CN116284281B

CN116284281B - G型产气荚膜梭菌的重组蛋白、疫苗及应用

Info

Publication number: CN116284281B
Application number: CN202310209976.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡海明; 胡俊菁; 申翰钦; 孙铭飞; 廖申权; 戚南山; 李娟�; 吕敏娜; 林栩慧; 宋勇乐; 肖文婉; 张小慧; 张健騑
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-03-07
Filing date: 2023-03-07
Publication date: 2025-10-03
Anticipated expiration: 2043-03-07
Also published as: CN116284281A

Abstract

本申请提供了一种G型产气荚膜梭菌的重组蛋白、疫苗及其应用。具体地，G型产气荚膜梭菌的重组蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。通过免疫本申请的重组蛋白，能够有效地防治G型产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎；并且具有安全、可靠、制备方法简单等特点。

Description

G型产气荚膜梭菌的重组蛋白、疫苗及应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种G型产气荚膜梭菌的重组蛋白、疫苗及应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)广泛分布在人类、动物和鸟类的肠道中。产气荚膜梭菌可以侵染人类和动物的许多组织，从而引起肠毒性疾病；该菌的滑动运动与其毒性功能相关，有助于菌株的粘附能力和生物膜形成。

产气荚膜梭菌的毒性可归因于它拥有20多种强毒素和水解酶。根据不同菌株的产毒模式，产气荚膜梭菌可以产生多种外毒素和侵袭性酶，根据产生的毒素类型，可将菌株分为七种毒素型(A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型)。其中，G型产气荚膜梭菌是禽类坏死性肠炎(Necrotic enteritis，NE)的主要病原菌。

目前，家禽产业中主要是通过使用抗生素对禽类坏死性肠炎进行预防性处理。然而，越来越多的细菌被报道对抗生素产生了抗性，因此迫切需要一种安全、有效的预防禽类坏死性肠炎的方法。

发明内容

基于此，本申请提供了一种能够有效防治禽类坏死性肠炎的G型产气荚膜梭菌的重组蛋白、疫苗及应用。

根据本申请的一个方面，提供了一种G型产气荚膜梭菌的重组蛋白，所述重组蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

一种分离的核酸，编码上述的重组蛋白。

在其中一个实施例中，所述核酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，含有上述的核酸。

一种宿主细胞，其基因组中掺有上述的核酸或上述的重组载体。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为原核细胞。

一种疫苗，含有上述的重组蛋白、上述的核酸或上述的重组载体。

在其中一个实施例中，还包括佐剂。

成套的试剂盒，包含上述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

根据本申请的另一方面，提供了上述的重组蛋白、上述的核酸或上述的重组载体在制备防治G型产气荚膜梭菌感染的药物中的应用。

与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

本申请针对G型产气荚膜梭菌的α毒素和NetB毒素，研制了氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的重组蛋白。该重组蛋白能够对G型产气荚膜梭菌产生有效的免疫保护，并且具有安全、稳定、无毒副作用等特点。

此外，本申请的重组蛋白能够通过分子疫苗或口服疫苗的形式使用，有效预防和治疗G型产气荚膜梭菌所引起的家禽坏死性肠炎。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例2中构建的重组质粒图谱；

图2为本申请实施例2中菌落PCR鉴定的凝胶电泳图；

图3为本申请实施例2中重组蛋白的纯化与鉴定结果图；

图4为本申请实施例3中构建的重组质粒图谱；

图5为本申请实施例3中菌落PCR鉴定的凝胶电泳图；

图6为本申请实施例4中鸡只的肠道病变结果图。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请的一些实施方式提供了一种G型产气荚膜梭菌的重组蛋白，其具有如SEQID NO.3所示的氨基酸序列。

具体地，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：

MGSDPSVGNNVKELVAYISTSGEKDAGTDDYMYFGIKTKDGKTQEWEMDNPGNDFMAGSKDTYTFKLKDENLKIDDIQNMWIRKRKYTAFPDAYKPENIKVIANGKVVVDKDINEWEAAAKYYGKMKWPETYRINVKSADVNNNIKIANSIPKNTIDKKDVSNSIGYSIGGNISVEGKTAGAGINASYNVQNTISYEQPDFRTIQRKDDANLASWDIKFVETKDGYNIDSYHAIYGNQLFMKSRLYNNGLE

本申请还提供了一种分离的核酸，编码上述的重组蛋白。

核酸可以为RNA或DNA。

在其中一些实施方式中，针对不同的宿主细胞，对上述核酸的核苷酸序列进行密码子优化。

密码子优化是指在不改变氨基酸序列的情况下，利用宿主细胞的偏爱密码子，对目的基因进行优化，提高重组蛋白的表达效率。

在其中一些实施方式中，上述的核酸具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

此外，上述的重组蛋白的氨基酸序列还可以与选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列实质上相似的序列。所述核酸的核苷酸序列还可以与选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列实质上相似的序列。“实质上相似”意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列共有至少95％的同一性，例如，96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％。或者，意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核酸或氨基酸的区别，对于多肽，这种区别优选为氨基酸的置换或者缺失。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的能够检测内源性抗体效率高的独特活性。通常置换视为保守置换，例如在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。

“实质上相似”氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.3所示的多肽的衍生物。术语“衍生物”是指化学修饰的蛋白质或多肽，其已经通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)还通过化学修饰技术，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他这样的分子来进行化学修饰，其中一个或多个分子不是天然地附着到野生型蛋白质。衍生物包括盐。这样的化学修饰在基础教科书和更详细的专论中以及在大量研究文献中有详细描述，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定蛋白质或多肽中的几个位点。此外，给定的蛋白质或多肽可以含有许多类型的修饰。修饰可发生在蛋白质或多肽中的任何位置，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲基化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚接、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烃基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、蛋白质的氨基酸的传递RNA介导加成(诸如精氨酰化)以及泛素化。它们还可以结合至维生素，例如生物素、叶酸或维生素B12。

本申请还涉及一种重组载体，其含有上述的核酸。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本申请所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

在其中一些实施方式中，本申请所述载体中还可以包含筛选所用的基因(例如抗生素抗性基因)、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKate等。

本申请还涉及一种宿主细胞，其基因组中掺有上述的核酸或上述的载体。

在其中一些实施方式中，本申请的宿主细胞被上述的载体所转化。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：大肠杆菌、乳酸杆菌或枯草菌等原核细胞；如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK-293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞通常不具有全能性的动物细胞(优选禽类细胞，例如鸡细胞)，例如不包括受精卵、胚胎、生殖干细胞、胚胎干细胞等。优选地，宿主细胞为原核细胞；更有选为大肠杆菌或乳酸杆菌。

本申请还涉及一种疫苗，其含有上述的重组多肽、上述的核酸或上述的载体。

在其中一些实施方式中，上述的疫苗还包括佐剂。适用于本申请疫苗的佐剂包括可增强或放大抗体免疫反应的佐剂，以及可增强细胞介导的T细胞表位反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的。

在其中一些实施方式中，上述的佐剂选自明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)，以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。其中，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烷和明矾一般不用于人。当添加时，疫苗中的佐剂的量通常在约1％(v/v)～20％(v/v)之间。在具体实施方案中，所述佐剂的量在约2％(v/v)～10％(v/v)之间。在更具体实施方案中，所述佐剂的量在约3％(v/v)～6％(v/v)之间。

在其中一些实施方式中，上述的疫苗还包括药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，同时无害且被目标良好耐受。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。水或水溶液盐水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油)水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。此外，所述载体可以是和/或包含水胶体和/或聚合物溶液，例如，以使待喷在禽类上的禽类疫苗变稠。

在其中一些实施方式中，上述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在其中一些实施方式中，上述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

进一步地，上述的疫苗包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如菌苗)和/或菌苗的抗原。这可以以任何合适的方式，例如作为“活”减毒、灭活或亚单位抗原衍生自对禽类致病的该微生物。

典型的免疫接种是通过皮下(SC)或肌内(IM)注射实现，或者，上述疫苗还可以经由皮肤贴剂、在延迟释放植入物中、划痕或局部施用进行施用。还可以经由受体禽类的饮用水和/或食物进行施用。

本申请还涉及成套的试剂盒，其包括上述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

本申请还涉及一种上述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

在适宜的条件下培养上述的宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化，制备上述的疫苗。

本申请还涉及上述的重组蛋白、上述的核酸或上述的重组载体在制备防治G型产气荚膜梭菌感染的药物中的应用。

本申请进一步提供了保护禽类免于G型产气荚膜梭菌感染的方法，其包括给禽类动物施用预防有效量/治疗有效量的本申请的疫苗。

术语“禽类”是指野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、天鹅、大雁、鸽子、鹌鹑等禽类，其中特别是鸡。

影响优选剂量方案的因素可以包括例如主体的物种或品种(例如禽类的物种或品种)、年龄、重量、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。这样的剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。

下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。

实施例1：编码基因的筛选

针对G型产气荚膜梭菌的α毒素和NetB毒素，筛选得到序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：

针对不同宿主细胞，进行密码子优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的编码基因序列。

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为：

CATATGGGCAGCGATCCGAGCGTGGGTAATAATGTGAAAGAACTGGTTGCCTATATTAGCACCAGCGGTGAAAAAGATGCAGGTACCGATGATTATATGTATTTTGGTATTAAGACCAAGGACGGTAAAACCCAGGAATGGGAAATGGATAATCCGGGTAATGATTTTATGGCCGGTAGCAAAGATACCTATACCTTTAAACTGAAAGACGAAAATCTGAAAATCGATGATATCCAGAATATGTGGATTCGCAAACGCAAATATACCGCCTTTCCGGATGCCTATAAACCGGAAAATATTAAAGTGATTGCGAATGGTAAGGTTGTGGTTGATAAAGATATTAATGAGTGGGAAGCCGCCGCAAAATATTATGGTAAAATGAAATGGCCGGAAACCTATCGTATTAATGTTAAAAGTGCAGATGTGAATAACAACATTAAGATTGCAAACAGTATCCCGAAAAATACCATTGATAAAAAGGATGTTAGCAACAGCATTGGTTATAGTATTGGCGGTAATATTAGCGTGGAAGGTAAAACCGCAGGTGCCGGTATTAATGCAAGCTATAATGTTCAGAATACCATTAGTTACGAGCAGCCGGATTTTCGTACCATTCAGCGCAAAGATGATGCAAATCTGGCCAGTTGGGATATTAAATTTGTGGAAACCAAAGATGGTTACAATATTGATAGCTATCACGCCATTTATGGCAATCAGCTGTTTATGAAAAGCCGTCTGTATAATAATGGTCTCGAG

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：

CCATGGGAATTCAGATCTTATGCTTTTGTTATAAGTTAGCACAAAAAAGCAGAAAATAAAAAGTAGAAATAAAAAAAGATGTTTTTTTGCCCATATCTCTATGAAAAAAACTGTGAAATGTGTAAAATATGGATGAAACATTGAATTTAAAAGGAGATATTTCATGAAGAAGGAATTGTCATTCCATGAAAAATTGTTGAAG

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GCTGGTGCTGGTATTAATGCTTCATATAATGTTCAAAACACTATTAGCTACG

AACAACCAGATTTTCGTACTATTCAACGTAAAGATGATGCTAATTTGGCTTC

ATGGGATATTAAGTTTGTTGAAACTAAGGATGGTTACAATATTGATTCATAC

CATGCTATTTACGGTAATCAATTATTCATGAAGAGCCGTTTATACAATAACG

GTGGATCCGAGCTCGGGCCCTCTAGAGTCGACCTCGAGCACCACCACCAC

CACCACTGATAACCCGGGTAATCTGAAGAAAAAGGAGGCTAGTATACTAGC

CTCCTTTTTCTTCAGATTACCCGGGGCGGCCGCAAGCTT

实施例2：重组蛋白的制备

(1)将人工筛选组合得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段经过全基因合成后，与原核表达载体pET-30a(+)同时进行NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切后，分别回收核酸片段，再用T4 DNA连接酶连接过夜；连接后的重组质粒图谱如图1所示。

(2)将连接产物热激转化至BL21(DE3)感染态细胞，并使用含有50μg/ml卡那霉素的LB培养板进行抗生素压力筛选，经过菌落PCR鉴定(如图2所示)和核酸测序分析后，得到重组菌。该菌中包含了步骤(1)中构建的重组质粒。

(3)挑取步骤(2)中筛选的重组菌的单菌落至5mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养后，再按1％的接种量接种到100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，25℃条件下培养至对数期，加入1mM的IPTG诱导剂，继续培养16h后，收集菌体。往上述菌体中加入PBS缓冲液，连续洗涤两次后，加入含有10mL 1％ Triton X-100的PBS缓冲液，冰上超声裂解菌体，12000rpm离心20min，收集上清Q1。利用Ni-Sepharose亲和层析柱，分离和纯化上清液Q1中的目的蛋白，收集洗脱液，得到G型产气荚膜梭菌的重组蛋白。

上述结果表明，重组菌经过诱导可以有效表达目的蛋白，大小约35Kda，重组蛋白的纯化结果如图3所示。

实施例3：口服疫苗的制备

(1)人工合成经过密码子优化的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，再通过带Not I酶切位点引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和Hind III酶切位点(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)的引物克隆得到片段1，同时，利用带BamH I酶切位点的引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示)克隆得到片段2，将上述两个片段依次酶切连接到pNZ8148载体上，并通过菌落PCR筛选正确阳性克隆，获得质粒8148-CACN，质粒图谱如图4所示。

表1引物信息

(2)制备NZ9000感受态细胞。首先，将NZ9000菌液划线于GM17固体培养基，厌氧条件下，30℃静置培养24h～36h；将平板划线后的单菌落挑取至5mL GM17液体培养基中，厌氧条件下，30℃静置培养12h～16h；按照5％比例接种至50mL新鲜G/L-SGM17液体培养基中，厌氧条件下，30℃静止培养，直至OD₆₀₀达到0.3～0.4(预计2h～3h)；4℃，5000g离心10min，弃上清，保留菌体沉淀；往菌体沉淀加入5mL洗涤液III，重悬菌体，室温条件下，静置30min；4℃，5000g离心10min，弃上清，保留菌体沉淀；往菌体沉淀加入5mL洗涤液I(预冷)，重悬菌体；4℃，5000g离心10min，弃上清，保留菌体沉淀；往菌体沉淀加入5mL洗涤液II(预冷)，重悬菌体；4℃，5000g离心10min，弃上清，保留菌体沉淀；往菌体沉淀加入1mL(1/50培养体积)洗涤液I(预冷)，重悬菌体，按照100μL/管分装感受态细胞(冰浴)，最后保存于-80℃冰箱备用。

其中，洗涤液I包括0.5mol/L蔗糖和10％甘油；洗涤液II包括0.5mol/L蔗糖、10％甘油和50mmol/L EDTA；洗涤液III包括100mmol/L乙酸锂二水、10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.6mol/L蔗糖和1mol/L Tris-HCl(pH为7.5)。

(3)将400ng步骤(1)制备的质粒8148-CACN加入到100μL NZ9000感受态细胞中，混匀后冰上放置5min；迅速转移至2mm电击杯(预冷10min以上)中，置于电转仪中，按照2.5kV，放电持续时间4.5ms～5ms；电转后迅速加入900μL复苏培养基(预冷)，冰浴5min；转移电转产物至1.5mL离心管，30℃静置培养2h；取100μL涂布于1/2000和1/4000氯霉素抗生素的GM17固体培养基，厌氧条件下，30℃静置培养36h～48h；挑取转化子进行菌落PCR鉴定，结果如图5所示，获得了与预期大小一致的菌落；由此制备口服疫苗。

本实施例将编码G型产气荚膜梭菌重组蛋白的核苷酸序列与表达载体连接，并通过pgsA(多聚钴胺酸合成酶A)定位到乳酸杆菌细胞表面进行展示表达；由此制备口服疫苗。

实施例4：G型产气荚膜梭菌疫苗的动物实验评估

(1)选取1日龄未接种疫苗的817肉鸡，分为3组，每组30只试验鸡。所有试验鸡均饲养于无球虫环境的笼具中，自由饮水和采食。其中，免疫组分别在1日龄、7日龄和14日龄进行皮下注射实施例2制备的重组蛋白。此后，免疫组和阳性对照组均在第26～29日龄进行G型产气荚膜梭菌的攻菌处理，按照8×10⁸CFU/只进行。

在1日龄、21日龄和30日龄时分别进行称重，并计算平均增重和相对增重率；在30日龄时，计算存活率；结果如表2所示。

存活率＝30日龄时存活鸡只数/21日龄时存活鸡只数*100％

平均增重(g)＝30日龄平均体重(g)-21日龄平均体重(g)

相对增重率(％)＝(感染鸡只的平均增重/未感染鸡只的平均增重)×100％

表2

实验组	相对增重率	存活率
			免疫组	102％	97％
阳性组	81％	97％
			阴性组	100％	100％

(2)剖杀部分鸡只，收集十二指肠、空肠、回肠和盲肠，进行病变计分和拍照记录。结果如表3和图6所示。

记分标准如下：0＝无明显病变，1＝肠粘膜充血，2＝小灶性坏死或溃疡(1～5个病灶)，3＝局灶性坏死或溃疡(6～15个病灶)；4＝局灶性坏死或溃疡(16个及以上病灶)

表3

实验组	十二指肠	空肠	盲肠
				免疫组	1.35	0.76	0.18
阳性组	2.42	1.00	0.68
				阴性组	1.45	0.50	0.15

可见，使用本申请的重组蛋白对鸡只进行免疫后，肠道病变较阳性对照组明显改善，而相对增重率和存活率与阴性对照组相近，表明本申请的重组蛋白可以有效地改善G型产气荚膜梭菌导致的肠道损伤。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种G型产气荚膜梭菌的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

2.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的重组蛋白。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其基因组中掺有权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

6.一种疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的重组蛋白。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，还包括佐剂。

8.成套的试剂盒，其特征在于，包含权利要求6～7任一项所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

9.权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的重组载体在制备防治G型产气荚膜梭菌感染的药物中的应用。