革性新策略。
附图说明
图1是结合计算机辅助蛋白设计、酶活性分子定向进化和高通量酶活性筛选等方法，设计活性受光信号控制的光控DNA合成酶的示意图。
图2是本发明所使用的感光蛋白cpLOV2在蓝光和黑暗状态下的构象转换示意图。其中，黄色部分代表cpLOV2的核心结构域，绿色部分代表Jα螺旋。
图3是本发明基于感光蛋白cpLOV2的光控DNA合成酶的原理示意图。在DNA合成酶TdT中嵌入感光蛋白cpLOV2。橙色部分代表感光蛋白cpLOV2，绿色和灰色分别代表正常活性和活性被限制状态下的TdT酶。
图4是本发明基于感光蛋白cpLOV2的光控DNA合成酶的结构示意图。
图5是本发明在蓝光和黑暗下光控DNA合成酶的催化速率图。纵坐标为光控DNA合成酶的催化速率。
具体实施方式
本发明提供一种全遗传编码的光控DNA合成酶、核酸与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有生物酶促合成法技术中，TdT酶在体外的寡核苷酸片段合成反应中具有活性高、反应效率快等优势，但同时具有对反应底物、反应速率不可控等缺点。基于此，本发明基于外界物理信号对于合成酶及反应活性位点的激活特性，及反应后反应位点的可逆抑制特性，在分子层面上实现了DNA合成酶活性的光学开关调控。具体利用cpLOV2在蓝光和黑暗状态下的构象变化实现了对TdT反应速率的有效差异控制。
具体地，本发明实施例提供一种全遗传编码的光控DNA合成酶，其中，所述光控DNA合成酶包括DNA合成酶和感光蛋白，所述感光蛋白嵌于所述DNA合成酶中，所述DNA合成酶为TdT酶(非模版依赖性的DNA末端核酸转移酶)，所述感光蛋白为cpLOV2。
本实施例的全遗传编码的光控DNA合成酶，具体为感光蛋白cpLOV2和DNA合成酶(即TdT酶)构成的嵌合体，利用感光蛋白cpLOV2实现了对TdT酶活性的光学调控。本实施例的全遗传编码的光控DNA合成酶是完全依赖氨基酸排列组合与蛋白质空间折叠而形成的光控蛋白。本实施例光控DNA合成酶能在不同光照条件下呈现出显著差异化的酶活性，实现催化活性的可逆光学调控，且具有催化效率高、稳定性高、可控性强的特点。本实施例利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，改善了传统DNA合成酶合成可控性差、合成反应多步骤、依赖去保护过程的局限。相比于背景技术中的生物合成法，本实施例利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，初步代替了传统的人工紫外或化学试剂去保护步骤，减少了反应步骤，提高了合成效率，同时降低了合成成本。为DNA合成酶的可控合成提供了变革性新策略。
本实施例提出的一种全新的DNA合成酶控制模式：利用感光蛋白cpLOV2实现了对TdT酶活性的光学调控，具体是cpLOV2在蓝光和黑暗状态下的构象变化实现了TdT酶反应速率的有效差异控制。
本实施例通过将感光蛋白cpLOV2同TdT酶关键活性调控位点融合，具体可以是，所述cpLOV2嵌入在TdT酶的第379号谷氨酸残基和第380号丝氨酸残基之间，从而实现TdT酶构象及其催化活性的可逆光学调控。
由于蛋白活性位点与小分子底物结合的复杂性，本实施例结合计算机辅助蛋白设计的方法，建立分子动力学模型，基于活性、构象可控的蛋白设计策略(图1)，并通过高通量的酶筛选平台获得催化效率高、稳定性高、可控性强的光控DNA合成酶。具体地，本实施例通过构建蛋白质的质粒基因序列图谱，运用无缝克隆技术扩增并连接片段载体。将质粒载体转入大肠杆菌，对大肠杆菌进行扩增，诱导蛋白表达，最终利用亲和筛选方式纯化目的蛋白。
具体地，所述光控DNA合成酶由DNA合成酶TdT(模版非依赖性DNA末端脱氧核苷酸核酸转移酶)和构象受蓝光调控的感光蛋白cpLOV2两部分组成。其中DNA合成酶TdT可催化脱氧核苷酸重复添加到寡核苷酸、单链和双链DNA的3'羟基端。TdT酶催化反应需要含有至少3个碱基的短序列作为引物。本实施例使用的另一个蛋白结构域是构象受蓝光调控的光-氧-电感结构域(Light-oxygen-voltage-sensing-domain,LOV)。这是一种广泛存在于藻类、燕麦中的光敏蛋白结构域。本实施例采用了LOV亚基优化循环排列(circularpermutation)后的改造蛋白cpLOV2作为感光蛋白。cpLOV2由核心结构域PAS和Jα螺旋(JαHelix)构成。当在400nm蓝光的照射下，由于cpLOV2的核心结构域与辅因子FMN之间的非共价作用转变为共价作用，导致其c端的Jα螺旋发生解螺旋(即变成松散的柔性结构)，见图2所示。因此，本实施例通过将cpLOV2结构域嵌入TdT酶中，利用蓝光和黑暗下蛋白的构象变化改变连接在c端的Jα的效应子，即融合的TdT酶的生物学功能(图3)。当光控DNA合成酶在蓝光条件下，TdT反应活性中心处于“开放”状态，导致酶活性中心构象发生变化，进而导致其生物催化效率被限制。当光控DNA合成酶在黑暗条件时，其酶活性中心恢复原有构象，从而正常发挥DNA合成酶的功能。外界物理光照的变化引起感光融合蛋白的构象变化，最终表现为受光学可逆调控的光控DNA合成酶催化活性的可控性。
具体地，所述TdT-cpLOV2的蛋白质结构示意图如图4所示，天蓝色、粉色和绿色部分分别代表DNA合成酶TdT的Thumb结构域、Finger结构域和Plam结构域。深绿色代表寡聚脱氧核糖核苷酸。黄色部分代表感光蛋白cpLOV2。
具体地，所述cpLOV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TdT酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述光控DNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明实施例提供一种核酸，其中，所述核酸含有编码本发明实施例所述的全遗传编码的光控DNA合成酶的核苷酸序列。
本发明实施例提供一种如上所述的全遗传编码的光控DNA合成酶在DNA合成反应中的应用。具体地，所述光控DNA合成酶能够催化脱氧核苷酸重复添加到寡核苷酸、单链和双链DNA的3'羟基端。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
(1)光控DNA合成酶的制备步骤如下：
TdT-cpLOV2筛选文库构建：通过Snapgene构建嵌入cpLOV2的TdT-cpLOV2质粒基因图谱。用KOD DNA聚合酶进行PCR反应:反应开始于94℃(5min)，随后进行30次循环94℃(20s)，退火温度63℃(1.5min)，最终延伸于72℃(5min)。将PCR产物用DpnI酶切后转化大肠杆菌129BL21(DE3)感受态细胞，过夜后于培养皿挑取单克隆。
TdT-cpLOV2的表达和纯化：选取单克隆突变，在含100μg/mL卡那霉素的200mL的LB培养基中孵育3小时至OD值为0.6。加入的IPTG(异丙基-β-d-硫半乳糖)至终浓度为0.5mM。230rpm转速，16℃下诱导过夜。6000g离心10分钟收集细胞，然后在50mL裂解缓冲液(30MmTris-HCL缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑)中重悬。用高压均质器裂解细胞，在4℃下以6000g离心10分钟去除细胞碎片。使澄清的裂解液在重力作用下流过镍亲和色谱柱。用50mL洗涤缓冲液(30Mm Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，40mM咪唑)去除非目标蛋白，然后用20mL洗脱缓冲液(30Mm Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，200mM咪唑)收集目标蛋白。用30kDa分子量的超滤离心柱对洗脱蛋白进行浓缩和透析，得到纯化的光控DNA合成酶。
(2)光控DNA合成酶反应条件
光控DNA合成酶缓冲溶液：用HEPES缓冲液(200mM NaCl，50mM HEPES,pH 7.2)将纯化的光控DNA合成酶稀释至0.5mg/ml，临时置于冰盒中备用；
光控DNA合成酶反应预备溶液：用HEPES缓冲液配制含有浓度为1μM寡核苷酸引物(P1,Supporting Information Table 7)，0.1mM脱氧核糖核苷酸，0.25mM CoCl2的反应准备液。置于30℃金属浴中保存备用；
准备两个白色96孔酶标板，将其中一个白色96孔酶标板置于暗室摇床，将另一个白色96孔酶标板置于蓝光反应器上，用多孔道移液器先后向两个酶标板中分别加入90μL光控DNA合成酶反应预备溶液和10μL的光控DNA合成酶，并立即用多孔道移液器轻轻地多次(至少8次)吹吸混匀；以200rpm转速摇晃反应30min。反应结束后立刻放入95℃金属板上加热5min停止反应。检测光控DNA合成酶催化DNA合成的反应情况，比较蓝光光照和黑暗两种条件下光控DNA合成酶的反应速率。
(3)基于光控DNA合成酶的活性测试
使用焦磷酸荧光探针试剂盒进行光控DNA合成酶活性测试。用多孔道移液器向白色96孔酶标板加入50μL的反应后溶液，50μL的焦磷酸荧光探针溶液。于室温下孵育10分钟后，用Flex Station3多功能酶标仪在发光模式下读取波长436nm和波长545nm处光强值，连续监测2min，计算该时间段的平均发光值，并计算荧光强度在黑暗和蓝光状态下的比值。
由图5可见，有无蓝光照射下，光控DNA合成酶TdT-cpLov2(p200-21)的光强比值不同。其催化速率在黑暗和蓝光照射的情况下，反应速率差异可达到10.4倍。
SEQ ID NO.1：cpLOV2
TEHVRDAAEREGVMLIKKTAENIDEAAKELGGGSGGSGGGLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSREEILGRNCRFLQGPETDRATVRKIRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGDVQYFIGVQLDG
SEQ ID NO.2：TdT
MDRFKAPAVISQRKRQKGLHSPKLSCSYEIKFSNFVIFIMQRKMGLTRRMFLMELGRRKGFRVESELSDSVTHIVAENNSYLEVLDWLKGQAVGDSSRFELLDISWFTACMEAGRPVDSEVKYRLMEQSQSLPLNMPALEMPAFIATKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAASLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERYKAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGLLYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHDIDFLITNPGPREDDELLHKVIDLWKKQGLLLYCDIIESTFVKEQLPSRKVDAMDHFQKCFAILKLYQPRVDNSTCNTSEQLEMAEVKDWKAIRVDLVITPFEQYPYALLGWTGSRQFGRDLRRYAAHERKMILDNHGLYDRRKRIFLKAGSEEEIFAHLGLDYVEPWERNA
SEQ ID NO.3：TdT-cpLOV2(p200-21):
MDRFKAPAVISQRKRQKGLHSPKLSCSYEIKFSNFVIFIMQRKMGLTRRMFLMELGRRKGFRVESELSDSVTHIVAENNSYLEVLDWLKGQAVGDSSRFELLDISWFTACMEAGRPVDSEVKYRLMEQSQSLPLNMPALEMPAFIATKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAASLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERYKAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGLLYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHDIDFLITNPGPREDDELLHKVIDLWKKQGLLLYCDIIETEHVRDAAEREGVMLIKKTAENIDEAAKELGGGSGGSGGGLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSREEILGRNCRFLQGPETDRATVRKIRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGDVQYFIGVQLDGSTFVKEQLPSRKVDAMDHFQKCFAILKLYQPRVDNSTCNTSEQLEMAEVKDWKAIRVDLVITPFEQYPYALLGWTGSRQFGRDLRRYAAHERKMILDNHGLYDRRKRIFLKAGSEEEIFAHLGLDYVEPWERNA
综上所述，本发明提供的一种全遗传编码的光控DNA合成酶、核酸与应用，本发明通过光触可控酶催化反应的形式，构建了一种利用cpLOV2实现TdT酶活性受光学调控的光控DNA合成酶。本发明光控DNA合成酶能在不同光照条件下呈现出显著差异化的酶活性，实现催化活性的可逆光学调控，且具有催化效率高、稳定性高、可控性强的特点。本发明利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，改善了传统DNA合成酶合成可控性差、合成反应多步骤、依赖去保护过程的局限。相比于背景技术中的生物合成法，本发明利用光控DNA合成酶活性的光学控制技术，初步代替了传统的人工紫外或化学试剂去保护步骤，减少了反应步骤，提高了合成效率，同时降低了合成成本。为DNA合成酶的可控合成提供了变革性新策略。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种全遗传编码的光控DNA合成酶，其特征在于，所述光控DNA合成酶包括DNA合成酶和感光蛋白，所述感光蛋白嵌于所述DNA合成酶中，所述DNA合成酶为TdT酶，所述感光蛋白为cpLOV2；
所述光控DNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸含有编码权利要求1所述的全遗传编码的光控DNA合成酶的核苷酸序列。
3.一种权利要求1所述的全遗传编码的光控DNA合成酶催化DNA合成反应的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述光控DNA合成酶催化脱氧核苷酸重复添加到寡核苷酸、单链DNA和双链DNA的3'羟基端。
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