CN116236479B

CN116236479B - Su3327在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途

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Publication number: CN116236479B
Application number: CN202310092613.1A
Authority: CN
Inventors: 沈建忠; 代重山; 陈洪亮; 吴聪明; 沈张奇; 汪洋
Original assignee: Xiamen Hanlixin Pharmaceutical Co ltd; China Agricultural University
Current assignee: Xiamen Hanlixin Pharmaceutical Co ltd; China Agricultural University
Priority date: 2022-11-08
Filing date: 2023-02-10
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2043-02-10
Also published as: CN116236479A; WO2024098967A1; US20250170106A1; EP4477219A1; JP2025507179A

Abstract

本发明提供一种C‑JUN的N末端激酶抑制剂SU3327在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途，以及SU3327和多黏菌素的组合物在制备抗细菌感染效力增强的药物中的用途，所述多黏菌素优选为多黏菌素E。本发明不仅通过棋盘法最小抑菌浓度试验、体外细菌生长曲线证明SU3327协同增效多黏菌素的抗菌活性，同时利用小鼠耐药细菌感染模型实验在动物水平证实了SU3327可以有效增强多黏菌素以及在体内的有效性。本发明提供了SU3327在增效多黏菌素类抗生素抗菌活性中的新用途，可解决多黏菌素临床耐药性和治疗指数低等技术问题。

Description

SU3327在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及抗菌领域，特别涉及一种利用C-JUN N末端激酶抑制剂SU3327增强多黏菌素抗菌活性的方法。

背景技术

多黏菌素（又称多粘菌素，polymyxin）是发现于多粘杆菌（Bacillus polymyxa）培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E等五种。抗菌谱相互类似而范围宽广，特别对革兰氏阴性细菌作用颇强，如大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌等。多黏菌素E（又称黏菌素，PolymyxinE），CAS号: 1066-17-7，英文名称: Colistin，商品名抗敌素、可立斯丁、粘菌素。临床应用主要是硫酸盐或甲磺酸盐形式，即硫酸多黏菌素E和甲磺酸盐多黏菌素E。多黏菌素E用于治疗大肠杆菌性造成的肠炎、肺炎克雷伯菌造成的肺炎、和治疗其他药物耐药的菌株，以及外用于烧伤和外伤引起的绿脓杆菌局部感染和耳、眼等部位敏感菌感染。

近10年来，多重耐药革兰氏阴性细菌造成的感染严重威胁动物和人类健康。目前，多黏菌素类抗菌药物被认为是临床治疗多重耐药革兰氏阴性细菌（主要包括耐碳青霉烯类大肠杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌等）感染的最后一线治疗选择。然而，由于多黏菌素耐药基因（MCR）的出现，导致临床多黏菌素的治疗输出显著降低，严重危险这一重要抗菌药物的使用寿命。因此，开发有效的黏菌素增效剂，基于黏菌素的联合给药，已经成为临床治疗治疗这些危害生命的多重耐药革兰氏阴性细菌的重要治疗策略。

为应对临床“细菌耐药性危机”，联合用药已成为临床应用多黏菌素治疗MDR-GNR最重要的用药策略，已有文献公开了多黏菌素的多种联合用药。测定17种不同抗菌药物对135株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem resistant Klebaiella pneumoniae,CRKP)的最低抑菌浓度，评价CRKP菌株药物敏感性。评价以Colistin为基础联合比阿培南、头孢他啶-阿维巴坦2种联合用药方案对CRKP的协同抗菌活性,为临床用药选择提供理论依据（参见：“Colistin联合其它抗菌药物对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯的体外抗菌活性研究”，白艳等，《2016年北京药学年会》，2016年公开）。建立药效学模型描述多黏菌素E(colistinE)与其他抗菌药联用对泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR-AB)的体外杀菌作用，所建立的药效学模型较好的描述了多黏菌素E对XDR-AB杀菌作用的特点,为抗菌药体外联用的药动学/药效学数据建模提供了范例（参见：“多黏菌素E联用其他抗菌药物治疗鲍曼不动杆菌感染的药效学模型研究”，付文婷等，《安徽医药》，2020年12期）。

SU3327（又称halicin、海立信，CAS No.: 40045-50-9）是一种C-JUN的N末端激酶抑制剂，结构见图1。SU3327是一种有效的，选择性的且具有底物竞争性的JNK抑制剂，IC₅₀为0.7μM。SU3327 还以IC₅₀值为239nM 抑制JNK和JIP之间的蛋白相互作用。SU3327对p38α和Akt激酶的活性较低。

目前，虽然现有技术已经公开了多黏菌素联用其他抗菌药物，但大多数成药性很差，本发明不仅提供了SU3327和多黏菌素的联用细胞水平的协同增效实验，还进一步提供动物水平实验证实其较好的协同杀菌效果。至今尚无研究报道关于SU3327作为多黏菌素增效剂，在增强多黏菌素抗菌活性中的应用。

发明内容

为了解决多重耐药革兰氏阴性细菌治疗的技术问题，本发明提供一种增强多黏菌素抗菌活性的方法，具体采用C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327联用多黏菌素，多黏菌素优选多黏菌素E，二者不仅是简单的功能相加，而是达到协同增效抗菌作用。本发明还公开了SU3327和多黏菌素E的抗菌组合配比，为临床治疗细菌感染，特别是多重耐药革兰氏阴性细菌感染，具体如存在多黏菌素耐药基因（MCR）的细菌感染提供了新的治疗策略。

本发明的一方面提供C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途。

本发明的另一方面提供C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327和多黏菌素的组合物在制备抗细菌感染效力增强的药物中的用途。

进一步地，所述多黏菌素为多黏菌素E（即黏菌素）或多黏菌素B。

进一步地，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因的细菌。

进一步地，所述细菌为革兰氏阴性细菌。

进一步地，所述革兰氏阴性细菌为多重耐药革兰氏阴性细菌。

进一步地，所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种；优选地，所述大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种为存在多黏菌素耐药基因的或多重耐药的。

进一步地，所述细菌为肺炎克雷伯菌；优选地，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因的或多重耐药的肺炎克雷伯菌。

进一步地，所述SU3327和多黏菌素的组合物中SU3327、多黏菌素质量比为：（2.5-10）:1。

进一步地，所述SU3327和多黏菌素的组合物的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、注射液剂型、滴丸、冻干粉针剂型中的一种。

进一步地，所述多黏菌素E和所述SU3327的最终治疗剂量为10mg/kg体重。

本发明提供的C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327的新用途，用于增强多黏菌素抗菌活性的方法具有以下优异的技术效果：

（1）本发明通过棋盘法最小抑菌浓度试验、体外细菌生长曲线证明SU3327协同增效多黏菌素的抗菌活性。

（2）区别于已有的多黏菌素与抗生素联用，本发明给出了小鼠耐药细菌感染模型实验，在动物水平证实了SU3327可以有效增强多黏菌素以及在体内的有效性，对下一步临床应用更有证明力。

（3）本发明阐明了SU3327可以恢复耐多黏菌素细菌的敏感性，并进一步评价了两者联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型的抗生素增效剂，缓解危害日趋严重的细菌耐药性问题。

（4）本发明提供了SU3327在增效多黏菌素类抗生素抗菌活性中的新用途，可解决多黏菌素临床耐药性和治疗指数低等技术问题。

附图说明

图1为本发明SU3327的化学结构图；

图2为本发明SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的棋盘法对菌株的联合抑菌活性试验结果；

图3A-图3B为本发明针对K.Pneumoniae1202和K.Pneumoniae1202-45-5，SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图，其中图3A为针对K.Pneumoniae1202 菌株SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图，图3B为针对K.Pneumoniae1202-45-5菌株SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图；

图4为本发明针对K.Pneumoniae1202-45-5，SU3327和多黏菌素E单用及二者联用治疗的小鼠大腿载菌量结果图。

具体实施方式

本发明实施例采用药物：SU3327购买自美国MCE试剂公司，纯度≥99%。硫酸多黏菌素E购买自河北圣雪大成唐山制药公司，效价≥23000 U/mg多黏菌素E。称取一定量的硫酸多黏菌素E配置成母液浓度为16 mg/mL水溶液。SU3327使用DMSO配置成母液浓度为40 mg/mL浓度的母液。所有母液制备好后储存在-20度冰箱。

实施例1 SU3327和多黏菌素联合用药的协同抗菌活性评价

1.1 试验菌株

试验中所用菌株大肠杆菌ATCC 25922（E.coli25922）、金黄色葡萄球菌ATCC29213（S.aureus29213）菌株购自中国兽医监察所菌种保存中心。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300（ATCC BAA-1717）购自美国标准菌种库。其他实验中所用菌株大肠杆菌B2（E.coliB2）、大肠杆菌GZP08-8（E.coliGZP08-8）、肺炎克雷伯1202（K.Pneumoniae1202）、肺炎克雷伯1202-45-5（K.Pneumoniae1202-45-5）、沙门氏菌1-5（Salmonella1-5）、志贺杆菌Y（ShigellaY）菌株均来自中国农业大学国家兽药安全评价中心保存。其中，大肠杆菌B2（E.coliB2）、大肠杆菌GZP08-8（E.coliGZP08-8）、肺炎克雷伯1202-45-5（K.Pneumoniae1202-45-5）、沙门氏菌1-5（Salmonella1-5）为含有MCR-1的耐多黏菌素的菌株。肺炎克雷伯1202（K.Pneumoniae1202）、志贺杆菌Y（ShigellaY）为临床黏菌素敏感菌株。

1.2 试验方法

使用倍比稀释法检测SU3327单独用药的MIC。随后，在96孔无菌微孔板内依照棋盘法分别进行SU3327和多黏菌素E（Colistin）单用及二者联用对上述菌株的联合抑菌活性试验，并进一步计算联合使用协同指数（FICI）。SU3327和多黏菌素E的FICI＝MIC(多黏菌素E联合)/MIC（多黏菌素E）+MIC（SU3327联合）/MIC（SU3327单用）。当FICI≤0.5判定为协同；当0.5<FICI≤1时，判定为相加作用；当0.5<FICI<4，判定为无关效应。

1.3 试验结果

SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的棋盘法对菌株的联合抑菌活性试验结果见图2，具体结果分析如下：

针对含有MCR-1的大肠杆菌B2（E.coliB2），多黏菌素E和SU3327的MIC分别为8μg/mL和20μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.5μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.1875，判定为协同作用。

针对临床黏菌素敏感菌肺炎克雷伯菌1202（K.Pneumoniae1202）菌株，多黏菌素E和SU3327的MIC分别为1μg/mL和20μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.0625μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.1875，判定为协同作用。

针对黏菌素敏感菌肺炎克雷伯菌1202-45-5（K.Pneumoniae1202-45-5）菌株，多黏菌素E和SU3327的MIC分别为16μg/mL和20μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.25μg/mL和5μg/mL，FICI为0.266，判定为协同作用。

针黏菌素敏感菌大肠杆菌GZP08-8（E.coliGZP08-8）菌株，多黏菌素E和SU3327的MIC分别为16μg/mL和10μg/Ml，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.25μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.266，判定为协同作用。

针对大肠杆菌标准菌株ATCC 25922（E.coli25922），多黏菌素E和SU3327的MIC分别为0.125μg/mL和10μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.0625μg/mL和5μg/mL，FICI为1，判定为相加作用。

针对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213（S.aureus29213），多黏菌素E和SU3327的MIC分别为大于128μg/mL和5μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到64μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.75，判定为相加作用。

针对黏菌素耐药菌株沙门氏菌1-5（Salmonella1-5），多黏菌素E和SU3327的MIC分别为大于128μg/mL和20μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到1μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.25，判定为协同作用。

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300（S.aureusUSA300）菌株，多黏菌素E和SU3327的MIC分别为大于128μg/mL和5μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到32μg/mL和1.25μg/mL，FICI为0.25，判定为协同作用。

针对黏菌素敏感菌株志贺菌Y（ShigellaY），多黏菌素E和SU3327的MIC分别为0.125μg/mL和5μg/mL，联合使用后，多黏菌素E和SU3327的MIC分别降低到0.032μg/mL和2.5μg/mL，FICI为0.75，判定为相加作用。

实施例2多黏菌素E联合SU3327使用的协同杀菌曲线

2.1 MHA培养基配制

取牛肉粉6.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂17.0g，加入900mL蒸馏水，调节pH至7.3，定容至1000 mL。121℃高压灭菌15分钟，待冷至50℃时倾入无菌平皿，晾干备用。

2.2 试验方法

将肺炎克雷伯1202菌（K.Pneumoniae1202）和肺炎克雷伯1202-45-5菌（K.Pneumoniae1202-45-5）在BHI肉汤中培养6-8小时后，使用比浊仪将细菌浓度稀释为10的六次方菌落数。其中，对肺炎克雷伯1202菌，设置药物处理浓度为：多黏菌素E(0.25μg/mL)、SU3327(10μg/m L)、SU3327 (10μg/m L)+多黏菌素E (0.25μg/m L)；对照组细菌给予0.1%的DMSO溶剂；对肺炎克雷伯1202-45-5菌，设置药物处理浓度为：多黏菌素E(1μg/mL)、SU3327 (20μg/mL)、SU3327 (20μg/mL)+多黏菌素E (1μg/mL)；在分别于药物处理第1h、3h、6 h、12h和24 h取菌液100μL涂布于琼脂平板上，培养至少16h后，进行菌落计数。

2.3试验结果

针对肺炎克雷伯1202菌（K.Pneumoniae1202）和肺炎克雷伯1202-45-5菌（K.Pneumoniae1202-45-5），SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图见图3A-图3B，其中图3A为针对K.Pneumoniae1202 菌株SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图，图3B为针对K.Pneumoniae1202-45-5菌株SU3327和多黏菌素E单用及二者联用的体外细菌生长曲线结果图。具体结果分析如下：

对肺炎克雷伯1202菌结果显示，在SU3327 (10 μg/mL)和多黏菌素E(0.25 μg/mL)联合处理组，杀菌效果较SU3327或多黏菌素E单药处理均得到明显提高；在连续处理24 h后，细菌菌落数在对照处理组为9.4 Log10 CFU/mL，多黏菌素E处理组为8.9 Log10 CFU/mL，SU3327处理组为8.35 Log10 CFU/mL，多黏菌素E和SU3327联合处理组为2.05 Log10CFU/mL；表明多黏菌素E联合SU3327处理后，杀菌效果得到显著提高。

对肺炎克雷伯1202-45-5菌结果显示，在SU3327 (20μg/m L)和多黏菌素E(1 μg/mL)联合处理组，杀菌效果较SU3327或多黏菌素E单药处理均得到明显提高；在连续处理24h后，细菌菌落数在对照处理组为9.35 Log10 CFU/mL，多黏菌素E处理组为9.3 Log10 CFU/mL，SU3327处理组为6.65 Log10 CFU/mL，多黏菌素E和SU3327联合处理组为2.7 Log10CFU/mL；表明多黏菌素E联合SU3327处理后，杀菌效果得到显著提高。

试验例3多黏菌素E和SU3327单独和联合使用在治疗BALB/c小鼠耐药细菌感染模型中的效果

3.1动物分组和处理

为了避免小鼠自身免疫力对实验的影响，所有小鼠在感染前4天和前1天分别预先分别给予环磷酰胺2次，每次腹腔注射100 mg/kg，造成小鼠中性粒细胞减少及免疫缺陷。24只6-8周龄BALB/c雌性小鼠(体重约20g)，对数期的肺炎克雷伯1202-45-5菌用PBS缓冲液重悬，制备成悬浮液，浓度为1x10⁷CFU/mL；在小鼠中，每只小鼠大腿最后注射的细菌总量为1x10⁶CFUs。然后随机分成模型对照组（即溶剂治疗组）、多黏菌素E治疗组（10 mg/kg体重）、SU3327治疗组（10 mg/kg体重）、和SU3327（10 mg/kg体重）+多黏菌素E（10 mg/kg体重）联合治疗组(每组6只)。具体处理如下：

溶剂对照治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射肺炎克雷伯1202-45-5菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL PBS缓冲液；

多黏菌素E治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射肺炎克雷伯1202-45-5菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL多黏菌素E药液(1 mg/m L)；最终剂量为10mg/kg体重；

SU3327治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射肺炎克雷伯1202-45-5菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL SU3327药液(1 mg/mL)；最终剂量为10 mg/kg体重；

SU3327（10 mg/kg）+多黏菌素E（10 mg/kg）联合治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射SU3327 (1mg/mL)和200μL多黏菌素E(1mg/m L)的混合药液。最终剂量为SU3327和多黏菌素E的剂量均为10mg/kg体重。治疗2次，每次间隔8小时。在感染后第24小时，所有小鼠进行安乐死后取小鼠右侧大腿肌肉，放置于3mL PBS溶液中，使用低温组织破碎仪破碎，最后取100μL破碎液涂板进行菌落计数。

3.2 试验结果

针对肺炎克雷伯1202-45-5菌，SU3327和多黏菌素E单用及二者联用治疗的小鼠大腿载菌量结果图见图4，结果如下：

与溶剂对照组相比，多黏菌素E单独治疗组中小鼠大腿载菌量为6.82 Log10 CFU/mL，与对照组无显著差异；与溶剂对照组相比，SU3327单独治疗组中小鼠大腿载菌量为6.55Log10 CFU/mL，与对照组相比差异显著；与溶剂对照组相比，多黏菌素E和SU3327联合治疗组中小鼠大腿载菌量为5.28 Log10 CFU/mL，与对照组相比差异显著，且分别与SU3327单独治疗组或多黏菌素E单独治疗组相比，均差异显著。这些结果表明了SU3327可以有效增强多黏菌素E和在体内的有效性，为耐药性革兰氏阴性细菌引起的感染性疾病的治疗提供了新的治疗方案。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims

1.C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327在制备增强多黏菌素E抗细菌感染效力的药物中的用途，其中所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种；其中，所述药物中SU3327、多黏菌素E的质量比为（2.5-10）:1。

2.C-JUN的N末端激酶抑制剂SU3327和多黏菌素E的组合物在制备抗细菌感染效力增强的药物中的用途, 其中所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种；其中，所述药物中SU3327、多黏菌素E的质量比为（2.5-10）:1。

3.根据权利要求1或2任一项所述的用途，其特征在于，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因的细菌，或者所述细菌为多重耐药。

4.根据权利要求1或2任一项所述的用途，其特征在于，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因的或多重耐药的肺炎克雷伯菌。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述SU3327和多黏菌素E的组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液、注射液、滴丸、冻干粉针中的一种。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述片剂为缓释片或控释片。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述口服液为糖浆。

8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述多黏菌素E和所述SU3327的最终治疗剂量为10mg/kg体重。