[go: up one dir, main page]

CN116249557A - 包含抗癌药物的线粒体及其应用 - Google Patents

包含抗癌药物的线粒体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116249557A
CN116249557A CN202180072536.2A CN202180072536A CN116249557A CN 116249557 A CN116249557 A CN 116249557A CN 202180072536 A CN202180072536 A CN 202180072536A CN 116249557 A CN116249557 A CN 116249557A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ser
pro
gly
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180072536.2A
Other languages
English (en)
Inventor
金天炯
韩圭范
柳信惠
金有珍
李叙溵
朴钟赫
曺佳煐
姜荣哲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paean Biotechnology Inc
Original Assignee
Paean Biotechnology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paean Biotechnology Inc filed Critical Paean Biotechnology Inc
Publication of CN116249557A publication Critical patent/CN116249557A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/548—Phosphates or phosphonates, e.g. bone-seeking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种包含具有抗癌功效的化合物的线粒体及其用途。证实了线粒体高效地递送化合物到肿瘤，并证实了包括该化合物的线粒体的抗癌效果。特别是，当与肿瘤特异性结合的抗体或其片段结合到线粒体表面时，该化合物的肿瘤特异性递送是可能的。因此，由于该化合物的副作用较小，根据本发明的包括该化合物的线粒体可有效地用于癌症治疗。

Description

包含抗癌药物的线粒体及其应用
技术领域
本发明提供了一种能够修饰线粒体的化合物，包含该化合物的线粒体，以及包含该线粒体作为活性成分的药物组合物。
背景技术
线粒体是真核细胞的细胞器，参与细胞内能量来源——三磷酸腺苷(ATP)的合成和调控。线粒体与体内的各种代谢途径有关，例如，细胞信号传导、细胞分化、细胞死亡，以及细胞周期和细胞生长的控制。线粒体有它们自己的基因组，是在细胞的能量代谢中发挥核心作用的细胞器。线粒体通过电子传递和氧化磷酸化过程生产能量，并在参与细胞凋亡信号传导途径方面发挥重要作用。
据报道，由于线粒体功能的下降，能量生产减少会引发各种疾病。当电子传递链反应的功能随着线粒体基因组和蛋白质组的变化而下降时，就会出现ATP生产的减少、活性氧的过度生产、钙调控功能的下降等。在这种情况下，线粒体的膜通透性发生变化，细胞凋亡的功能可能发生异常，并导致癌症和不治之症。
因此，据报道的由线粒体功能障碍导致的人类疾病，包括与线粒体相关遗传病、糖尿病、心脏病、帕金森病或阿尔茨海默病等老年痴呆症，以及各种癌症和癌症转移的发生等等。此外，在200多种各种癌症中常见的特征有细胞凋亡功能损伤，增加的炎症应答，以及增加的异常代谢。所有这些过程都与线粒体功能密切相关，癌症和线粒体之间的相关性备受关注。
另一方面，已知正常细胞通过电子传递系统过程，每个葡萄糖分子生产36个ATP。但癌细胞与正常细胞不同，在氧气充足的条件下，通过糖酵解过程，每个葡萄糖分子生产2个ATP(有氧糖酵解)。因此，可知癌细胞与正常细胞不同，在能量方面使用低效的糖酵解过程，以生产细胞快速增殖所需的氨基酸、脂类、核酸等。由于这个原因，可知癌细胞比正常细胞需要更少的氧气并生产更大量的乳酸。
因此，由于癌细胞中发生的异常代谢导致的癌症微环境组成的变化、线粒体功能失调导致的细胞凋亡的抑制、炎症应答的增加，以及癌细胞中的异常代谢反应在癌症增殖中起着非常重要的作用。因此，利用这些特征开发代谢相关的抗癌剂可能是一种能够解决传统抗癌剂的副作用和经济问题的好方法。另一方面，最近有将线粒体作为药物直接施用或开发的尝试(韩国注册专利第10-2111321号)。
发明内容
技术问题
因此，本发明人在研究线粒体的抗癌活性过程中，通过证实线粒体与常规使用的抗癌剂联合使用时具有优异的抗癌效果，完成了本发明。
技术方案
在本发明的一个方面，提供了一种包含抗癌剂的线粒体和包含其的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供了一种制备包含抗癌剂的线粒体的方法，其包括混合抗癌剂和分离的线粒体。
在本发明的另一个方面，提供了一种修饰的抗癌剂，TPP与抗癌剂化学结合。
在本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗癌症的方法，其包括向受试者施用包括线粒体的药物组合物，该线粒体包含抗癌剂。
发明效果
证实了根据本发明的包含具有抗癌功效的化合物的线粒体能高效地递送化合物到肿瘤，并且证实了包含该化合物的线粒体的抗癌效果。具体地，当与肿瘤特异性结合的抗体或其片段与线粒体表面结合时，该化合物可被特异性地递送到肿瘤。因此，由于该化合物的副作用很少，根据本发明的包含该化合物的线粒体可有效地用于治疗癌症。
附图说明
图1显示了用于表达融合线粒体形式的抗HER2抗体单链可变区片段的表达载体的示意图。
图2显示了通过Western blot证实的抗HER2抗体单链可变区片段在人胎肾细胞系(HEK293)中表达的结果。
图3显示了通过共聚焦显微镜证实的在人胎肾细胞系(HEK293)中表达的抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内位置的结果。比例尺代表10μm。
图4显示了通过Western blot证实的在人胎肾细胞系(HEK293)中表达的抗HER2抗体的单链可变区片段与线粒体存在于细胞内同一位置的结果。
图5显示了从表达抗HER2抗体单链可变区片段的人胎肾细胞系(HEK293)中分离的线粒体(MTα-HER2scFv)中ATP的测量结果图表。在这种情况下，对照组为从不表达抗HER2抗体单链可变区片段的HEK293细胞中分离的线粒体。
图6显示了从表达抗HER2抗体单链可变区片段的人胎肾细胞系(HEK293)中分离的线粒体(MTα-HER2scFv)的膜电位的测量结果图表。在这种情况下，对照组为从不表达抗HER2抗体单链可变区片段的HEK293细胞中分离的线粒体。
图7显示了从表达抗HER2抗体单链可变区片段的人胎肾细胞系(HEK293)中分离的线粒体(MTα-HER2scFv)中的活性氧(ROS)的测量结果图表。在这种情况下，对照组为从不表达抗HER2抗体单链可变区片段的HEK293细胞中分离的线粒体。
图8显示了通过Western blot证实的HER2在人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、肺成纤维细胞系(WI-38)和人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)中表达的结果。
图9显示了通过免疫细胞化学染色证实的HER2在人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人肺成纤维细胞系(WI-38)和人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)中表达的结果。
图10显示了通过流式细胞仪证实的HER2在人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)和人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)中表达的结果。
图11显示了用于验证从表达抗HER2抗体单链可变区片段的人胎肾细胞系(HEK293)中分离出的线粒体(MTα-HER2scFv)的HER2靶向能力的实验方法。
图12显示了将HER2+细胞(人乳腺癌细胞系SK-BR-3)和HER2-细胞(人肺癌细胞系NCI-H1975)共培养，然后用MTα-HER2scFv处理培养液后，通过免疫细胞化学染色证实的HER2和抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗HER2抗体的单链可变区片段。
图13显示了将HER2+细胞(人乳腺癌细胞系BT-474)和HER2-细胞(人肺癌细胞系NCI-H1975)共培养，然后用MTα-HER2scFv处理细胞后，通过免疫细胞化学染色证实的HER2和抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗HER2抗体的单链可变区片段。
图14显示了将HER2+细胞(人胃癌细胞系NCI-N87)和HER2-细胞(人胃癌细胞系MKN-74)共培养，然后用MTα-HER2scFv处理细胞后，通过免疫细胞化学染色证实的HER2和抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗HER2抗体的单链可变区片段。
图15显示了将HER2+细胞(人乳腺癌细胞系SK-BR-3)和HER2-细胞(人乳腺癌细胞系MDA-MB-231)共培养，然后用MTα-HER2scFv处理细胞后，通过免疫细胞化学染色证实的HER2和抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗HER2抗体的单链可变区片段。
图16显示了将HER2+细胞(人乳腺癌细胞系BT-474)和HER2-细胞(人乳腺癌细胞系MDA-MB-231)共培养，然后用MTα-HER2scFv处理细胞后，通过免疫细胞化学染色证实的HER2和抗HER2抗体单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗HER2抗体的单链可变区片段。
图17显示了制备DOX_MTα-HER2scFv的方法，其中MTα-HER2scFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷多柔比星(doxorubicin)结合。
图18显示了通过共聚焦显微镜观察到的人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)和人肺癌细胞系(NCI-H1975)用DOX_MTα-HER2scFv处理后的结果。
图19显示了通过共聚焦显微镜观察到的人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)用DOX_MTα-HER2scFv处理后，癌细胞随时间的形态学变化和死亡过程的结果。
图20显示了通过测量每种浓度的多柔比星的吸光度得到的标准曲线表。
图21显示了测量用DOX或DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)和人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)的细胞毒性的结果图表。在这种情况下，MT为没有负载DOX的MTα-HER2scFv。
图22显示了测量用DOX或DOX_MTα-HER2scFv处理人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)的细胞毒性的结果图表。在这种情况下，MT为没有装载DOX的MTα-HER2scFv。
图23显示了证实DOX或DOX_MTα-HER2scFv在人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)和人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)中IC50值的结果。
图24显示了测量用0.5μM DOX或DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)、人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)的细胞毒性的结果图表。在这种情况下，MT为没有装载DOX的MTα-HER2scFv。
图25显示了通过TUNEL检测证实人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)用MTα-HER2scFv或DOX_MTα-HER2scFv处理后细胞凋亡的结果。
图26显示了通过Western blot证实由MTα-HER2scFv或DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)引起的细胞凋亡的结果。
图27显示了通过流式细胞仪证实人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)用MTα-HER2scFv或DOX_MTα-HER2scFv处理后细胞凋亡的结果。在这种情况下，MT为没有装载DOX的MTα-HER2scFv。
图28显示了证实DOX_MTα-HER2scFv对表达HER2的癌细胞的选择性杀伤作用的实验方法。
图29显示了通过TUNEL检测证实将人乳腺癌细胞系BT-474(HER2+，白色箭头)和人肺成纤维细胞系WI-38(HER2-)共培养，然后用DOX_MTα-HER2scFv处理细胞的细胞凋亡的结果。
图30显示了三苯基膦(TPP)-多柔比星(TPP-DOX)的合成过程。
图31显示了TPP-DOX的MRI分析结果。
图32显示了制备TPP-DOX_MTα-HER2scFv的方法，其中MTα-HER2scFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷TPP-DOX结合。
图33显示了通过共聚焦显微镜观察到的人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)和肺癌细胞系(NCI-H1975)用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理后的结果。
图34显示了通过共聚焦显微镜观察到的人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理后，癌细胞的形态学变化和死亡过程的结果。
图35显示了测量用TPP-DOX和TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)和人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)的细胞毒性的结果。在这种情况下，MT为没有装载DOX的MTα-HER2scFv。
图36是显示测量用TPP-DOX和TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)的细胞毒性的结果。在这种情况下，MT为没有装载DOX的MTα-HER2scFv。
图37显示了证实的TPP-DOX和TPP-DOX_MTα-HER2scFv在人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)和人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)中IC50值的结果。
图38显示了测量用0.5μM TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)和人肺成纤维细胞系(WI-38和CCD-8Lu)的细胞毒性的结果。
图39显示了通过TUNEL检测证实人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474及MDA-MB-231)和胃癌细胞系(NCI-N87)用MTα-HER2scFv或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理后细胞凋亡的结果。
图40显示了通过Western blot证实由MTα-HER2scFv或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)引起的细胞凋亡的结果。
图41显示了通过流式细胞仪证实的由MTα-HER2scFv或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和胃癌细胞系(NCI-N87)引起的细胞凋亡的结果。
图42显示了证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv对表达HER2的细胞的选择性杀伤作用的实验方法。
图43显示了通过TUNEL检测证实将人乳腺癌细胞系SK-BR-3(HER2+，白色箭头)和人肺成纤维细胞系CCD-8Lu(HER2-)共培养，然后用TTP-DOX_MTα-HER2scFv处理细胞后的细胞凋亡的结果。
图44显示了用于表达融合线粒体形式的抗PDL1抗体单链可变区片段的表达载体的示意图。
图45显示了通过Western blot证实在人胎肾细胞系(HEK293)中表达的抗PDL1抗体单链可变区片段的结果。
图46显示了通过Western blot证实PD-L1在人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)中表达的结果。
图47显示了用于验证将PDL1+细胞和PDL1-细胞共培养，然后用从表达抗PDL1抗体单链可变区片段的人胎肾细胞系(HEK293)中分离出来的线粒体(MTα-PDL1scFv)处理细胞后，MTα-PDL1scFv的PDL1靶向能力的实验方法。
图48显示了通过免疫细胞化学染色证实的将人胃癌细胞系SNU-216(PDL1+，白色箭头)和SNU-484(PDL1-)共培养，或将人胰腺癌细胞系BXPC-3(PDL1+，白色箭头)和人胰腺癌细胞系CFPAC-1(PDL1-)共培养，然后用MTα-PDL1scFv处理细胞后，抗PDL1抗体的单链可变区片段的细胞内表达的结果。在这种情况下，MT为从HEK293细胞中分离出来的线粒体，其没有融合抗PDL1抗体的单链可变区片段。
图49显示了制备DOX_MTα-PDL1scFv的方法，其中MTα-PDL1scFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷多柔比星(DOX)结合。
图50显示了测量用MTα-PDL1scFv或DOX_MTα-PDL1scFv处理人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)的细胞毒性的结果图表。
图51显示了通过Western blot证实的人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)用MTα-PDL1scFv或DOX_MTα-PDL1scFv处理后的的细胞凋亡的结果。
图52显示了用于表达融合线粒体形式的抗间皮素(MSLN)抗体的单链可变区片段的表达载体的示意图。
图53显示了通过Western blot证实抗MSLN抗体的单链可变区片段在人胎肾细胞系(HEK293)中表达的结果。
图54显示了制备PBA_MTα-MSLNscFv的方法，其中MTα-MSLNscFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷脱镁叶绿酸A(PBA)结合。
图55显示了测量用MTα-MSLNscFv或PBA_MTα-MSLNscFv处理人类胰腺癌细胞系(AsPC-1)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为PBA_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图56显示了测量用MTα-MSLNscFv或PBA_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系(Capan-1)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为PBA_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图57显示了测量用MTα-MSLNscFv或PBA_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系(Capan-2)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为PBA_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图58显示了测量用MTα-MSLNscFv或PBA_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系(Mia PaCa-2)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为PBA_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图59显示了制备Gem_MTα-MSLNscFv的方法，其中MTα-MSLNscFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷吉西他滨(gemcitabine)结合。
图60显示了测量用MTα-MSLNscFv或Gem_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系(AsPC-1、Capan-1、Capan-2和Mia PaCa-2)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为Gem_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图61显示了制备VIBE_MTα-MSLNscFv的方法，其中MTα-MSLNscFv用MitoTracker Green染色并与化合物有效载荷长春瑞宾(vinorelbine)结合。
图62显示了测量用MTα-MSLNscFv或VIBE_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系(AsPC-1、Capan-1、Capan-2和Mia PaCa-2)的细胞毒性的结果图表。MTα-MSLNscFv为VIBE_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
图63显示了用于验证向移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型施用MTα-HER2scFv后，MTα-HER2scFv的HER2靶向能力的实验方法。
图64显示了观察到的向移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型施用MTα-HER2scFv后，MTα-HER2scFv位于肿瘤中的结果。
图65显示了用于证实TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv在移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型中的抗癌功效的实验方法。
图66显示了向移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型施用TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv后按日期测量肿瘤大小(肿瘤体积)的结果。
图67为证实了从开始施用TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的25天后，在移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型中提取的肿瘤大小的示意图。
图68显示了从开始施用TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的25天后，测量在移植人胃癌细胞系NCI-N87(HER2+)形成的异种移植小鼠模型中提取的肿瘤重量的结果图表。
图69显示了在移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中，证实MTα-HER2scFv、TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的抗癌功效的实验方法。
图70显示了向移植过量表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型施用MTα-HER2scFv、TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv后按日期测量肿瘤大小(肿瘤体积)的结果。
图71为证实了从开始施用MTα-HER2scFv、TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的21天后，移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中提取的肿瘤大小的示意图。
图72显示了从开始施用MTα-HER2scFv、TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的21天后，测量在移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中提取的肿瘤重量的结果图表。
图73显示了用于证实在移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中，MTα-HER2scFv、DOX或DOX_MTα-HER2scFv的抗癌效果的实验方法。
图74显示了向移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型施用MTα-HER2scFv、DOX或DOX_MTα-HER2scFv后按日期测量肿瘤大小的结果图表。
图75为证实了从开始施用MTα-HER2scFv、TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv的21天后，移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中提取的肿瘤大小。
图76显示了从开始施用MTα-HER2scFv、DOX或DOX_MTα-HER2scFv的21天后，测量在移植过表达人HER2的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10形成的异体移植小鼠模型中提取的肿瘤重量的结果图表。
具体实施方式
包含抗癌剂的线粒体
在本发明的一个方面，提供了一种包含抗癌剂的线粒体。此外，在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括包含抗癌剂的线粒体作为活性成分。
如本文所用，术语“线粒体”是真核细胞的细胞器，参与细胞内能量来源——三磷酸腺苷(ATP)的合成和调控。线粒体与体内的各种代谢途径有关，例如，细胞信号传导、细胞分化、细胞死亡，以及细胞周期和细胞生长的控制。因此，有报道称，由于遗传、环境或未知原因导致的线粒体功能下调或失调与线粒体相关的遗传病、如类风湿性关节炎的炎症性疾病、缺血性疾病、感染性疾病、心脏病、肌肉疾病、如帕金森病或阿尔茨海默病的退行性疾病等的发生以及各种疾病的发展，例如致癌和癌症转移，有关。
线粒体可以从真核生物中获得，也可以从哺乳动物或人类中获得。具体来说，线粒体可以从细胞或组织中分离出来。例如，线粒体可从体细胞、生殖细胞或干细胞中获得，并可从血细胞或血小板中分离。此外，线粒体可以通过浓缩从而裂解组织或细胞后分离出来，或者可以通过冻存后解冻从而裂解组织或细胞样品后分离出来。
具体来说，体细胞可以是肌肉细胞、肝细胞、神经细胞、成纤维细胞、上皮细胞、脂肪细胞、骨细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板或黏膜细胞。
此外，干细胞是具有分化为各种类型的组织细胞的能力的未分化的细胞，并可以是选自由间质干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、肢体干细胞和组织来源的干细胞组成的组中的任何一种，但不限于此。在这种情况下，间质干细胞可以从选自由脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、滑液、睾丸、羊膜和胎盘组成的组中的任何一种中获得。
此外，线粒体可以通过体外培养细胞或组织分离出来，也可以从冻存后解冻的样品中分离出来。
此外，线粒体可以从自体(autologous)、异体(allogenic)或异种(xenogenic)受试者中获得。具体来说，自体线粒体是指从同一受试者的组织或细胞中获得的线粒体。此外，异体线粒体是指从与受试者属于同一物种且具有不同等位基因型的另一受试者中获得的线粒体。此外，异种线粒体是指从与受试者属于不同物种的另一受试者中获得的线粒体。
此外，线粒体可以是从细胞中分离出来的线粒体。此外，线粒体可以是完整的并具有线粒体活性。
另一方面，当线粒体从特定的细胞中分离出来时，线粒体可以通过各种改进的方法来分离，包括各种已知的方法，例如，使用特定的缓冲溶液或使用电位差和磁场等。
为保持线粒体活性，分离线粒体可以通过裂解细胞并离心来获得。
在这种情况下，抗癌剂可能存在于线粒体的外膜中。具体来说，抗癌剂可以位于外膜和内膜之间。此外，抗癌剂可以位于嵴中。它也可以存在于内膜内部的基质中。
此外，线粒体可以是修饰的线粒体。在这种情况下，修饰的线粒体可以是细胞表面存在与肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的抗体或其片段的线粒体。
在这种情况下，肿瘤相关抗原可以是选自由CD19、CD20、黑色素瘤抗原E(MAGE)、NY-ESO-1、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、生存素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白2(tyrp2)、短尾畸形(Brachyury)、间皮素(Mesothelin)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、ERBB2、Wilms肿瘤蛋白(WT1)、FAP、EpCAM、PD-L1、ACPP、CPT1A、IFNG、CD274、FOLR1、EPCAM、ICAM2、NCAM1、LRRC4、UNC5H2 LILRB2、CEACAM、MSLN、结合素-3及其组合组成的组中的任何一种，但不限于上述类型。
如本文所用，术语“癌症”归类为正常组织细胞因某些原因而无限增殖，并且不顾活体的生命现象或周围组织状况持续快速生长的疾病。在本发明中，癌症可以是选自由人体各种癌症，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中的任何一种癌症，但不限于上述类型。
如本文所用，术语“抗癌剂”是用于抑制癌细胞增殖的药物。在本发明中，抗癌剂可选自由化学抗癌剂、靶向抗癌剂和驱虫剂组成的组，但不限于此。
具体来说，“化学抗癌剂”可以是选自由烷基化剂(alkylating agent)、微管抑制剂(microtuble inhibitor)、抗代谢剂(antimetbolite)和拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)组成的组中的任何一种，但不限于此。
烷基化剂可以是选自由二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、氯霉素(chlorambucil)、硫特帕(thiotepa)、六甲密胺(altretamine)、甲基苄肼(procarbazine)、布洛芬(busulfan)、链霉素(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)、伊莫司汀(iomustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多柔比星(doxorubincin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)组成的组，但不限于此。微管抑制剂可以是选自多西他赛(docetaxel)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(vinorelbine)的组成的组中的任何一种，但不限于此。抗代谢剂可以是选自由氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)和巯基嘌呤(mercaptopurine)组成的组中的任何一种，但不限于此。拓扑异构酶抑制剂可以是选自由拓扑替康(hycamtin)、伊立替康(camptosar)、依托泊苷(vepesid)、紫杉醇(taxol)、博来霉素(bleomycin)、阿霉素(adriamycin)和柔红霉素(cerubidine)组成的组中的任何一种，但不限于此。
此外，“靶向抗癌剂”可以是调控特定靶向生物标志物的化合物。例如，靶向抗癌剂可以是选自由靶向BTK、Bcr-abl、EGFR、PDGFR/VEGFR/FGFR家族、MEK/RAF、HER2/Neu、CDK、泛素、JAK、MAP2K、ALK、PARP、TGFβRI、蛋白酶体、Bcl-2、Braf、C-Met、VR1、VR2、VR3、c-kit、AXL和RET的化合物组成的组的任何一种，但不限于此。
靶向抗癌剂中的化合物的一个实施方案可以是靶向BTK的依鲁替尼(Ibrutinib)。此外，它可以是靶向Bcr-abl的达沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、伊马替尼(Imatinib)或伯舒替尼(Bosutinib)。此外，它可以是靶向EGFR的奥希替尼(Osimertinib)、厄洛替尼(Erlotinib)或吉非替尼(Gefitinib)，但不限于此。此外，它可以是靶向PDGFR/VEGFR/FGFR家族的尼达尼布(Nintedanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、卡博替尼(Cabozantinib)、仑瓦替尼(Lenvatinib)、瑞格非尼(Regorafenib)、马赛替尼(Masitinib)、司马沙尼(Semaxanib)、替沃扎尼(Tivozanib)、凡德他尼(Vandetanib)、阿西替尼(Axitinib)或帕唑帕尼(Pazapanib)，但不限于此。此外，它可以是靶向MEK/RAF的曲美替尼(Trametinib)/达拉非尼(Dabrafenib)，但不限于此。
此外，它可以是靶向HER2/Neu的阿法替尼(Afatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)或来那替尼(Neratinib)，但不限于此。此外，它可以是靶向CDK的玻玛西尼(Abemaciclib)或帕博西尼(Palbociclib)，但不限于此。此外，它可以是靶向泛素的来那度胺(Lenalidomide)，但不限于此。此外，它可以是靶向JAK的芦可替尼(Ruxolitinib)、来他替尼(Lestaurtinib)或帕克替尼(Pacritinib)，但不限于此。此外，它可以是靶向MAP2K的考比替尼(Cobimethinib)、司美替尼(Selumetinib)、曲美替尼(Trametinib)或比美替尼(Binimetinib)，但不限于此。此外，它可以是靶向ALK的艾乐替尼(Alectinib)或克唑替尼(Crizotinib)，但不限于此。此外，它可以是靶向PARP的奥拉帕尼(Olaparib)，但不限于此。此外，它可以是靶向TGFβRI的galunisertib，但不限于此。此外，它可以是靶向蛋白酶体的伊沙佐米(Ixazomib)，但不限于此。此外，它可以是靶向Bcl-2的维奈托克(Venetoclax)，但不限于此。此外，它可以是靶向Braf的维莫非尼(Vemurafenib)，但不限于此。
此外，“驱虫剂”可以是选自由OXPHOS(氧化磷酸化)抑制剂、糖酵解抑制剂、糖酵解相关间接抑制剂、PPP(磷酸戊糖途径)抑制剂和自噬抑制剂组成的组中的任何一种，但不限于此。具体来说，驱虫剂可以是选自由吡维氯铵(pyrvinium)、氯硝柳胺(niclosamide)、硝唑尼特、伊维菌素、芬苯达唑、硝唑尼特和阿苯达唑组成的组中的任何一种，但不限于此。
修饰的线粒体
修饰的线粒体指线粒体外膜上结合外源蛋白的线粒体。在这种情况下，修饰的线粒体可能在韩国专利申请公开第10-2019-0048279号中公开。
如本文所用，术语“外源蛋白”指包含能够在细胞内外发挥作用的靶蛋白的蛋白。在这种情况下，外源蛋白为不存在于线粒体中的蛋白，可以是重组蛋白。具体来说，外源蛋白可以包括线粒体锚定肽和靶蛋白。此外，外源蛋白可以是包括线粒体锚定肽和靶蛋白的重组融合蛋白。在这种情况下，外源蛋白可以包括线粒体锚定肽。优选地，线粒体锚定肽可以是可位于线粒体外膜上的肽。因此，外源蛋白可以通过线粒体锚定肽与线粒体外膜结合。线粒体锚定肽可以是包括蛋白的N端区域或C端区域的多肽，所述蛋白存在于线粒体膜蛋白中；上述存在于线粒体蛋白外膜的蛋白的N端区域或C端区域可位于线粒体外膜上。在这种情况下，锚定肽可进一步包括线粒体信号序列。
存在于线粒体膜蛋白中的蛋白的一个实施方案可以是选自由TOM20、TOM70、OM45、TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中的任何一种。特别是，当线粒体锚定肽源自选自由TOM20、TOM70和OM45组成的组中的任何一种时，它可以包括TOM20、TOM70或OM45的N端区域。线粒体锚定肽的一个实施方案可以是如SEQ ID NO:75所示的源自酵母的TOM70，或如SEQ ID NO:76所示的源自人类的TOM70。另一个实施方案可以是如SEQID NO:77所示的源自酵母的TOM20，或如SEQ ID NO:78所示的源自人类的TOM20。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:79所示的源自酵母的OM45。
此外，当线粒体锚定肽源自选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中的任何一种时，它可以包括选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中的任何一种的C端区域。线粒体锚定肽的一个实施方案可以是如SEQ ID NO:80所示的源自酵母的TOM5或如SEQ ID NO:81所示的源自人类的TOM5。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:82所示的源自酵母的TOM7，或如SEQ ID NO:83所示的源自人类的TOM7。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:84所示的源自酵母的TOM22，或如SEQ ID NO:85所示的源自人类的TOM22。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:86所示的源自酵母的Fis1，或如SEQ ID NO:87所示的源自人类的Fis1。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:88所示的源自人类的Bcl-2alpha。另一个实施方案可以是如SEQ ID NO:89所示的源自酵母的VAMP1，或如SEQ ID NO:90所示的源自人类的VAMP1。
在这种情况下，包含在外源蛋白中的能够在细胞内外发挥作用的靶蛋白可以是选自由在细胞中表现出活性的活性蛋白，存在于细胞中的蛋白，以及具有与存在于细胞膜中的配体或受体结合能力的蛋白组成的组中的任何一种。
活性蛋白或存在于细胞中的蛋白的一个实施方案可以是选自由p53、颗粒酶B(Granzyme B)、Bax、Bak、PDCD5、E2F、AP-1(Jun/Fos)、EGR-1、视网膜母细胞瘤(RB)、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、钙黏蛋白(E-cadherin)、神经纤维瘤蛋白-2(NF-2)、聚[ADP-核糖]合成酶1(PARP-1)、BRCA-1、BRCA-2、腺瘤性结肠息肉(APC)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)、RAF激酶抑制蛋白(RKIP)、p16、KLF-10、LKB1、LHX6、C-RASSF、DKK-3PD1、Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc组成的组中的任何一种。当靶蛋白选自上述组时，靶蛋白可与包括TOM20、TOM70或OM45的N端区域的锚定肽结合。
这种融合蛋白可按照以下顺序结合：
N端-包括TOM20、TOM70或OM45的N端区域的锚定肽-靶蛋白-C端。
此外，外源蛋白可以进一步包括在线粒体锚定肽和靶蛋白之间被真核细胞中的蛋白水解酶、泛素或其片段识别的氨基酸序列。真核细胞中的蛋白水解酶指降解存在于真核细胞中的蛋白的酶。在这种情况下，由于外源蛋白包括被降解蛋白的酶所识别的氨基酸序列，因此与线粒体外膜结合的外源蛋白可在细胞内分离为锚定肽和靶蛋白。
在这种情况下，泛素片段可以包括如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的C端Gly-Gly，并且可以包括从C端连续的3-75个氨基酸。此外，外源蛋白可以进一步包括靶蛋白与泛素或其片段之间的连接子。在这种情况下，连接子可以由1-150个氨基酸组成，或由10-100个氨基酸组成，或由20-50个氨基酸组成，但不限于此。连接子可以由从20个氨基酸中适当选择的氨基酸组成，优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成。连接子的一个实施方案可以是由甘氨酸和丝氨酸组成的5-50个氨基酸组成。连接子的一个实施方案可以是(G4S)n，其中n是1-10的整数，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
此外，具有与存在于细胞膜中的配体或受体结合能力的蛋白可以是存在于肿瘤细胞表面的配体或受体。在这种情况下，存在于肿瘤细胞表面的配体或受体可以是，但不限于，由CD19、CD20、黑色素瘤抗原E(MAGE)、NY-ESO-1、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、生存素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白2(tyrp2)、短尾畸形(Brachyury)、间皮素(Mesothelin)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、ERBB2、Wilms肿瘤蛋白(WT1)、FAP、EpCAM、PD-L1、ACPP、CPT1A、IFNG、CD274、FOLR1、EPCAM、ICAM2、NCAM1、LRRC4、UNC5H2LILRB2、CEACAM、结合素3及其组合组成的组中的任何一种。
此外，具有与存在于细胞膜中的配体或受体结合能力的蛋白可以是与选自上述组的任何一种结合的抗体或其片段。特别是，抗体片段指具有与抗体相同的互补性决定区(CDR)的片段。具体来说，它可以是Fab、scFv、F(ab')2或其组合。
在这种情况下，靶蛋白可以与包括选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中任何一种的C端区域的锚定肽结合，并且外源蛋白可以按以下顺序来结合：
N端-靶蛋白-包括选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中任何一种的C端区域的锚定肽-C端。
此外，外源蛋白可以进一步包括在靶蛋白和选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中任何一种的C端区域之间的连接子。在这种情况下，连接子如上所述。在这种情况下，靶蛋白、活性蛋白、存在于细胞中的蛋白和具有与存在于细胞膜中的配体或受体结合能力的蛋白等如上所述。
在靶蛋白的一个实施方案中，靶向特定细胞的抗体或其片段可以是与包括选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-x和VAMP1B组成的组中任何一种的C端区域的锚定肽结合的形式。与靶蛋白结合的修饰的线粒体可以容易地引入特定靶点，从而使线粒体可以有效地进入特定的细胞中。
修饰的线粒体的一个实施方案可以是与一个或多个靶蛋白结合的形式。具体来说，它可以是与包括p53的靶蛋白和包括抗HER-2抗体或其片段的靶蛋白结合的形式。这种修饰的线粒体可有效地将线粒体递送到表达HER-2的癌细胞中。此外，癌细胞可有效地被与修饰的线粒体结合的p53杀伤。
根据修饰的线粒体的目的，可以构建包括一种或多种活性蛋白的靶蛋白，并使其与线粒体结合。此外，根据靶细胞的情况，可以用各种方式构建靶向细胞的靶蛋白。
包括线粒体外膜靶向蛋白和靶蛋白的融合蛋白可被称为改进线粒体活性的融合蛋白。这种融合蛋白可具有以下结构的任何一种：
<结构式1>
N端-线粒体外膜锚定肽-靶蛋白-C端
<结构式2>
N端-线粒体外膜锚定肽-泛素或其片段-靶蛋白-C端
<结构式3>
N端-线粒体外膜靶向肽-连接子1-泛素或其片段-靶蛋白-C端
<结构式4>
N端-线粒体外膜锚定肽-泛素或其片段-连接子2-靶蛋白-C端
<结构式5>
N端-线粒体外膜靶向肽-连接子1-泛素或其片段-连接子2-靶蛋白-C端
在上述结构式1-5中，外膜锚定肽可以是选自由TOM20、TOM70和OM45组成的组的蛋白质的末端序列，靶蛋白可以是选自由p53、颗粒酶B(Granzyme B)、Bax、Bak、PDCD5、E2F、AP-1(Jun/Fos)、EGR-1、视网膜母细胞瘤(RB)、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、钙黏蛋白(E-cadherin)、神经纤维瘤蛋白-2(NF-2)、聚[ADP-核糖]合成酶1(PARP-1)、BRCA-1、BRCA-2、腺瘤性结肠息肉(APC)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)、RAF激酶抑制蛋白(RKIP)、p16、KLF-10、LKB1、LHX6、C-RASSF和DKK-3PD1组成的组中的任何一种。
在这种情况下，连接子1或2可以分别是由1-100、1-80、1-50或1-30个氨基酸组成的多肽，且可以优选为由丝氨酸、甘氨酸或苏氨酸单独或组合而成的由1-30个氨基酸组成的多肽。此外，连接子1或2可以分别是由5-15个氨基酸组成的多肽，且可以优选为由丝氨酸、甘氨酸或苏氨酸单独或组合而成的由5-15个氨基酸组成的多肽。连接子的一个实施方案可以是(GGGGS)3(SEQ ID NO:70)。
<结构式6>
N端-靶蛋白-线粒体外膜锚定肽-C端
<结构式7>
N端-靶蛋白-泛素或其片段-线粒体外膜锚定肽-C端
<结构式8>
N端-靶蛋白-连接子1-泛素或其片段-线粒体外膜锚定肽-C端
<结构式9>
N端-靶蛋白-泛素或其片段-连接子2-线粒体外膜锚定肽-C端
<结构式10>
N端-靶蛋白-连接子1-泛素或其片段-连接子2-线粒体外膜靶向肽-C端
在上述结构式6-10中，外膜锚定肽可以是选自由TOM5、TOM6、TOM7、TOM22、Fis1、Bcl-2、Bcl-X和VAMP1B组成的组的蛋白质的末端序列，靶蛋白可以是选自由p53、颗粒酶B(Granzyme B)、Bax、Bak、PDCD5、E2F、AP-1(Jun/Fos)、EGR-1、视网膜母细胞瘤(RB)、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、钙黏蛋白(E-cadherin)、神经纤维瘤蛋白-2(NF-2)、聚[ADP-核糖]合成酶1(PARP-1)、BRCA-1、BRCA-2、腺瘤性结肠息肉(APC)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)、RAF激酶抑制蛋白(RKIP)、p16、KLF-10、LKB1、LHX6、C-RASSF、DKK-3PD1、Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc组成的组中的任何一种。在这种情况下，连接子1或2如上所述。
对于药物组合物，可以但不限于以约0.1μg/mL至约500μg/mL，约0.2μg/mL至约450μg/mL，或约0.5μg/mL至约400μg/mL，的浓度包含线粒体。以上述范围包含的线粒体可有助于给药时调整线粒体的剂量，并可提高患者疾病症状的改善程度。在这种情况下，可以通过定量分离的线粒体的膜蛋白来定量线粒体从而确定线粒体的剂量。具体来说，可以通过布拉德福德蛋白质测定法(Bradford protein assay)对分离的线粒体进行定量。
此外，对于药物组合物，可以但不限于以0.1μg/mL至500μg/mL，0.2μg/mL至450μg/mL，或0.5μg/mL至400μg/mL的浓度包含与线粒体结合的抗癌剂。以上述范围包含的抗癌剂可有助于在给药时调整抗癌剂的剂量，并可提高患者疾病症状的改善程度。
可以以每1μg线粒体包含约0.01μg至1μg，约0.05μg至0.5μg，或约0.1μg至0.3μg的量包含与线粒体结合的抗癌剂。优选地，可以约0.2μg的量包含它。
抗癌剂和线粒体可按适当比例混合，从而抗癌剂可包含在线粒体中。例如，基于重量比的抗癌剂和线粒体的混合比例可以是约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1，约1:5至约5:1，约1:4至约4:1，约1:3至约3:1，约1:2至约2:1，或约1:1的重量比。优选地，它可以是约1:5。
特别地是，抗癌剂可以是与三苯基膦(TPP)结合的抗癌剂。
如本文所用，术语“三苯基膦(TPP)”为亲脂性阳离子化合物，其可轻易穿透细胞膜和线粒体膜，并在线粒体膜内存在的负电压(-150至-170mV)作用下被直接吸收到线粒体内。由于这些特性，TPP被用作靶向癌细胞、癌症干细胞和成纤维细胞的物质，因为它在与正常细胞相比具有差异很大的线粒体膜电位的癌细胞或心肌细胞的线粒体中积累得更多。
在这种情况下，线粒体可以以每1μg线粒体约0.01μg至1μg，约0.05μg至0.5μg，或约0.1μg至0.3μg的量在线粒体中包含结合TPP的抗癌剂。优选地，可以以约0.25μg的量包含它。
此外，结合TPP的抗癌剂和线粒体可按适当比例混合，从而抗癌剂可包含在线粒体中。例如，基于重量比的抗癌剂和结合TPP的线粒体的混合比例可以是约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1，约1:5至约5:1，约1:4至约4:1，约1:3至约3:1，约1:2至约2:1，或约1:1。优选地，它可以是约1:4。
在本说明书的一个实施方案中，构建了融合包括TPP-DOX的抗HER2抗体片段的线粒体(TPP-DOX_MTα-HER2scFv)，其中TPP与多柔比星(DOX)结合(图30-32)，并证实了其在癌细胞(图33-43)和肿瘤小鼠模型(图65-68)中优异的抗癌活性。
此外，TPP可能包含TPP衍生物。TPP衍生物可以是2-丁烯-1，4-二-TPP、2-氯苄基-TPP、3-甲苯甲基-TPP、2,4-对二氯苄-TPP、1-萘甲基-TPP和对亚二甲苯双-TPP等，但不限于此。此外，TPP衍生物可进一步包含其衍生物。例如，它可以是2-丁烯-1,4-二-TPP的衍生物、2-氯苄基-TPP的衍生物、3-甲苯甲基-TPP的衍生物、2,4-对二氯苄-TPP的衍生物、1-萘甲基-TPP的衍生物、对亚二甲苯双-TPP的衍生物等，但不限于此。
本发明包括包含抗癌剂的线粒体的药物组合物可用于预防或治疗癌症，和/或可增加治疗效果(功效)。在这种情况下，线粒体和抗癌剂如上所述。
癌症可以是由乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中的任何一种，但不限于此。
如本文所用，术语“预防”指通过施用药物组合物抑制或延缓癌症发生的任何行为。此外，“治疗”指通过施用药物组合物改善或有益地改变癌症症状的任何行为。
如本文所用，术语“功效”可由一个或多个参数确定，如存活率或如1年、5年或10年的一段时间内的无疾病的存活率。此外，参数可包括对受试者体内至少一个肿瘤大小的抑制。
如生物利用度的药代动力学参数和如清除率的基础参数也可能对功效生产影响。因此，“增强的功效”(例如，功效的改善)可能归因于增强的药代动力学参数和增强的功效，可通过比较试验动物或人类受试者的清除率和肿瘤生长，或通过比较例如存活率、复发率或无疾病的存活率等参数来衡量。
药物组合物的优选剂量会根据患者的病情和体重、疾病的严重程度、药物的剂型、给药途径和给药时间而不同，但本领域技术人员可以进行合适选择。本发明用于预防或治疗癌症的药物组合物中，可根据用途、制剂、联合目的等而以任意量(有效量)包含活性成分，只要其具有抗癌活性。此处，“有效量”指能够诱导抗癌作用的活性成分的量。这种有效量可在本领域普通技术人员的普通能力内通过实验来确定。
本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是任何载体，只要它是适合递送给患者的无毒材料。蒸馏水、酒精、脂肪、蜡和惰性固体都可以作为载体包含。此外，药学上可接受的辅料(缓冲剂、分散剂)可包含在药物组合物中。
具体来说，药物组合物可根据给药途径以本领域已知的常规方法制备为肠外制剂，除活性成分外还包含药学上可接受的载体。此处，“药学上可接受的”意为它不抑制活性成分的活性，并且不具有超出应用(处方)对象可适应的毒性。
当本发明的药物组合物被制备成肠外制剂时，根据本领域已知的方法，它可与合适的载体一起配制成注射剂、透皮制剂和鼻腔吸入剂的形式。当其配制成注射剂时，可使用无菌水、乙醇、如甘油或丙二醇的多元醇，或其混合物作为合适的载体，可优选使用林格氏溶液(Ringer’s solution)、含有三乙醇胺的PBS(磷酸盐缓冲盐水)或注射用无菌水、如5％葡萄糖的等渗溶液等。
本发明的药物组合物可以是一种可注射的制剂。因此，根据本发明所述的药物组合物可以通过使用如酸性水溶液或磷酸盐等缓冲溶液来调整pH值，配制为物理或化学上非常稳定的注射剂，其可作为注射剂使用，以便根据开处方的注射剂的分发来保证产品的稳定性。
具体来说，本发明的药物组合物可包括注射用水。注射用水指为溶解固体注射剂或稀释水溶性注射液而准备的蒸馏水。它可以是葡萄糖注射剂、木糖醇注射剂、D-甘露醇注射剂、果糖注射剂、生理盐水、右旋糖酐40注射剂、右旋糖酐70注射剂、氨基酸注射剂、林格氏溶液、乳酸-林格氏溶液，或pH值约为3.5-7.5的磷酸缓冲溶液或磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液。
另一方面，本发明的药物组合物以药学有效量施用。术语“治疗有效量”或“药学有效量”指对预防或治疗目标疾病有效的化合物或组合物的量，该量足以以适用于医学治疗的合理获益/风险比治疗该疾病，且不会引起副作用。有效量的水平可根据包括病人的健康状况、疾病的类型和严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药方法、给药时间、给药途径和排泄率、治疗期、要联合或同时使用的药物的因素以及医学领域众所周知的其他因素来确定。在一个实施方案中，治疗有效量指对治疗癌症有效的药物量。
如本文所用，术语“给药”或“施用”指通过适当的方法将预定的物质引入受试者，组合物的给药途径可以是任何一般途径，只要它可以到达目标组织。它可以是腹腔给药、静脉给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、局部给药、鼻内给药、直肠内给药，但不限于此。
本发明的药物组合物的优选剂量可根据施用对象的体重，以0.01mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至4mg/kg或0.25mg/kg至2.5mg/kg的量施用一次线粒体，但不限于此。也就是说，就细胞活性而言，最优选的是根据具有癌症组织的受试者的体重，施用包括包含如上述范围内的抗癌剂的量的修饰的线粒体的药物组合物。此外，药物组合物可施用1-10次，3-8次，或5-6次，优选5次。在这种情况下，给药间隔可以是1-7天或2-5天的间隔，最好是3天的间隔。这种剂量在任何方面不应理解为限制本发明的范围。
术语“受试者”指可应用(处方)本发明的组合物的受试者，可以是患有癌症的受试者。此外，受试者可以是如大鼠、小鼠或家畜的哺乳动物，包括人类，优选为人类。除了含有抗癌剂的线粒体外，本发明的组合物可进一步包括任何已知的已被验证的具有抗癌活性和安全性的化合物或天然提取物，用于提高和加强抗癌活性。在这种情况下，药物组合物和具有抗癌活性的化合物或天然提取物可以同时或先后给药。
在本发明的另一方面，提供了一种包含抗癌剂的线粒体的制备方法，其包括混合抗癌剂和分离的线粒体。在这种情况下，抗癌剂和线粒体如上所述。
抗癌剂和线粒体可按适当比例混合，从而抗癌剂可包含在线粒体中。例如，基于重量比的抗癌剂和线粒体的混合比例可以是约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1，约1:5至约5:1，约1:4至约4:1，约1:3至约3:1，约1:2至约2:1，或约1:1。优选地，它可以是约1:5。
在本发明的另一方面，提供了与TPP化学结合的修饰的抗癌剂。在这种情况下，TPP和抗癌剂如上所述。
在本发明的另一方面，提供了一种包括包含抗癌剂的线粒体的药物组合物的用途，其用于预防或提高癌症治疗效果。在这种情况下，抗癌剂和线粒体如上所述。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法和/或一种提高治疗效果的方法，其包括向受试者施用包括包含抗癌剂的线粒体的药物组合物。在这种情况下，抗癌剂、线粒体和施用都如上所述。受试者可为患有癌症的受试者。此外，受试者可以是哺乳动物，优选为人类。
实施例
下面，将通过以下实例对本发明进行更详细的描述。然而，以下实施例只为说明本发明，且本发明的范围不限于此。
I.证实与靶蛋白结合的线粒体的靶向能力
制备实施例1.包含与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞系的制备
为了将线粒体特异性地引入表达HER2的肿瘤细胞，构建了特异性结合HER2的抗HER2scFv抗体(SEQ ID NO:98)融合至线粒体外膜的线粒体(图1和2)。具体的构建方法参照韩国专利申请公开第10-2019-0124656号中描述的方法。
实施例1.证实融合抗HER2scFv抗体的线粒体的特性
实施例1.1.分析抗HER2scFv抗体的表达
为了证实抗HER2scFv在上述制备实施例1中构建的包含融合了抗HER2scFv抗体的线粒体(MTα-HER2scFv)的HEK293细胞中的表达水平，使用免疫细胞化学染色法对细胞进行染色，并使用共聚焦显微镜观察图像。
具体来说，将HEK293细胞以3×104个/孔接种到24孔板中并培养24小时。培养24小时后，用MitoTracker Red染色细胞约30分钟，用PBS清洗，然后用3.7％甲醛固定。去除甲醛，用含有1％山羊血清的PBS以1:1,000稀释一抗，即抗myc抗体(Roche，11667149001)，用该稀释液处理细胞并反应18小时。反应完成后，用PBS清洗除去一抗，然后将Alexa
Figure BDA0004194317040000201
488(Invitrogen，11001)标记的二抗，即抗小鼠IgG抗体，在含有0.1％BSA的PBS中以1:500稀释，用该稀释液处理细胞并反应约1小时。反应完成后，用PBS清洗细胞，装片，并用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果证实，标记线粒体的红色荧光的位置与标记抗HER2scFv抗体的绿色荧光的位置是一致的(图3)。
实施例1.2.证实抗HER2scFv抗体的表达位置
进行Western blot来证实以与上述制备实施例1相同的方式构建的抗HER2scFv抗体是否在HEK293细胞的线粒体中表达。
具体来说，表达抗HER2scFv的细胞裂解后，通过离心将细胞提取物分离成线粒体部分和细胞质部分。对每个部分进行电泳和Western blot。为了鉴定抗HER2scFv、线粒体标记和细胞质标记蛋白，分别使用抗myc抗体(Roche，11667149001)、抗COX4抗体(abcam，33985)和抗β-微管蛋白抗体(Thermo，MA5-16308)作为一抗。使用抗小鼠IgG HRP或抗兔IgGHRP作为二抗。
结果证实，抗HER2scFv抗体与作为线粒体阳性标记的COX4一起存在于线粒体部分，而不存在于存在阳性标记β-微管蛋白的细胞质部分中(图4)。通过上述实施例中免疫细胞化学染色和Western blot分析的结果，证实了抗HER2scFv抗体在HEK293细胞的线粒体中表达。
实施例1.3.测量与抗HER2scFv抗体融合的线粒体生产ATP的能力
为了比较通过与上述制备实施例1相同的方式构建的与抗HER2scFv抗体融合的线粒体与正常线粒体之间的功能差异，比较了从HEK293细胞(MTα-HER2scFv)(该细胞系表达与抗HER2scFv抗体融合的线粒体)和HEK293细胞中分离出的线粒体生产ATP的能力，生产ATP是线粒体的主要功能之一。
具体来说，用25μM的ADP和100μL的荧光素处理5μg/100μL的分离的线粒体，并测量线粒体中生产的ATP和荧光素反应生产的发光值(RLU)，从而证实其生产ATP的能力。结果表明，MT和MTα-HER2scFv生产ATP的能力没有差别(图5)。
实施例1.4.测量与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的膜电位
为了比较通过与上述制备实施例1相同的方式构建的与抗HER2scFv抗体融合的线粒体与正常线粒体之间的功能差异，比较了包括与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞(MTα-HER2scFv)和未经处理的HEK293细胞(MT)的膜电位，膜电位是线粒体的主要特征之一。
具体来说，将细胞以3×104个细胞/孔接种到96孔板中，培养24小时。24小时后，用DCFDA(Invitrogen，C6827)染料处理细胞并反应1小时。此后，用PBS清洗细胞，并用Hoechst33242将细胞染色10分钟。测量DCFDA和Hoechst33242的荧光值，然后通过计算它们的比率(DAFDA的荧光值/Hoechst33242的荧光值)确定膜电位。结果表明，MT和MTα-HER2scFv的膜电位没有差别(图6)。
实施例1.5.测量与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的活性氧
为了比较通过与上述制备实施例1相同的方式构建的与抗HER2scFv抗体融合的线粒体与正常线粒体之间的活性氧(ROS)的生产水平，测量了包括与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞(MTα-HER2scFv)和未经处理的HEK293细胞(MT)的线粒体的活性氧。
具体来说，将细胞以3×104个细胞/孔接种到96孔板中，培养24小时。24小时后，用TMRE(Invitrogen公司，T669)染料处理细胞并反应1小时。用PBS清洗细胞，然后用Hoechst33242染色10分钟。测量TMRE和Hoechst33242的荧光值，然后通过计算它们的比率(TMRE的荧光值/Hoechst33242的荧光值)确定活性氧的生产量。结果表明，从细胞中分离出的MT和MTα-HER2scFv的活性氧生产量没有差别(图7)。
实施例2.分析人癌细胞系和正常细胞系中HER2的表达
实施例2.1.通过Western blot分析证实HER2在人癌细胞系和正常细胞系中的表达
通过Western blot证实HER2在人乳腺癌、肺癌、胃癌细胞系和肺成纤维细胞系中的表达水平。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(NCI-H1975)、人胃癌细胞系(MKN-74和NCI-N87)和人肺成纤维细胞系(WI-38)以大约1×106个细胞/孔接种到6孔板中培养24小时。此时，SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞是通过在含有10％ FBS的RPMI-1640培养基中培养制备的，而MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN-74和WI-38细胞是通过在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养制备的。
24小时后，除去培养液，用PBS清洗细胞两次，然后直接向细胞中加入100μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液。10分钟后，用刮刀回收细胞，转移到微管中，然后以大约12,000xg离心10分钟。得到分离的上清液并转移到一个新的微管中，然后用BCA分析对蛋白进行定量。对每个样品的相同数量的蛋白进行电泳，然后进行Western blot。使用抗HER2抗体(Cell signaling，29D8)和抗β肌动蛋白抗体(Sigma，A2208)作为一抗，使用抗小鼠IgG HRP和抗兔IgG HRP作为二抗。
结果证实SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞是表达HER2的HER2+细胞。另一方面，发现MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN-74和WI-38细胞几乎未显示HER2表达，表明它们是HER2-细胞(图8)。
实施例2.2.通过免疫细胞化学染色证实HER2在人癌细胞系和正常细胞系中的表达
为了证实人乳腺癌、肺癌、胃癌细胞系和人肺成纤维细胞系中HER2的表达水平，采用抗HER2抗体进行免疫细胞化学染色。
具体来说，将细胞分别以3×104个细胞/孔接种到24孔板中，并培养24小时。24小时后，用3.7％甲醛固定细胞。去除甲醛，用含1％山羊血清的PBS以1:1,000稀释一抗，即抗HER2抗体(Cell Signaling Technology,2165)，用该稀释液处理细胞并反应18小时。用PBS洗去一抗，然后用含有0.1％BSA的PBS以1:500稀释Alexa
Figure BDA0004194317040000221
488(Invitrogen，11008)标记的二抗，即抗兔IgG抗体，用该稀释液处理细胞并反应1小时。反应完成后，用PBS清洗细胞，装片，并用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，对于SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞，即HER2+细胞，HER2在细胞表面表达并观察到绿色荧光，而对于MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN74和CCD-8Lu细胞，即HER2-细胞，没有观察到绿色荧光(图9)。
实施例2.3.通过流式细胞仪证实HER2在人癌症细胞系中的表达
为了证实人乳腺癌、肺癌和胃癌细胞系中HER2的表达水平，使用抗HER2抗体进行流式细胞术。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、人胃癌细胞系(NCI-N87和MKN-74)和人肺癌细胞系(NCI-H1975)分别以大约1×106个细胞/孔接种到6孔板中，并培养24小时。24小时后，去除培养液，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理并收集细胞，用3.7％甲醛固定。在含有1％山羊血清的PBS中以1:1,000稀释一抗，即抗HER2抗体(CellSignaling Technology,2165)，用该稀释液处理细胞并反应18小时。用PBS洗去一抗，然后用含有0.1％BSA的PBS以1:500稀释Alexa
Figure BDA0004194317040000231
555(Invitrogen,21428)标记的二抗，即抗兔IgG抗体，用该稀释液处理细胞并反应1小时。反应完成后，用PBS清洗细胞，通过流式细胞仪证实HER2的表达。
结果表明，对于SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞，即HER2+细胞，HER2在细胞表面表达，观察到的荧光值(PE-A)高，而对于MDA-MB-231、NCI-H1975和MKN-74细胞，即HER2-细胞，其显示的荧光值比HER2+细胞低(图10)。
从以上Western blot分析、免疫细胞化学染色和流式细胞仪的结果可证实，SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞是表达HER2的HER2+细胞，而MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN-74、WI-38细胞和CCD-8Lu细胞是HER2-细胞。
实施例3.验证与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HER2靶向性
为了证实通过与上述制备实施例1相同的方式构建的与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HER2靶向能力，将与抗HER2scFv抗体融合的线粒体(MTα-HER2scFv)与HER2+细胞和HER2-细胞共培养处理，然后进行免疫细胞化学染色。
具体来说，将HER2+细胞和HER2-细胞一起以1.5×104细胞/孔接种到24孔板中，在含有10％FBS的DMEM培养基中共培养24小时。此时，HER2+细胞SK-BR-3、BT-474和NCI-N87通过在含10％FBS的RPMI-1640培养基中培养来制备，HER2-细胞MDA-MB-231、NCI-H1975和MKN-74通过在含10％FBS的DMEM培养基中培养来制备。通过用MitoTracker Red分别处理未经处理的HEK293细胞(MT)和包括与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞(MTα-HER2scFv)来制备线粒体，并分离染色的线粒体。共培养24小时后，将每个分离的线粒体与共培养的细胞处理，并反应12小时(图11)。
实施例3.1.证实HER2阳性和阴性细胞系中与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的位置
将用与上述实施例3相同的方法处理的细胞用PBS清洗一次，并在室温下加入3.7％甲醛固定30分钟，然后进行免疫细胞化学染色。此时，使用抗HER2抗体(Cellsignaling，29D8)作为一抗，使用Alexa
Figure BDA0004194317040000241
488标记的抗兔IgG抗体(Invitrogen，11008)作为二抗。用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果如图12所示，当用来源于未经处理的HEK293细胞的线粒体(MT)处理共培养的SK-BR-3(HER2+)和NCI-H1975(HER2-)细胞时，在SK-BR-3(HER2+)细胞和NCI-H1975(HER2-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red(红色荧光)染色的线粒体。另一方面，当用来源于包括与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞的线粒体(MTα-HER2scFv)处理细胞时，在HER2+细胞，即SK-BR-3细胞中特异性地观察到Mitotracker Red染色的线粒体。
在共培养的BT-474(HER2+)和NCI-H1975(HER2-)细胞中，在MT处理组中，在BT-474(HER2+)细胞和NCI-H1975(HER2-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red染色的线粒体，而在MTα-HER2scFv处理组中，只在HER2+细胞，即BT-474细胞中特异性地观察到Mitotracker Red染色的线粒体(图13)。
在共培养的NCI-N87(HER2+)和MKN-74(HER2-)细胞中，在MT处理组中，在NCI-N87(HER2+)细胞和MKN-74(HER2-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red染色的线粒体，而在MTα-HER2scFv处理组中，只在HER2+细胞即NCI-N87中特异性地观察到Mitotracker Red染色的线粒体(图14)。
在共培养的SK-BR-3(HER2+)和MDA-MB-231(HER2-)细胞中，在MT处理组中，在SK-BR-3(HER2+)细胞和MDA-MB-231(HER2-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red染色的线粒体，而在MTα-HER2scFv处理组中，只在HER2+细胞，即SK-BR-3细胞中特异性地观察到Mitotracker Red染色的线粒体(图15)。
在共培养的BT-474(HER2+)和MDA-MB-231(HER2-)细胞中，在MT处理组中，在BT-474(HER2+)细胞和MDA-MB-231(HER2-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red染色的线粒体，而在MTα-HER2scFv处理组中，只在HER2+细胞，即BT-474细胞中特异性地观察到Mitotracker Red染色的线粒体(图16)。
从上述结果可证实，与抗HER2scFv抗体融合的线粒体(MTα-HER2scFv)可以特异性地靶向表达HER2抗原的HER2+细胞。
II.包含抗癌剂并结合靶蛋白的线粒体的制备及其活性的证实
制备实施例2.与抗HER2scFv抗体和多柔比星融合的线粒体复合物的制备
用MitoTracker Green处理包括与抗HER2scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞，对线粒体进行染色(绿色荧光)，然后分离线粒体(MTα-HER2scFv)。将30μg分离的线粒体与100μM多柔比星(DOX)在4℃下反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟，来去除未反应的多柔比星。此后，用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗两次，最后得到包括多柔比星的线粒体(DOX_MTα-HER2scFv)(图17)。
实施例4.评价DOX_MTα-HER2scFv对癌细胞的抗癌活性
实施例4.1.证实DOX_MTα-HER2scFv进入癌细胞的递送特性
分别用与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)和人肺癌细胞系(NCI-H1975)，然后用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，在细胞质中观察到MitoTracker Green染色的线粒体(MTα-HER2scFv，绿色荧光)，而在细胞核中观察到显示红色荧光的多柔比星(DOX)(图18)。从上述结果发现，转运入细胞的DOX_MTα-HER2scFv中的多柔比星移动到细胞核，并位于细胞核内的DNA中。
实施例4.2.证实用DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞的形态学变化
分别用与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)，然后用共聚焦显微镜观察癌细胞随时间的形态学变化。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果观察到，用DOX_MTα-HER2scFv(黄色荧光)处理6小时后，大部分多柔比星(DOX，红色荧光)与其一起存在于线粒体中(绿色荧光)。然而，随着时间的推移，观察到多柔比星在细胞核中，用DOX_MTα-HER2scFv处理72小时后，观察到明显的细胞形态学变化(图19)。
实施例4.3.测定与MTα-HER2scFv结合的多柔比星浓度
为了定量通过与上述制备实施例2相同的方式获得的与DOX_MTα-HER2scFv结合的多柔比星的浓度，通过测量每一浓度的多柔比星的吸光度制备标准曲线，然后计算与DOX_MTα-HER2scFv结合的多柔比星浓度。
具体来说，将各100μL浓度为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM和0μM的多柔比星溶液和在PBS中以1/20稀释的DOX_MTα-HER2scFv分装到96孔板中。此后，用酶标仪(BioTek,Synerge HTX)测量吸光度(发射波长为590nm)。根据多柔比星的浓度用吸光度值制备标准曲线，然后通过替代DOX_MTα-HER2scFv稀释溶液的吸光度值来确定与DOX_MTα-HER2scFv结合的多柔比星浓度(图20)。
实施例4.4.通过各浓度的DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞来证实增殖抑制能力
为了证实通过与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv的抗癌活性，使用200μg MTα-HER2scFv和100μM多柔比星(DOX)，并通过用DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌、肺癌和胃癌细胞系来评估细胞增殖抑制作用。
具体来说，将人乳腺癌(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H1975)和胃癌(NCI-N87和MKN-74)细胞系分别以约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞在含有10％ FBS的RPMI-1640培养基中培养，而MDA-MB-231、NCI-H1975和MKN-74细胞在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，用浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM的多柔比星(DOX)或DOX_MTα-HER2scFv处理每个细胞。样品处理144小时后，用WST-1检测法测量细胞增殖。
结果如图21所示，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MT)中没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，在DOX处理组和DOX_MTα-HER2scFv处理组中，癌细胞的增殖以浓度依赖的方式被抑制。特别是，证实了与未处理组相比，当用1μM DOX_MTα-HER2scFv处理时，根据癌细胞系，细胞生长抑制了约60％至90％(图21)。
实施例4.5.通过各浓度的DOX_MTα-HER2scFv处理正常细胞来证实增殖抑制能力
将200μg的MTα-HER2scFv和100μM的多柔比星(DOX)以与上述制备例2相同的方式进行反应。为了证实获得的DOX_MTα-HER2scFv对正常细胞的细胞增殖的影响，评估了用DOX_MTα-HER2scFv处理人肺成纤维细胞的细胞增殖抑制作用。
具体来说，将人肺成纤维细胞系WI-38和CCD-8Lu分别以大约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，WI-38和CCD-8Lu在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，用浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM的多柔比星(DOX)或DOX_MTα-HER2scFv处理每个细胞。样品处理144小时后，用WST-1检测法测量细胞增殖。
结果如图22所示，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MT)中没有观察到细胞增殖的抑制作用。此外，证实了在DOX处理组和DOX_MTα-HER2scFv处理组中，细胞增殖抑制能力弱于癌细胞。
实施例4.6.分析用DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞和正常细胞的IC50值
根据实施例4.4和实施例4.5中各浓度的DOX_MTα-HER2scFv细胞增殖抑制结果，分析各细胞的IC50值并示于图23。
实施例4.7.比较用DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞和正常细胞的增殖抑制能力
将200μg的MTα-HER2scFv和100μM的多柔比星(DOX)以与上述制备例2相同的方式进行反应。为了比较得到的DOX_MTα-HER2scFv对癌细胞和正常细胞的细胞增殖的影响，用相同浓度的DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌、肺癌、胃癌细胞系和肺成纤维细胞系后，测量细胞增殖抑制能力。
具体来说，将人乳腺癌(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H1975)、胃癌(MKN-74和NCI-N87)细胞系和肺成纤维细胞系(CCD-8Lu和WI-38)分别以大约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养。MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN-74、CCD-8Lu和WI-38细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，分别用0.5μM多柔比星(DOX)或DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，144小时后，用WST-1检测评价细胞增殖抑制能力。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。使用Graphpad 5.0软件进行统计学处理，用单因素ANOVA(Turkey's)检验测量p值(*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001)。
结果如图24所示，对于癌细胞和正常细胞的未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中没有观察到细胞增殖抑制作用。在DOX处理组和DOX_MTα-HER2scFv处理组中，与未处理组相比，对癌细胞的细胞增殖抑制作用表现为约50％至80％或更高，而对正常细胞的细胞增殖抑制作用表现为约25％或更低。
实施例4.8.通过TUNEL检测证实用DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实以与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv在癌细胞中的细胞凋亡诱导活性，在用DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌和胃癌细胞系后，进行TUNEL检测。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)以大约3×104个细胞/孔接种到24孔板中并培养24小时。培养24小时后，用MTα-HER2scFv或1μM DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，48小时后，进行TUNEL检测以证实细胞凋亡。此时，将仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为DOX_MTα-HER2scFv的对照组。用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中几乎没有观察到细胞凋亡(绿色荧光)。然而，在DOX_MTα-HER2scFv处理组的细胞核中观察到细胞凋亡的增加。从上述结果可证实，DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡(图25)。
实施例4.9.通过Western blot分析证实用DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实以与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv在癌细胞中的细胞凋亡作用，在用DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系后，使用针对细胞凋亡标志物的抗体进行Western blot。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)分别以约5×106个细胞/孔接种到6孔板中，并培养24小时。培养24小时后，分别用MTα-HER2scFv或DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，96小时后，裂解细胞，提取蛋白，进行Western blot。将抗裂解PARP抗体(Cell signaling，9541S)、抗裂解半胱天冬酶3抗体(Cell signaling，9664S)、抗磷酸-p53抗体(ABclonal，AP0762)和抗β肌动蛋白抗体(Sigma，A2228)作为一抗。将抗小鼠IgG HRP或抗兔IgG HRP作为二抗。通过β肌动蛋白的表达水平来校正蛋白量。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。
结果表明，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中，与未处理组(No treat)类似，没有观察到细胞凋亡过程中PARP和半胱天冬酶3的裂解形式，也没有观察到p53的磷酸化形式。另一方面，在DOX_MTα-HER2scFv处理组中，观察到了磷酸化的p53以及PARP和半胱天冬酶3的裂解形式的表达(图26)。从上述结果可证实，DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡。
实施例4.10.通过流式细胞仪证实DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实以与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv在癌细胞中的细胞凋亡作用，在用DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌和胃癌细胞系后，通过用膜联蛋白V/PI染色进行流式细胞测量。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)分别以大约5×106个细胞/孔接种到6孔板中，并培养24小时。培养24小时后，用MTα-HER2scFv或1μMDOX_MTα-HER2scFv处理细胞。处理96小时后，用PBS清洗细胞两次，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞。离心获得的细胞，然后用PBS清洗以去除0.05％胰蛋白酶-EDTA。此后，使用膜联蛋白V/PI染色试剂盒(Roche，11988549001)染色细胞10分钟，并使用FACS设备(BeckmanCoulter，CytoFLEX)分析染色的细胞。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中没有观察到膜联蛋白V/PI值的变化。另一方面，膜联蛋白V/PI值在DOX_MTα-HER2scFv处理组中有所增加(图27)。从上述结果可证实，DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡。
实施例4.11.评价DOX_MTα-HER2scFv对HER2表达细胞的选择性细胞凋亡诱导活性
为了证实以与上述制备实施例2相同的方式获得的DOX_MTα-HER2scFv的HER2选择性细胞凋亡诱导作用，用DOX_MTα-HER2scFv处理共培养的HER2+癌细胞和HER2-正常细胞，然后进行TUNEL检测和免疫细胞化学染色。
具体来说，将人乳腺癌细胞系BT-474(HER2+)和人肺成纤维细胞系WI-38(HER2-)一起以3×104个细胞/孔接种到24孔板中，在含有10％FBS的DMEM培养基中共培养24小时。此时，BT-474细胞通过在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养而制备，而WI-38细胞通过在含有10％FBS的DMEM培养基中培养而制备。培养24小时后，用1μM DOX_MTα-HER2scFv处理共培养的细胞，再培养48小时。通过TUNEL检测和免疫细胞化学染色来评估细胞凋亡(图28)。
实施例4.12.通过TUNEL检测来证实DOX_MTα-HER2scFv对HER2表达细胞选择性细胞凋亡诱导活性
将与上述实施例4.11相同的方式处理的细胞用PBS清洗两次，然后在室温下加入3.7％甲醛固定30分钟。此后，用抗HER2抗体(Cell Signaling Technology，2165)作为一抗，用Alexa
Figure BDA0004194317040000291
555标记的抗兔IgG抗体(Invitrogen，21428)作为二抗，HER2+细胞被标记为红色荧光。此后，用TUNEL溶液染色细胞30分钟，将发生细胞凋亡的细胞用绿色荧光标记并装片，用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，仅在BT-474细胞(白色箭头)中选择性地观察到强烈的绿色荧光，该细胞是HER2+癌细胞(图29)。从上述结果可证实，DOX_MTα-HER2scFv可根据HER2表达的有无而选择性地诱导细胞凋亡。
制备实施例3.与三苯基膦-多柔比星结合的化合物的制备
为了有效地将抗癌药物多柔比星(DOX)递送到分离的线粒体中，将能够靶向线粒体的化合物与多柔比星融合。最具代表性的线粒体靶向化合物是三苯基膦(TPP)，与TPP结合的抗癌剂如图30所示进行反应，使用“Mitochondrial Delivery of Doxorubicin viaTriphenylphosphine Modification for Overcoming Drug Resistance in MDA-MB-435/DOX Cells”(Molecular Pharmaceutics，11(8)，2640-2649)中已知的方法制备TPP-多柔比星(TPP-DOX)，并通过对该化合物进行MRI分析来证实该化合物为TPP-多柔比星(图31)。
制备实施例4.线粒体-TPP和多柔比星复合物的制备
用MitoTracker Green处理表达了抗HER2scFv抗体的HEK293细胞以染色线粒体，然后分离出线粒体MTα-HER2scFv。此后，将30μg与抗HER2scFv抗体融合的线粒体(MTα-HER2scFv)与100μM TPP-多柔比星在4℃下反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟来去除未反应的TPP-多柔比星。用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗反应产物两次，最后得到包括TPP-多柔比星的线粒体(TPP-DOX_MTα-HER2scFv)(图32)。
实施例5.评价TPP-DOX_MTα-HER2scFv对癌细胞的抗癌活性
实施例5.1.证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv进入癌细胞的递送特性
分别用以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)和人肺癌细胞系(NCI-H1975)，然后用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，在细胞质的同一位置观察到MitoTracker Green(MTα-HER2scFv)染色的线粒体和显示红色荧光的多柔比星(TPP-DOX)(图33)。从上述结果可证实，TPP-DOX和MTα-HER2scFv所转运的TPP-DOX_MTα-HER2scFv都位于细胞质中。
实施例5.2.证实用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞形态学变化
分别用以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)，然后用共聚焦显微镜观察癌细胞随时间的形态学变化。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果观察到，用TPP-DOX_MTα-HER2scFv(黄色荧光)处理12小时后，大部分TPP-DOX(红色荧光)与其一起存在于线粒体中(绿色荧光)。然而，随着时间的推移，观察到TPP-DOX在细胞核中，用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理72小时后，观察到明显的细胞形态学变化(图34)。
实施例5.3.通过各浓度的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞来证实增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv的抗癌活性，通过用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌、肺癌和胃癌细胞系来评价细胞增殖抑制作用。
具体来说，将人乳腺癌(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H1975)和胃癌(NCI-N87和MKN-74)细胞系分别以约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养，而人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人肺癌细胞系NCI-H1975和人胃癌细胞系MKN-74在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，用浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM的TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理每个细胞。样品处理144小时后，用WST-1检测法测量细胞增殖。此时，仅线粒体处理组(MT，MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。
结果如图35所示，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MT)中没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，在TPP-DOX处理组和TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组中，癌细胞增殖以浓度依赖的方式被抑制。特别是，证实了与未处理组相比，当用1μM TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理时，根据癌细胞系，细胞生长抑制了约60％至70％。
实施例5.4.通过各浓度的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理正常细胞来证实增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv对正常细胞增殖的影响，评价了用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人肺成纤维细胞后的细胞增殖抑制作用。
具体来说，将人肺成纤维细胞系WI-38和CCD-8Lu分别以大约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，WI-38和CCD-8Lu在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，用浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM的TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理每个细胞。样品处理144小时后，用WST-1检测法测量细胞增殖。此时，仅线粒体处理组(MT，MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。
结果如图36所示，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MT)中没有观察到细胞增殖抑制作用。此外，证实了在TPP-DOX处理组和TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组中，细胞增殖抑制能力弱于癌细胞。
实施例5.5.分析用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞和正常细胞的IC50值
根据实施例5.3和实施例5.4中各浓度的TPP-DOX_MTα-HER2scFv细胞增殖抑制结果，分析各细胞的IC50值并示于图37。
实施例5.6.比较用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞和正常细胞的增殖抑制能力
为了比较以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv对癌细胞和正常细胞增殖的影响，用相同浓度的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌、肺癌、胃癌细胞系和肺成纤维细胞系后，测量细胞的增殖抑制能力。
具体来说，将人乳腺癌(SK-BR-3、BT-474和MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H1975)、胃癌(MKN-74和NCI-N87)细胞系和肺成纤维细胞系(CCD-8Lu和WI-38)分别以大约3×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。此时，SK-BR-3、BT-474和NCI-N87细胞在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养，而MDA-MB-231、NCI-H1975、MKN-74、CCD-8Lu和WI-38细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。培养24小时后，分别用0.5μM TPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，144小时后，用WST-1检测评价细胞增殖抑制能力。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。使用Graphpad 5.0软件进行统计学处理，用单因素ANOVA(Turkey's)检验测量p值(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。
结果如图38所示，对于癌细胞和正常细胞的未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中没有观察到细胞增殖抑制作用。在仅TPP-DOX处理组和TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组的情况下，与未处理组相比，对癌细胞的细胞增殖抑制作用表现为约60％至75％或更高。然而已证实，与癌细胞不同，对正常细胞的增殖抑制能力弱。
实施例5.7.通过TUNEL检测证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv在癌细胞中的细胞凋亡诱导活性，用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌和胃癌细胞系后，进行TUNEL检测。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)分别以约3×104个细胞/孔接种到24孔板，并培养24小时。培养24小时后，用MTα-HER2scFv或1μMTPP-DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，48小时后，进行TUNEL检测以证实细胞凋亡情况。此时，将仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的对照组。用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中几乎没有观察到细胞凋亡(绿色荧光)。然而，在TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组的细胞核中观察到细胞凋亡的增加。从上述结果可证实，TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡(图39)。
实施例5.8.通过Western blot分析证实用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞的细胞凋亡作用，在用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌和胃癌细胞系后，使用针对细胞凋亡标志物的抗体进行Western blot。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)分别以大约5×106个细胞/孔接种到6孔板，并培养24小时。培养24小时后，分别用MTα-HER2scFv或1μM TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理细胞，96小时后，裂解细胞，提取蛋白，进行Western blot分析。将抗裂解PARP抗体(Cell signaling，9541S)、抗裂解半胱天冬酶3抗体(Cell signaling，9664S)、抗磷酸-p53抗体(ABclonal，AP0762)和抗β肌动蛋白抗体(Sigma，A2228)作为一抗。将抗小鼠IgG HRP或抗兔IgG HRP作为二抗。通过β肌动蛋白的表达水平来校正蛋白量。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的对照组。
结果表明，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中，与未处理组(No treat)类似，没有观察到细胞凋亡过程中PARP和半胱天冬酶3的裂解形式，也没有观察到p53的磷酸化形式。另一方面，在TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组中，观察到磷酸化的p53和PARP及半胱天冬酶3的裂解形式的表达(图40)。从上述结果可证实，TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡。
实施例5.9.通过流式细胞仪证实用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理的癌细胞凋亡作用
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理癌细胞的细胞凋亡作用，在用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理人乳腺癌和胃癌细胞系后，通过用膜联蛋白V/PI染色进行流式细胞术。
具体来说，将人乳腺癌细胞系(SK-BR-3和BT-474)和人胃癌细胞系(NCI-N87)分别以大约5×106个细胞/孔接种到6孔板中，并培养24小时。培养24小时后，用MTα-HER2scFv或1μMTPP-DOX_MTα-HER2scFv处理细胞。96小时后，用PBS清洗细胞两次，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞。离心获得的细胞，然后用PBS清洗以去除0.05％胰蛋白酶-EDTA。此后，使用膜联蛋白V/PI染色试剂盒(Roche，11988549001)对细胞染色10分钟，并使用FACS设备(Beckman Coulter，CytoFLEX)分析染色的细胞。此时，仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)作为TPP-DOX_MTα-HER2scFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MTα-HER2scFv)中没有观察到膜联蛋白V/PI值的变化。另一方面，在TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组中，膜联蛋白V/PI值有所增加(图41)。从上述结果可证实，TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理诱导细胞凋亡。
实施例5.10.评价TPP-DOX_MTα-HER2scFv对HER2表达细胞的选择性细胞凋亡诱导活性
为了证实以与上述制备实施例4相同的方式获得的TPP-DOX_MTα-HER2scFv的HER2选择性细胞凋亡诱导作用，用TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理共培养的HER2+癌细胞和HER2-正常细胞，然后进行TUNEL检测和免疫细胞化学染色。
具体来说，将人乳腺癌细胞系SK-BR-3(HER2+)和人肺成纤维细胞系CCD-8Lu(HER2-)以3×104个细胞/孔一起接种到24孔板中，在含有10％FBS的DMEM培养基中共培养24小时。此时，SK-BR-3细胞通过在含10％FBS的RPMI-1640培养基中培养而制备，WI-38细胞通过在含10％FBS的DMEM培养基中培养而制备。培养24小时后，用1μM TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理共培养的细胞，再培养48小时。通过TUNEL检测和免疫细胞化学染色来评价细胞凋亡(图42)。
实施例5.11.通过TUNEL检测证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv的HER2表达细胞选择性细胞凋亡诱导活性
将以与上述实施例5.10相同的方式处理的细胞用PBS清洗两次，然后在室温下加入3.7％甲醛固定30分钟。此后，用抗HER2抗体(Cell signaling，29D8)作为一抗，用Alexa
Figure BDA0004194317040000341
555(Invitrogen，21428)作为二抗，HER2+细胞被标记为红色荧光。此后，用TUNEL溶液染色30分钟，将发生细胞凋亡的细胞用绿色荧光标记并装片，用共聚焦显微镜观察细胞。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，仅在SK-BR-3细胞(白色箭头)中选择性地观察到强烈的绿色荧光，这些细胞是HER2+细胞(图43)。从上述结果可证实，TPP-DOX_MTα-HER2scFv可根据HER2表达的有无而选择性地诱导细胞凋亡。
制备实施例5.包括与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞系的制备
为了将线粒体特异性地引入表达PDL1的肿瘤细胞中，构建了特异性结合PDL1的抗PDL1scFv抗体(SEQ ID NO:94)融合至线粒体外膜的线粒体(图44和45)。具体构建方法参照韩国专利申请公开第10-2019-0124656号中描述的方法。
实施例6.通过Western blot分析PDL1在人类癌症细胞系中的表达
进行Western blot分析来证实PDL1在人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)中的表达水平。
具体来说，将人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)以大约1×106个细胞/孔接种到6孔板，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。24小时后，除去培养液，用PBS清洗两次细胞，然后直接向细胞中加入100μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液。10分钟后，用刮刀回收细胞，转移到微管中，然后以大约12,000xg离心10分钟。得到分离的上清液并转移到一个新的微管中，然后用BCA分析对蛋白进行定量。对每个样品的相同数量的蛋白进行电泳，然后进行Western blot。使用抗PDL1抗体(Cell signaling，13684)和抗β管蛋白抗体(Thermo Fisher，MA5-16308)作为一抗，使用抗小鼠IgG HRP抗体或抗兔IgG HRP抗体作为二抗。
结果如图46所示，证实了BXPC-3和SNU-216细胞是表达PDL1的PDL1+细胞。另一方面，证实了CFPAC-1和SNU-484细胞几乎没有表达PDL1，表明它们是PDL1-细胞。
实施例7.验证与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的PDL1靶向性
为了证实以与上述制备实施例5中构建的抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的PDL1靶向能力，将共培养的PDL1+细胞和PDL1-细胞用与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体(MTα-PDL1scFv)处理，然后进行免疫细胞化学染色。
具体来说，BXPC-3(PDL1+)和CFPAC-1(PDL1-)，或SNU-216(PDL1+)和SNU-484(PDL1-)一起以1.5×104细胞/孔接种到24孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中共培养24小时。通过用MitoTracker Red处理未经处理的HEK293细胞(MT)和包括与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞(MTα-PDL1scFv)来染色线粒体以制备用作样品的线粒体，然后分离线粒体。共培养24小时后，将共培养的细胞用每个分离的线粒体处理，并反应24小时(图47)。
实施例7.1.证实与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体在PDL1阳性和阴性细胞系中的位置
将以与上述实施例4相同的方式处理的细胞用PBS清洗一次，并在室温下加入3.7％甲醛固定30分钟，然后进行免疫细胞化学染色。此时，用抗PDL1抗体(Cellsignaling，86744)作为一抗，用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)作为二抗。用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果如图48所示，当用来源于未经处理的HEK293细胞的线粒体(MT)处理共培养的BXPC-3(PDL1+)和CFPAC-1(PDL1-)细胞时，在BXPC-3(PDL1+)和CFPAC-1(PDL1-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red(红色荧光)染色的线粒体。另一方面，当用来源于包括与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞的线粒体(MTα-PDL1scFv)处理细胞时，在PDL1+细胞(BXPC-3细胞)中特异性地观察到用Mitotracker Red染色的线粒体。
此外，同样地，在共培养的SNU-216(PDL1+)和SNU-484(PDL1-)细胞中，在MT处理组中，在PDL1+(SNU-216)和SNU-484(PDL1-)细胞中同样地观察到Mitotracker Red染色的线粒体，而在MTα-PDL1scFv处理组中，只在PDL1+细胞(SNU-216细胞)中特异性地观察到。从上述结果可以发现，与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体特异性地靶向表达PDL1抗原的细胞。
制备实施例6.与抗PDL1scFv抗体和多柔比星融合的线粒体的复合物的制备
将分离自包括与抗PDL1scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞的30μg线粒体(MTα-PDL1scFv)在4℃下与100μM多柔比星(DOX)反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟以去除未反应的多柔比星。此后，用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗两次，最后得到包括多柔比星的线粒体(DOX_MTα-PDL1scFv)(图49)。
实施例8.评价DOX_MTα-PDL1scFv对癌细胞的抗癌活性
实施例8.1.通过各浓度的DOX_MTα-PDL1scFv处理来证实细胞增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例6相同的方式获得的DOX_MTα-PDL1scFv的抗癌活性，用DOX_MTα-PDL1scFv处理人胰腺癌和胃癌细胞系后，评价细胞增殖抑制作用。
具体来说，将人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)以大约5×103个细胞/孔接种到96孔板中并培养24小时。培养24小时后，用浓度为0.01μM、0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM和1μM的DOX_MTα-PDL1scFv处理每个细胞。每隔24小时用WST-1检测法测量细胞增殖，直到样品处理后168小时。此时，仅线粒体处理组(MTα-PDL1scFv)作为DOX_MTα-PDL1scFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(NC)，在仅线粒体处理组(MTα-PDL1scFv)中没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，在DOX_MTα-PDL1scFv处理组中，癌细胞的增殖随时间以浓度依赖的方式被抑制(图50)。
实施例8.2.通过Western blot分析证实DOX_MTα-PDL1scFv处理的癌细胞凋亡
为了证实DOX_MTα-PDL1scFv在癌细胞中的细胞凋亡作用，在用DOX_MTα-PDL1scFv处理人胰腺癌和胃癌细胞系后，使用针对细胞凋亡标志物的抗体进行Western blot。
具体来说，将人胰腺癌细胞系(BXPC-3和CFPAC-1)和人胃癌细胞系(SNU-216和SNU-484)分别以大约5×106个细胞/孔接种，并培养24小时。
培养24小时后，分别用MTα-PDL1scFv或DOX_MTα-PDL1scFv处理细胞，96小时后，裂解细胞，提取蛋白，并进行Western blot。将抗裂解PARP抗体(Cell signaling，9541S)、抗裂解caspase 3抗体(Cell signaling，9664)、抗磷酸-p53抗体(ABclonal，AP0762)和抗β肌动蛋白抗体(Sigma，A2228)用作一抗，将抗小鼠IgG HRP或抗兔IgG HRP用作二抗。通过β肌动蛋白的表达水平来校正蛋白量。此时，仅线粒体处理组(MTα-PDL1scFv)作为DOX_MTα-PDL1scFv的阴性对照。
结果表明，在仅线粒体处理组(MTα-PDL1scFv)中，与未处理组(No treat)类似，没有观察到细胞凋亡期间观察到的PARP和半胱天冬酶3的裂解形式，也没有观察到p53的磷酸化形式。另一方面，在DOX_MTα-PDL1scFv处理组中，观察到了磷酸化的p53以及PARP和半胱天冬酶3的裂解形式的表达(图51)。从上述结果可证实，DOX_MTα-PDL1scFv处理诱导细胞凋亡。
制备实施例7.包括与抗MSLN scFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞系的制备
为了将线粒体特异性地引入表达间皮素(MSLN)的肿瘤细胞中，构建了与MSLN特异性结合的抗MSLNscFv抗体(SEQ ID NO:102)融合至线粒体外膜的线粒体(图52和53)。具体构建方法参照韩国专利申请公开第10-2019-0124656号中描述的方法。
制备实施例8.与抗MSLNscFv抗体和脱镁叶绿酸A融合的线粒体的复合物的制备将从包括与抗MSLNscFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞中分离的100μg线粒体(MTα-MSLNscFv)在4℃下与100μM的脱镁叶绿酸A(PBA)反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟以除去未反应的脱镁叶绿酸A。此后，用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗两次，最后得到包括脱镁叶绿酸A的线粒体(PBA_MTα-MSLNscFv)(图54)。
实施例9.证实PBA_MTα-MSLNscFv处理的细胞增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例8相同的方式获得的PBA_MTα-MSLNscFv的抗癌活性，用PBA_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系后，评价细胞增殖抑制效果。
具体来说，将人胰腺癌细胞系AsPC-1、Capan-1、Capan-2和Mia PaCa-2以5×103个细胞/孔接种到96孔板中并培养24小时。此后，用MTα-MSLNscFv或1μg PBA-MTα-MSLNscFv处理细胞，再培养72小时，然后用WST-1检测评价细胞增殖。此时，仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)作为PBA_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(CTR)，在仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，证实了在PBA_MTα-MSLNscFv处理组中，与未处理组相比，细胞生长被抑制了约80％至95％(图55至58的底部)。
此外，用倒置显微镜观察每个胰腺癌细胞系中MTα-MSLNscFv和PBA_MTα-MSLNscFv处理的形态学变化。在MTα-MSLNscFv处理组中，与未处理组相比，几乎没有观察到形态学变化，而在PBA_MTα-MSLNscFv处理组中，证实了所有癌细胞系的细胞形态都发生了变化(图55至58的顶部)。
制备实施例9.与抗MSLNscFv抗体和吉西他滨融合的线粒体复合物的制备
将从包括与抗MSLNscFv抗体融合的线粒体HEK293细胞中分离出来的100μg线粒体，在4℃下与100μM吉西他滨(Gem)反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟，除去未反应的吉西他滨。此后，用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗两次，最后得到包括吉西他滨的线粒体(Gem_MTα-MSLNscFv)(图59)。
实施例10.证实用Gem_MTα-MSLNscFv处理的细胞增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例9相同的方式获得的Gem_MTα-MSLNscFv的抗癌活性，在用Gem_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系后，评个细胞增殖抑制效果。
具体来说，将人胰腺癌细胞系AsPC-1、Capan-1、Capan-2和Mia PaCa-2分别以约5×103个细胞/孔接种到96孔板中，并培养24小时。培养24小时后，用MTα-MSLNscFv或2μg Gem_MTα-MSLNscFv处理每个细胞，再培养72小时，然后用WST-1检测测量细胞增殖。此时，仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)作为Gem_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(CTR)，在仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)中没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，证实了与未处理组相比，Gem_MTα-MSLNscFv处理组根据癌细胞系，显示出约20％至30％的细胞生长抑制作用(图60)。
制备实施例10.与抗MSLNscFv抗体和长春瑞滨融合的线粒体的复合物的制备
将从包括与抗MSLNscFv抗体融合的线粒体的HEK293细胞中分离的100μg线粒体(MTα-MSLNscFv)在4℃下与100μM长春瑞滨(VIBE)反应10分钟，然后以约12,000xg离心10分钟以除去未反应的长春瑞滨。此后，用500μL SHE(250mM蔗糖、20mM HEPES(pH7.4)、2mM EGTA)缓冲液清洗两次，最后得到包括长春瑞滨的线粒体(VIBE_MTα-MSLNscFv)(图61)。
实施例11.证实VIBE_MTα-MSLNscFv处理的细胞增殖抑制能力
为了证实以与上述制备实施例10相同的方式获得的VIBE_MTα-MSLNscFv的抗癌活性，用VIBE_MTα-MSLNscFv处理人胰腺癌细胞系后，评价细胞增殖抑制效果。
具体来说，将人胰腺癌细胞系AsPC-1、Capan-1、Capan-2和MIA PaCa-2分别以约5×103个细胞/孔接种到96孔板，并培养24小时。培养24小时后，用MTα-MSLNscFv或2μg VIBE_MTα-MSLNscFv处理每个细胞，再培养72小时，然后用WST-1检测法测量细胞增殖。此时，仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)作为VIBE_MTα-MSLNscFv的阴性对照。
结果表明，对于未处理组(CTR)，在仅线粒体处理组(MTα-MSLNscFv)没有观察到细胞增殖抑制作用。另一方面，证实了与未处理组相比，VIBE_MTα-MSLNscFv处理组根据癌细胞系，显示出约50％的细胞生长抑制作用(图62)。
实施例12.验证MTα-HER2scFv在异种移植肿瘤小鼠模型中的肿瘤细胞靶向性
将5周龄BALB/c雄性裸鼠(初始体重18～20g)(Nara Biotech)适应性训练1周，然后将HER2+人胃癌细胞系NCI-N87以1×107细胞/鼠通过皮下移植到侧腹，以构建异种移植肿瘤模型鼠。当肿瘤的平均体积达到50mm3或以上时，静脉注射20μg的MTα-HER2scFv。24小时后，提取小鼠的组织。使用抗myc抗体对每个提取的组织进行免疫组化染色分析，以证实MTα-HER2scFv在小鼠组织中的分布(图63)。
实施例12.1.证实MTα-HER2scFv在异种移植肿瘤小鼠模型中的肿瘤细胞靶向性
对以与上述实施例12中相同方式处理的小鼠组织进行免疫组化染色。使用标记有线粒体MTα-HER2scFv的抗myc抗体(罗氏，11667149001)作为一抗，使用标记有Alexa
Figure BDA0004194317040000381
488的抗小鼠IgG抗体(Invitrogen，11001)作为二抗。此时，用DAPI染色来观察细胞的细胞核。
结果表明，在肾脏和肝脏组织中没有观察到MTα-HER2scFv，但在肿瘤组织中却观察到MTα-HER2scFv(图64)。从上述结果可证实，注入小鼠静脉的MTα-HER2scFv特异性地靶向了皮下移植到小鼠侧腹的NCI-N87(HER2+)肿瘤细胞。
实施例13.评价TPP-DOX_MTα-HER2scFv在异种移植肿瘤小鼠模型中的抗癌活性
5周龄BALB/c雄性裸鼠(初始体重18～20克)(Nara Biotech)适应性训练1周，然后将HER2+人胃癌细胞株NCI-N87以1×107细胞/鼠通过皮下移植到侧腹，以构建异种移植肿瘤模型小鼠。当肿瘤的平均体积达到50～100mm3时，将小鼠分成3组，每组7只，静脉注射4μgTPP-DOX或TPP-DOX_MTα-HER2scFv，每周1次，共7次。每隔2～4天测量一次肿瘤大小，给药开始25天后，提取肿瘤组织，测量其大小和重量(图65)。
实施例13.1.证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv在异种移植肿瘤小鼠模型中的肿瘤细胞生长抑制能力
通过上述实施例13的方法进行实验的结果表明，在TPP-DOX给药组中，与对照组(CTR)相比，肿瘤大小直到第30天都很相似。另一方面，与对照组相比，TPP-DOX_MTα-HER2scFv给药组的肿瘤大小明显减小(图66)。此外，实验结束后提取的肿瘤大小(图67)和重量(图68)在TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组中也显著减小。使用Graphpad 5.0软件进行统计学处理，用单因素ANOVA(Turkey's)检验测量p值(*p<0.05)。
实施例14.评价TPP-DOX_MTα-HER2scFv在异体移植肿瘤小鼠模型中的抗癌活性
将7周龄的C57BL/6雌性小鼠(Samtako Bio Korea)适应性训练1周，然后将小鼠黑色素瘤细胞系B16F10以约5×105个细胞/鼠通过皮下移植到小鼠的侧腹，以构建异体移植肿瘤小鼠。此时，使用慢病毒过表达人HER2基因的B16F10细胞作为B16F10细胞。当肿瘤的平均体积达到100～200mm3时，将小鼠分为4组，每组3只，并将MTα-HER2scFv(20μg)、TPP-DOX(5μg)或TPP-DOX_MTα-HER2scFv(TPP-DOX/MT：5μg/20μg)静脉注射，每周3次，持续3周。每周测量3次肿瘤大小，实验结束后(从开始给药起3周后)，提取小鼠的肿瘤组织，并测量其大小和重量(图69)。
实施例14.1.证实TPP-DOX_MTα-HER2scFv在异体癌细胞移植动物模型中的肿瘤细胞生长抑制能力
通过上述实施例14的方法进行实验的结果表明，在MTα-HER2scFv和TPP-DOX给药组中，肿瘤大小与对照组(CTR)相似。另一方面，与对照组相比，TPP-DOX_MTα-HER2scFv给药组的肿瘤大小明显减小(图70)。此外，TPP-DOX_MTα-HER2scFv处理组在实验结束后提取的肿瘤的大小(图71)和重量(图72)都有所减小。
实施例15.评价DOX_MTα-HER2scFv在同种异体瘤动物模型中的抗癌活性
将7周龄的C57BL/6雌性小鼠(Samtako Bio Korea)适应性训练1周，然后将小鼠黑色素瘤细胞系B16F10以约5×105个细胞/鼠通过皮下移植到小鼠的侧腹，以构建异体移植肿瘤小鼠。此时，使用慢病毒过表达人类HER2基因的B16F10细胞作为B16F10细胞。当肿瘤的平均体积达到100～200mm3时，将小鼠分为4组，每组3只，每周静脉注射3次MTα-HER2scFv(20μg)、DOX(4μg)或DOX_MTα-HER2scFv(TPP-DOX/MT：4μg/20μg)，持续3周。每周测量3次肿瘤大小，实验结束后(从开始给药起3周后)，提取小鼠的肿瘤组织，并测量其大小和重量(图73)。
实施例15.1.证实DOX_MTα-HER2scFv在异体移植肿瘤动物模型中的肿瘤细胞生长抑制能力
通过上述实施例14的方法进行实验的结果表明，在MTα-HER2scFv给药组中，肿瘤大小与对照组(CTR)相似。另一方面，与对照组相比，DOX给药组和DOX_MTα-HER2scFv给药组的肿瘤大小显著减小。此外，证实了与DOX处理组相比，DOX_MTα-HER2scFv给药组的肿瘤大小进一步减小(图74)。此外，与对照组相比，DOX_MTα-HER2scFv给药组在实验结束后提取的肿瘤的大小(图75)和重量(图76)都有所减小。
[序列表的自由文本]
SEQ ID NO:1：T2p53引物
SEQ ID NO:2：Xp53引物
SEQ ID NO:3：编码p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:4：NdeUB引物
SEQ ID NO:5：T2UB引物
SEQ ID NO:6：编码UB-p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:7：NdeTOM70引物
SEQ ID NO:8：TOM70-AS引物
SEQ ID NO:9：TOM70UB-S引物
SEQ ID NO:10：T2UB-AS引物
SEQ ID NO:11：编码TOM70-UB-p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:12：TOM70(G)3-AS引物
SEQ ID NO:13：(G)3UB-S引物
SEQ ID NO:14：Xp53(noT)引物
SEQ ID NO:15：编码TOM70-(GGGGS)3-UB-p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:16：B(G)3p53
SEQ ID NO:17：编码TOM70-(GGGGS)3-p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:18：Xp53(noT)引物
SEQ ID NO:19：XTOM7引物
SEQ ID NO:20：LTOM7引物
SEQ ID NO:21：编码UB-p53-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:22：Rp53引物
SEQ ID NO:23：编码p53-myc/His的核苷酸序列
SEQ ID NO:24：T2GZMB引物
SEQ ID NO:25：XGZMB(noT)引物
SEQ ID NO:26：编码颗粒酶B的核苷酸序列
SEQ ID NO:27：编码TOM70-(GGGGS)3-UB-颗粒酶B的核苷酸序列
SEQ ID NO:28：编码UB-颗粒酶B-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:29：T2RKIP引物
SEQ ID NO:30：XRKIP(noT)引物
SEQ ID NO:31：编码RKIP的核苷酸序列
SEQ ID NO:32：编码TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP的核苷酸序列
SEQ ID NO:33：T2PTEN引物
SEQ ID NO:34：XPTEN(noT)引物
SEQ ID NO:35：编码PTEN的核苷酸序列
SEQ ID NO:36：编码TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN的核苷酸序列
SEQ ID NO:37：编码scFvHER2的核苷酸序列
SEQ ID NO:38：编码UB-scFvHER2-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:39：RscFvHER2引物
SEQ ID NO:40：XTOM7(noT)引物
SEQ ID NO:41：编码scFvHER2-TOM7-myc/His的核苷酸序列
SEQ ID NO:42：编码scFvMEL的核苷酸序列
SEQ ID NO:43：编码UB-scFvMEL-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:44：RscFvMEL引物
SEQ ID NO:45：编码scFvMEL-TOM7-myc/His的核苷酸序列
SEQ ID NO:46：编码scFvPD-L1的核苷酸序列
SEQ ID NO:47：编码scFvPD-L1-TOM7-myc/His的核苷酸序列
SEQ ID NO:48：p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:49：UB-p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:50：TOM70-UB-p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:51：TOM70-(GGGGS)3-UB-p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:52：TOM70-(GGGGS)3-p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:53：UB-p53-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:54：p53-myc/His的氨基酸序列
SEQ ID NO:55：颗粒酶B的氨基酸序列
SEQ ID NO:56：TOM70-(GGGGS)3-UB-颗粒酶B的氨基酸序列
SEQ ID NO:57：UB-颗粒酶B-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:58：RKIP的氨基酸序列
SEQ ID NO:59：TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP的氨基酸序列
SEQ ID NO:60：PTEN的氨基酸序列
SEQ ID NO:61：TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN的氨基酸序列
SEQ ID NO:62：scFvHER2的氨基酸序列
SEQ ID NO:63：UB-scFvHER2-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:64：scFvHER2-TOM7-myc/His的氨基酸序列
SEQ ID NO:65：scFvMEL的氨基酸序列
SEQ ID NO:66：UB-scFvMEL-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:67：scFvMEL-TOM7-myc/His的氨基酸序列
SEQ ID NO:68：scFvPD-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO:69：scFvPD-L1-TOM7-myc/His的氨基酸序列
SEQ ID NO:70：连接子
SEQ ID NO:71：泛素的氨基酸序列
SEQ ID NO:72：编码泛素的核苷酸序列
SEQ ID NO:73：p53的氨基酸序列
SEQ ID NO:74：编码p53的核苷酸序列
SEQ ID NO:75：酿酒酵母的TOM70
SEQ ID NO:76：人的TOM70
SEQ ID NO:77：酿酒酵母的TOM20
SEQ ID NO:78：人的TOM20
SEQ ID NO:79：酿酒酵母的OM45
SEQ ID NO:80：酿酒酵母的TOM5
SEQ ID NO:81：人的TOM5
SEQ ID NO:82：酿酒酵母的TOM7
SEQ ID NO:83：人的TOM7
SEQ ID NO:84：酿酒酵母的TOM22
SEQ ID NO:85：人的TOM22
SEQ ID NO:86：酿酒酵母的Fis1
SEQ ID NO:87：人的Fis1
SEQ ID NO:88：人的Bcl-2α
SEQ ID NO:89：酿酒酵母的VAMP1
SEQ ID NO:90：人的VAMP1
SEQ ID NO:91：P53-启动子-S
SEQ ID NO:92：P53-启动子-AS
SEQ ID NO:93：编码scFvPDL1-myc-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:94：scFvPDL1-myc-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:95：编码scFvHER2的核苷酸序列
SEQ ID NO:96：scFvHER2的氨基酸序列
SEQ ID NO:97：编码scFvHER2-myc-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:98：scFvHER2-myc-TOM7的氨基酸序列
SEQ ID NO:99：编码scFvMSLN的核苷酸序列
SEQ ID NO:100：scFvMSLN的氨基酸序列
SEQ ID NO:101：编码scFvMSLN-myc-TOM7的核苷酸序列
SEQ ID NO:102：scFvMSLN-myc-TOM7的氨基酸序列
<110> 白雁生物技术公司
<120> 包含抗癌药物的线粒体及其应用
<130> P23111530WP
<150> KR 10-2020-0137779
<151> 2020-10-22
<160> 102
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2p53引物
<400> 1
aaaaaaccgc ggtggtgagg agccgcagtc agatcctag 39
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xp53引物
<400> 2
aaaaaactcg agtgagtctg agtcaggccc ttctg 35
<210> 3
<211> 1186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码p53的核苷酸序列
<400> 3
ccgcggtggt gaggagccgc agtcagatcc tagcgtcgag ccccctctga gtcaggaaac 60
attttcagac ctgtggaaac tacttcctga aaacaacgtt ctgtccccct tgccgtccca 120
agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga cgatattgaa caatggttca ctgaagaccc 180
aggtccagat gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc cgcgtggccc ctgcaccagc 240
agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc cccctcctgg cccctgtcat cttctgtccc 300
ttcccagaaa acctaccagg gcagctacgg tttccgtctg ggcttcttgc attctgggac 360
agccaagtct gtgacttgca cgtactcccc tgccctcaac aagatgtttt gccaactggc 420
caagacctgc cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc ccgcccggca cccgcgtccg 480
cgccatggcc atctacaagc agtcacagca catgacggag gttgtgaggc gctgccccca 540
ccatgagcgc tgctcagata gcgatggtct ggcccctcct cagcatctta tccgagtgga 600
aggaaatttg cgtgtggagt atttggatga cagaaacact tttcgacata gtgtggtggt 660
gccctatgag ccgcctgagg ttggctctga ctgtaccacc atccactaca actacatgtg 720
taacagttcc tgcatgggcg gcatgaaccg gaggcccatc ctcaccatca tcacactgga 780
agactccagt ggtaatctac tgggacggaa cagctttgag gtgcgtgttt gtgcctgtcc 840
tgggagagac cggcgcacag aggaagagaa tctccgcaag aaaggggagc ctcaccacga 900
gctgccccca gggagcacta agcgagcact gcccaacaac accagctcct ctccccagcc 960
aaagaagaaa ccactggatg gagaatattt cacccttcag atccgtgggc gtgagcgctt 1020
cgagatgttc cgagagctga atgaggcctt ggaactcaag gatgcccagg ctgggaagga 1080
gccagggggg agcagggctc actccagcca cctgaagtcc aaaaagggtc agtctacctc 1140
ccgccataaa aaactcatgt tcaagacaga agggcctgac tcagac 1186
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeUB引物
<400> 4
ggattccata tgcaactttt cgtcaaaact ctaac 35
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2UB引物
<400> 5
atgaccaccg cggagtctca acaccaa 27
<210> 6
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码UB-p53的核苷酸序列
<400> 6
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgcaaatct tcgtcaaaac tctaacaggg aagactataa ccctagaggt tgaaccatcc 120
gacactattg aaaacgtcaa agctaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 180
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 240
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtga ggagccgcag 300
tcagatccta gcgtcgagcc ccctctgagt caggaaacat tttcagacct gtggaaacta 360
cttcctgaaa acaacgttct gtcccccttg ccgtcccaag caatggatga tttgatgctg 420
tccccggacg atattgaaca atggttcact gaagacccag gtccagatga agctcccaga 480
atgccagagg ctgctccccg cgtggcccct gcaccagcag ctcctacacc ggcggcccct 540
gcaccagccc cctcctggcc cctgtcatct tctgtccctt cccagaaaac ctaccagggc 600
agctacggtt tccgtctggg cttcttgcat tctgggacag ccaagtctgt gacttgcacg 660
tactcccctg ccctcaacaa gatgttttgc caactggcca agacctgccc tgtgcagctg 720
tgggttgatt ccacaccccc gcccggcacc cgcgtccgcg ccatggccat ctacaagcag 780
tcacagcaca tgacggaggt tgtgaggcgc tgcccccacc atgagcgctg ctcagatagc 840
gatggtctgg cccctcctca gcatcttatc cgagtggaag gaaatttgcg tgtggagtat 900
ttggatgaca gaaacacttt tcgacatagt gtggtggtgc cctatgagcc gcctgaggtt 960
ggctctgact gtaccaccat ccactacaac tacatgtgta acagttcctg catgggcggc 1020
atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc acactggaag actccagtgg taatctactg 1080
ggacggaaca gctttgaggt gcgtgtttgt gcctgtcctg ggagagaccg gcgcacagag 1140
gaagagaatc tccgcaagaa aggggagcct caccacgagc tgcccccagg gagcactaag 1200
cgagcactgc ccaacaacac cagctcctct ccccagccaa agaagaaacc actggatgga 1260
gaatatttca cccttcagat ccgtgggcgt gagcgcttcg agatgttccg agagctgaat 1320
gaggccttgg aactcaagga tgcccaggct gggaaggagc caggggggag cagggctcac 1380
tccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttc 1440
aagacagaag ggcctgatag 1460
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeTOM70引物
<400> 7
gaattccata tgaaaagttt tataactcgg aataaaactg caattttcgc aactgttgc 59
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-AS引物
<400> 8
ggtgcatact actattatca aacttttcgt caaaactc 38
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70UB-S引物
<400> 9
ggctacgtat ttatttccaa cttttcgtca aaactc 36
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2UB-AS引物
<400> 10
ggcaccaccg cggagtctca acac 24
<210> 11
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-UB-p53的核苷酸序列
<400> 11
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatcaa atcttcgtca aaactctaac agggaagact 120
ataaccctag aggttgaacc atccgacact attgaaaacg tcaaagctaa aattcaagat 180
aaagaaggta tccctccgga tcagcagaga ttgatttttg ctggtaagca actagaagat 240
ggtagaacct tgtctgacta caacatccaa aaggaatcta ctcttcactt ggtgttgaga 300
ctccgcggtg gtgaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa 360
acattttcag acctgtggaa actacttcct gaaaacaacg ttctgtcccc cttgccgtcc 420
caagcaatgg atgatttgat gctgtccccg gacgatattg aacaatggtt cactgaagac 480
ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca gaggctgctc cccgcgtggc ccctgcacca 540
gcagctccta caccggcggc ccctgcacca gccccctcct ggcccctgtc atcttctgtc 600
ccttcccaga aaacctacca gggcagctac ggtttccgtc tgggcttctt gcattctggg 660
acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc cctgccctca acaagatgtt ttgccaactg 720
gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc 780
cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag cacatgacgg aggttgtgag gcgctgcccc 840
caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt ctggcccctc ctcagcatct tatccgagtg 900
gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat gacagaaaca cttttcgaca tagtgtggtg 960
gtgccctatg agccgcctga ggttggctct gactgtacca ccatccacta caactacatg 1020
tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac cggaggccca tcctcaccat catcacactg 1080
gaagactcca gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt 1140
cctgggagag accggcgcac agaggaagag aatctccgca agaaagggga gcctcaccac 1200
gagctgcccc cagggagcac taagcgagca ctgcccaaca acaccagctc ctctccccag 1260
ccaaagaaga aaccactgga tggagaatat ttcacccttc agatccgtgg gcgtgagcgc 1320
ttcgagatgt tccgagagct gaatgaggcc ttggaactca aggatgccca ggctgggaag 1380
gagccagggg ggagcagggc tcactccagc cacctgaagt ccaaaaaggg tcagtctacc 1440
tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca gaagggcctg actcagacct cgagcaccac 1500
caccaccacc actag 1515
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70(G)3-AS引物
<400> 12
gcccccggat cctccacccc cgcttccgcc acctccataa tagtagtatg caccaatag 59
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (G)3UB-S引物
<400> 13
ggtggaggat ccgggggcgc ggaagccaaa tc 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xp53(noT)引物
<400> 14
aaaaaactcg aggtctgagt caggcccttc tg 32
<210> 15
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-(GGGGS)3-UB-p53的核苷酸序列
<400> 15
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatgga ggtggcggaa gcgggggtgg aggatccggg 120
ggcggcggaa gccaaatctt cgtcaaaact ctaacaggga agactataac cctagaggtt 180
gaaccatccg acactattga aaacgtcaaa gctaaaattc aagataaaga aggtatccct 240
ccggatcagc agagattgat ttttgctggt aagcaactag aagatggtag aaccttgtct 300
gactacaaca tccaaaagga atctactctt cacttggtgt tgagactccg cggtggtgag 360
gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc cctctgagtc aggaaacatt ttcagacctg 420
tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg tcccccttgc cgtcccaagc aatggatgat 480
ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa tggttcactg aagacccagg tccagatgaa 540
gctcccagaa tgccagaggc tgctccccgc gtggcccctg caccagcagc tcctacaccg 600
gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc ctgtcatctt ctgtcccttc ccagaaaacc 660
taccagggca gctacggttt ccgtctgggc ttcttgcatt ctgggacagc caagtctgtg 720
acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag atgttttgcc aactggccaa gacctgccct 780
gtgcagctgt gggttgattc cacacccccg cccggcaccc gcgtccgcgc catggccatc 840
tacaagcagt cacagcacat gacggaggtt gtgaggcgct gcccccacca tgagcgctgc 900
tcagatagcg atggtctggc ccctcctcag catcttatcc gagtggaagg aaatttgcgt 960
gtggagtatt tggatgacag aaacactttt cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg 1020
cctgaggttg gctctgactg taccaccatc cactacaact acatgtgtaa cagttcctgc 1080
atgggcggca tgaaccggag gcccatcctc accatcatca cactggaaga ctccagtggt 1140
aatctactgg gacggaacag ctttgaggtg cgtgtttgtg cctgtcctgg gagagaccgg 1200
cgcacagagg aagagaatct ccgcaagaaa ggggagcctc accacgagct gcccccaggg 1260
agcactaagc gagcactgcc caacaacacc agctcctctc cccagccaaa gaagaaacca 1320
ctggatggag aatatttcac ccttcagatc cgtgggcgtg agcgcttcga gatgttccga 1380
gagctgaatg aggccttgga actcaaggat gcccaggctg ggaaggagcc aggggggagc 1440
agggctcact ccagccacct gaagtccaaa aagggtcagt ctacctcccg ccataaaaaa 1500
ctcatgttca agacagaagg gcctgactca gacctcgagc accaccacca ccaccactag 1560
1560
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B(G)3p53
<400> 16
ggtggaggat ccgggggcgg cggaagcgag gagccgcagt cagatcctag c 51
<210> 17
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-(GGGGS)3-p53的核苷酸序列
<400> 17
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatgga ggtggcggaa gcgggggtgg aggatccggg 120
ggcggcggaa gcgaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa 180
acattttcag acctgtggaa actacttcct gaaaacaacg ttctgtcccc cttgccgtcc 240
caagcaatgg atgatttgat gctgtccccg gacgatattg aacaatggtt cactgaagac 300
ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca gaggctgctc cccgcgtggc ccctgcacca 360
gcagctccta caccggcggc ccctgcacca gccccctcct ggcccctgtc atcttctgtc 420
ccttcccaga aaacctacca gggcagctac ggtttccgtc tgggcttctt gcattctggg 480
acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc cctgccctca acaagatgtt ttgccaactg 540
gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc 600
cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag cacatgacgg aggttgtgag gcgctgcccc 660
caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt ctggcccctc ctcagcatct tatccgagtg 720
gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat gacagaaaca cttttcgaca tagtgtggtg 780
gtgccctatg agccgcctga ggttggctct gactgtacca ccatccacta caactacatg 840
tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac cggaggccca tcctcaccat catcacactg 900
gaagactcca gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt 960
cctgggagag accggcgcac agaggaagag aatctccgca agaaagggga gcctcaccac 1020
gagctgcccc cagggagcac taagcgagca ctgcccaaca acaccagctc ctctccccag 1080
ccaaagaaga aaccactgga tggagaatat ttcacccttc agatccgtgg gcgtgagcgc 1140
ttcgagatgt tccgagagct gaatgaggcc ttggaactca aggatgccca ggctgggaag 1200
gagccagggg ggagcagggc tcactccagc cacctgaagt ccaaaaaggg tcagtctacc 1260
tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca gaagggcctg actcagacct cgagcaccac 1320
caccaccacc actag 1335
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xp53(noT)引物
<400> 18
aaaaaactcg aggtctgagt caggcccttc tg 32
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XTOM7引物
<400> 19
aaaaaactcg agtttgccat tcgctggggc tttatc 36
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTOM7引物
<400> 20
aaaaaagtcg acttatcccc aaagtaggct caaaacag 38
<210> 21
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码UB-p53-TOM7的核苷酸序列
<400> 21
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgcaaatct tcgtcaaaac tctaacaggg aagactataa ccctagaggt tgaaccatcc 120
gacactattg aaaacgtcaa agctaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 180
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 240
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtga ggagccgcag 300
tcagatccta gcgtcgagcc ccctctgagt caggaaacat tttcagacct atggaaacta 360
cttcctgaaa acaacgttct gtcccccttg ccgtcccaag caatggatga tttgatgctg 420
tccccggacg atattgaaca atggttcact gaagacccag gtccagatga agctcccaga 480
atgccagagg ctgctccccg cgtggcccct gcaccagcag ctcctacacc ggcggcccct 540
gcaccagccc cctcctggcc cctgtcatct tctgtccctt cccagaaaac ctaccagggc 600
agctacggtt tccgtctggg cttcttgcat tctgggacag ccaagtctgt gacttgcacg 660
tactcccctg ccctcaacaa gatgttttgc caactggcca agacctgccc tgtgcagctg 720
tgggttgatt ccacaccccc gcccggcacc cgcgtccgcg ccatggccat ctacaagcag 780
tcacagcaca tgacggaggt tgtgaggcgc tgcccccacc atgagcgctg ctcagatagc 840
gatggtctgg cccctcctca gcatcttatc cgagtggaag gaaatttgcg tgtggagtat 900
ttggatgaca gaaacacttt tcgacatagt gtggtggtgc cctatgagcc gcctgaggtt 960
ggctctgact gtaccaccat ccactacaac tacatgtgta acagttcctg catgggcggc 1020
atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc acactggaag actccagtgg taatctactg 1080
ggacggaaca gctttgaggt gcatgtttgt gcctgtcctg ggagagaccg gcgcacagag 1140
gaagagaatc tccgcaagaa aggggagcct caccacgagc tgcccccagg gagcactaag 1200
cgagcactgt ccaacaacac cagctcctct ccccagccaa agaagaaacc actggatgga 1260
gaatatttca cccttcagat ccgtgggcgt gagcgcttcg agatgttccg agagctgaat 1320
gaggccttgg aactcaagga tgcccaggct gggaaggagc caggggggag cagggctcac 1380
tccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttc 1440
aagacagaag ggcctgactc agacctcgag tttgccattc gctggggctt tatccctctt 1500
gtgatttacc tgggatttaa gaggggtgca gatcccggaa tgcctgaacc aactgttttg 1560
agcctacttt ggggatag 1578
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rp53引物
<400> 22
aaaaaagaat tcatggtctg agtcaggccc ttctg 35
<210> 23
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码p53-myc/His的核苷酸序列
<400> 23
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
gacctgtgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120
gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180
gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccgcgtgg cccctgcacc agcagctcct 240
acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300
aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360
tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420
tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480
gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540
cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600
ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660
gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720
tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780
agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tcctgggaga 840
gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900
ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960
aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1020
ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1080
gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1140
aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagacc tcgagtctag agggcccttc 1200
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatatgcata ccggtcatca tcaccatcac 1260
cattga 1266
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2GZMB引物
<400> 24
aaaaaaccgc ggtggtatca tcgggggaca tgaggcacat gaggccaagc c 51
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XGZMB(noT)引物
<400> 25
aaaaaactcg aggtagcgtt tcatggtttt ctttatcc 38
<210> 26
<211> 691
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码颗粒酶B的核苷酸序列
<400> 26
ccgcggtggt atcatcgggg gacatgaggc caagccccac tcccgcccct acatggctta 60
tcttatgatc tgggatcaga agtctctgaa gaggtgcggt ggcttcctga tacaagacga 120
cttcgtgctg acagctgctc actgttgggg aagctccata aatgtcacct tgggggccca 180
caatatcaaa gaacaggagc cgacccagca gtttatccct gtgaaaagac ccatccccca 240
tccagcctat aatcctaaga acttctccaa cgacatcatg ctactgcagc tggagagaaa 300
ggccaagcgg accagagctg tgcagcccct caggctacct agcaacaagg cccaggtgaa 360
gccagggcag acatgcagtg tggccggctg ggggcagacg gcccccctgg gaaaacactc 420
acacacacta caagaggtga agatgacagt gcaggaagat cgaaagtgcg aatctgactt 480
acgccattat tacgacagta ccattgagtt gtgcgtgggg gacccagaga ttaaaaagac 540
ttcctttaag ggggactctg gaggccctct tgtgtgtaac aaggtggccc agggcattgt 600
ctcctatgga cgaaacaatg gcatgcctcc acgagcctgc accaaagtct caagctttgt 660
acactggata aagaaaacca tgaaacgcta c 691
<210> 27
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-(GGGGS)3-UB-颗粒酶B的核苷酸序列
<400> 27
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatgga ggtggcggaa gcgggggtgg aggatccggg 120
ggcggcggaa gccaaatctt cgtcaaaact ctaacaggga agactataac cctagaggtt 180
gaaccatccg acactattga aaacgtcaaa gctaaaattc aagataaaga aggtatccct 240
ccggatcagc agagattgat ttttgctggt aagcaactag aagatggtag aaccttgtct 300
gactacaaca tccaaaagga atctactctt cacttggtgt tgagactccg cggtggtatc 360
atcgggggac atgaggccaa gccccactcc cgcccctaca tggcttatct tatgatctgg 420
gatcagaagt ctctgaagag gtgcggtggc ttcctgatac gagacgactt cgtgctgaca 480
gctgctcact gttggggaag ctccataaat gtcaccttgg gggcccacaa tatcaaagaa 540
caggagccga cccagcagtt tatccctgtg aaaagaccca tcccccatcc agcctataat 600
cctaagaact tctccaacga catcatgcta ctgcagctgg agagaaaggc caagcggacc 660
agagctgtgc agcccctcag gctacctagc aacaaggccc aggtgaagcc agggcagaca 720
tgcagtgtgg ccggctgggg gcagacggcc cccctgggaa aacactcaca cacactacaa 780
gaggtgaaga tgacagtgca ggaagatcga aagtgcgaat ctgacttacg ccattattac 840
gacagtacca ttgagttgtg cgtgggggac ccagagatta aaaagacttc ctttaagggg 900
gactctggag gccctcttgt gtgtaacaag gtggcccagg gcattgtctc ctatggacga 960
aacaatggca tgcctccacg agcctgcacc aaagtctcaa gctttgtaca ctggataaag 1020
aaaaccatga aacgctacct cgagcaccac caccaccacc actag 1065
<210> 28
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码UB-颗粒酶 B-TOM7的核苷酸序列
<400> 28
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgcaaatct tcgtcaaaac tctaacaggg aagactataa ccctagaggt tgaaccatcc 120
gacactattg aaaacgtcaa agctaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 180
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 240
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtat catcggggga 300
catgaggcca agccccactc ccgcccctac atggcttatc ttatgatctg ggatcagaag 360
tctctgaaga ggtgcggtgg cttcctgata cgagacgact tcgtgctgac agctgctcac 420
tgttggggaa gctccataaa tgtcaccttg ggggcccaca atatcaaaga acaggagccg 480
acccagcagt ttatccctgt gaaaagaccc atcccccatc cagcctataa tcctaagaac 540
ttctccaacg acatcatgct actgcagctg gagagaaagg ccaagcggac cagagctgtg 600
cagcccctca ggctacctag caacaaggcc caggtgaagc cagggcagac atgcagtgtg 660
gccggctggg ggcagacggc ccccctggga aaacactcac acacactaca agaggtgaag 720
atgacagtgc aggaagatcg aaagtgcgaa tctgacttac gccattatta cgacagtacc 780
attgagttgt gcgtggggga cccagagatt aaaaagactt cctttaaggg ggactctgga 840
ggccctcttg tgtgtaacaa ggtggcccag ggcattgtct cctatggacg aaacaatggc 900
atgcctccac gagcctgcac caaagtctca agctttgtac actggataaa gaaaaccatg 960
aaacgctacc tcgagtttgc cattcgctgg ggctttatcc ctcttgtgat ttacctggga 1020
tttaagaggg gtgcagatcc cggaatgcct gaaccaactg ttttgagcct actttgggga 1080
tag 1083
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2RKIP引物
<400> 29
aaaaaaccgc ggtggtccgg tggacctcag caagtggtc 39
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XRKIP(noT)引物
<400> 30
aaaaaactcg agcttcccag acagctgctc gtacagtttg g 41
<210> 31
<211> 568
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码RKIP的核苷酸序列
<400> 31
ccgcggtggt ccggtggacc tcagcaagtg gtccgggccc ttgagcctgc aagaagtgga 60
cgagcagccg cagcacccac tgcatgtcac ctacgccggg gcggcggtgg acgagctggg 120
caaagtgctg acgcccaccc aggttaagaa tagacccacc agcatttcgt gggatggtct 180
tgattcaggg aagctctaca ccttggtcct gacagacccg gatgctccca gcaggaagga 240
tcccaaatac agagaatggc atcatttcct ggtggtcaac atgaagggca atgacatcag 300
cagtggcaca gtcctctccg attatgtggg ctcggggcct cccaagggca caggcctcca 360
ccgctatgtc tggctggttt acgagcagga caggccgcta aagtgtgacg agcccatcct 420
cagcaaccga tctggagacc accgtggcaa attcaaggtg gcgtccttcc gtaaaaagta 480
tgagctcagg gccccggtgg ctggcacgtg ttaccaggcc gagtgggatg actatgtgcc 540
caaactgtac gagcagctgt ctgggaag 568
<210> 32
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP的核苷酸序列
<400> 32
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatgga ggtggcggaa gcgggggtgg aggatccggg 120
ggcggcggaa gccaaatctt cgtcaaaact ctaacaggga agactataac cctagaggtt 180
gaaccatccg acactattga aaacgtcaaa gctaaaattc aagataaaga aggtatccct 240
ccggatcagc agagattgat ttttgctggt aagcaactag aagatggtag aaccttgtct 300
gactacaaca tccaaaagga atctactctt cacttggtgt tgagactccg cggtggtccg 360
gtggacctca gcaagtggtc cgggcccttg agcctgcaag aagtggacga gcagccgcag 420
cacccactgc atgtcaccta cgccggggcg gcggtggacg agctgggcaa agtgctgacg 480
cccacccagg ttaagaatag acccaccagc atttcgtggg atggtcttga ttcagggaag 540
ctctacacct tggtcctgac agacccggat gctcccagca ggaaggatcc caaatacaga 600
gaatggcatc atttcctggt ggtcaacatg aagggcaatg acatcagcag tggcacagtc 660
ctctccgatt atgtgggctc ggggcctccc aagggcacag gcctccaccg ctatgtctgg 720
ctggtttacg agcaggacag gccgctaaag tgtgacgagc ccatcctcag caaccgatct 780
ggagaccacc gtggcaaatt caaggtggcg tccttccgta aaaagtatga gctcagggcc 840
ccggtggctg gcacgtgtta ccaggccgag tgggatgact atgtgcccaa actgtacgag 900
cagctgtctg ggaagctcga gcaccaccac caccaccact ag 942
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2PTEN引物
<400> 33
aaaaaaccgc ggtggtacag ccatcatcaa agagatcgtt ag 42
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XPTEN(noT)引物
<400> 34
aaaaaactcg aggacttttg taatttgtgt atgctg 36
<210> 35
<211> 1216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PTEN的核苷酸序列
<400> 35
ccgcggtggt acagccatca tcaaagagat cgttagcaga aacaaaagga gatatcaaga 60
ggatggattc gacttagact tgacctatat ttatccaaac attattgcta tgggatttcc 120
tgcagaaaga cttgaaggcg tatacaggaa caatattgat gatgtagtaa ggtttttgga 180
ttcaaagcat aaaaaccatt acaagatata caatctttgt gctgaaagac attatgacac 240
cgccaaattt aattgcagag ttgcacaata tccttttgaa gaccataacc caccacagct 300
agaacttatc aaaccctttt gtgaagatct tgaccaatgg ctaagtgaag atgacaatca 360
tgttgcagca attcactgta aagctggaaa gggacgaact ggtgtaatga tatgtgcata 420
tttattacat cggggcaaat ttttaaaggc acaagaggcc ctagatttct atggggaagt 480
aaggaccaga gacaaaaagg gagtaactat tcccagtcag aggcgctatg tgtattatta 540
tagctacctg ttaaagaatc atctggatta tagaccagtg gcactgttgt ttcacaagat 600
gatgtttgaa actattccaa tgttcagtgg cggaacttgc aatcctcagt ttgtggtctg 660
ccagctaaag gtgaagatat attcctccaa ttcaggaccc acacgacggg aagacaagtt 720
catgtacttt gagttccctc agccgttacc tgtgtgtggt gatatcaaag tagagttctt 780
ccacaaacag aacaagatgc taaaaaagga caaaatgttt cacttttggg taaatacatt 840
cttcatacca ggaccagagg aaacctcaga aaaagtagaa aatggaagtc tatgtgatca 900
agaaatcgat agcatttgca gtatagagcg tgcagataat gacaaggaat atctagtact 960
tactttaaca aaaaatgatc ttgacaaagc aaataaagac aaagccaacc gatacttttc 1020
tccaaatttt aaggtgaagc tgtacttcac aaaaacagta gaggagccgt caaatccaga 1080
ggctagcagt tcaacttctg taacaccaga tgttagtgac aatgaacctg atcattatag 1140
atattctgac accactgact ctgatccaga gaatgaacct tttgatgaag atcagcatac 1200
acaaattaca aaagtc 1216
<210> 36
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN的核苷酸序列
<400> 36
atgaaaagtt ttataactcg gaataaaact gcaattttcg caactgttgc tgctacggga 60
accgctattg gtgcatacta ctattatgga ggtggcggaa gcgggggtgg aggatccggg 120
ggcggcggaa gccaaatctt cgtcaaaact ctaacaggga agactataac cctagaggtt 180
gaaccatccg acactattga aaacgtcaaa gctaaaattc aagataaaga aggtatccct 240
ccggatcagc agagattgat ttttgctggt aagcaactag aagatggtag aaccttgtct 300
gactacaaca tccaaaagga atctactctt cacttggtgt tgagactccg cggtggtaca 360
gccatcatca aagagatcgt tagcagaaac aaaaggagat atcaagagga tggattcgac 420
ttagacttga cctatattta tccaaacatt attgctatgg gatttcctgc agaaagactt 480
gaaggcgtat acaggaacaa tattgatgat gtagtaaggt ttttggattc aaagcataaa 540
aaccattaca agatatacaa tctttgtgct gaaagacatt atgacaccgc caaatttaat 600
tgcagagttg cacaatatcc ttttgaagac cataacccac cacagctaga acttatcaaa 660
cccttttgtg aagatcttga ccaatggcta agtgaagatg acaatcatgt tgcagcaatt 720
cactgtaaag ctggaaaggg acgaactggt gtaatgatat gtgcatattt attacatcgg 780
ggcaaatttt taaaggcaca agaggcccta gatttctatg gggaagtaag gaccagagac 840
aaaaagggag taactattcc cagtcagagg cgctatgtgt attattatag ctacctgtta 900
aagaatcatc tggattatag accagtggca ctgttgtttc acaagatgat gtttgaaact 960
attccaatgt tcagtggcgg aacttgcaat cctcagtttg tggtctgcca gctaaaggtg 1020
aagatatatt cctccaattc aggacccaca cgacgggaag acaagttcat gtactttgag 1080
ttccctcagc cgttacctgt gtgtggtgat atcaaagtag agttcttcca caaacagaac 1140
aagatgctaa aaaaggacaa aatgtttcac ttttgggtaa atacattctt cataccagga 1200
ccagaggaaa cctcagaaaa agtagaaaat ggaagtctat gtgatcaaga aatcgatagc 1260
atttgcagta tagagcgtgc agataatgac aaggaatatc tagtacttac tttaacaaaa 1320
aatgatcttg acaaagcaaa taaagacaaa gccaaccgat acttttctcc aaattttaag 1380
gtgaagctgt acttcacaaa aacagtagag gagccgtcaa atccagaggc tagcagttca 1440
acttctgtaa caccagatgt tagtgacaat gaacctgatc attatagata ttctgacacc 1500
actgactctg atccagagaa tgaacctttt gatgaagatc agcatacaca aattacaaaa 1560
gtcctcgagc accaccacca ccaccactag 1590
<210> 37
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvHER2的核苷酸序列
<400> 37
ccgcggtggt gaagtgcaac ttgttgagag tggcggagga ctggtccaac cgggcggttc 60
acttaggctc tcatgtgcag cttcagggtt cacgttcacg gactatacaa tggactgggt 120
gaggcaagcc cctggtaagg gactggagtg ggttgctgac gttaacccta attccggtgg 180
gtccatctac aaccagcgat tcaagggacg atttactctt tcagtcgaca gaagcaaaaa 240
caccctctac ctccagatga actccttgcg ggcagaggat acagcggtct actattgcgc 300
gagaaacttg ggaccaagct tctacttcga ctactggggg caaggaacgc ttgttacggt 360
ttcaagcgga ggtggaggaa gtggaggtgg cggttccggc ggtggcggtt cagatataca 420
gatgacccaa tcacccagtt ctcttagcgc gtctgtaggc gacagggtaa ccataacctg 480
caaggcgtcc caggacgtgt caattggagt tgcctggtat cagcaaaaac ctgggaaagc 540
tccgaagctc ctgatttaca gcgcatctta ccgatatact ggtgtccctt caaggttcag 600
tggcagtgga tctgggacag actttacgct tactatcagc agtctgcaac ctgaggattt 660
cgcgacctac tactgtcagc agtattacat ctatccgtac acgttcggtc aaggtacaaa 720
ggtagaaata aaacgcact 739
<210> 38
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码UB-scFvHER2-TOM7的核苷酸序列
<400> 38
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgcaaatct tcgtcaaaac tctaacaggg aagactataa ccctagaggt tgaaccatcc 120
gacactattg aaaacgtcaa agctaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 180
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 240
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtga agtgcaactt 300
gttgagagtg gcggaggact ggtccaaccg ggcggttcac ttaggctctc atgtgcagct 360
tcagggttca cgttcacgga ctatacaatg gactgggtga ggcaagcccc tggtaaggga 420
ctggagtggg ttgctgacgt taaccctaat tccggtgggt ccatctacaa ccagcgattc 480
aagggacgat ttactctttc agtcgacaga agcaaaaaca ccctctacct ccagatgaac 540
tccttgcggg cagaggatac agcggtctac tattgcgcga gaaacttggg accaagcttc 600
tacttcgact actgggggca aggaacgctt gttacggttt caagcggagg tggaggaagt 660
ggaggtggcg gttccggcgg tggcggttca gatatacaga tgacccaatc acccagttct 720
cttagcgcgt ctgtaggcga cagggtaacc ataacctgca aggcgtccca ggacgtgtca 780
attggagttg cctggtatca gcaaaaacct gggaaagctc cgaagctcct gatttacagc 840
gcatcttacc gatatactgg tgtcccttca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac 900
tttacgctta ctatcagcag tctgcaacct gaggatttcg cgacctacta ctgtcagcag 960
tattacatct atccgtacac gttcggtcaa ggtacaaagg tagaaataaa acgcactttt 1020
gccattcgct ggggctttat ccctcttgtg atttacctgg gatttaagag gggtgcagat 1080
cccggaatgc ctgaaccaac tgttttgagc ctactttggg gatag 1125
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RscFvHER2引物
<400> 39
aaaaaagaat tcatggaagt gcaacttgtt gagagtgg 38
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XTOM7(noT)引物
<400> 40
aaaaaactcg agtccccaaa gtaggctcaa aacag 35
<210> 41
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvHER2-TOM7-myc/His的核苷酸序列
<400> 41
atggaagtgc aacttgttga gagtggcgga ggactggtcc aaccgggcgg ttcacttagg 60
ctctcatgtg cagcttcagg gttcacgttc acggactata caatggactg ggtgaggcaa 120
gcccctggta agggactgga gtgggttgct gacgttaacc ctaattccgg tgggtccatc 180
tacaaccagc gattcaaggg acgatttact ctttcagtcg acagaagcaa aaacaccctc 240
tacctccaga tgaactcctt gcgggcagag gatacagcgg tctactattg cgcgagaaac 300
ttgggaccaa gcttctactt cgactactgg gggcaaggaa cgcttgttac ggtttcaagc 360
ggaggtggag gaagtggagg tggcggttcc ggcggtggcg gttcagatat acagatgacc 420
caatcaccca gttctcttag cgcgtctgta ggcgacaggg taaccataac ctgcaaggcg 480
tcccaggacg tgtcaattgg agttgcctgg tatcagcaaa aacctgggaa agctccgaag 540
ctcctgattt acagcgcatc ttaccgatat actggtgtcc cttcaaggtt cagtggcagt 600
ggatctggga cagactttac gcttactatc agcagtctgc aacctgagga tttcgcgacc 660
tactactgtc agcagtatta catctatccg tacacgttcg gtcaaggtac aaaggtagaa 720
ataaaacgca cttttgccat tcgctggggc tttatccctc ttgtgattta cctgggattt 780
aagaggggtg cagatcccgg aatgcctgaa ccaactgttt tgagcctact ttggggactc 840
gagtctagag ggcccttcga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tatgcatacc 900
ggtcatcatc accatcacca ttga 924
<210> 42
<211> 760
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvMEL的核苷酸序列
<400> 42
ccgcggtggt acggacattg tgatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg 60
agacagggtc agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg gatactaatg tagcctggta 120
tcaacaaaaa ccagggcaat ctcctgaacc actgcttttc tcggcatcct accgttacac 180
tggagtccct gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag 240
caatgtgcag tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatcctct 300
gacgttcggt ggaggcacca agctggagat caaaggctcc accagcggca gcggtaagcc 360
aggctccggc gaaggcagca ccaaaggcga agtgaaggtt gaggagtctg gaggaggctt 420
ggtgcaacct ggaggatcca tgaaactctc ctgtgttgtc tctggattca ctttcggtaa 480
ttactggatg aactgggtcc gccagtctcc agagaagggg cttgagtgga ttgcagaaat 540
tagattgaaa tccaataatt ttgcaagata ttatgcggag tctgtgaaag ggaggttcac 600
catctcaaga gatgattcca aaagtagtgt ctacctgcaa atgatcaacc taagagctga 660
agatactggc atttattact gtaccagtta tggtaactac gttgggcact attttgacca 720
ctggggccaa ggcaccactc tcaccgtctc cctttgggga 760
<210> 43
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码UB-scFvMEL-TOM7的核苷酸序列
<400> 43
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgcaaatct tcgtcaaaac tctaacaggg aagactataa ccctagaggt tgaaccatcc 120
gacactattg aaaacgtcaa agctaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 180
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 240
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtac ggacattgtg 300
atgacccagt ctcaaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc 360
aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct 420
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca 480
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg 540
gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag 600
ctggagatca aaggctccac cagcggcagc ggtaagccag gctccggcga aggcagcacc 660
aaaggcgaag tgaaggttga ggagtctgga ggaggcttgg tgcaacctgg aggatccatg 720
aaactctcct gtgttgtctc tggattcact ttcggtaatt actggatgaa ctgggtccgc 780
cagtctccag agaaggggct tgagtggatt gcagaaatta gattgaaatc caataatttt 840
gcaagatatt atgcggagtc tgtgaaaggg aggttcacca tctcaagaga tgattccaaa 900
agtagtgtct acctgcaaat gatcaaccta agagctgaag atactggcat ttattactgt 960
accagttatg gtaactacgt tgggcactat tttgaccact ggggccaagg caccactctc 1020
accgtctcct catttgccat tcgctggggc tttatccctc ttgtgattta cctgggattt 1080
aagaggggtg cagatcccgg aatgcctgaa ccaactgttt tgagcctact ttgggga 1137
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RscFvMEL引物
<400> 44
aaaaaagaat tcatgaaaac aagtaaccca ggagtg 36
<210> 45
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvMEL-TOM7-myc/His的核苷酸序列
<400> 45
atgacggaca ttgtgatgac ccagtctcaa aaattcatgt ccacatcagt aggagacagg 60
gtcagcgtca cctgcaaggc cagtcagaat gtggatacta atgtagcctg gtatcaacaa 120
aaaccagggc aatctcctga accactgctt ttctcggcat cctaccgtta cactggagtc 180
cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcaatgtg 240
cagtctgaag acttggcaga gtatttctgt cagcaatata acagctatcc tctgacgttc 300
ggtggaggca ccaagctgga gatcaaaggc tccaccagcg gcagcggtaa gccaggctcc 360
ggcgaaggca gcaccaaagg cgaagtgaag gttgaggagt ctggaggagg cttggtgcaa 420
cctggaggat ccatgaaact ctcctgtgtt gtctctggat tcactttcgg taattactgg 480
atgaactggg tccgccagtc tccagagaag gggcttgagt ggattgcaga aattagattg 540
aaatccaata attttgcaag atattatgcg gagtctgtga aagggaggtt caccatctca 600
agagatgatt ccaaaagtag tgtctacctg caaatgatca acctaagagc tgaagatact 660
ggcatttatt actgtaccag ttatggtaac tacgttgggc actattttga ccactggggc 720
caaggcacca ctctcaccgt ctcctcattt gccattcgct ggggctttat ccctcttgtg 780
atttacctgg gatttaagag gggtgcagat cccggaatgc ctgaaccaac tgttttgagc 840
ctactttggg gactcgagtc tagagggccc ttcgaacaaa aactcatctc agaagaggat 900
ctgaatatgc ataccggtca tcatcaccat caccattga 939
<210> 46
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvPD-L1的核苷酸序列
<400> 46
atggacatcg tgatgagcca gtctcccagc agcctggctg tgtctgctgg ggagaaggtg 60
accatgtcct gcaagagctc ccagtccctg ctgaacagcc gcaccaggaa gaactacctg 120
gcctggtacc agcagaagcc aggccagagc cccaagctcc tcatctactg ggccagcacc 180
cgggagagcg gggtgcctga ccgcttcact ggaagtggca gcggcacaga cttcaccctg 240
accatcagct ctgtgcaggc cgaggacctg gcagtgtact actgccagca aagctatgat 300
gtggtgacat ttggagctgg caccaagctg gagctgaagg gaggtggcgg aagcgggggt 360
ggaggatccg ggggcggcgg aagccaggtc caggtgcagc agagcggggc tgagctggcc 420
gagcccgggg cctctgtgaa gatgagctgc aaggcttctg gctacatctt caccagctac 480
tggatgcact ggctcaagca gaggcctggg caggggctgg agtggatcgg ctatatcaac 540
cccagcagtg actacaatga atattctgag aagttcatgg acaaagccac cctgactgct 600
gacaaggcca gcaccaccgc ctacatgcag ctgatcagcc tgacctcaga ggacagcgct 660
gtgtactact gtgcccggag cggctggctg gtgcacgggg actattattt tgattattgg 720
ggccagggca ccacactgac agtgagcagc 750
<210> 47
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvPD-L1-TOM7-myc/His的核苷酸序列
<400> 47
atggacatcg tgatgagcca gtctcccagc agcctggctg tgtctgctgg ggagaaggtg 60
accatgtcct gcaagagctc ccagtccctg ctgaacagcc gcaccaggaa gaactacctg 120
gcctggtacc agcagaagcc aggccagagc cccaagctcc tcatctactg ggccagcacc 180
cgggagagcg gggtgcctga ccgcttcact ggaagtggca gcggcacaga cttcaccctg 240
accatcagct ctgtgcaggc cgaggacctg gcagtgtact actgccagca aagctatgat 300
gtggtgacat ttggagctgg caccaagctg gagctgaagg gaggtggcgg aagcgggggt 360
ggaggatccg ggggcggcgg aagccaggtc caggtgcagc agagcggggc tgagctggcc 420
gagcccgggg cctctgtgaa gatgagctgc aaggcttctg gctacatctt caccagctac 480
tggatgcact ggctcaagca gaggcctggg caggggctgg agtggatcgg ctatatcaac 540
cccagcagtg actacaatga atattctgag aagttcatgg acaaagccac cctgactgct 600
gacaaggcca gcaccaccgc ctacatgcag ctgatcagcc tgacctcaga ggacagcgct 660
gtgtactact gtgcccggag cggctggctg gtgcacgggg actattattt tgattattgg 720
ggccagggca ccacactgac agtgagcagc ctcgagtttg ccattcgctg gggctttatc 780
cctcttgtga tttacctggg atttaagagg ggtgcagatc ccggaatgcc tgaaccaact 840
gttttgagcc tactttgggg actcgagtct agagggccct tcgaacaaaa actcatctca 900
gaagaggatc tgaatatgca taccggtcat catcaccatc accattga 948
<210> 48
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> p53的氨基酸序列
<400> 48
Arg Gly Gly Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn
20 25 30
Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser
35 40 45
Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu
50 55 60
Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser
85 90 95
Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg
100 105 110
Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr
115 120 125
Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro
130 135 140
Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg
145 150 155 160
Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg
165 170 175
Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro
180 185 190
Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu
195 200 205
Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro
210 215 220
Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys
225 230 235 240
Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile
245 250 255
Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe
260 265 270
Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu
275 280 285
Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly
290 295 300
Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro
305 310 315 320
Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly
325 330 335
Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu
340 345 350
Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser
355 360 365
Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys
370 375 380
Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390 395
<210> 49
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UB-p53的氨基酸序列
<400> 49
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu
100 105 110
Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser
115 120 125
Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp
130 135 140
Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg
145 150 155 160
Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe
195 200 205
Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala
210 215 220
Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu
225 230 235 240
Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala
245 250 255
Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro
260 265 270
His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His
275 280 285
Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg
290 295 300
Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val
305 310 315 320
Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser
325 330 335
Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu
340 345 350
Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg
355 360 365
Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu
370 375 380
Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys
385 390 395 400
Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys
405 410 415
Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg
420 425 430
Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala
435 440 445
Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu
450 455 460
Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe
465 470 475 480
Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
485
<210> 50
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-UB-p53的氨基酸序列
<400> 50
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Ile Phe
20 25 30
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
50 55 60
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
65 70 75 80
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
85 90 95
Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser
100 105 110
Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu
115 120 125
Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp
130 135 140
Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp
145 150 155 160
Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val
165 170 175
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro
180 185 190
Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly
195 200 205
Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser
210 215 220
Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu
225 230 235 240
Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro
245 250 255
Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met
260 265 270
Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu
290 295 300
Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val
305 310 315 320
Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His
325 330 335
Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg
340 345 350
Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu
355 360 365
Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp
370 375 380
Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His
385 390 395 400
Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr
420 425 430
Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn
435 440 445
Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly
450 455 460
Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr
465 470 475 480
Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
485 490 495
Leu Glu His His His His His His
500
<210> 51
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-(GGGGS)3-UB-p53的氨基酸序列
<400> 51
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Phe Val
35 40 45
Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro
65 70 75 80
Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly
85 90 95
Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu
100 105 110
Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val
115 120 125
Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp
145 150 155 160
Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala
180 185 190
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
195 200 205
Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser
210 215 220
Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala
245 250 255
Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly
260 265 270
Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr
275 280 285
Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg
305 310 315 320
Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val
325 330 335
Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr
340 345 350
Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro
355 360 365
Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly
370 375 380
Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg
385 390 395 400
Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu
405 410 415
Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser
420 425 430
Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu
435 440 445
Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu
450 455 460
Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser
485 490 495
Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Leu
500 505 510
Glu His His His His His His
515
<210> 52
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-(GGGGS)3-p53的氨基酸序列
<400> 52
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Pro Gln
35 40 45
Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp
50 55 60
Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser
65 70 75 80
Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp
85 90 95
Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala
100 105 110
Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys
130 135 140
Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly
145 150 155 160
Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met
165 170 175
Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser
180 185 190
Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln
195 200 205
Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg
210 215 220
Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val
225 230 235 240
Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg
245 250 255
His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys
260 265 270
Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly
275 280 285
Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser
290 295 300
Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys
305 310 315 320
Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly
325 330 335
Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro
340 345 350
Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly
355 360 365
Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe
370 375 380
Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys
385 390 395 400
Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys
405 410 415
Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly
420 425 430
Pro Asp Ser Asp Leu Glu His His His His His His
435 440
<210> 53
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UB-p53-TOM7的氨基酸序列
<400> 53
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu
100 105 110
Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser
115 120 125
Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp
130 135 140
Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg
145 150 155 160
Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe
195 200 205
Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala
210 215 220
Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu
225 230 235 240
Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala
245 250 255
Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro
260 265 270
His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His
275 280 285
Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg
290 295 300
Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val
305 310 315 320
Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser
325 330 335
Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu
340 345 350
Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val His
355 360 365
Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu
370 375 380
Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys
385 390 395 400
Arg Ala Leu Ser Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys
405 410 415
Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg
420 425 430
Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala
435 440 445
Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu
450 455 460
Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe
465 470 475 480
Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Leu Glu Phe Ala Ile Arg Trp Gly
485 490 495
Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro
500 505 510
Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly
515 520 525
<210> 54
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> p53-myc/His的氨基酸序列
<400> 54
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
340 345 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
370 375 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Leu Glu Ser Arg Gly Pro Phe
385 390 395 400
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His Thr Gly His
405 410 415
His His His His His
420
<210> 55
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 颗粒酶B的氨基酸序列
<400> 55
Arg Gly Gly Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro
1 5 10 15
Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys
20 25 30
Gly Gly Phe Leu Ile Gln Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys
35 40 45
Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu
50 55 60
Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His
65 70 75 80
Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln
85 90 95
Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu
100 105 110
Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala
115 120 125
Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln
130 135 140
Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu
165 170 175
Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
180 185 190
Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met
195 200 205
Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys
210 215 220
Lys Thr Met Lys Arg Tyr
225 230
<210> 56
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-(GGGGS)3-UB-颗粒酶B的氨基酸序列
<400> 56
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Phe Val
35 40 45
Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro
65 70 75 80
Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly
85 90 95
Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu
100 105 110
Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro
115 120 125
His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser
130 135 140
Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr
145 150 155 160
Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His
165 170 175
Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg
180 185 190
Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile
195 200 205
Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln
210 215 220
Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr
225 230 235 240
Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser
245 250 255
His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys
260 265 270
Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val
275 280 285
Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly
290 295 300
Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg
305 310 315 320
Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val
325 330 335
His Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr Leu Glu His His His His
340 345 350
His His
<210> 57
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UB-颗粒酶 B-TOM7的氨基酸序列
<400> 57
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala
100 105 110
Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe
115 120 125
Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser
130 135 140
Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro
145 150 155 160
Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr
165 170 175
Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg
180 185 190
Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly
210 215 220
Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys
225 230 235 240
Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr
245 250 255
Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys
260 265 270
Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val
275 280 285
Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg
290 295 300
Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met
305 310 315 320
Lys Arg Tyr Leu Glu Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val
325 330 335
Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro
340 345 350
Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly
355 360
<210> 58
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RKIP的氨基酸序列
<400> 58
Arg Gly Gly Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gln Glu Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala
20 25 30
Gly Ala Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gln Val
35 40 45
Lys Asn Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Tyr Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp
65 70 75 80
Pro Lys Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly
85 90 95
Asn Asp Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly
100 105 110
Pro Pro Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu
115 120 125
Gln Asp Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ser
130 135 140
Gly Asp His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr
145 150 155 160
Glu Leu Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln Ala Glu Trp Asp
165 170 175
Asp Tyr Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly Lys
180 185
<210> 59
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP的氨基酸序列
<400> 59
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Phe Val
35 40 45
Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro
65 70 75 80
Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly
85 90 95
Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu
100 105 110
Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly
115 120 125
Pro Leu Ser Leu Gln Glu Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His
130 135 140
Val Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Gln Val Lys Asn Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Gly Lys Leu Tyr Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Arg Lys Asp Pro Lys Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val
195 200 205
Asn Met Lys Gly Asn Asp Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr
210 215 220
Val Gly Ser Gly Pro Pro Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp
225 230 235 240
Leu Val Tyr Glu Gln Asp Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu
245 250 255
Ser Asn Arg Ser Gly Asp His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe
260 265 270
Arg Lys Lys Tyr Glu Leu Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln
275 280 285
Ala Glu Trp Asp Asp Tyr Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly
290 295 300
Lys Leu Glu His His His His His His
305 310
<210> 60
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PTEN的氨基酸序列
<400> 60
Arg Gly Gly Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg
1 5 10 15
Arg Tyr Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro
20 25 30
Asn Ile Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr
35 40 45
Arg Asn Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys
50 55 60
Asn His Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Ala Lys Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn
85 90 95
Pro Pro Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln
100 105 110
Trp Leu Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg
130 135 140
Gly Lys Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val
145 150 155 160
Arg Thr Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr
165 170 175
Val Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro
180 185 190
Val Ala Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe
195 200 205
Ser Gly Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val
210 215 220
Lys Ile Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe
225 230 235 240
Met Tyr Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys
245 250 255
Val Glu Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met
260 265 270
Phe His Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr
275 280 285
Ser Glu Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser
290 295 300
Ile Cys Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu
305 310 315 320
Thr Leu Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn
325 330 335
Arg Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr
340 345 350
Val Glu Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr
355 360 365
Pro Asp Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr
370 375 380
Thr Asp Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr
385 390 395 400
Gln Ile Thr Lys Val
405
<210> 61
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN的氨基酸序列
<400> 61
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Phe Val
35 40 45
Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro
65 70 75 80
Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly
85 90 95
Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu
100 105 110
Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser
115 120 125
Arg Asn Lys Arg Arg Tyr Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr
130 135 140
Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu
145 150 155 160
Glu Gly Val Tyr Arg Asn Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp
165 170 175
Ser Lys His Lys Asn His Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg
180 185 190
His Tyr Asp Thr Ala Lys Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe
195 200 205
Glu Asp His Asn Pro Pro Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu
210 215 220
Asp Leu Asp Gln Trp Leu Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile
225 230 235 240
His Cys Lys Ala Gly Lys Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr
245 250 255
Leu Leu His Arg Gly Lys Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe
260 265 270
Tyr Gly Glu Val Arg Thr Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser
275 280 285
Gln Arg Arg Tyr Val Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu
290 295 300
Asp Tyr Arg Pro Val Ala Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr
305 310 315 320
Ile Pro Met Phe Ser Gly Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys
325 330 335
Gln Leu Lys Val Lys Ile Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg
340 345 350
Glu Asp Lys Phe Met Tyr Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys
355 360 365
Gly Asp Ile Lys Val Glu Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys
370 375 380
Lys Asp Lys Met Phe His Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Thr Ser Glu Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln
405 410 415
Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu
420 425 430
Tyr Leu Val Leu Thr Leu Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys
435 440 445
Asp Lys Ala Asn Arg Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr
450 455 460
Phe Thr Lys Thr Val Glu Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser
465 470 475 480
Thr Ser Val Thr Pro Asp Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg
485 490 495
Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu
500 505 510
Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val Leu Glu His His His His His
515 520 525
His
<210> 62
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvHER2的氨基酸序列
<400> 62
Arg Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
50 55 60
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
180 185 190
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg Thr
245
<210> 63
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UB-scFvHER2-TOM7的氨基酸序列
<400> 63
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
100 105 110
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
115 120 125
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
130 135 140
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
145 150 155 160
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
165 170 175
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
180 185 190
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
195 200 205
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
245 250 255
Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val
275 280 285
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
305 310 315 320
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
325 330 335
Lys Arg Thr Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr
340 345 350
Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val
355 360 365
Leu Ser Leu Leu Trp Gly
370
<210> 64
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvHER2-TOM7-myc/His的氨基酸序列
<400> 64
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile
245 250 255
Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr
260 265 270
Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly Leu Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln
275 280 285
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His Thr Gly His His His
290 295 300
His His His
305
<210> 65
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvMEL的氨基酸序列
<400> 65
Arg Gly Gly Thr Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser
1 5 10 15
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn
20 25 30
Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
85 90 95
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala
180 185 190
Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser
195 200 205
Ser Val Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile
210 215 220
Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 66
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UB-scFvMEL-TOM7的氨基酸序列
<400> 66
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
85 90 95
Thr Asp Ile Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
100 105 110
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
115 120 125
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu
130 135 140
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
145 150 155 160
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
165 170 175
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
180 185 190
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
210 215 220
Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys
225 230 235 240
Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Tyr Trp Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile
260 265 270
Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
275 280 285
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr
305 310 315 320
Ser Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
325 330 335
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro
340 345 350
Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro
355 360 365
Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly
370 375
<210> 67
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvMEL-TOM7-myc/His的氨基酸序列
<400> 67
Met Thr Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp
20 25 30
Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro
35 40 45
Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Tyr Trp
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
165 170 175
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe
245 250 255
Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly
260 265 270
Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly Leu Glu Ser Arg
275 280 285
Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His
290 295 300
Thr Gly His His His His His His
305 310
<210> 68
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvPD-L1的氨基酸序列
<400> 68
Met Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
20 25 30
Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
180 185 190
Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Thr Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 69
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvPD-L1-TOM7-myc/His的氨基酸序列
<400> 69
Met Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
20 25 30
Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
180 185 190
Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Thr Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu Phe Ala Ile Arg
245 250 255
Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala
260 265 270
Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly Leu
275 280 285
Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
290 295 300
Asn Met His Thr Gly His His His His His His
305 310 315
<210> 70
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 70
ggggsggggs ggggs 15
<210> 71
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 泛素的氨基酸序列
<400> 71
Gln Leu Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Val Thr Leu Glu Val
1 5 10 15
Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 72
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码泛素的核苷酸序列
<400> 72
caacttttcg tcaaaactct aacagggaag actgtaaccc tagaggttga atcttccgac 60
actattgaca acgtcaaaag taaaattcaa gataaagaag gtatccctcc ggatcagcag 120
agattgattt ttgctggtaa gcaactagaa gatggtagaa ccttgtctga ctacaacatc 180
caaaaggaat ctactcttca cttggtgttg agactccgcg gtggt 225
<210> 73
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> p53的氨基酸序列
<400> 73
Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu
1 5 10 15
Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser
20 25 30
Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp
35 40 45
Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg
50 55 60
Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr
65 70 75 80
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val
85 90 95
Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe
100 105 110
Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala
115 120 125
Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu
130 135 140
Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala
145 150 155 160
Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro
165 170 175
His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His
180 185 190
Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg
195 200 205
Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val
210 215 220
Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser
225 230 235 240
Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu
245 250 255
Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg
260 265 270
Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu
275 280 285
Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys
290 295 300
Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys
305 310 315 320
Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg
325 330 335
Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala
340 345 350
Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu
355 360 365
Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe
370 375 380
Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Leu Glu His His His His His His
385 390 395 400
<210> 74
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码p53的核苷酸序列
<400> 74
gaggagccgc agtcagatcc tagcgtcgag ccccctctga gtcaggaaac attttcagac 60
ctgtggaaac tacttcctga aaacaacgtt ctgtccccct tgccgtccca agcaatggat 120
gatttgatgc tgtccccgga cgatattgaa caatggttca ctgaagaccc aggtccagat 180
gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc cgcgtggccc ctgcaccagc agctcctaca 240
ccggcggccc ctgcaccagc cccctcctgg cccctgtcat cttctgtccc ttcccagaaa 300
acctaccagg gcagctacgg tttccgtctg ggcttcttgc attctgggac agccaagtct 360
gtgacttgca cgtactcccc tgccctcaac aagatgtttt gccaactggc caagacctgc 420
cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc ccgcccggca cccgcgtccg cgccatggcc 480
atctacaagc agtcacagca catgacggag gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc 540
tgctcagata gcgatggtct ggcccctcct cagcatctta tccgagtgga aggaaatttg 600
cgtgtggagt atttggatga cagaaacact tttcgacata gtgtggtggt gccctatgag 660
ccgcctgagg ttggctctga ctgtaccacc atccactaca actacatgtg taacagttcc 720
tgcatgggcg gcatgaaccg gaggcccatc ctcaccatca tcacactgga agactccagt 780
ggtaatctac tgggacggaa cagctttgag gtgcgtgttt gtgcctgtcc tgggagagac 840
cggcgcacag aggaagagaa tctccgcaag aaaggggagc ctcaccacga gctgccccca 900
gggagcacta agcgagcact gcccaacaac accagctcct ctccccagcc aaagaagaaa 960
ccactggatg gagaatattt cacccttcag atccgtgggc gtgagcgctt cgagatgttc 1020
cgagagctga atgaggcctt ggaactcaag gatgcccagg ctgggaagga gccagggggg 1080
agcagggctc actccagcca cctgaagtcc aaaaagggtc agtctacctc ccgccataaa 1140
aaactcatgt tcaagacaga agggcctgac tcagacctcg agcaccacca ccaccaccac 1200
tag 1203
<210> 75
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的TOM70
<400> 75
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr
20 25
<210> 76
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的TOM70
<400> 76
Met Ala Ala Ser Lys Pro Val Glu Ala Ala Val Val Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Pro Ser Ser Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Pro Gly
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Pro Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ala Val Gly Ala Pro
35 40 45
Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Ile Tyr Leu Trp Ser
50 55 60
<210> 77
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的TOM20
<400> 77
Met Ser Gln Ser Asn Pro Ile Leu Arg Gly Leu Ala Ile Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ile Ala Ala Leu Ser Ala Thr Gly Tyr Ala Ile Tyr Phe
20 25
<210> 78
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的TOM20
<400> 78
Met Val Gly Arg Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gly Val Cys Gly Ala Leu
1 5 10 15
Phe Ile Gly Tyr Cys Ile Tyr Phe
20
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的OM45
<400> 79
Met Ser Ser Arg Ile Ile Val Gly Ser Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ile
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Met Val
20
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的TOM5
<400> 80
Ala Ala Tyr Val Ala Ala Phe Leu Trp Val Ser Pro Met Ile Trp His
1 5 10 15
Leu Val Lys Lys Gln Trp Lys
20
<210> 81
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的TOM5
<400> 81
Ile Arg Asn Phe Leu Ile Tyr Val Ala Leu Leu Arg Val Thr Pro Phe
1 5 10 15
Ile Leu Lys Lys Leu Asp Ser Ile
20
<210> 82
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的TOM7
<400> 82
Ile Leu Thr Leu Thr His Asn Val Ala His Tyr Gly Trp Ile Pro Phe
1 5 10 15
Val Leu Tyr Leu Gly Trp Ala His Thr Ser Asn Arg Pro Asn Phe Leu
20 25 30
Asn Leu Leu Ser Pro Leu Pro Ser Val
35 40
<210> 83
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的TOM7
<400> 83
Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe
1 5 10 15
Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu
20 25 30
Leu Trp Gly
35
<210> 84
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的TOM22
<400> 84
Leu Ala Trp Thr Leu Thr Thr Thr Ala Leu Leu Leu Gly Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Leu Ala Glu Gln Gln Leu Ile Glu Met Glu Lys Thr
20 25 30
Phe Asp Leu Gln Ser Asp Ala Asn Asn Ile Leu Ala Gln Gly Glu Lys
35 40 45
Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asn
50 55
<210> 85
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的TOM22
<400> 85
Ala Ala Leu Trp Ile Gly Thr Thr Ser Phe Met Ile Leu Val Leu Pro
1 5 10 15
Val Val Phe Glu Thr Glu Lys Leu Gln Met Glu Gln Gln Gln Gln Leu
20 25 30
Gln Gln Arg Gln Ile Leu Leu Gly Pro Asn Thr Gly Leu Ser Gly Gly
35 40 45
Met Pro Gly Ala Leu Pro Ser Leu Pro Gly Lys Ile
50 55 60
<210> 86
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的Fis1
<400> 86
Gly Val Val Val Ala Gly Gly Val Leu Ala Gly Ala Val Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser Phe Phe Leu Arg Asn Lys Arg Arg
20 25
<210> 87
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的Fis1
<400> 87
Gly Leu Val Gly Met Ala Ile Val Gly Gly Met Ala Leu Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Ala Val Ser Lys Ser Lys Ser
20 25 30
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的Bcl-2α
<400> 88
Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys Ile
1 5 10 15
Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys
20 25
<210> 89
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酿酒酵母的VAMP1
<400> 89
Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile Val
1 5 10 15
Arg Arg Asp
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人的VAMP1
<400> 90
Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile
1 5 10 15
Val Ile Tyr Phe Phe Thr
20
<210> 91
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P53-启动子-S
<400> 91
gggcatgctc gggcatgccc gggcatgctc gggcatgccc gggcatgctc gggcatgccc 60
60
<210> 92
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P53-启动子-AS
<400> 92
gggcatgccc gagcatgccc gggcatgccc gagcatgccc gggcatgccc gagcatgccc 60
60
<210> 93
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvPDL1-myc-TOM7的核苷酸序列
<400> 93
atggacatcg tgatgagcca gtctcccagc agcctggctg tgtctgctgg ggagaaggtg 60
accatgtcct gcaagagctc ccagtccctg ctgaacagcc gcaccaggaa gaactacctg 120
gcctggtacc agcagaagcc aggccagagc cccaagctcc tcatctactg ggccagcacc 180
cgggagagcg gggtgcctga ccgcttcact ggaagtggca gcggcacaga cttcaccctg 240
accatcagct ctgtgcaggc cgaggacctg gcagtgtact actgccagca aagctatgat 300
gtggtgacat ttggagctgg caccaagctg gagctgaagg gaggtggcgg aagcgggggt 360
ggaggatccg ggggcggcgg aagccaggtc caggtgcagc agagcggggc tgagctggcc 420
gagcccgggg cctctgtgaa gatgagctgc aaggcttctg gctacatctt caccagctac 480
tggatgcact ggctcaagca gaggcctggg caggggctgg agtggatcgg ctatatcaac 540
cccagcagtg actacaatga atattctgag aagttcatgg acaaagccac cctgactgct 600
gacaaggcca gcaccaccgc ctacatgcag ctgatcagcc tgacctcaga ggacagcgct 660
gtgtactact gtgcccggag cggctggctg gtgcacgggg actattattt tgattattgg 720
ggccagggca ccacactgac agtgagcagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 780
gtgaagctga gcaaagaggc caagcagaga ctacagcagc tcttcaaggg gagccagttt 840
gccattcgct ggggctttat ccctcttgtg atttacctgg gatttaagag gggtgcagat 900
cccggaatgc ctgaaccaac tgttttgagc ctactttggg gataa 945
<210> 94
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvPDL1-myc-TOM7的氨基酸序列
<400> 94
Met Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
20 25 30
Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
180 185 190
Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Thr Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Ser Gly Trp Leu Val His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
245 250 255
Glu Glu Asp Leu Val Lys Leu Ser Lys Glu Ala Lys Gln Arg Leu Gln
260 265 270
Gln Leu Phe Lys Gly Ser Gln Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro
275 280 285
Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro
290 295 300
Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly
305 310
<210> 95
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvHER2的核苷酸序列
<400> 95
atggaagtgc aacttgttga gagtggcgga ggactggtcc aaccgggcgg ttcacttagg 60
ctctcatgtg cagcttcagg gttcacgttc acggactata caatggactg ggtgaggcaa 120
gcccctggta agggactgga gtgggttgct gacgttaacc ctaattccgg tgggtccatc 180
tacaaccagc gattcaaggg acgatttact ctttcagtcg acagaagcaa aaacaccctc 240
tacctccaga tgaactcctt gcgggcagag gatacagcgg tctactattg cgcgagaaac 300
ttgggaccaa gcttctactt cgactactgg gggcaaggaa cgcttgttac ggtttcaagc 360
ggaggtggag gaagtggagg tggcggttcc ggcggtggcg gttcagatat acagatgacc 420
caatcaccca gttctcttag cgcgtctgta ggcgacaggg taaccataac ctgcaaggcg 480
tcccaggacg tgtcaattgg agttgcctgg tatcagcaaa aacctgggaa agctccgaag 540
ctcctgattt acagcgcatc ttaccgatat actggtgtcc cttcaaggtt cagtggcagt 600
ggatctggga cagactttac gcttactatc agcagtctgc aacctgagga tttcgcgacc 660
tactactgtc agcagtatta catctatccg tacacgttcg gtcaaggtac aaaggtagaa 720
ataaaacgca ct 732
<210> 96
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvHER2的氨基酸序列
<400> 96
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr
<210> 97
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvHER2-myc-TOM7的核苷酸序列
<400> 97
atggaagtgc aacttgttga gagtggcgga ggactggtcc aaccgggcgg ttcacttagg 60
ctctcatgtg cagcttcagg gttcacgttc acggactata caatggactg ggtgaggcaa 120
gcccctggta agggactgga gtgggttgct gacgttaacc ctaattccgg tgggtccatc 180
tacaaccagc gattcaaggg acgatttact ctttcagtcg acagaagcaa aaacaccctc 240
tacctccaga tgaactcctt gcgggcagag gatacagcgg tctactattg cgcgagaaac 300
ttgggaccaa gcttctactt cgactactgg gggcaaggaa cgcttgttac ggtttcaagc 360
ggaggtggag gaagtggagg tggcggttcc ggcggtggcg gttcagatat acagatgacc 420
caatcaccca gttctcttag cgcgtctgta ggcgacaggg taaccataac ctgcaaggcg 480
tcccaggacg tgtcaattgg agttgcctgg tatcagcaaa aacctgggaa agctccgaag 540
ctcctgattt acagcgcatc ttaccgatat actggtgtcc cttcaaggtt cagtggcagt 600
ggatctggga cagactttac gcttactatc agcagtctgc aacctgagga tttcgcgacc 660
tactactgtc agcagtatta catctatccg tacacgttcg gtcaaggtac aaaggtagaa 720
ataaaacgca ctgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tggtgaagct gagcaaagag 780
gccaagcaga gactacagca gctcttcaag gggagccagt ttgccattcg ctggggcttt 840
atccctcttg tgatttacct gggatttaag aggggtgcag atcccggaat gcctgaacca 900
actgttttga gcctactttg gggataa 927
<210> 98
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvHER2-myc-TOM7的氨基酸序列
<400> 98
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Val Lys
245 250 255
Leu Ser Lys Glu Ala Lys Gln Arg Leu Gln Gln Leu Phe Lys Gly Ser
260 265 270
Gln Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly
275 280 285
Phe Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser
290 295 300
Leu Leu Trp Gly
305
<210> 99
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvMSLN的核苷酸序列
<400> 99
atgcaagtgc agctcgtcca gtctggggct gaggtgaaga ggcctggagc cagtgttcag 60
gtgtcctgcc gggcctctgg ctacagcatc aacacctact atatgcagtg ggtgcggcag 120
gcccctgggg ccggcctgga gtggatgggc gtcatcaatc ccagcggggt gacctcctat 180
gcccagaagt tccagggccg cgtgactctc accaatgaca ccagcaccaa cacagtctac 240
atgcagctga acagcctcac ttcagctgac acagctgtgt actactgtgc ccgctgggcc 300
ctgtggggag actttggcat ggatgtgtgg ggcaagggca ctctggtgac agtgagcagt 360
ggagggggcg gcagcggtgg cggtggaagt ggcggaggag gcagtgacat ccagatgacc 420
cagagcccct ccacactgtc tgcttccatc ggggacagag tcaccatcac ctgccgcgcc 480
agcgagggca tctaccactg gctggcctgg taccagcaga aaccaggaaa agcccccaag 540
ctgctgattt acaaggcctc ctccctggct tcaggcgccc caagccgctt cagcggctcc 600
ggctctggaa cagacttcac cctgacaatc agcagcctgc agccagatga ttttgccacc 660
tattactgcc agcagtactc caactacccc ctgaccttcg gcgggggcac caagttggag 720
atcaag 726
<210> 100
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvMSLN的氨基酸序列
<400> 100
Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Gln Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Asn Thr
20 25 30
Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Asn Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Leu Trp Gly Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 101
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFvMSLN-myc-TOM7的核苷酸序列
<400> 101
atgcaagtgc agctcgtcca gtctggggct gaggtgaaga ggcctggagc cagtgttcag 60
gtgtcctgcc gggcctctgg ctacagcatc aacacctact atatgcagtg ggtgcggcag 120
gcccctgggg ccggcctgga gtggatgggc gtcatcaatc ccagcggggt gacctcctat 180
gcccagaagt tccagggccg cgtgactctc accaatgaca ccagcaccaa cacagtctac 240
atgcagctga acagcctcac ttcagctgac acagctgtgt actactgtgc ccgctgggcc 300
ctgtggggag actttggcat ggatgtgtgg ggcaagggca ctctggtgac agtgagcagt 360
ggagggggcg gcagcggtgg cggtggaagt ggcggaggag gcagtgacat ccagatgacc 420
cagagcccct ccacactgtc tgcttccatc ggggacagag tcaccatcac ctgccgcgcc 480
agcgagggca tctaccactg gctggcctgg taccagcaga aaccaggaaa agcccccaag 540
ctgctgattt acaaggcctc ctccctggct tcaggcgccc caagccgctt cagcggctcc 600
ggctctggaa cagacttcac cctgacaatc agcagcctgc agccagatga ttttgccacc 660
tattactgcc agcagtactc caactacccc ctgaccttcg gcgggggcac caagttggag 720
atcaaggaac aaaaactcat ctcagaagag gatctggtga agctgagcaa agaggccaag 780
cagagactac agcagctctt caaggggagc cagtttgcca ttcgctgggg ctttatccct 840
cttgtgattt acctgggatt taagaggggt gcagatcccg gaatgcctga accaactgtt 900
ttgagcctac tttggggata a 921
<210> 102
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFvMSLN-myc-TOM7的氨基酸序列
<400> 102
Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Gln Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Asn Thr
20 25 30
Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Asn Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Leu Trp Gly Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Val Lys Leu Ser
245 250 255
Lys Glu Ala Lys Gln Arg Leu Gln Gln Leu Phe Lys Gly Ser Gln Phe
260 265 270
Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys
275 280 285
Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu
290 295 300
Trp Gly
305

Claims (14)

1.一种修饰的线粒体，其包含抗癌剂。
2.根据权利要求1所述的修饰的线粒体，其中，所述抗癌剂结合三苯基膦(TPP)或其衍生物。
3.根据权利要求1所述的修饰的线粒体，其中，所述抗癌剂选自由化学抗癌剂、靶向抗癌剂和驱虫剂组成的组。
4.根据权利要求3所述的修饰的线粒体，其中，所述化学抗癌剂为选自由烷化剂、微管抑制剂、抗代谢药和拓扑异构酶抑制剂组成的组中任一种。
5.根据权利要求3所述的修饰的线粒体，其中，所述靶向抗癌剂为选自由靶向BTK、Bcr-abl、EGFR、PDGFR/VEGFR/FGFR家族、MEK/RAF、HER2/Neu、CDK、泛素、JAK、MAP2K、ALK、PARP、TGFβRI、蛋白酶体、Bcl-2 Braf、C-Met、VR1、VR2、VR3、c-kit、AXL和RET的化合物组成的组中任一种。
6.根据权利要求3所述的修饰的线粒体，其中，所述驱虫剂为选自由OXPHOS(氧化磷酸化)抑制剂、糖酵解抑制剂、糖酵解相关间接抑制剂、PPP(磷酸戊糖途径)抑制剂和自噬抑制剂组成的组中任一种。
7.根据权利要求1所述的修饰的线粒体，其中，所述线粒体为细胞内存在与肿瘤相关抗原特异性结合的抗体的修饰的线粒体。
8.根据权利要求1所述的修饰的线粒体，其中，所述肿瘤相关抗原为选自由CD19、CD20、黑色素瘤抗原E(MAGE)、NY-ESO-1、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、生存素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白2(tyrp2)、短尾畸形(Brachyury)、间皮素(Mesothelin)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、ERBB2、Wilms肿瘤蛋白(WT1)、FAP、EpCAM、PD-L1、ACPP、CPT1A、IFNG、CD274、FOLR1、EPCAM、ICAM2、NCAM1、LRRC4、UNC5H2 LILRB2、CEACAM、结合素-3及其组合组成的组中任一种。
9.根据权利要求1所述的修饰的线粒体，其中，癌为选自由乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中任一种。
10.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括根据权利要求1所述的修饰的线粒体作为活性成分。
11.根据权利要求1所述的修饰的线粒体在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。
12.一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用根据权利要求1所述的修饰的线粒体。
13.一种制备包括抗癌剂的线粒体的方法，其包括：混合所述抗癌剂和分离的线粒体。
14.一种修饰的抗癌剂，其与TPP或其衍生物结合。
CN202180072536.2A 2020-10-22 2021-10-22 包含抗癌药物的线粒体及其应用 Pending CN116249557A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0137779 2020-10-22
KR20200137779 2020-10-22
PCT/KR2021/014886 WO2022086257A1 (ko) 2020-10-22 2021-10-22 항암제를 포함한 미토콘드리아 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116249557A true CN116249557A (zh) 2023-06-09

Family

ID=81290849

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180072536.2A Pending CN116249557A (zh) 2020-10-22 2021-10-22 包含抗癌药物的线粒体及其应用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230372529A1 (zh)
EP (1) EP4233882A4 (zh)
JP (1) JP2023546326A (zh)
KR (2) KR20220053505A (zh)
CN (1) CN116249557A (zh)
TW (1) TW202233246A (zh)
WO (1) WO2022086257A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115212188B (zh) * 2022-07-29 2023-04-07 西安交通大学医学院第一附属医院 一种缺血脑区靶向纳米线粒体及其制备方法、用途
KR102858624B1 (ko) * 2024-05-14 2025-09-15 주식회사 파이안바이오테크놀로지 개질된 미토콘드리아를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110105437A1 (en) * 2008-03-14 2011-05-05 Stephen John Ralph Mitochondrially Delivered Anti-Cancer Compounds
CN104523723A (zh) * 2014-12-08 2015-04-22 中国人民解放军第四军医大学 一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统
KR20190124656A (ko) * 2018-04-26 2019-11-05 주식회사 파이안바이오테크놀로지 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3129017A4 (en) * 2014-04-08 2017-11-08 University of Georgia Research Foundation, Inc. Mitochondria-targeting platinum(iv) prodrug
WO2017124037A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-20 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
KR101743399B1 (ko) * 2016-05-31 2017-06-05 충남대학교산학협력단 폴리에틸렌글리콜과 트리페닐포스포늄이 컨쥬게이트된 물질 및 이를 적용한 미토콘드리아 표적 자기조립형 나노약물 전달체
KR20190048279A (ko) 2017-10-31 2019-05-09 세종대학교산학협력단 합성곱 신경망 기반의 영상 처리 방법 및 장치
KR102111321B1 (ko) 2017-11-27 2020-05-18 주식회사 파이안바이오테크놀로지 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 및 발모 촉진용 약학 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110105437A1 (en) * 2008-03-14 2011-05-05 Stephen John Ralph Mitochondrially Delivered Anti-Cancer Compounds
CN104523723A (zh) * 2014-12-08 2015-04-22 中国人民解放军第四军医大学 一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统
KR20190124656A (ko) * 2018-04-26 2019-11-05 주식회사 파이안바이오테크놀로지 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANTUMUR BATTOGTOKH: "Mitochondrial-Targeting Anticancer Agent Conjugates and Nanocarrier Systems for Cancer Treatment", FRONT PHARMACOL, 17 August 2018 (2018-08-17), pages 6 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202233246A (zh) 2022-09-01
JP2023546326A (ja) 2023-11-02
KR20220053505A (ko) 2022-04-29
KR20250022727A (ko) 2025-02-17
WO2022086257A1 (ko) 2022-04-28
EP4233882A1 (en) 2023-08-30
US20230372529A1 (en) 2023-11-23
EP4233882A4 (en) 2023-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102533834B1 (ko) 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도
JP7398518B2 (ja) 臨床のための、改変されたＮＫ－９２ ｈａＮＫ００３細胞
CA3097399A1 (en) T cell receptors with mage-b2 specificity and uses thereof
EP2957630B1 (en) Undifferentiated cell elimination method
UA128687C2 (uk) Антитіло до gitr
KR20250022727A (ko) 항암제를 포함한 미토콘드리아 및 이의 용도
CN109913422A (zh) 一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用
CN112522208A (zh) 一种转基因肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
EP4458956A1 (en) Anti-mesothelin nanobody chimeric antigen receptor and use thereof
US20160200804A1 (en) Compositions and methods for treating anaplastic thyroid cancer
KR20160116848A (ko) Tspan7 억제제를 포함하는 파골세포 형성 억제 또는 골 질환의 치료용 조성물
Buocikova et al. Placental mesenchymal stem cells: A promising platform for advancing gene therapy in pancreatic ductal adenocarcinoma
KR102671551B1 (ko) 전구약물 전환 효소를 포함하는 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도
RU2811467C2 (ru) Модифицированные митохондрии и их применение
US20250179186A1 (en) Anti-b7-h3 compounds and methods of use
KR101465354B1 (ko) Ｓｋｐ 단백질을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도
JP2025186259A (ja) 改変されたミトコンドリアおよびその使用
KR20190047489A (ko) 53bp1의 신규한 용도
HK40011833A (zh) 用於临床的修饰的nk-92 hank003细胞
KR20160090274A (ko) Ｔｓｐｙｌ５ 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 성장 및 암 전이 억제용 조성물
HU230186B1 (hu) Tumorellenes anyagok szállítása szolid tumorokba

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination