CN116284420A - 一种特异性的真菌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种特异性的真菌检测试剂盒。本发明通过分离纯化获得了白色念珠菌标准株ATCC10231的烯醇化酶，以该酶作为免疫原，通过小鼠杂交瘤技术制备并获得了白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19。该单抗具有较好的亲和靶标能力以及结合特性，通过多种菌株检测验证了该单抗具有极好的检测特异性可以用于制备白色念珠菌的试剂盒。

Description

一种特异性的真菌检测试剂盒

技术领域

本申请涉及生物检测领域，具体的涉及真菌检测，更具体的涉及一种特异性的真菌检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着人类环境、疾病等方面的改变，真菌类感染的发病率呈现逐年上升的趋势，念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病。临床症状错综复杂，急缓不一，儿童多为急性继发性感染。该病常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。所有内脏感染常继发于多种慢性消耗性疾病，且有长期应用广谱抗生素、皮质激素及化疗、放疗等诱发因素。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，其发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果。

白色念珠菌是导致真菌感染的重要致病菌之一，此外它还是重要的食源性致病菌。白色念珠菌(CandidaAlbicans)又称白假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白色念珠菌就会繁殖并改变生长形式侵入人体细胞从而引起疾病。白色念珠菌细胞呈卵圆形，致病性菌株细胞呈现假菌丝。该菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，以37℃或室温孵育2～3d后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。若接种于4％玉蜀黍琼脂上，室温孵育3～5d可见假菌丝，芽生孢子，厚膜孢子。白色念珠菌对热的抵抗力不强，加热至60℃，1h后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。因此，开展白色念珠菌检测方法研究在医学临床检验、食品安全检测领域都具有重要意义。

白色念珠菌检测方法临床上主要有直接镜检、真直菌培养、组织病理学等三种方法。直接镜检是最简便、快速的方法.但检查阳性不能确定真菌的种类，检查阴性也不能排除真菌病。真菌培养多用沙保罗培养基，可分离菌种，是鉴定白色珠菌的重要方法.是临床诊断真菌病的依据。随着分子生物学、免疫学等检测技术的发展，越来越多的试验方法于白色念珠菌感染的诊断检测。

PCR诊断法是常用的诊断方法，由于该方法可以在数小时内检测出极微量的真菌DNA，故使白色念珠菌感染的早期快速诊断成为可能。特异性通用引物PCR诊断法:设计一个以热启动PCR为检测手段选用一段真菌菌界保守序列作为特异性通用引物，检测真菌，敏感性性高，特异性强，有较好的代表性。可用来检测白色念念珠菌。但其成用有局限性，不能代替真菌培养。

免疫学方面的抗体检测方法通过抗原测测定抗体，如补体结合试验、免疫扩散试验，直接或间接接凝集试验等，此类方法敏感性较好，成本低廉。单克隆免疫组化技术是检测测组织内真菌具有很高的敏感性和特异性，目前应用用的有抗白色念珠菌、抗红色毛菌、抗曲霉菌单克克隆抗体，免疫组化与培养法结合能更清楚地了解泽组织内真菌是腐生污染还是病原菌，而且还可以证证实混合感染的存在。CN110204616A中公开了一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体，该单克隆抗体针对的靶标是烯醇化酶(enolase，eno1)又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶。该酶它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸转化，是白色念珠菌糖酵解过程的限速酶。一直以来认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白，然而随着分子生物学对有免疫原性蛋白的研究日趋发展，发现该酶是白色念珠菌血清学检测最重要的靶标分子，例如，侵袭性念珠菌感染患者可以观测到烯醇化酶血症。目前，利用抗烯醇化酶单克隆抗体与羊抗烯醇化酶多克隆抗体匹配，建立ELISA方法可检测白色念珠菌培养上清中的烯醇化酶蛋白，该方法与近平滑念珠菌有微弱的交叉反应，与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。但是目前，可供选择的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体种类还不够多，特别是适用于市场化的的适用于大规模市场化检测的抗体及其试剂盒种类还不够多。

发明内容

本发明一方面，提供了一种特异性针对抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体。

进一步的，本发明的提供的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的轻链和/或重链可变区序列进一步的还可以被保守取代。

术语“保守取代”还包括具有类似亲水指数或分数的氨基酸取代。每种氨基酸基于它们的疏水性和电荷特性而分配了亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行基于亲水指数的变化时，亲水指数在+/-0.2以内的氨基酸的取代是优选的。更优选地，取代包括亲水指数在+/-0.1以内的氨基酸，更优选在约+/-0.05以内。

进一步的，本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的轻链和/或重链可变区序列进一步的还可以被保守氨基酸取代。其包括基于亲水性制备的类似氨基酸的取代，尤其是由此产生的生物学功能等同的蛋白或肽预期用于免疫实施方案，就如目前的情况。例如，取决于邻近氨基酸的亲水性的蛋白最大的局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性有关。如美国专利4,554,101号所详述，下列亲水值已经分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水值进行变化时，优选地，取代的氨基酸具有彼此在约+/-0.2以内的亲水值，更优选在约+/-0.1以内，甚至更优选在+/-0.05以内。

进一步的，本发明的单抗还包括对序列的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变化、修饰、替换、缺失或添加但是仍然保持相应的抗体的生物学活性，更优选至少基本上相同的活性。

进一步的，本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19还可以被与标记偶联。标记可以是其存在可以方便地检测的任何实体。例如，标记可以是直接标记，例如详细描述于May et al.的美国专利5,656,503号中的那些标记。直接标记包括但不限于在天然状态可以通过肉眼方便地看到或借助于滤光器和/或施加的刺激如UV光以激发荧光的实体。实例包括放射性化合物、化学发光化合物、电活性化合物(如氧化还原标记)和荧光化合物。直接颗粒标记如染料溶胶、金属溶胶(如金)和有色胶乳颗粒也是非常适合的，并且与荧光化合物一起都是优选的。在这些选择中，有色胶乳颗粒和荧光化合物是最优选的。将标记浓缩到小区域或体积中应当产生容易检测的信号，例如强着色区域。也可以使用间接标记，例如酶，如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，尽管这些间接标记通常需要在可以检测可见信号之前添加一种或多种显影剂，如底物。

标记与诸如本发明抗体的结合剂的偶联可以通过共价或非共价(包括疏水)键合，或通过吸附。用于这类偶联的技术是本领域常见的，并且可以轻易地适应于使用的具体试剂。

诸如本发明抗体的也可以包被在固体支持物上。例如，抗体可以包被在合成塑料材料、磁性颗粒、微量滴定测定板、微阵列芯片、胶乳珠、包含纤维素或合成聚合材料的滤器、玻璃或塑料载片、浸量尺、毛细管装填装置等。

进一步的，本发明的抗体与固体支持物连接以允许对酶的粗分离。分离技术优选的最大程度保留待收集组分的活性。可以使用不同效率的各种技术来获得较粗的分离。使用的具体技术取决于分离效率、相关细胞毒性、表现的易用性和速度以及先进设备和/或专门技能的需求。用于分离的方法可以包括但不限于磁力分离、使用包被抗体的磁珠、亲和力层析和利用连接到固体基质的抗体的“淘选(panning)”。提供精确分离的技术包括但不限于MACS、Dynal磁珠选择和FACS。

进一步的，本发明还提供了一种用于白色念珠菌检测的试剂盒，其特征在于含有本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19。

进一步的，本发明还提供了一种用于白色念珠菌检测的试纸条，其特征在于含有本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19。

进一步的，本发明还提供一种特异的检测白色念珠菌的方法，所述方法包括ELISA方法，双抗体夹心方法等，所述方法包括使用本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19。

进一步的，本发明还提供白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19在制备用于检测白色念珠菌的试剂盒中的用途。

有益效果

本发明通过分离纯化获得了白色念珠菌标准株ATCC10231的烯醇化酶，以该酶作为免疫原，通过小鼠杂交瘤技术制备并获得了白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19。该单抗具有较好的亲和靶标能力以及结合特性，通过多种菌株检测验证了该单抗具有极好的检测特异性可以用于制备白色念珠菌的试剂盒。

附图说明

图1白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的效价测定图；

图2白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的Western blot检测结果图；其中，泳道2的白色念珠菌菌悬液、泳道3重组白色念珠菌烯醇化酶均可以与白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19形成单一的条带，而泳道1的BSA不与白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19反应。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1白色念珠菌烯醇化酶的制备

白色念珠菌标准株ATCC10231以液体沙堡培养基振荡培养24h得菌悬液。按比浊方法控制菌悬液浓度，最终浓度为2×10⁹/mL。采用Lyticase酶解破壁法进行破壁。以50％及75％的硫酸胺逐次沉淀蛋白液，离心后收集50％及75％硫酸胺溶液沉淀物，将其置于蒸馏水中过夜透析。

以浓度为10mmol/L溶液平衡，pH7.8的Tris-HCl溶液平衡DEAE-Sephadex A-50柱，将所得到的透析后的蛋白液过柱，流速为50mL/h，待流出穿过峰后以0.2MNaCl洗柱，接含相对分子质量为47000蛋白的洗脱峰，用蒸馏水透析脱盐。以浓度为10mM，pH8.0的Tris-HCl溶液平衡DEAE-Sephadex A-50柱，将上步的洗脱峰过柱，流速为18mL/h其余步骤同上。以浓度为10mM pH为7.4的Tris-HCl溶液平衡ConA-Sephrose-4B柱，以上步洗脱峰过柱，流速为13mL/h接穿过峰。经SDS-PAGE鉴定，获得了条带单一的相对分子量为47000的单一蛋白。

白色念珠菌烯醇化酶酶蛋白活性测定：以酿酒酵母烯醇化酶为标准(Us＝300U/mg，pH7.4，25摄氏度)，用波长为340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定白念珠菌烯醇化酶的活性(Ua)。反应混合物为50mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl₂，2mM EDTA，2mM NADH，1mMADP，10U丙酮酸激酶，10U乳酶脱氢酶及不同种烯醇化酶。反应总体积为1mL，反应温度为25摄氏度。鉴定纯化后的白色念珠菌烯醇化酶酶的Ua为2845.3U/mg。将所述较好酶活的白色念珠菌烯醇化酶(CAEnolase)4摄氏度冰箱保持备用。

实施例2白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备

实验用小鼠系BALB/c小鼠为军事医学科学院动物中心提供。初次免疫用实施例1纯化的白色念珠菌烯醇化酶蛋白50mg，用生理盐水稀释后与等体积弗氏完全佐剂混匀搅拌乳化后，3只BALB/c小鼠皮下免疫两点，其余腹腔注射。2周后用同样剂量的抗原与不完全佐剂混匀进行二次免疫，方法同首次免疫，2周后用同样剂量的抗原与不完全佐剂混匀进行二次免疫，方法同首次免疫，7d后ELISA测血清效价选择效价最高的大于1:50000的1号小鼠于融合前3天再用同等剂量的抗原腹腔注射，加强免疫1次。

取加强免疫后的1号小鼠，眼眶采血后处死，酒精消毒后平皿中取脾，转移至50ml离心管中，加RPMI1640至30ml稀释后取1×10⁸个细胞备用。取SP2/0细胞1×10⁷个与之前的脾细胞混合离心，2000r/min离心5min，弃上清，37℃水浴，1min内加入1ml PEG4000并搅拌，37℃水浴放置1min。分别在1、2、3min内加入1、4、15ml RPMI1640终止融合，1000r/min离心5min。弃上清弹匀细胞，加入HAT培养液，混匀后，滴入96孔板，放入CO₂培养箱中，并定时换液，同时用实施例1纯化的酶蛋白和BSA对照蛋白做包被抗原，采用间接ELISA筛选细胞培养上清，将初筛的47株阳性克隆以有限稀释法克隆化，筛选得到特异性最好的单克隆抗体3G19。以该杂交瘤细胞诱生BALB/c小鼠腹水单抗，并纯化，采用BCA测定蛋白浓度为2.4mg/mL后备用。

实施例3白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19效价测定

首先用实施例1纯化的酶蛋白包被96孔酶联板，4℃过液，洗液洗涤3次，加封闭液37℃4h后洗3次，拍干，4℃保存。将纯化的腹水单抗加样到包被好的酶标板上，每板取空白小鼠血清为阴性对照，再选阳性血清，作为阳性对照，37℃孵育30min洗板4次，拍干，加入1∶5000稀释的酶标二抗37℃孵育30min，洗板4次，拍干。37℃DAB显色30min，加终止液，450nm测定OD值。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，本发明制备的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19具有较好的效价特性。

采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定得到白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的亚型为IgG2a。

实施例4白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19特异性鉴定

将白色念珠菌菌悬液、重组白色念珠菌烯醇化酶，货号pro-2297，ProSpec以及BSA蛋白分别与样品缓冲液按3∶1的比例混匀，100℃水浴加热5min。制备分离胶和浓缩胶溶液，待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将样品孔中依次加入白色念珠菌菌悬液、重组白色念珠菌烯醇化酶，货号pro-2297，ProSpec以及BSA蛋白各10μl。在恒压80V条件下开始电泳，至样品溶液进入分离胶后将电压调至180V，直至电泳结束。免疫印迹法检测抗体的反应性和特异性：取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于TF缓冲液30min。另取与凝胶同样大小的厚7滤纸2张，硝酸纤维素膜(PVDF膜)1张，用TF缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移。在电极板上依次放上湿厚滤纸1张，硝酸纤维素膜1张，电泳凝胶，湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8mA/cm²硝酸纤维素膜，恒电压18V转移30min。取出硝酸纤维素膜浸入封闭液37℃封闭60min，弃去液体。加入5ml按照1:3000稀释的适量的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19溶液，4℃反应过夜。硝酸纤维素膜用TBST缓冲液洗1次，再用TBST缓冲液浸洗3次，每次8min。弃去液体，再加入10ml适量的HRP标记的二抗，37℃摇动反应30min。硝酸纤维素膜用TBST缓冲液洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次10min。弃去液体，加入混合好的ECL显色液，在暗室进行曝光显影。阳性结果应呈现明显曝光带，阴性结果没有曝光带。结果如图2所示。

从图2可以看出，泳道2的白色念珠菌菌悬液、泳道3重组白色念珠菌烯醇化酶均可以与白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19形成单一的条带，而泳道1的BSA不与白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19反应，这体现了白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19具有较好的特异性。

实施例5白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19亲和特性鉴定及序列鉴定

SPR技术检测白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19抗体亲和力：将抗鼠IgG二抗固定于CM5芯片上，利用BiacoreT200捕获白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19抗体(鼠抗)，将重组白色念珠菌烯醇化酶抗原作为分析物，用缓冲液分别稀释到0、7.5、15、30、60nM浓度梯度，利用单循环动力学检测不同抗体与重组白色念珠菌烯醇化酶抗原的结合。最终数据用biacore evaluation software3.0按1:1模型进行kinetics拟合分析。结果如表1所示。

表1白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19亲和特性结果

抗体SPR	结果
		KD(mol/L)	1.68E-10
Ka(1/(mol*s/L))	3.05E+05
		Kd(1/s)	5.13E-05

从表1可以看出，本发明的白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19具有较好的与靶蛋白亲和特性，结合稳定性较强。

按照Tiangen细菌总RNA提取试剂盒(货号DP430)说明书从3G19杂交瘤细胞株中提取mRNA。按照Invitrogen III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成第一条链，并做PCR扩增。按照pEASY-T1 Cloning Kit(Transgen CT101)试剂盒说明书进行TA克隆。使用M13通用引物进行PCR鉴定，选取阳性克隆测序。通过序列分析，鉴定得到白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例6白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体3G19制备的检测试纸条及鉴定

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金,以单克隆抗体3G19标记胶体金,采用差速离心法纯化胶体金探针。分别以白色念珠菌烯醇化酶多克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体作为试纸的检测线和质控线,包被NC膜,组装胶体金试纸。利用光滑念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、酵母菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和链球菌进行特异性试验。结果如表2所示。

表2抗体3G19试纸条特异性实验结果

“-”表示没有条带，“+”表示存在阳性条带。

从表2的结果可以看出，本发明的抗体3G19试纸条具有非常好的特异性，与其他非白色念珠菌均不产生特异性条带，而只于白色念珠菌以及白色念珠菌的烯醇化酶重组蛋白有强阳性条带反应，表现了较好的特异性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种特异性靶向白色念珠菌烯醇化酶的单克隆抗体3G19，其特征在于其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的特异性靶向白色念珠菌烯醇化酶的单克隆抗体3G19，其特征在于该单克隆抗体的亚型是IgG2a。

3.一种特异性检测白色念珠菌的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的特异性靶向白色念珠菌烯醇化酶的单克隆抗体3G19，所述单克隆抗体含有可检测的标记；所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。

4.如权利要求1所述的特异性靶向白色念珠菌烯醇化酶的单克隆抗体3G19在制备用于检测白色念珠菌的试剂盒中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述试剂盒含有标记有权利要求1的所述的特异性靶向白色念珠菌烯醇化酶的单克隆抗体3G19的试纸条。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的试剂盒是ELISA检测试剂盒。

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