CN116284199A - 积雪草酸微生物转化衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了一种积雪草酸微生物转化衍生物及其制备方法与应用。本发明利用微生物的酶体系，对积雪草酸的母核非化学反应活性位点7位、20位，21位和22位成功地引入了羟基，并进一步使20位和28形成内酯，获得了2α,3β,7β,23‑四羟基‑20(21)‑双键乌苏烷‑28β‑羧酸和2α,3β,7β,23‑四羟基‑21(22)‑双键乌苏烷‑20β,28β‑内酯两个新颖的积雪草酸微生物转化衍生物，其具有更多的反应活性位点，可作为重要的医药中间体。且通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这两种积雪草酸微生物转化衍生物具有显著的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种积雪草酸微生物转化衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
积雪草酸(asiatic acid)又可称亚细亚酸，是伞形科植物积雪草中提取出的乌苏烷型五环三萜酸。70年代，研究人员发现积雪草酸具有促进皮肤创面修复的作用后，积雪草酸及其衍生物的结构修饰和药理活性逐渐成为人们关注的重点。但是此类化合物存在溶解度差，生物利用度低的问题，在临床应用上比较局限。化学修饰是解决此类问题的常用的方法，具体可以通过化学修饰对积雪草酸进行结构改造，以期能得到具有更强溶解性和生物活性的衍生物。然而，五环三萜类化合物结构具有特殊性，母核缺乏化学反应活性基团。利用有机化学方法对积雪草酸进行结构修饰的位点主要为积雪草酸中原有的两种化学反应活性基团——A环上2位、3位和23位的羟基以及D/E环上28位的羧基。积雪草酸母核上的大多数C-H键为非化学反应活性位点，采用常规化学反应方法难以对母核结构进行修饰，从而获得母核上具有羟基、羰基等化学活性基团修饰的衍生物。因此，严重限制了积雪草酸化学结构修饰的反应位点与衍生物的多样性。
微生物转化是利用微生物细胞体内的酶对底物进行结构修饰，使其转化成为其他化合物的过程。发酵真菌、放线菌等微生物在生长过程中产生的细胞内或细胞外特殊的酶不仅可以催化自身物质，对于外来化合物也能催化特定的化学反应，例如水解、氧化、还原、裂解、骨架重排等，因而成为了复杂天然产物结构修饰与改造的有力工具。本课题组长期从事天然活性成分的微生物转化研究，尤其是天然活性三萜的微生物转化研究。利用多种微生物对天然来源的常见三萜(包括达玛烷型、环阿尔廷烷型、乌苏烷型、齐墩果烷型三萜和羽扇豆烷型等)进行转化研究，发现微生物酶体系能选择性催化三萜母核上的多个非化学反应活性位点，从而获得母核上具有羟基、羰基等化学活性基团的衍生物(Journalofnaturalproducts 2021,84:2664-2674；Phytochemistry 2021,182:112608；NaturalProduct Research 2021,35(16):2685-2690；Phytochemistry 2019，166:112076；PlantaMedica 2019,85(1):56-61)。微生物转化产物一方面可以获得更强生物活性的衍生物直接用于药物研发，另一方面经微生物转化后母核上新引进的化学活性基团增加了进行化学修饰与改造的位点，解决了三萜类化合物有机化学制备衍生物反应位点少的难题。
而与有机化学的方法相比，微生物转化是不能从理论上或者发酵方法本身预测或确定哪个微生物具有转化的能力，也不能预测或确定转化产物的结构，只有制备得到化合物后经结构鉴定才能确认。已有研究表明，即使先导化合物结构差异不大，经过微生物酶体系选择性催化所获得的衍生物结构差异会非常显著。即使是相同的先导化合物，不同的微生物酶催化后所获得的衍生物结构也会有显著差异，而这也是微生物转化的多样性特色。因而，微生物转化法作为一种化合物结构修饰的方法，其产物结构具有多样性和不确定性的特征，只有制备获得并经结构确证才能最终确定。因此，微生物转化法并不能像有机化学那样先设计好化合物，然后再去反向合成。同时，自然界中微生物的种类繁多，挑选合适的微生物菌株是采用微生物转化法对积雪草酸进行结构修饰与改造的关键。
此外，自然界微生物种类繁多，不同种类的微生物具有的转化能力千差万别。而药物分子作为完整的化合物结构，仅仅是羰基、羟基和甲基的区别，表现出来的药理活性也会有显著差异。而在没有获得相应化合物并进行药理性测试之前，并不能准确预测其效果。因此，微生物菌株的筛选与选择对于发现活性更好的化合物至关重要。例如，Xu等人的研究就发现积雪草酸(4)经微生物转化后的产物(4a)并未表现出抗肿瘤活性(RSC Advances2017,7:20754)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种积雪草酸微生物转化衍生物及其制备方法与应用，该积雪草酸衍生物相比于积雪草酸具有更多可进行化学修饰与改造的位点以及更显著的抗肿瘤活性，可用于制备医药中间体或抗肿瘤的药物，医学用途广泛。
本发明提供了一种积雪草酸微生物转化衍生物，该积雪草酸微生物转化衍生物为2α,3β,7β,23-四羟基-20(21)-双键乌苏烷-28β-羧酸，具有式Ⅰ结构：
本发明提供了一种积雪草酸微生物转化衍生物，所述积雪草酸微生物转化衍生物为2α,3β,7β,23-四羟基-21(22)-双键乌苏烷-20β,28β-内酯，具有式Ⅱ结构：
本发明还提供了一种式Ⅰ结构或式Ⅱ结构所示积雪草酸微生物转化衍生物的制备方法，其制备过程的反应路线如下式所示，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入积雪草酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为小克银汉霉属的菌株；
2)将所述发酵液经萃取，得到转化物；
3)将所述转化物经过反相硅胶柱色谱纯化，所述反相硅胶柱纯化采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到2α,3β,7β,23-四羟基-20(21)-双键乌苏烷-28β-羧酸和2α,3β,7β,23-四羟基-21(22)-双键乌苏烷-20β,28β-内酯。
优选的，所述微生物为刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata CGMCC3.970。
优选的，步骤1)中，转化培养温度为28℃，摇床转速为140转/分，培养时间为72小时。
优选的，步骤2)中，所述萃取的萃取溶剂为二氯甲烷。
优选的，步骤3)中，优选梯度洗脱条件为甲醇：水20:80-40:60-60:40-80:20-100:0。
本发明还提供了一种医药中间体，所述医药中间体为式Ⅰ结构或式Ⅱ结构所示积雪草酸微生物转化衍生物或上述的制备方法制备得到的积雪草酸微生物转化衍生物。
式Ⅰ结构或式Ⅱ结构所示积雪草酸微生物转化衍生物或上述的制备方法制备得到的积雪草酸微生物转化衍生物在抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，能特异性的同时在母核上非化学反应活性位点7位、20位，21位和22位成功地进行结构修饰，引入了活性反应活性基团羟基，进一步的使20位和28形成内酯，从而获得了具有更多可进行化学修饰与改造的位点的积雪草酸微生物转化衍生物(化合物式Ⅰ和式Ⅱ)，可作为重要的医药中间体。通过体外抗肿瘤细胞试验证实，本发明获得的微生物转化衍生物具有更显著的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的新型积雪草酸衍生物及其制备方法进行详细描述。
实施例1：结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以积雪草酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤制备本发明化合物。小克银汉霉属(Cunninghamella)的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata CGMCC 3.970为例，制备结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物的过程如下：
1)发酵、转化以及萃取
将刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata CGMCC 3.970接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上140rpm、28℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg积雪草酸(0.2mL，100mg/mL乙醇溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化3天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的二氯甲烷萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.49g。
2)反相硅胶柱色谱分离
转化粗提物经反相硅胶柱色谱进行分离。甲醇：水梯度洗脱(20:80，40:60，60:40，80:20，100:0)。收集流份，经HPLC分析后合并，得合并组分A-E。
3)反相高效液相色谱纯化
合并组分E用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMCODSA-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(45:55，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的转化产物，其质谱和波谱数据如下所示。
化合物Ⅰ：2α,3β,7β,23-四羟基-20(21)-双键乌苏烷-28β-羧酸(2α,3β,7β,23-tetrahydroxyurs-20(21)-en-28-oic acid)；旋光度
(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3462,3035,2947,1723,1381,1217,1051cm-1；高分辨质谱m/z505.3529[M+H]+(calcd.505.3524for C30H49O6)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅱ：2α,3β,7β,23-四羟基-21(22)-双键乌苏烷-20β,28β-内酯(2α,3β,7β,23-tetrahydroxyurs-21(22)-en-28,20β-lactone)；旋光度
(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3511,3033,2934,1703,1428,1226,1069cm-1；高分辨质谱m/z503.3367[M+H]+(calcd.503.3367forC30H47O6)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
表1.化合物Ⅰ和Ⅱ的核磁氢谱和碳谱数据归属(氘代甲醇)
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2：化合物Ⅰ和Ⅱ的抗肿瘤活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试用肿瘤细胞株：Hela细胞(人宫颈癌细胞)、K562细胞(人白血病细胞)、K562/ADR细胞(人白血病耐药细胞)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)、Du-145(人前列腺癌细胞)、HePG2细胞(人肝癌细胞)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)、CT26细胞(结肠癌细胞)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
测试样品：积雪草酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ和Ⅱ，纯度在95％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM I 1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定570nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS 11.5软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(IC50)。
3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算测试样品对上述细胞的IC50值，结果如表2所示。
表2.测试样品体外细胞毒活性筛选结果
结果表明，本发明的化合物Ⅰ和Ⅱ具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种积雪草酸微生物转化衍生物，其特征在于，所述积雪草酸微生物转化衍生物为2α,3β,7β,23-四羟基-20(21)-双键乌苏烷-28β-羧酸，具有式Ⅰ结构：
2.一种积雪草酸微生物转化衍生物，其特征在于，所述积雪草酸微生物转化衍生物为2α,3β,7β,23-四羟基-21(22)-双键乌苏烷-20β,28β-内酯，具有式Ⅱ结构：
3.一种积雪草酸微生物转化衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入积雪草酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为小克银汉霉属的菌株；
2)将所述发酵液经萃取，得到转化物；
3)将所述转化物经过反相硅胶柱色谱纯化，所述反相硅胶柱纯化采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到2α,3β,7β,23-四羟基-20(21)-双键乌苏烷-28β-羧酸和2α,3β,7β,23-四羟基-21(22)-双键乌苏烷-20β,28β-内酯。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述微生物为刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata CGMCC 3.970。
5.一种医药中间体，其特征在于，所述医药中间体为权利要求1或2所述的积雪草酸微生物转化衍生物或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的积雪草酸微生物转化衍生物。
6.权利要求1或2所述的积雪草酸微生物转化衍生物或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的积雪草酸微生物转化衍生物在抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
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