CN116286665A - 嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于增强T细胞应答的组合物和方法。一些实施方案涉及包含分离的核酸序列的细胞，所述分离的核酸序列包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码作为或包含的治疗剂IL‑12，IL‑2，IL‑6，IL‑7，IL‑15，IL‑17，IFN‑γ和IL‑23中的至少一种。细胞表达并分泌治疗剂。

Description

嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂

本发明专利申请是针对申请号：201910542560.2的分案申请，原申请的申请日为：2019-06-21，发明创造名称为：嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂。

技术领域

本公开涉及与嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂有关的组合物和方法，及其在治疗包括癌症在内的疾病中的用途。

背景技术

癌症被称为涉及异常细胞生长的恶性肿瘤，可能侵入或扩散到身体的其他部位。在人类中，有超过一百种类型的癌症。一个例子是发生在乳房上皮组织中的乳腺癌。由于乳腺癌细胞失去了正常细胞的特征，乳腺癌细胞之间的联系就会丧失。一旦癌细胞脱落，它们就会通过血液和/或淋巴系统扩散到整个身体，因此会危及生命。目前，乳腺癌已成为女性身心健康的常见威胁之一。尽管已经证明免疫疗法(例如，CAR T)对于治疗癌症是有效的，但是仍然需要改进免疫疗法以使其对某些癌症如实体瘤更有效。

发明内容

本发明所采用的技术方案如下：

实施方案涉及用于增强T细胞应答的组合物和方法。一些实施方案涉及包含分离的核酸序列的细胞，所述分离的核酸序列包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码包含治疗剂IL-12，IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17，IFN-γ和IL-23中的至少一种。细胞表达并分泌治疗剂。

本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也并非旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

所谓“约”是指数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度变化多达20,15,10,9,8,7,6,4,3,2或1％至参考数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度。

如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体，单克隆抗体，Fv，Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlowet al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密，非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(每个来自H和L链的3个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指存在于其天然存在的构象中的所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和DNA分子的表达以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术获得合成DNA。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括组织样本，肿瘤样本，细胞或生物流体的生物样本产生，合成或衍生抗原。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少，肿瘤细胞数量减少，转移瘤数量减少，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤细胞存活，具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过肽，多核苷酸，细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外源的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述源自受试者的材料，随后将其重新引入相同的受试者。

术语“同种异体”用于描述来源于相同物种的不同受试者的移植物。作为例子，供体受试者可以是相关或不相关或受体受试者，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。

术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”，“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述步骤或元件或步骤或元件组但不排除任何其他步骤或元素或一组步骤或元素。

短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何事物。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素。

短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰或有助于本公开中针对所列元素指定的活动或行动的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或者可能是“完整的”“或”核酸之间的“总”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

术语“对应”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸在肽或蛋白质中；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC，树突细胞，B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号之外的信号，其介导T细胞应答，包括增殖，激活，分化和其他中的至少一种细胞反应。共刺激配体可包括B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，PD-L1，PD-L2,4-1BBL，OX40L，诱导型共刺激配体(ICOS-L)，细胞间粘附分子(ICAM)，CD30L，CD40，CD70，CD83，HLA-G，MICA，MICB，HVEM，淋巴毒素β受体，3/TR6，ILT3，ILT4，HVEM，CD7的配体，结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子，BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为不良状况或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少特定的一组症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不及时治疗，疾病并不一定会导致动物的健康状况进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，具有任何定义的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)并且通常在序列表中提供，并且非编码链用作模板对于基因或cDNA的转录，可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源性”是指在野生型细胞或生物中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源性”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如以产生另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，并且由此有助于过表达编码的多肽。

术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。

术语“同源的”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个多肽中的每一个中的位置。DNA分子被腺嘌呤占据，然后分子在该位置同源。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以产生最大同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA，IgG，IgM，IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液，泪液，母乳，胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集，补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是免疫球蛋白，其没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。IgE是免疫球蛋白，其通过在暴露于过敏原时从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导即时超敏反应。

术语“分离的”是指基本上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常是正常序列中去除的DNA片段与片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境的体外分离和/或纯化，以及与其他组分细胞。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在某些实施方案中，细胞在体外培养。在某些实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息输送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV，SIV和FIV都是慢病毒的例子。来自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比，调节受试者中反应水平的可检测增加或减少，和/或与在其他方面相同但未经处理的主题中的回应。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤，癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌症，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如脑胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤))，胶质母细胞瘤(也是称为多形性胶质母细胞瘤)，星形细胞瘤，中枢神经系统淋巴瘤，生殖细胞瘤，髓母细胞瘤，神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，血管瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)，静脉内(iv)，肌内(im)，胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”，“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何人，动物或生物体。在某些非限制性实施方案中，患者，受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物如狗，猫，小鼠，大鼠及其转基因物种。

需要治疗或有此需要的受试者包括患有需要治疗的疾病，病症或病症的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病，病症或病症的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA，RNA，cRNA，rRNA，cDNA或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加，缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变，添加，缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及所有整数百分比之间，例如90％，95％或98％)序列同一性的多核苷酸在此描述。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直向同源物。

术语“多肽”，“多肽片段”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的酶促多肽或“酶”。

术语“多肽变体”是指通过添加，缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分的多肽。在某些实施方案中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域中熟知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基置换的多肽。

术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列特异性转录所需的细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”，或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体，蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于存在。特定结构(例如，抗原决定簇或表位)对化学物质的影响；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的重要度量包括p值，即如果零假设为真，观察事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.5或更小。“降低”或“减少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括减少约1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6 1.7,1.8,1.9,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40或50次或更多次(例如100,500,1000次)(包括1和在1以上的所有整数和小数，例如1.5,1.6,1.7.1.8等，这里描述的数量或水平。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激分子”是指特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体的T细胞上的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。

术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC，树突细胞，B细胞等)上时可以与同源结合配偶体特异性结合的配体(在本文中称为作为“刺激分子”)在细胞(例如T细胞)上的表达，从而介导T细胞的主要应答，包括激活，启动免疫应答，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽，抗CD3抗体，超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

术语“治疗剂”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制，缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态症状而获得。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员，兽医，医生或另一临床医生正在寻求的组织，系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物，疾病及其严重程度和年龄，体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括主要受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag，pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1，HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，基因env，vif，vpr，vpu和nef被删除，使得载体在生物学上是安全的。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

“嵌合抗原受体”(CAR)分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域，跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域。在实施方案中，CAR的结构域位于相同的多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在实施方案中，结构域位于不同的多肽链上，例如结构域不是连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域结合B细胞表面上的抗原，例如细胞表面分子或标记物。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169，CD1c，CD33，CD38，CD138，或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。在特定的实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

在实施方案中，抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如肿瘤相关MUC1，胶质瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，β-人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白(AFP)，凝集素反应性AFP，甲状腺球蛋白，RAGE-1，MN-CAIX，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2(AS)，肠道羧基酯酶，mut hsp70-2，M-CSF，前列腺素酶，前列腺特异性抗原(PSA)，PAP，NY-ESO-1，LAGE-1a，p53，prostein，PSMA，Her2/neu，存活，端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)，MAGE，ELF2M，中性粒细胞弹性蛋白酶，ephrinB2，CD22，胰岛素生长因子(IGF)-I，IGF-II，IGF-I受体和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以称为CD19CAR。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一种scFv或至少一种单结构域抗体。例如，CAR上可以有两个scFv。scFv包括轻链可变区(VL)和通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的重链可变区(VH)。单链可变区片段可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备(Bird等，Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：20)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头(Bird等，Science242:423-426,198)。通常，接头可以是短的，柔性的多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞，真核细胞，如酵母，植物，昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞，如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号结构域衍生自主要信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7的细胞内结构域，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自T细胞受体的CD3-ζ结构域。

在实施方案中，CAR的细胞质结构域仅包括一个或多个刺激结构域而没有信号传导结构域。

CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在细胞外结构域和CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

受试者中的淋巴细胞或T细胞应答是指与辅助细胞，杀伤细胞，调节细胞和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中辅助其他WBC以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的许多病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞，T细胞在与病毒感染的细胞共培养时释放的细胞因子的量和/或或肿瘤细胞，受试者中T细胞的增殖水平，T细胞的表型变化，例如记忆T细胞的变化，以及受试者中T细胞的水平寿命或寿命。

在实施方案中，增强T细胞应答的方法治疗有此需要的受试者，例如，诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指块状肿瘤，其可以是液体肿瘤的集合，例如血液或固体物质。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血癌的实例包括慢性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。

实体瘤通常不含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌。肉瘤是在称为间充质细胞的软组织细胞中发展的肿瘤，其可以在血管，骨，脂肪组织，韧带淋巴管，神经，软骨，肌肉，韧带或肌腱中发现，而癌是在上皮细胞中形成的肿瘤，在皮肤和粘膜中发现。最常见的肉瘤类型包括未分化的多形性肉瘤，其涉及软组织和骨细胞；平滑肌肉瘤，包括排列血管，胃肠道和子宫的平滑肌细胞；涉及骨细胞的骨肉瘤和涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的一些实例包括尤文肉瘤，横纹肌肉瘤，软骨肉瘤，间皮瘤，纤维肉瘤，纤维肉瘤和神经胶质瘤。

五种最常见的癌包括肾上腺癌，其涉及产生液体或粘液的器官，例如乳房和前列腺；基底细胞癌，包括皮肤最外层的细胞，例如皮肤癌；鳞状细胞癌，涉及皮肤基底细胞；和影响泌尿道过渡细胞的移行细胞癌，包括膀胱，肾和输尿管。癌的实例包括甲状腺癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肠癌，皮肤癌，胰腺癌，肝癌，肾癌和膀胱癌，以及胆管癌。

本文描述的方法可用于治疗诊断患有癌症的受试者。癌症可以是血癌或可以是实体瘤，例如肉瘤或癌。治疗方法包括向受试者施用包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的有效量的T细胞以提供T细胞应答，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合不同于WBC的细胞表面分子的抗原。在实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性增强体内表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的T细胞的增殖。

本文描述的实施方案涉及用于制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少CAR的DNA转染细胞样品，并在选择性增强CAR表达T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。

在实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，通过单采血液成分术或静脉穿刺术获得细胞样品。在实施方案中，细胞样品是T细胞的亚群。

一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17和IL-23的组合物。在一些实施方案中，治疗剂是或包含Eome，TRAF6，IL12，IL2，IL18，IL23，AQP9，Runx3，AMPK或BCL-2。

一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，不同的趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子或膜受体抗体-其结合形式可以和D28家族的配体对应于表7中的序列。TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子受体抗体或膜结合其形式，或D28家族的配体。例如，TNFRSF超家族成员受体可包括肿瘤坏死因子受体1，肿瘤坏死因子受体2，淋巴毒素β受体，淋巴毒素β受体，CD40，Fas受体，诱饵受体3，CD27，CD30,4-1BB，死亡受体4，死亡受体5，诱饵受体1，诱饵受体2，RANK，骨保护素，TWEAK受体，TACI，BAFF受体，疱疹病毒进入介质，神经生长因子受体，B细胞成熟抗原，糖皮质激素诱导的TNFR相关，TROY，死亡受体6，死亡受体3，Ectodysplasin A2受体等

在一些实施方案中，治疗剂是或包括抗体试剂(例如，单链抗体(例如，scFv)，单结构域抗体(例如，骆驼抗体)，或双特异性抗体试剂(例如，双特异性T细胞)。在其他实施方案中，治疗剂是或包括细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，MIP-1n，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子可包括促炎细胞因子，例如：IFN-γ，IL-15，IL-4，TNFα，IL-8，IL-5，IL-6，GM-CSF和MIP-1α。例如，IFN-γ已被FDA批准治疗患有恶性骨质疏松症的患者(例如，Journal of Pediatrics 121(1)：119-24·1992年8月)。

一些实施方案涉及包含核酸序列和另外的核酸序列的CAR细胞群，其中CAR细胞包含淋巴细胞，白细胞或PBMC。在一些实施方案中，CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。在一些实施方案中，多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。在一些实施方案中，CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于CAR的抗原结合的另外的CAR，或结合实体肿瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在实施方案中，治疗剂或其变体可以重组或合成产生。对于治疗剂的合成生产，可以使用自动合成仪。为了重组产生治疗剂，可以将含有编码治疗剂的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞，真核细胞，如酵母，植物，昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞，如大肠杆菌。编码目标治疗剂的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得治疗剂。

一些实施方案涉及包含CAR细胞群的药物组合物。一些实施方案涉及在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物。

一些实施方案涉及包含一种或多种CAR的修饰细胞，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂，所述治疗剂是IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17和IL-23中的至少一种或包含IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17和IL-23中的至少一种。在一些实施方案中，将细胞工程化以表达治疗剂，所述治疗剂与修饰细胞的膜结合。

一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含一种或多种CAR的T细胞组合物，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌作为或包含IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17和IL-23中的至少一种的治疗剂，并且与给予不表达或分泌治疗剂的T细胞。

一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物；施用有效量的治疗剂，所述治疗剂是或包含IL-2，IL-6，IL-7，IL-15，IL-17和IL-23中的至少一种，其中T细胞应答增强为与不施用治疗剂的CAR T细胞的施用相比。在一些实施方案中，施用有效量的治疗剂包括静脉内递送一定量的人IL-6，其范围为约0.5-50μg/千克体重。在一些实施方案中，治疗剂是IL-6或IL-7。

在一些实施方案中，该方法可以进一步包括监测受试者的组织或血液中治疗剂的浓度；如果受试者的浓度和/或其他参数不在期望的条件下，则施用治疗剂或治疗剂的受体拮抗剂(例如，抗体)。例如，参数可以包括体温水平，CRS水平和神经毒性水平等。

在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统，其增加或激活治疗剂或其组合的表达。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统。例如，四环素控制的转录激活是诱导型基因表达的方法，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)的存在下可逆地打开或关闭转录。在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节和/或修饰的细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。例如，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型caspase-9系统。

在一些实施方案中，T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在一些实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR，B细胞抗原是CD19，CD20，CD22或BCMA。

在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。

在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III，人表皮生长因子受体2(HER2)，间皮素(MSLN)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)，二唾液酸神经节苷脂2(GD2)，白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，碳酸酐酶IX(CAIX)，L1细胞粘附分子(L1-CAM)，癌抗原125(CA125)，分化簇133(CD133)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)，粘蛋白1(MUC1)，叶酸受体-α(FR-α)，CD19，FZD10，TSHR，PRLR，Muc 17，GUCY2C，CD207，CD3，CD5，B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

在一些实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1突变体，使得细胞的PD-1/PD1-1信号传导途径受到干扰。

在一些实施方案中，治疗剂在重组DNA构建体，mRNA或病毒载体中存在于修饰的细胞中。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码治疗剂的治疗剂mRNA，并且mRNA未整合到修饰的细胞的基因组中。在一些实施方案中，可以将治疗剂mRNA引入(例如，电穿孔)到修饰的细胞中，使得治疗剂的表达和/或分泌是短暂的。可以注射合成mRNA以实现瞬时基因表达。例如，由mRNA提供的治疗剂是短暂的，使得治疗剂的释放是可控的，尤其是对于促炎细胞因子，例如：IFN-γ，IL-4，TNFα，IL-8，IL-5，IL-6，GM-CSF和MIP-1α。

在一些实施方案中，修饰的细胞包含核酸序列，其包含或分离的核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节细胞中治疗剂表达的转录调节剂(例如转录因子)的结合位点。表7中提供了核酸序列或分离的核酸序列的实例可以将这些构建体正向或反向置于载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方案中，转录调节剂是或包括Hif1a，NFAT，FOXP3和/或NFkB。在一些实施方案中，启动子对转录调节剂有响应。在一些实施方案中，启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动治疗剂在细胞中的表达。在一些实施方案中，将治疗剂连接至特定启动子，以诱导治疗剂在所需条件下表达。启动子分为两部分，一个含有转录因子结合位点的特定调节区，加上一个最小启动子。在一些实施方案中，启动子和结合位点对应于表7中列出的序列关于NFAT的更多信息可以在WO2018006882中找到，其在此引入作为参考。

一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。例如，治疗剂是IL-15或IL-12，或其组合。一些实施方案涉及包含核酸序列和另外的核酸序列的CAR细胞群，其中CAR细胞包含淋巴细胞，白细胞或PBMC。在实施方案中，一些实施方案的CAR细胞群，其中CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。在实施方案中，多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。在实施方案中，CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于CAR的抗原结合的另外的CAR，或结合实体肿瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。一些实施方案涉及包含CAR细胞群的药物组合物。一些实施方案涉及在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的一些实施方案的组合物。在实施方案中，CAR细胞，修饰的细胞，细胞是T细胞，NK细胞，巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞，修饰细胞，细胞是T细胞。

在实施方案中，另外的核酸序列包含编码IL6的第一核酸序列和编码IFN-γ的第二核酸序列，并且第一核酸序列和第二核酸序列通过IRES元件或第三核酸连接。编码2A肽的序列。在实施方案中，另外的核酸序列是或包含SEQ ID NO：21或22的核酸序列，或其组合。在实施方案中，通过条件表达系统调节另外的核酸序列的表达，使得治疗剂响应于靶抗原的结合而表达。在实施方案中，另外的核酸序列的表达受SynNotch多肽的调节。

一些实施方案涉及与如上所述的小蛋白质(例如细胞因子)相关的FC融合蛋白。在实施方案中，治疗剂可包含FC融合蛋白。例如，细胞因子如IL-15，IFN-γ或IL-6可以与一个或多个免疫球蛋白Fc结构域连接。在实施方案中，Fc结构域独立地折叠并且可以在体外和体内改善小蛋白质的溶解度和稳定性。在实施方案中，Fc区允许在制造期间通过蛋白-G/A亲和层析容易地进行成本有效的纯化。在实施方案中，可以修饰FC融合蛋白以聚合成含有多种小蛋白质的明确定义的复合物。在实施方案中，融合蛋白可以由修饰的细胞(例如，CART细胞)表达和分泌，其用于治疗患有癌症和/或其他疾病的受试者。在实施方案中，融合蛋白的施用可以与表达和分泌融合蛋白的CAR T细胞的处理组合。例如，用于增强T细胞应答和/或治疗患有癌症或其他疾病的受试者的方法可以包括向受试者施用与小蛋白质(例如，IFN-γ)相关的融合蛋白并施用有效量的组合物包含CAR并表达以及将与小蛋白质相关的融合蛋白分泌到受试者中的T细胞群体。在实施方案中，融合蛋白的施用可以在CAR T治疗的早期阶段(例如，在输注CAR T细胞后1,2,3,4,5或6天)增强CAR T细胞的扩增)。例如，融合蛋白可以在输注CAR T细胞后1,2,3,4,5或6天施用于受试者。在实施方案中，该方法可以包括向受试者施用与小蛋白质(例如，IFN-γ)相关的融合蛋白，并施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物，而不表达或分泌融合蛋白。与受试者的小蛋白质相关。例如，融合蛋白可以在预定时间内施用于受试者。关于FC融合蛋白的更多信息可以在J Immunol 2004，172：2925-2934和EMBO Mol Med2012，4(10):1015-1028中找到。其通过引用并入。关于施用治疗剂(例如细胞因子)的更多信息可以在J Interferon Cytokine Res 2019,39(1):6-21，其通过引用并入。

一些实施方案涉及包含一种或多种CAR的修饰细胞，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含一种或多种CAR的T细胞组合物，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。在实施方案中，治疗剂是与IL-6或IFN-γ相关的小蛋白质。例如，向受试者施用IL-15可以使患者血液中IL-6和IFN-γ的浓度增加至多50倍。一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物；并施用有效量的治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。在实施方案中，CAR细胞，修饰的细胞，细胞是T细胞，NK细胞，巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞，修饰细胞，细胞是T细胞。一些实施方案涉及增强T细胞应答和/或治疗患有癌症或其他疾病的受试者的方法，其可包括向受试者施用治疗剂(例如，重组或天然IFN-γ)并施用有效量的组合物包含CAR并表达以及将治疗剂分泌到受试者的T细胞群体中的一种。在实施方案中，治疗剂的施用可以在CAR T治疗的早期阶段(例如，在输注CART细胞后1,2,3,4,5或6天)增强CAR T细胞的扩增)。例如，可以在输注CAR T细胞后1,2,3,4,5或6天将治疗剂施用于受试者。在实施方案中，该方法可以包括向受试者施用治疗剂和施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物，而不向受试者表达或分泌治疗剂。例如，可以将治疗剂施用到受试者中预定的时间。在实施方案中，可以修饰治疗剂，使得可以增强治疗剂的生物学和/或药理学性质。例如，可以将杂合FC融合技术实施为治疗剂的活性成分的溶解度和/或稳定性。

在实施方案中，治疗剂可以是分离的天然或重组人细胞因子。例如，重组人IL-15可以每天推注输注施用3mcg/kg/天和1mcg/kg/天的预定时间。重组人IFN-γ可以每天2百万单位的剂量在预定时间内每周给药5天。在实施方案中，施用有效量的治疗剂包括施用有效量的治疗剂，使得受试者的血液中IL-6和/或IFN-γ的浓度可以增加5-1000倍(例如，50次)。例如，治疗剂包含IL-15。

在实施方案中，与施用不表达或分泌治疗剂的T细胞相比，T细胞应答增强，或者与施用不施用治疗剂的CAR T细胞相比，T细胞应答增强。

在实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌由诱导型表达系统调节和/或修饰的细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。在实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统。在实施方案中，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型半胱天冬酶-9系统。

在实施方案中，受试者血液中IL-6的浓度值范围为60至5000pg/mL，200-5000pg/mL或2000-5000pg/mL。在实施方案中，受试者血液中IFN-γ的浓度范围为20至5000pg/mL，200至5000pg/mL，或500至5000pg/mL。在实施方案中，施用有效量的治疗剂包括静脉内递送一定量的人IL-6，其范围为约0.5-50μg/千克体重。在实施方案中，修饰的细胞可以表达治疗剂，使得受试者的血液中IL-6和/或IFN-γ的浓度可以增加5-1000倍(例如，50倍)。例如，治疗剂包含IL-15。有关IFN-γ临床用途的更多详细信息可在Cancer Med 2018,7：4509-4516中找到,其通过引用并入。

在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR和B细胞抗原是CD19，CD20，CD22或BCMA。

在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1。在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含缺乏功能性PD-1细胞内结构域的修饰的PD-1。

在实施方案中，CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。在实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关的共刺激分子的细胞内结构域。抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其组合。在实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III，人表皮生长因子受体2(HER2)，间皮素(MSLN)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)，二唾液酸神经节苷脂2(GD2)，白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，碳酸酐酶IX(CAIX)，L1细胞粘附分子(L1-CAM)，癌抗原125(CA125)，分化簇133(CD133)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)，粘蛋白1(MUC1)，叶酸受体-α(FR-α)，CD19，FZD10，TSHR，PRLR，Muc 17，GUCY2C，CD207，CD3，CD5，B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

在实施方案中，治疗剂在重组DNA构建体，mRNA或病毒载体中存在于修饰的细胞中。在实施方案中，修饰的细胞包含编码治疗剂的治疗剂mRNA，并且mRNA未整合到修饰的细胞的基因组中。在实施方案中，修饰的细胞包含核酸序列，所述核酸序列包含或包含分离的核酸序列，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包括Hif1a，NFAT，FOXP3和/或NFkB。在实施方案中，启动子对转录调节剂有响应。在实施方案中，启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动治疗剂在细胞中的表达和/或分泌。在实施方案中，启动子包含SEQ ID Nos：23-26中的至少一个。

在实施方案中，CAR细胞，修饰的细胞，细胞是T细胞，NK细胞，巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞，修饰细胞，细胞是T细胞。

本文描述的实施方案还涉及修饰的T细胞包含CAR，其中所述T细胞包含一个核酸序列，该核酸序列包含串联的编码IL-6的核酸序列和编码IFN-γ的核酸序列，所述T细胞经工程化改造当T细胞被激活时以表达和分泌IL-6和INF-γ，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。

在实施方案中，该修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱。在此，选择某些细胞因子(例如IL-6和INF-γ)在T细胞中表达或过表达。这些细胞因子至少不会削弱抑制肿瘤细胞的杀伤功能和/或能力。因为并非所有细胞因子都可以由T细胞表达和分泌而不减少它们杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤生长的功能。报告显示某些细胞因子的肿瘤促进作用。例如，TAM产生的IL-10可以通过抑制APC的功能并随后阻断T细胞效应子功能如细胞毒性来减弱抗肿瘤反应(Mannino，MH，Zhu，Z.，Xiao，H.，Bai，Q.，Wakefield，MR,Fang，Y.,Cancer Lett.2015Oct 28；367(2):103-7)。小鼠肿瘤模型的研究表明IL-10可抑制肿瘤浸润性DC成熟及其产生IL-12以刺激Th1细胞，除非IL-10信号传导是同时阻断(Vicari AP,Chiodoni C,Vaure C,Ait-Yahia S,Dercamp C,Matsos F,Reynard O,Taverne C,Merle P,Colombo MP,O’Garra A,Trinchieri G,Caux C.J ExpMed.2002；196:541–549.。通过CpG免疫刺激性寡核苷酸和抗白细胞介素10受体抗体逆转肿瘤诱导的树突细胞麻痹(J.Exp.Med.196,541-549)。再例如，研究表明，TGF-β可能是T细胞增殖的有效抑制剂(Kehrl JH,Wakefield LM,Roberts AB,Jakowlew S,Alvarez-Mon M,Derynck R,Sporn MB,Fauci AS.Production of transforming growth factor beta byhuman T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cellgrowth.J Exp Med.1986May 1；163(5):1037–1050)。几种机制驱动TGF-β介导的T细胞增殖抑制，包括抑制IL-2产生，下调c-myc和上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Li MO，WanYY，Sanjabi S，Robertson AK，Flavell,Transforming growth factor-beta regulationof immune responses,Annu Rev Immunol.2006；24:99-146)。在某些情况下，TGF-β在促进细胞死亡以限制激活后T细胞扩增中也起重要作用(Mark A.TravisandDean Sheppard，TGF-βActivation and Function in Immunity，Annu.Rev.Immunol.2014，32：51-82)。趋化因子是一大类细胞因子，可指导正常的白细胞迁移。它们还涉及白细胞发育和许多疾病的发病机理。此外，一些趋化因子浓度梯度在结内T细胞迁移中起重要作用。这些趋化因子的过度表达会破坏T细胞的迁移，从而削弱实体瘤的CAR T细胞治疗。如果没有适当的迁移，T细胞可能无法到达肿瘤细胞。例如，据报道趋化因子CCL21的过表达会破坏T细胞迁移(Christopherson KW and,Campbell JJ,Hromas RA.Transgenic overexpression of theCC chemokine CCL21 disrupts T-cell migration.Blood.2001Dec 15；98(13):3562-8)。因此，在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括CCL21,IL-10和/或TGF-β。在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括IL-10和/或TGF-β。在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括TGF-β。

在实施方案中，所述修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱。

在实施方案中，所述修饰T细胞不表达和/或分泌IL-10和/或TGF-β。

在实施方案中，所述CAR结合实体瘤抗原。某些细胞因子可在T细胞中过表达或表达，以增强CAR T疗法治疗肿瘤。然而，一些细胞因子(例如IL-6)不能在T细胞中过表达或表达以治疗血肿瘤。IL-6是导致CAR T治疗血液肿瘤如ALL和NHL的严重CRS的主要因素。因此，IL-6可在T细胞中过表达或表达以治疗实体瘤，因为很少有报道显示CART治疗实体瘤的严重CRS。

在实施方案中，所述修饰T细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。

在实施方案中，所述CAR结合tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR。在实施方案中，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区，这个传导区包含共刺激分子的胞内结构域，分子选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其组合。在实施方案中，所述抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1。，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR。

在实施方案中，所述核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节所述转录调节剂的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。在实施方案中，所述转录调节剂是或包含Hif1a，NFAT，FOXP3或NFkB。在实施方案中，所述启动子对转录调节剂有响应。在实施方案中，所述启动子与该核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述T细胞中IL-6和INF-γ的表达和/或分泌。在实施方案中，所述启动子包含SEQ ID Nos：23-26中的至少一种。

在实施方案中，所述含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列，和SEQ ID NO：27，使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。

在实施方案中，所述CAR，IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR，IL-6和INF-γ，并且在CAR，IL-6和INF-γ之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。

进一步，本文描述的实施方案涉及组合物在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含上述的修饰细胞。通过参考以下示例性实施例和示例来进一步描述本公开。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的，并非旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1显示了表达各种蛋白质的T细胞的流式细胞术测定结果。

图2显示了表达各种蛋白质的T细胞的拷贝数。

图3显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-6释放。

图4显示响应于与nalm6细胞的共培养的IL-6释放。

图5显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IFN-γ(即IFNg)释放。

图6显示响应于与nalm6细胞共培养的IFN-γ释放。

图7显示了对CAR T细胞的毒性测定。

图8和9显示响应于与nalm6细胞共培养的其他IFN-γ释放。

图10和11显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-12和IFN-γ释放。

图12和13显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-6和IFN-γ释放。

图14显示了CAR和治疗剂的结构的示意性实例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下是示例性实施例：

1.一种分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码包含IL-6或IFN-γ或其组合的治疗剂。

2.一种CAR细胞群，其包含实施方案1的核酸序列和另外的核酸序列，其中CAR细胞包含淋巴细胞，白细胞或PBMC。

3.实施方案2的CAR细胞群，其中CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。

4.实施方案2-3之一的CAR细胞群，其中所述多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。

5.实施方案2-4之一的CAR细胞群，其中CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与抗原结合的另外的CAR，其不同于CAR结合的抗原，或另外的CAR结合实体瘤抗原，CAR结合白细胞的抗原。

6.药物组合物，其包含实施方案2-5之一的CAR细胞群。

7.一种在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的实施方案6的组合物。

8.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物或实施方案1-7之一的方法，其中所述另外的核酸序列包含编码IL-6的第一核酸序列和编码第二核酸序列的第二核酸序列。IFN-γ和第一核酸序列和第二核酸序列通过IRES元件或编码2A肽的第三核酸序列连接。

9.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物或实施方案1-8之一的方法，其中所述另外的核酸序列是或包含SEQ ID NO：21或22的核酸序列或其组合。

10.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物或实施方案1-9之一的方法，其中通过条件表达系统调节另外的核酸序列的表达，使得治疗剂是响应于靶抗原的结合而表达，或者另外的核酸序列的表达受SynNotch多肽的调节。

11.一种经修饰的细胞，其被工程化以表达和分泌作为或包含IL-6或IFN-γ或其组合的治疗剂。

12.如实施例11所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含一种或多种CAR。

13.一种引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，所述方法包括：施用有效量的包含一种或多种CAR的T细胞组合物，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌作为IL-6或IFN-γ或包含IL-6或IFN-γ或其组合的治疗剂。

14.一种引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：给予有效量的包含CAR的T细胞群的组合物；施用有效量的IL-6或IFN-γ或其组合的治疗剂或其组合。

15.实施方案7,13和14之一的修饰细胞或方法，其中与施用不表达或分泌治疗剂的T细胞相比，T细胞应答增强，或与不给予治疗剂的CAR T细胞的给药相比T细胞应答增强。

16.实施方案11-15之一的修饰细胞或方法，其中治疗剂的表达和/或分泌受诱导型表达系统调节和/或修饰细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。

17.实施方案11-15之一的修饰细胞或方法，其中IL-6的血液中IL-6的浓度值范围为60-5000pg/mL，200-5000pg/mL或2000-5000pg/mL。

18.实施方案11-15之一的修饰细胞或方法，其中血液中IFN-γ的浓度范围为20至5000pg/mL，200至5000pg/mL或500至5000pg/mL。

19.实施方案11-18之一的经修饰的细胞或方法，其中施用有效量的治疗剂包括静脉内递送量为约0.5-50ug/kg体重的人IL-6。

20.实施方案11-19之一的修饰细胞或方法，其中修饰的细胞或T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。

21.实施方案20的修饰细胞或方法，其中实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，Mesothelin，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR，B细胞抗原是CD19，CD20，CD22或BCMA。

22.实施方案11-21之一的修饰的细胞或方法，其中修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1。

22.实施方案11-21之一的修饰细胞或方法，其中修饰的细胞或T细胞包含缺乏功能性PD-1细胞内结构域的修饰的PD-1。

23.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-23之一的方法，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。

24.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-23之一的方法，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含共刺激分子的细胞内结构域。选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，及其组合。

25.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-24之一的方法，其中所述抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长的变体III，因子受体(EGFRvIII)，人表皮生长因子受体2(HER2)，间皮素(MSLN)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)，二唾液酸神经节苷脂2(GD2)，白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)，磷脂蛋白-3(GPC3)，碳酸酐酶IX(CAIX)，L1细胞粘附分子(L1-CAM)，癌抗原125(CA125)，分化簇133(CD133)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)，粘蛋白1(MUC1)，叶酸受体-α(FR-α)，CD19，FZD10，TSHR，PRLR，Muc17，GUCY2C，CD207，CD3，CD5，B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

26.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-25之一的方法，其中治疗剂以重组DNA构建体存在于修饰的细胞中，mRNA，或病毒载体。

27.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-26之一的方法，其中修饰的细胞包含编码治疗剂的治疗剂mRNA，并且mRNA是没有整合到修饰细胞的基因组中。

28.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案1-27之一的方法，其中所述修饰的细胞包含核酸序列，所述核酸序列包含或分离的核酸序列包含包含转录调节剂结合位点的启动子，其调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。

29.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞或实施方案28的方法，其中转录调节剂是或包括Hif1a，NFAT，FOXP3和/或NFkB。

30.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞或实施方案28的方法，其中所述启动子对转录调节剂有反应。

31.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞或实施方案28的方法，其中所述启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动表达和/或在细胞中分泌治疗剂。

32.分离的核酸序列，CAR细胞群，药物组合物，修饰的细胞，或实施方案28-31之一的方法，其中所述启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一个。

33.包含编码IL-6和IFN-γ的核酸序列的修饰细胞，IL-6和IFN-γ的表达由转录调节剂NFAT调节。

34.实施例33的修饰细胞，其中修饰的细胞是NK，T或巨噬细胞。

35.实施例34的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含CAR，遗传修饰的TCR或靶向肿瘤细胞的选定TCR。

34.实施例33的修饰细胞，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：28和编码SEQ IDNO：21和22的核酸序列。

35.修饰的细胞包含CAR，其中所述细胞经工程化改造以表达和分泌一种治疗剂，所述细胞包含编码这种治疗剂作的核酸序列，该核酸序列包含。这种治疗剂作为或包含IL-6或IFN-γ或其组合，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。

36.实施例35的修饰细胞，其中所述治疗剂包含IL-6和IFN-γ，或所述修饰细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。

37.实施例35和36之一的修饰细胞，其中CAR结合tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR，B细胞抗原是CD19，CD20，CD22或BCMA。

38.实施例35-37之一的修饰细胞，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区，这个传导区包含共刺激分子的胞内结构域，分子选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其组合。

39.实施例35-38之一的修饰细胞，其中所述抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III，人表皮生长因子受体2(HER2)，间皮素(MSLN)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)，二唾液酸神经节苷脂2(GD2)，白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，碳酸酐酶IX(CAIX)，L1细胞粘附分子(L1-CAM)，癌抗原125(CA125)，分化簇133(CD133)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)，粘蛋白1(MUC1)，叶酸受体-α(FR-α)，CD19，FZD10，TSHR，PRLR，Muc17，GUCY2C，CD207，CD3，CD5，B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

40.实施例35-39之一的修饰细胞，其中治疗剂存在于修饰细胞中，重组DNA构建体中，mRNA中或病毒载体中。

41.实施例35-40之一的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含核酸序列，所述核酸序列或所述分离的核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节所述转录调节剂的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。

42.实施例41的修饰细胞，其中转录调节剂是或包含Hif1a，NFAT，FOXP3或NFkB。

43实施例41的修饰细胞，其中启动子对转录调节剂有响应。

44.实施例41的修饰细胞，其中所述启动子与编码所述治疗剂的核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述细胞中治疗剂的表达和/或分泌。

45.实施例7的修饰细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一种。

46.实施例35-45之一的修饰细胞，其中修饰的细胞是修饰的T细胞，其包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列，和SEQ ID NO：27，使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。

47.实施例47的修饰细胞，其中CAR和治疗剂以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子，并且在CAR和治疗剂之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。

48.组合物在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含实施例35-47的修饰细胞。

49.实施例48的组合物，该组合物用于下列的一种或多种的药剂中的用途：刺激对人中靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答，提供人中抗肿瘤免疫，治疗患有癌症的人，制备用于在诊断患有癌症的人中产生基因工程改造的T细胞的持续群的药剂，和在诊断患有癌症的人中扩展包括子代T细胞群的基因工程改造的T细胞群。

50.实施例48的组合物，所述修饰细胞包括T细胞的持续群包括记忆T细胞，该T细胞的持续群在施用后，在所述人中持续至少三个。

51.组合物，其包含修饰的T细胞，该T细胞包含CAR，其中所述T细胞包含一个核酸序列，该核酸序列包含(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列，所述T细胞经工程化改造，当T细胞被激活时以表达和分泌IL-6和或INF-γ，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原，所述CAR结合实体瘤抗原。

52.实施例51的组合物，其中所述修饰T细胞包含串联的(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。

53.实施例51的组合物，其中所述修饰T细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。

54.实施例51-53之一的组合物，其中CAR结合tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR。

55.实施例51-54之一的组合物，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区，这个传导区包含共刺激分子的胞内结构域，分子选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其组合和或，所述抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR。

56.实施例51-55之一的组合物，其中所述核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节所述转录调节剂的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。

57.实施例56的组合物，其中转录调节剂是或包含Hif1a，NFAT，FOXP3或NFkB。

58.实施例56的组合物，其中启动子对转录调节剂有响应。

59.实施例56的组合物，其中所述启动子与该核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述T细胞中IL6和INFγ的表达和/或分泌。

60.实施例56的组合物，其中所述启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一种。

61.实施例51-60之一的组合物，其包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列，和SEQID NO：27，使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。

62.实施例61的组合物，其中CAR，IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR，IL-6和INF-γ，并且在CAR，IL-6和INF-γ之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。

63.实施例51-62之一的组合物，其中该修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱，该修饰T细胞不表达和/或分泌TGF-β。

64.组合物在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含实施例51-63的修饰细胞。

65.实施例51-64之一的组合物，该组合物是药物组合物，其药物组合物包括抗肿瘤有效量的修饰T细胞，其中所述抗肿瘤有效量优选地是需要这类细胞的人的每kg体重10⁴至10⁹或10⁵至10⁶个细胞。

66.实施例65的组合物，其中该药物组合物进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

67.实施例65的组合物，其中该药物组合物进一步包括缓冲液。

68.实施例67的组合物，其中所述缓冲液是中性缓冲盐水或硫酸盐缓冲盐水。

69.实施例65的组合物，其中该药物组合物进一步包括碳水化合物。

70.实施例69的组合物，其中所述碳水化合物选自葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇。

71.实施例85的组合物，其中该药物组合物进一步包括可注入的冷冻培养基。

72.实施例71的组合物，其中所述可注入的冷冻培养基包括plasmalyte-A、右旋糖、NaCl、DMSO、葡聚糖和人血清白蛋白。

73.实施例51-72之一的组合物，该组合物用于下列的一种或多种的药剂中的用途：刺激对人中靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答，提供人中抗肿瘤免疫，治疗患有癌症的人，制备用于在诊断患有癌症的人中产生基因工程改造的T细胞的持续群的药剂，和在诊断患有癌症的人中扩展包括子代T细胞群的基因工程改造的T细胞群。

例子

表达嵌合受体的细胞在复发/难治性急性淋巴细胞白血病患者中建立抗肿瘤作用

该临床试验设计用于评估改良用于表达CD19特异性CAR/4-1BB/CD3-ζ或CD19特异性CAR/4-1BB/CD3-ζ的自体T细胞的安全性和有效性。注入标准如下：1)年龄小于60岁；2)复发或难治CD19+ALL；3)复发性同种异体HSCT无移植物抗宿主病(GVHD)证据，无需免疫抑制治疗；和4)可测量的疾病和足够表现状态和器官功能。该方案由机构评估委员会医学院第一附属医院批准。所有患者均提供书面知情同意书。

CD19特异性的单链片段变量(scFv)序列衍生自Clone FMC63(参见Zola H.等人，Immunol Cell Biol 1991；69：411-22)。产生4-1BB共刺激结构域，CD3-ζ信号转导域和铰链和跨膜结构域。将携带抗CD19 scFv(SEQ ID：6)和人4-1BB和CD3-ζ信号转导域的CART19-4-1BB载体如前所述克隆入慢病毒骨架(参见Hu Y.Journal of Hematology&Oncology 2016；9：70)。抗CD19 scFv和人4-1BB和CD3-ζ信号转导域的PD-1/CART19-4-1BB载体克隆入慢病毒主链。

用CART19-4-1BB载体和病毒包装质粒转染293T细胞产生慢病毒，其在-80℃下冷冻并在转导前立即解冻。收获慢病毒上清液。如所述(参见Kalos M.等人，Sci Transl Med2011；3：95ra73)，分离和激活CD3+T细胞。然后将细胞在含有100U/mL白细胞介素-2(IL-2)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中培养，并在24小时内以5:1至10:1的高感染复数(MOI)用慢病毒上清液转导-48小时。获得CAR转导的T细胞(CD19-CART细胞，之后为“CART19”)，培养11天。给药前3天，取代新鲜培养基。之后，不进行对细胞的操作，直到运输输液。通过流式细胞术(FACS)在慢病毒转导后第5-7天评估转导效率。使用以下抗人抗体：抗hCD45APC(BDBioscience)，抗hCD3 FITC(BD Bioscience)，特异于F(ab')2片段的生物素标记的山羊抗小鼠IgG(Jackson免疫研究，Cat#115-065-072)和PE抗生蛋白链菌素(BD Bioscience)。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)进行数据采集。在CART19s输注之前，对每个患者进行CART19s的转导效率和体外细胞毒性测定的FACS分析。另外，CART19培养物被检查两次可能的真菌，细菌，支原体，衣原体和内毒素的污染。

在第8天，为CART19s制备，外周血单核细胞(PBMC)用白细胞分离术从患者获得。第一天CART19s输注设定为第0天。给患者进行淋巴细胞清除的调理治疗。基于氟达拉滨和环磷酰胺的调理治疗根据骨髓(BM)和外周血(PB)中的肿瘤负荷而变化。CART19s在连续3天的时间内以不断增加的剂量，直接输入患者无需任何术前用药法。每天将CART19s运送到医院，洗涤，计数，检查活力，然后准备给予患者，然后密切观察至少2小时。CRS根据修订的分级系统分级(参见Lee DW等人，Blood 2014；124：188-95)。治疗期间和之后的其他毒性根据美国国家卫生研究院不良事件版本4.0常用术语标准(http://ctep.cancer.gov/)进行评估。通过流式细胞术和形态学分析评估治疗反应。如果可能，通过嵌合基因表达水平评估患者。响应类型定义为补充材料中描述的最小残留病(MRD)阴性，完全应答，完全反应，不完全计数恢复，疾病稳定和进行性疾病。

将CART19s输注后的系列BM和PB样品收集在K2EDTA BD真空管(BD)中。通过FACS确定来自新鲜PB和BM患者的CART19s的持续性。基于测量的绝对CD3+T淋巴细胞计数计算每μl循环CART19数。同时，CAR DNA拷贝被评估为确定CART19s扩增和持久性的另一种方法。使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)从冷冻保存的PB和BM中提取基因组DNA。通过定量实时PCR评估CAR DNA拷贝。

根据制造商的说明书，以多重格式测定血清和CSF中细胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17等的水平。使用Mann-Whitney U检验比较2组的可能影响3级或4级CRS发展变化的连续变量和危险因素。Fisher精确检验用于评估两组间分类变量对3级CRS的影响。使用基于秩的Spearman检验计算相关性。总体生存(OS)和无白血病生存(LFS)概率通过Kaplan-Meier方法使用所有入组患者来确定OS和具有MRD阴性反应的LFS。所有引用的P值均为双侧，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

CD19+-RFP和RFP经慢病毒转导入K562，分别产生CD19-RFP-K562细胞和K562-RFP细胞。通过与靶细胞，CD19-RFP-K562细胞或K562-RFP细胞共同培养，以不同比例的效应细胞与靶细胞(E：T)在输注前测量CART19s的细胞毒活性。将靶细胞以每孔104个细胞接种在补充有10％FBS(Gibco)的50μLRPMI 1640培养基中的96孔微孔板(Nunc)中。除去CD3/CD28珠，并以指定的E：T比将效应T细胞与孔中的靶细胞混合。总体积为每孔200μL。孵育24小时后，用多通道移液器将细胞在96孔微孔板中上下移液，以将细胞分离成单细胞悬浮液。拍摄每个孔中存活的RFP靶细胞，计数存活的RFP靶细胞数，并与没有效应细胞的孔进行比较。细胞死亡率计算为(对照样品)/对照×100％。还使用人IFN-γValukine ELISA试剂盒(R&D系统)收集和定量上清液。

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)从冷冻保存的外周血和骨髓中提取基因组DNA。在7500个实时PCR系统(Applied Biosystems)中，使用具有AmpErase UNG(Applied Biosystems)的ABI 2×TaqMan Universal Master Mix一式三份进行定量实时PCR。从含有102-108拷贝/μL的纯化CAR质粒的10倍连续稀释度的标准曲线计算每微克基因组DNA的拷贝数。内部对照基因的扩增用于DNA量的标准化，如前所述(参见

.等人，Blood 2012；120：2032-41和O'Brien S.等人，J Clin Oncol 2013；31：676-83)。

通过流式细胞术和形态学来评估治疗反应。如果可能，在患者中评估嵌合基因表达水平。反应类型定义为MRD阴性，完全反应，完全反应包括不完全计数恢复，疾病稳定，和进行性疾病，如前所述。通过流式细胞术将MRD阴性定义为小于0.01％的骨髓母细胞。完全反应定义为少于5％的骨髓母细胞，无循环爆发，无绝经嗜中性粒细胞计数为1000/μL或更多，血小板100,000μL/μL以上的疾病的髓外部位。不完全计数恢复的完全反应被定义为具有血细胞减少的完全反应。稳定性疾病被定义为不符合完全反应，完全反应不完全计数恢复或进行性疾病的标准的疾病。进行性疾病被定义为M状态较差或M状态无变化，绝对外周血细胞计数增加超过50％。CART19治疗后，每周随访患者，每4周进行一次骨髓检查，包括形态学，MRD状态，嵌合基因表达和CART细胞计数。

将样品收集在凝胶管中并在4℃下储存，直到同一天晚些时候离心。然后将所有血液和CSF样品以5000rpm离心6分钟。转移上清液用于随后的分析。BD Cytometric BeadArray Human Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)，FCAP Array v3.0软件(BDBiosciences)和BD FACS CANTO II(BD Biosciences)用于测量和分析细胞因子例如IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17A，IFN-γ和TNF-α等等。

将红细胞裂解的全部BM样品用于骨髓抽吸当天的免疫分型。使用单克隆抗体(mAb)与异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE)，别藻蓝蛋白(APC)的四色组合，通过流式细胞术(FACSCalibur flow cytometer，BD Biosciences，San Jose，CA)系统地分析胚细胞的抗原表达)和藻红蛋白-花青素7(PE-Cy7)。Cell-Quest软件(Becton DickinsonBiosciences)用于数据分析。单克隆抗体购自以下制造商：BD Biosciences，CD10-APC，CD19-FITC，CD22-PE，CD34-PE，CD45-PE-Cy7，cyCD79a-PE，表面免疫球蛋白(sIg)M-PE，细胞质免疫球蛋白cIg)M-APC；Beckman Coulter，CD20-APC，sIg-Lamda-FITC，sIg-Kappa-APC。

对于MRD的调查，mAb的组合是基于单独诊断的白血病母细胞的异常表型，至少获得了50万个事件。MRD结果表示为有核细胞中具有异常表型的细胞的百分比。在所有样品分析中均达到0.01％的敏感性。每天通过分析Calibrite^TM珠和标准血液样品(来自BDBiosciences的BD^TM多重检查控制或Streck，Inc.的CD-chex^TMPlus)来校准仪器设置以进行质量控制。

患者(3例)用CD19-CAR T细胞治疗，结果总结在下面的表1。这些结果表明，表达CD19 CAR的T细胞在r/r ALL患者中建立抗肿瘤作用。此外，和其他因子相比，IL-6和IFN-γ在之三名病人的血液中在会输CD19 CAR的T细胞后有显著升高(表格1-4)。因此，为了帮助CAR T细胞在实体瘤的治疗中也取得在血液瘤的疗效，下面的用于治疗实体瘤的T细胞表达或过表达的细胞因子首先选择IL-6和IFNγ。

表格1

表格2

表格3

表格4

细胞表达IL-6,IL-12，和或IFN-γ和其特征/功能

图1显示了表达图1中所示的各种蛋白质的T细胞的流式细胞术测定结果。18.第0天，取健康志愿者的外周血，分选CD3+T细胞，并以1：1的比例加入CD3/CD28 Dynabeads。第2天，使用包括各种下列载体的慢病毒转染T细胞。根据MOI＝10-1的感染率感染19CAR；根据MOI＝60-1的感染率感染hCD19CAR，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞。第3天，更换培养基，除去慢病毒，将细胞重悬于新鲜培养基中。第7天，流式细胞术测定用于检测CAR表达。19CAR是人源化抗体，因此用人CAR抗体检测。如图1所示。19,19CAR-T CAR表达为23.99％，hCD19CAR-6xNFAT-GFP CAR表达为25％，hCD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγCAR表达为17.6％。使用人CAR抗体进行流式细胞术测定以检测CAR的表达强度和表达水平。

图2显示了表达各种蛋白质的T细胞的拷贝数。第1天，使用CD3/CD28珠子分选并激活来自健康供体的T细胞。第2天，分别用载体1230(MOI 10：1)，6205(hCD19CAR-GFP)(MOI60：1)和6221(hCD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ)(MOI 60：1)转染105个细胞。在第3天，更换细胞培养基。在第4天，计数细胞数。在第5,6和8天，进行用于测量培养因子，CAR拷贝数，表型和表达的测定。第8天，进行毒性测定，并检测培养因子。副本号在下表中提供。在该实施例和以下实施例中，6xNFAT或NFAT的序列是SEQ ID NO 27；TSHR CAR的scFv是SEQ ID NO：8；CD19 CAR的scFv是SEQ ID 5，IL-6的aa是SEQ ID NO：21,2A是SEQ ID NO：28，IFN-γ的aa是SEQ ID NO：22。其他组分的序列可以在表7中找到。

图3显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-6释放。第0天，取健康志愿者的外周血，分选CD3+T细胞，并以1：1的比例加入CD3/CD28 Dynabeads。第2天，使用包括各种下列载体的慢病毒转染T细胞。根据MOI＝10-1的感染率感染19CAR；根据MOI＝60-1的感染率感染hCD19CAR，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞。第3天，更换培养基，除去慢病毒，将细胞重悬于新鲜培养基中。第5,6和8天，使用200μL培养物中的细胞上清液检测IL-6因子的释放。如图3所示，在第5,6和8天，从培养基中取出200μL的细胞上清液，释放出IL-6因子的释放。在第5天，第6天和第8天，每10⁴的19CAR和19CAR-6xNFAT-GFP释放的IL-6的量为0-10pg/mL.10⁴CD19CAR-6xNFAT-IL6-2A-IFNγ具有498pg/mL的IL6释放和第5天和第6天为378pg/mL，第8天的释放量为9.8pg/mL。在第5天和第6天，用CD3/CD28 Dynabeads培养细胞，使细胞活化，激活NFAT元件，使IL-6转录，使IL-6释放。然而，在第8天，Dynabeads刺激的作用已降至较低水平，并且细胞未被激活。因此，关闭NFAT元件并且禁用IL-6的转录。因此，IL-6未被释放。当CD3/28Dynabeads刺激T细胞时，细胞在短时间内被激活。此时，NFAT元件引起由于激活而表达的基因的转录翻译，并且当细胞处于静止或较低活化水平时表达相应的表达基因，NFAT元件不启动转录翻译。非活动状态下的目的基因。因此，可以通过在CAR-T细胞的活化和失活状态下表达靶基因来判断NFAT元件是否有活性以及诱导基因是否表达。

图4显示响应于与nalm6细胞共培养的IL6释放(参见下表5)。将细胞培养至第8天，然后用NT细胞水平以区分CD19 CAR-T细胞和CD19CAR-6xNFAT-GFP与CD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞的CAR比率。将10⁴CAR+细胞与10⁴Nalm-6细胞共培养或分别培养。24小时后，收集上清液并测量释放的IL-6的量。将细胞与nalm6细胞共培养并处于活化状态。因此，NFAT元件在激活状态下启动IL6的转录，从而允许释放IL-6。当CAR-T细胞与靶细胞共培养时，由于CAR-T细胞识别肿瘤细胞表面上的膜蛋白，因此细胞被激活。NFAT元件启动由于活化而表达的基因的转录翻译。表达相应的表达基因。当细胞处于静止或激活水平低时，NFAT元件不会在非活性状态下启动目的基因的转录翻译。因此，可以通过在CAR-T细胞的活化和失活状态下表达靶基因来判断NFAT元件是否有活性以及诱导基因是否表达。

表格5

图5显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IFN-γ(即IFNg)释放。在第0天，取健康志愿者的外周血，分选CD3+T细胞，并以1：1的比例加入CD3/CD28 Dynabeads。在第2天，使用包括各种下列载体的慢病毒转染T细胞。根据MOI＝10-1的感染率感染19CAR；根据MOI＝60-1的感染率感染hCD19CAR，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-GFP，hCD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞。除去慢病毒，将细胞重悬于新鲜培养基中。在第5,6和8天，使用200μL培养物中的细胞上清液检测IFN-γ的释放。在第5天和第6天，用CD3/CD28 Dynabeads培养细胞，使细胞活化，激活NFAT元件，使IFN-γ转录，使IFN-γ释放。然而，在第8天，Dynabeads刺激的作用已降至较低水平，并且细胞未被激活。因此，关闭NFAT元件并且禁用IFN-γ的转录。因此，IFN-γ未被释放。当CD3/28Dynabeads刺激T细胞时，细胞在短时间内被激活。此时，NFAT元件引起由于激活而表达的基因的转录翻译，并且当细胞处于静止或较低活化水平时表达相应的表达基因，NFAT元件不启动转录翻译。非活动状态下的目的基因。因此，可以通过在CAR-T细胞的活化和失活状态下表达靶基因来判断NFAT元件是否有活性以及诱导基因是否表达。

图6显示响应于与nalm6细胞共培养的IFN-γ释放(参见下表6)。将细胞培养至第8天，然后用NT细胞水平以区分CD19 CAR-T细胞和CD19CAR-6xNFAT-GFP与CD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞的CAR比率。将10⁴CAR+细胞与10⁴Nalm-6细胞共培养或分别培养。24小时后，收集上清液并测量释放的IFN-γ的量。将细胞与nalm6细胞共培养并处于活化状态。因此，NFAT元件在激活状态下启动IFN-γ的转录，从而允许释放IFN-γ。当CAR-T细胞与靶细胞共培养时，由于CAR-T细胞识别肿瘤细胞表面上的膜蛋白，因此细胞被激活。NFAT元件启动由于活化而表达的基因的转录翻译。表达相应的表达基因。当细胞处于静止或激活水平低时，NFAT元件不会在非活性状态下启动目的基因的转录翻译。因此，可以通过在CAR-T细胞的活化和失活状态下表达靶基因来判断NFAT元件是否有活性以及诱导基因是否表达。

表格6

图7显示了对CAR T细胞的毒性测定。将来自健康供体的T细胞培养至第8天，然后用NT细胞水平以区分CD19 CAR-T细胞和CD19CAR-6xNFAT-GFP与CD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞的CAR比率。将30×10⁴CAR+细胞分别与10⁴Nalm-6细胞和90e4 Nalm-6细胞共培养。24小时后检测到nalm6细胞残留。将CD19CAR-T细胞，CD19CAR-6xNFAT-GFP细胞和CD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞与nalm6细胞以不同比例共培养。3个细胞组之间没有显著差异。CD19CAR-T，CD19CAR-6xNFAT-GFP和CD19CAR-6xNFAT-IL6-2a-IFNγ细胞被肿瘤激活后，T细胞发挥杀伤作用，对靶细胞起作用，使靶细胞死亡。

图8和9显示响应于与nalm6细胞共培养的其他IFN-γ释放。第0天，从志愿者获得外周血T细胞，并使用Dynabeads以1：1的比例刺激。第1天，用慢病毒载体感染细胞。第2天，换培养基。第7天流式细胞术测定用于检测CAR表达和CAR拷贝数。1204代表h19CAR，6107代表h19CAR-2A-IL12，其中细胞连续表达IL-12。将CAR表达式调整为17％。将10⁴CAR阳性细胞和10⁴Nalm6或Nalm6-PDL1肿瘤细胞在24孔板中共培养24小时，检测上清液的IFN-γ。1204具有42％CAR表达，每个CART细胞1.5个拷贝，6107具有23％CAR表达，每个CART细胞0.94个拷贝，并且CAR被平衡至17％用于共培养。如柱状图所示，共培养结果表明，由于PDL1对T细胞的抑制作用，Nalm6-PDL1在1230刺激产生的IFNγ约为Nalm6刺激的一半。来自6107的IFN-γ的释放达到1230的约10倍，证明CART释放的IL-12显著促进IFN-γ释放。

图10和11显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-12和IFN-γ释放。第0天，从志愿者获得外周血T细胞，并使用Dynabeads以1：1的比例刺激。第1天，用慢病毒载体感染细胞。第2天，换培养基。在第9天，使用流式细胞术检测CAR表达。1230代表h19CAR，6209代表h19CAR-6xNFAT-IL12(T细胞活化下IL-12的条件释放)将CAR表达水平调节至30％。Dynabeads以1：3的比例刺激相同数量的细胞24小时，并测定上清液的IL-12和IFN-γ。在1230中存在65％的CAR表达，在6209中存在34％的CAR表达。在调平至30％后，添加Dynabeads。24小时后，收集上清液检测因子结果作为直方在Dynabeads的刺激下，6209每10⁴T细胞平均释放55μgIL-12。无论刺激如何，1230都不释放IL-12，并且6209在没有刺激的情况下不释放IL-12。这表明NFAT原始激活Dynabeads刺激下的IL-12转录，如图11左所示。如图11右所示的IFN释放，两种CART细胞在没有刺激的情况下没有IFN-γ释放，并且6209在Dynabeads刺激下释放更多的IFN-γ，表明IL-12与6209CART细胞协同释放更多的IFN-γ。

图12和13显示响应于CD3/CD28 Dynabeads活化的IL-6和IFN-γ释放。第0天，从志愿者获得外周血T细胞，并使用Dynabeads以1：1的比例刺激。第1天，用慢病毒载体感染细胞。第2天，媒体发生了变化。在第7天，使用流式细胞术检测CAR表达。1230代表h19CAR，6221代表h19CAR-6xNFAT-IL6-2A-IFNγ(T细胞活化下IL6和IFN-γ的条件释放)。将CAR表达式调整为12.66％。Dynabeads以1：3的比例刺激相同数量的细胞24小时，并测定上清液的IL-6和IFN-γ。在1230中有67％的CAR表达，在6221中有29％的CAR表达。达到12.66％并添加Dynabeads。24小时后，收集上清液检测因子结果作为直方没有Dynabeads，两种细胞都没有IL-6或IFN-γ释放。加入Dynabeads后，6221显著释放更多的IL-6和IFN-γ(每10⁴T细胞释放的平均pg数)。

本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改，替换，省略和改变。

表格7

Claims (10)

1.包含分离的核酸序列的细胞群，所述细胞群包含：编码结合白细胞的抗原的CAR的核酸序列；编码包含治疗剂IL-12的另外的核酸序列；和编码结合实体肿瘤抗原的另外的CAR的第三核酸序列。

2.根据权利要求1所述的细胞群，所述核酸序列、另外的核酸序列与第三核酸序列在同一细胞或不同细胞中。

3.根据权利要求1所述的细胞群，所述CAR和治疗剂IL-12以多蛋白的形式产生；其被切割以产生单独的CAR和治疗剂IL-12，和/或所述CAR和治疗剂IL-12各自组成型表达。

4.根据权利要求3所述的细胞群，所述多蛋白包含CAR和治疗剂IL-12之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。

5.包含分离的核酸序列的细胞，所述分离的核酸序列包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码CAR，所述CAR结合白细胞的抗原；所述另外的核酸序列编码包含治疗剂IL-12。

6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述分离的核酸序列包含SEQ ID NO:27。

7.根据权利要求5或6所述的细胞，其中所述细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于所述CAR的另外的CAR，所述另外的CAR结合实体肿瘤抗原。

8.修饰的T细胞，所述T细胞包含CAR，其中所述T细胞包含一个核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码IL-6的核酸序列；和(2)编码IFN-γ的核酸序列；所述T细胞经工程化改造，当T细胞被激活时以表达和分泌IL-6和INF-γ，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原，所述CAR结合实体瘤抗原。

9.根据权利要求8所述的T细胞，其包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列，和SEQ IDNO：27，使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。

10.根据权利要求1～4中任意一项所述的细胞群，或权利要求7所述的细胞，或权利要求8或9所述的修饰的T细胞，其中所述实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，PSCA或EGFR。

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