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CN116217657A - 蛋白质界面 - Google Patents

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CN116217657A
CN116217657A CN202310203866.1A CN202310203866A CN116217657A CN 116217657 A CN116217657 A CN 116217657A CN 202310203866 A CN202310203866 A CN 202310203866A CN 116217657 A CN116217657 A CN 116217657A
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rad51
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cells
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查理·沙赫翁
玛丽亚·索罗维奇克
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Synthex Inc
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Abstract

本公开内容提供了使用靶向抗性癌细胞的化合物治疗包括癌症在内的病况的方法。该化合物可用于使抗性癌细胞敏感或减少细胞增殖。该化合物可以靶向DNA损伤修复途径中的蛋白质，从而导致靶细胞中的DNA损伤修复减少。

Description

蛋白质界面
本申请是申请日为2017年05月26日、申请号为201780046940.6、发明名称为“蛋白质界面”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2017年05月26日、申请号为PCT/US2017/034870)的分案申请。
交叉引用
本申请要求于2016年5月27日提交的第62/342,840号临时申请和于2016年9月7日提交的第62/384,226号临时申请的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
背景技术
癌症是不受控制的细胞增殖，是多因素的疾病，其特征在于肿瘤形成、生长，以及在某些情况下的转移。目前的癌症治疗包括化疗和靶向治疗，其试图通过凋亡、坏死或增殖抑制来破坏癌细胞。脱氧核糖核酸(DNA)修复途径在癌细胞中经常过表达，并可能对化疗抗性癌症的增殖至关重要。因此，可以减弱异常DNA损伤修复途径信号传导的化合物可能对癌症患者有益。然而，在DNA修复和癌症中，这类信号传导途径经常涉及蛋白质-蛋白质相互作用作为关键的调节步骤，使得传统的基于酶活性位点抑制剂的药物开发方案具有挑战性。因此，需要开发针对癌症和DNA修复中的蛋白质-蛋白质相互作用的方法和组合物。
发明内容
本公开内容涉及鉴别和产生蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的方法、组合物和技术，以及使用蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的方法、组合物和技术。
一方面，本发明涉及与人RAD51上RAD51AP1的结合位点相互作用的非天然存在的化合物。在一个实施方案中，该化合物与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。在一个实施方案中，该化合物进一步与人RAD51的残基187相互作用。在另一个实施方案中，该化合物与RAD51的结合常数是Kd值为10-4M或更低。在另一个实施方案中，该化合物包含多肽。在一个实施方案中，该多肽包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽既包含(L)-氨基酸又包含(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽包含至少一种(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式I的氨基酸序列或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式II-IV中任一个的氨基酸序列或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据SEQ ID NO.:1、SEQ IDNO.:5、SEQ ID NO.:10、SEQ ID NO.:66或SEQ ID NO.:67的氨基酸序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物是化合物1、化合物5、化合物10、化合物13或化合物14。在另一个实施方案中，该多肽不是抗体。在另一个实施方案中，该多肽由少于30个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由60个或更少的氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由少于30个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由少于20个、少于15个或少于10个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽进一步包含细胞穿透肽序列。在另一个实施方案中，该化合物在与细胞中的RAD51结合后表现出至少一种以下特性：(a)抑制RAD51单体在DNA上的装配；(b)抑制细胞同源重组；(c)缺乏对RAD51 ATP酶活性的抑制；或(d)降低RAD51对Ca2+的亲和力。
另一方面，本发明涉及诱导细胞死亡的方法，其中该方法包括使细胞与结合细胞中的真核重组酶的多肽接触，其中该多肽与该真核重组酶的结合抑制了该真核重组酶与该细胞中的蛋白质的结合，其中在该多肽与该真核重组酶结合时，该细胞表现出细胞内游离钙浓度的增加。在一个实施方案中，该多肽包含根据式I的氨基酸序列或其反向序列。在另一个实施方案中，该真核重组酶是RAD51。在另一个实施方案中，该蛋白质是BRCA2。在另一个实施方案中，该蛋白质是RAD51AP1。在另一个实施方案中，该细胞死亡是凋亡性细胞死亡。在另一个实施方案中，该多肽与该细胞中的真核重组酶的结合使该细胞对化疗剂敏感。在另一个实施方案中，该方法进一步包括施用化疗剂。在另一个实施方案中，该化疗剂是PD-L1、抗PD1剂或PARP抑制剂。在另一个实施方案中，该真核细胞是癌细胞。在另一个实施方案中，该细胞是人细胞。在另一个实施方案中，该多肽以一定的速率诱导细胞的死亡，该速率至少是不存在该多肽时的10倍。在另一个实施方案中，该多肽诱导癌细胞死亡的速率大于诱导非癌细胞死亡的速率。在另一个实施方案中，该多肽诱导癌细胞死亡的速率至少是诱导非癌细胞死亡的速率的10倍。在另一个实施方案中，该多肽诱导依赖于RAD51活性升高的癌细胞死亡的速率高于诱导非癌细胞死亡的速率。
在另一方面，本发明涉及治疗与异常RAD51活性相关的病况的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的与人RAD51上RAD51AP1的结合位点相互作用的多肽。在一个实施方案中，该化合物与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。在一个实施方案中，该化合物进一步与人RAD51的残基187相互作用。在另一个实施方案中，该化合物与RAD51的结合常数是Kd值为10-4M或更低。在另一个实施方案中，该化合物包含多肽。在另一个实施方案中，该多肽包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽既包含(L)-氨基酸又包含(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽包含至少一种(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式I的氨基酸序列，或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式II-IV中的任一个的氨基酸序列，或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:5、SEQID NO.:10、SEQ ID NO.:66或SEQ ID NO.:67的氨基酸序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物是化合物1、化合物5、化合物10、化合物13或化合物14。在另一个实施方案中，该多肽不是抗体。在另一个实施方案中，该多肽由少于30个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该肽由60个或更少的氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由少于20个、少于15个或少于10个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽进一步包含细胞穿透肽序列。在另一个实施方案中，该化合物在与细胞内的RAD51结合时显示至少一种下列特性：(a)抑制RAD51单体在DNA上的装配；(b)抑制细胞同源重组；(c)缺乏对RAD51ATP酶活性的抑制；或(d)降低RAD51对Ca2+的亲和力。在另一个实施方案中，所述病况是布卢姆综合征。在另一个实施方案中，所述病况是布卢姆综合征、范科尼贫血、维尔纳综合征或Nijmegen断裂综合征。
在又一方面，本发明涉及降低细胞中的抗药性的方法，其包括使细胞与多肽接触，该多肽结合人RAD51上RADAP1的结合位点。在一个实施方案中，所述化合物与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。在一个实施方案中，该化合物进一步与人RAD51的残基187相互作用。在另一个实施方案中，该化合物与RAD51的结合常数是Kd值为10-4M或更低。在另一个实施方案中，该化合物包含多肽。在另一个实施方案中，该多肽包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽既包含(L)-氨基酸又包含(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽包含至少一种(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式I的氨基酸序列或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据式II-IV中的任一个的氨基酸序列或其反向序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物包含根据SEQ ID NO.:1、SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:10、SEQ ID NO.:66或SEQ ID NO.:67的氨基酸序列，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。在另一个实施方案中，该化合物是化合物1、化合物5、化合物10、化合物13或化合物14。在另一个实施方案中，该多肽不是抗体。在另一个实施方案中，该多肽由少于30个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由60个或更少的氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽由少于20个、少于15个或少于10个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，该多肽进一步包含细胞穿透肽序列。在另一个实施方案中，该化合物在与细胞内的RAD51结合时显示出至少一种下列特性：(a)抑制RAD51单体在DNA上的装配；(b)抑制细胞同源重组；(c)缺乏对RAD51 ATP酶活性的抑制；或(d)降低RAD51对Ca2+的亲和力。在另一个实施方案中，所述药物是PD-L1、抗PD1剂或PARP抑制剂。在另一个实施方案中，该药物是美法仑、多柔比星、阿霉素、依托泊苷、喜树碱、丝裂霉素C、顺铂、替莫唑胺、奥沙利铂、卡铂或吉西他滨。
在又一方面，本发明涉及检测宿主细胞中第一测试蛋白质与第二测试蛋白质之间的相互作用的方法，其包括：a)在宿主细胞中表达包含第一测试蛋白质和DNA结合部分的第一融合蛋白；b)在宿主细胞中表达包含第二测试蛋白质和基因活化部分的第二融合蛋白；c)在宿主细胞中表达死亡剂，其中细胞毒性报告子被该DNA结合部分特异性的启动子DNA序列激活，其中第一蛋白质与第二蛋白质之间的相互作用使所述基因活化部分激活该细胞毒性报告子的表达。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含超过一种被所述DNA结合部分特异性的启动子DNA序列激活的细胞毒性报告子。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含：a)编码第一融合蛋白的基因组DNA和编码第二融合蛋白的基因组DNA；以及b)编码细胞毒性报告子的质粒DNA。在另一个实施方案中，所述DNA结合部分衍生自LexA、cI、糖皮质激素受体、TetR或Ume6。在另一个实施方案中，所述基因活化部分衍生自GAL4、B42、VP16或Dof1。在另一个实施方案中，所述细胞毒性报告子是核糖体编码的异生物质、核糖体编码的毒物、在轻度过表达时导致严重生长缺陷的核糖体编码的内源或外源基因、切除活力必需基因的核糖体编码的重组酶、参与毒性次级代谢物的合成的限制因素，或其任何组合。在另一个实施方案中，所述细胞毒性报告子是霍乱毒素、SpvB毒素、CARDS毒素、SpyA毒素、HopU1、Chelt毒素、Certhrax毒素、EFV毒素、ExoT、CdtB、白喉毒素、ExoU/VipB、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoG、VopF、YopJ、AvrPtoB、SdbA、SidG、VpdA、Lpg0969、Lpg1978、YopE、SptP、SopE2、SopB/SigD、SipA、YpkA、YopM、鹅膏蕈毒素、类鬼笔毒环肽、杀伤毒素KP1、杀伤毒素KP6、杀伤毒素K1、杀伤毒素K28(KHR)、杀伤毒素K28(KHS)、炭疽致死因子内肽酶、志贺毒素、蓖麻毒素，或其任何组合。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是真菌或细菌细胞。在另一个实施方案中，所述方法还包括在包含编码随机化多肽文库的DNA序列的宿主细胞中表达测试基因。在另一个实施方案中，该随机化多肽文库包含长度为60个或更少氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，该随机化多肽文库包含长度为30个或更少氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，该随机化多肽文库包含长度为20个或更少氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，该测试基因包含短蛋白质的3'UTR。在另一个实施方案中，该3'UTR是sORF1的3'UTR。在另一个实施方案中，编码随机化多肽文库的DNA序列编码甲硫氨酸-缬氨酸-天冬酰胺的共同N-末端序列。在另一个实施方案中，编码随机化多肽文库的DNA序列编码共同的N-末端稳定化序列。在另一个实施方案中，由随机化肽文库编码的多肽在宿主细胞中被加工成环肽。在另一个实施方案中，由随机化肽文库编码的多肽在宿主细胞中被来自具缘盔孢伞(G.marginata)或双孢鹅膏(A.bisporigera)的POPB加工成环肽。
在另一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO.:63的核苷酸序列的质粒载体。在一个实施方案中，该质粒载体具有与TetR-DBD符合读框地插入的编码第一多肽的DNA序列，以及与Dof1-AD符合读框地插入的编码第二多肽的DNA序列。
在另一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO.:63的核苷酸序列的宿主细胞，或包含SEQ ID NO.:63的核苷酸序列的宿主细胞，其中编码第一多肽的DNA序列与TetR-DBD符合读框地插入，并且其中编码第二多肽的DNA序列与Dof1-AD符合读框地插入。
在另一方面，本发明涉及质粒载体文库，每个质粒载体包含：a)与第一开关启动子可操作地连接的编码不同肽序列的DNA序列；和b)在第二开关启动子控制下的编码细胞毒性报告子的DNA序列。在一个实施方案中，所述不同肽序列编码共同的N-末端稳定化序列。在另一个实施方案中，编码不同肽序列的DNA序列进一步编码3'UTR。在另一个实施方案中，所述不同肽序列的长度为60个或更少的氨基酸。在另一个实施方案中，所述不同肽序列的长度为30个或更少的氨基酸。在另一个实施方案中，所述不同肽序列的长度为20个或更少的氨基酸。在另一个实施方案中，所述N-末端稳定化序列是M-V-A。在另一个实施方案中，所述3'UTR衍生自sORF1。在另一个实施方案中，所述不同肽序列是随机的。在另一个实施方案中，所述不同肽序列是针对与靶标的结合而预富集的。
在另一方面，本发明涉及宿主细胞文库，每个宿主细胞包含0或1个拷贝的上述质粒载体文库的质粒载体。
在另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其表达：a)包含DNA结合部分的第一融合蛋白；b)包含基因活化部分的第二融合蛋白；c)细胞毒性报告子，其中该细胞毒性报告子的表达在所述DNA结合部分特异性的DNA结合序列的控制之下；d)包含编码60个或更少氨基酸的多肽的核苷酸序列的mRNA，其中该mRNA包含位于该多肽的3'侧的3'UTR，并且其中该多肽编码用于肽稳定的N-末端序列。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真菌或细菌细胞。在另一个实施方案中，该宿主细胞是单倍体酵母细胞。在另一个实施方案中，该宿主细胞是二倍体酵母细胞。在另一个实施方案中，该二倍体酵母细胞通过将第一宿主细胞与第二宿主细胞接合而产生，第一宿主细胞包含编码第一嵌合基因和第二嵌合基因的DNA序列，第二宿主细胞包含编码细胞毒性报告子的DNA序列和包含编码多肽的核苷酸序列的mRNA。在另一个实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞。
通过以下详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，以下详细描述中仅示出和描述本公开内容的说明性实施方案。如将认识到的，本公开内容能有其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面修改，所有这些都不背离本公开内容。因此，附图和具体实施方式在本质上看作是说明性的，而不是限制性的。
援引并入
本申请中引用的每一项专利、出版物和非专利文献均在此通过引用整体并入本文，如同每一项单独通过引用而并入。
附图说明
通过参考以下对利用本发明原理的说明性方面加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1描述了化合物1、3和5对SSP-25细胞的影响。
图2描述了化合物1和5对SSP-25和HeLa细胞的影响。
图3描述了化合物1对SSP-25和HeLa细胞的影响。
图4描述了化合物1对SSP-25细胞的影响。
图5描述了化合物1和2对SSP-25细胞的影响。
图6描述了依托泊苷和化合物1对GM08505细胞的影响。
图7是蛋白质-蛋白质整合质粒的说明性实例。
图8是蛋白质-蛋白质整合质粒的序列(SEQ ID NO.:60和61)。
图9是选择和文库质粒的说明性实例。
图10是选择和文库质粒的序列(SEQ ID NO.:62)。
图11是确认质粒的说明性实例。
图12是本公开内容的平台的说明性实例，其用于鉴别破坏蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。
图13显示使用xCELLigence试验，用化合物5对SSP-25细胞的细胞杀伤。垂直箭头表示化合物给药次数，细胞指数(Y轴)表示细胞活力。
图14使用xCELLigence试验，比较了用化合物5和6对PC3细胞的细胞杀伤。
图15显示使用xCELLigence试验，化合物10对A549细胞的细胞杀伤。垂线表示化合物给药时间，细胞指数(Y轴)表示细胞活力。
图16显示曲线拟合的实例，其基于图15所示的数据计算化合物10的IC50。
图17显示根据本发明的示例性化合物的完整化学结构，及其对SSP-25细胞的细胞死亡IC50的测量。
图18显示根据本发明的示例性化合物，示出了对其使用细胞穿透肽的细胞死亡IC50的相对不敏感性。
图19显示在体内无胸腺小鼠A549异种移植模型中肿瘤内和腹膜内施用的化合物10的效果。
图20显示化合物10在体外对源自不同肿瘤类型的无限增殖化细胞系的IC50。
图21显示包含如本文所述的RAD51相互作用化合物的示例性马库什结构。
图22显示与RAD51结合的、根据本发明的示例性RAD51肽的结合模型(以pdb结构1N0W表示)。突出显示了所鉴别的对于肽结合关键的残基。左图显示结合在RAD51上的BRCA2肽(该化合物与围绕BRCA2肽突出显示的残基相互作用)，右图不包括BRCA2的这一序列，并仅突出显示了RAD51上的化合物相互作用残基。
图23显示来源于各种不同物种的RAD51的序列比对，它们根据本发明的RAD51相互作用肽是否与SEQ ID NO.:5结合而分组，如通过使用RAD51/SEQ ID NO.:5对的Y2H试验所评估的。突出显示了似乎导致结合差异的变异残基。
图24显示对SSP-25细胞的xCELLigence细胞死亡试验，其中化合物10单独加入或与钙螯合剂BAPTA-AM组合加入，证明了加入BAPTA-AM可挽救化合物10导致的细胞死亡。
图25显示对SSP-25细胞的xCELLigence细胞死亡试验，其中化合物10单独加入或与钙螯合剂钌红(ruthenium red)组合加入，证明了加入钌红可以挽救化合物10导致的细胞死亡。
图26显示对SSP-25细胞的xCELLigence细胞死亡试验，其中化合物10或奥拉帕利(olaparib)单独或组合加入，证明了相对于单独的化合物10或奥拉帕利，化合物10和奥拉帕利的组合增强了细胞死亡。
具体实施方式
虽然本发明的各个实施方案已在此展示和描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解，可以采用此处描述的本发明实施方案的各种替代方案。
本公开内容提供了使用可以与参与同源重组DNA修复途径的蛋白质结合的化合物治疗癌症的方法。本发明的化合物可降低癌细胞的细胞增殖速率，并避免影响那些不过度表达DNA修复途径特异性蛋白质的细胞。本发明的化合物可以进一步使细胞对化疗敏感，并使那些对治疗剂已产生抗性的细胞敏感。本文公开的化合物可显示出对带有特定转录特征的癌细胞的特异性。
癌症是一批相关疾病，其特征在于不受控制的细胞增殖，其可能转移到全身。癌症可分为五大类，包括，例如癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和腺瘤。癌可以起因于覆盖身体内部和外部如肺、乳腺和结肠的细胞。肉瘤可以起因于位于骨骼、软骨、脂肪、结缔组织、肌肉和其他支持组织中的细胞。淋巴瘤可以发生在淋巴结和免疫系统组织中。白血病可以发生在骨髓中，并在血流中累积。腺瘤可出现在甲状腺、垂体、肾上腺和其他腺体组织中。
尽管不同的癌症可以在几乎任何身体组织中发生，但是导致癌症的基本过程在所有形式的疾病中可以是相似的。当细胞从对细胞分裂的正常限制中解脱出来，并开始生长和异常分裂时，癌症就开始了。细胞中的基因突变可以阻止细胞控制细胞分裂或启动凋亡的能力，并可导致不受控制的细胞生长和分裂。
癌基因和肿瘤抑制基因可以调节细胞的增殖。基因突变可以影响癌基因和肿瘤抑制基因，可能会异常激活或抑制活性，进一步促进不受控制的细胞分裂。癌基因有助于细胞生长，而肿瘤抑制基因通过修复受损DNA并激活凋亡来减缓细胞分裂。可在癌症中突变的细胞癌基因包括，例如Cdk1、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk6、c-MYC、EGFR、HER2、K-Ras、PDGFR、Raf激酶和VEGF。可在癌症中突变的肿瘤抑制基因包括，例如BRCA1、BRCA2、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C、PTEN、p16、p27、p53、p73和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)。
DNA损伤和癌症
DNA损伤可由于例如UV辐射、IR辐射、X射线、活性氧、脱嘌呤、脱嘧啶、单链断裂、双链断裂、胞嘧啶脱氨基、O6-甲基鸟嘌呤、碱基烷基化、DNA交联、复制错误或自由基而发生。化学化合物还可通过引起大体积加合物、链间交联、链内交联、DNA链之间的插入或DNA烷基化而引起DNA损伤。可引起DNA损伤的化合物包括，例如，放线菌素-D、苯并[a]芘、顺铂、柔红霉素、溴化乙锭、氮芥、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、N-亚硝基-N-甲基脲(NMU)或补骨脂素。
在癌症中可以发现DNA损伤修复途径的突变或过早表达。在DNA损伤修复途径中可受影响的基因包括，例如，ATM、ATRX、BRCA1、BRCA2、ERCC1、FANCB、FANCF、FEN1、HMGA1、HMGA1、MDC1、MGMT、MLH1、MSH2、MSH4、Mre11A、NBS1、NEIL1、PARP1、PARP2、PMS2、RAD51、RAD52、RAD54、RAD51AP1、WRN或XPF。
BRCA1和BRCA2是参与细胞DNA损伤修复途径的肿瘤抑制物。BRCA1和BRCA2均可与RAD51相互作用，RAD51是参与DNA修复的真核重组酶。BRCA1或BRCA2中的种系突变可使个体易患各种癌症，包括例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和肝癌。具有BRCA2突变的肿瘤可表现出野生型等位基因的杂合性丢失。
BRCA1可与其他肿瘤抑制物、DNA损伤传感器和信号转导物组合，以形成被称为BRCA1相关基因组监视复合物(BASC)的大型多亚单元蛋白质复合物。BRCA1还可以与RNA聚合酶II和组蛋白脱乙酰酶复合物缔合。因此，BRCA1可以在转录、双链断裂的DNA修复和重组中起作用。BRCA1具有细胞周期依赖性定位，并可见于例如细胞核、细胞质或内质网中。
BRCA2可维持基因组稳定性，而BRCA1和BRCA2均可特异性调节双链DNA修复的同源重组途径。BRCA2蛋白含有约7个拷贝的70个氨基酸的基序，被称为BRC基序，该基序可介导与RAD51重组酶的结合。RAD51可以行使同源重组和DNA修复所需的某些生化活性，例如，促进联合分子形成和同源DNA分子之间的DNA链交换。作为这些功能的先决条件，RAD51可与DNA结合形成高度有序的核蛋白丝，其中DNA被包裹在蛋白质鞘内。RAD51AP1是一种RAD51辅助蛋白质，其通过结构特异性DNA结合和与RAD51的物理接触的组合，可以刺激联合分子的形成。RAD51AP1可以保护细胞免受DNA双链断裂诱导剂的不利影响。
BRCA2中的BRC3或BRC4重复序列与RAD51之间的直接和特异性相互作用可以以准备定位于DNA损伤位点的形式螯合RAD51，从而被激活以用于DNA修复。功能性BRCA2的缺失或BRCA2的过表达可以通过例如防止RAD51定位于DNA损伤位点来扰乱RAD51的功能。这些受损位点可以包含在停滞或断裂的复制叉处形成的双链断裂，或由外源物质诱导的双链断裂，可以提供激活哺乳动物SOS修复响应的信号。激活可以涉及RAD51的翻译后修饰，或通过与其他修复蛋白质的相互作用而发生。
BRCA2的BRC基序可以以细胞周期依赖性方式，并响应于DNA损伤而结合RAD51单体或寡聚体形式。BRCA2蛋白可直接参与RAD51的核转运。例如，胰腺腺癌细胞系CAPAN-1是BRCA2缺陷的，这可导致CAPAN-1中RAD51的核转运受损。因此，RAD51可能需要BRCA2来进行核转位和适当的同源重组过程。
双链DNA断裂可以由例如天然和医学辐射和其他环境暴露引起。当染色体在减数分裂过程中和DNA交联修复过程中交换遗传物质时，也会发生双链DNA断裂。通过修复DNA，BRCA1和BRCA1在维持人类基因组的稳定性和降低可能导致恶性肿瘤的危险基因重排的可能性方面发挥作用。
使用化疗或放疗的癌症治疗可以通过诱导加合物或DNA双链或单链断裂来靶向并破坏肿瘤细胞DNA的功能。癌细胞可以通过产生抗性机制来克服这些疗法，所述抗性机制可以是癌细胞诱导的或固有的。由于RAD51的过表达，在癌细胞中可以存在高水平的同源重组。这种RAD51的过表达可见于，例如乳腺癌、胰腺癌、NSCLC、mCRPC、AML、ICC和CML中。在这些癌细胞中，RAD51的过表达可通过促进化疗诱导的双链断裂的修复来提供癌症抗性。因此，本发明的化合物可以干扰RAD51或参与DNA损伤修复途径的其他蛋白质的活性，使癌细胞对化疗重新敏感，或增强化疗的效果。
双杂交系统
双杂交筛选可用于鉴别和表征蛋白质-蛋白质相互作用。双杂交系统最初是使用酵母作为宿主生物体而开发的。然而，细菌双杂交系统也可用于表征蛋白质-蛋白质相互作用。本公开内容提供了一种系统，其可以使用统一的酵母和细菌双杂交系统，其中在两种生物体环境中使用单一诱饵表达质粒。此外，可以产生广泛的一系列已知亲和力的亮氨酸拉链融合蛋白，以比较使用两种系统的相互作用的检测效率。酵母系统可以在动态范围内产生定量读数。诱饵引起的“自动激活”在细菌系统中可能不太普遍。此外，本文公开的修饰的表达载体可用于在酵母和细菌中表达目的蛋白质。
如本文所用，“报道基因”是指可以测定其表达的基因。这类基因包括，例如，LacZ、β-葡糖醛酸酶(GUS)、氨基酸生物合成基因、酵母LEU2、HIS3、LYS2或URA3基因、核酸生物合成基因、哺乳动物氯霉素转乙酰酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白(GFP)或任何可获得其特异性抗体的表面抗原基因。
“启动子”是位于可操作地连接的转录序列5'末端的转录起点附近的DNA序列。启动子可含有一个或多个调节元件或模块，该元件或模块在调节可操作地连接的基因的转录中相互作用。启动子可以是可开关的或组成型的。开关启动子允许在施用药剂时可逆地诱导或抑制可操作地连接的靶基因。开关启动子的实例包括但不限于TetO操纵子和醇脱氢酶I(alcA)基因启动子。组成型启动子的实例包括人β-肌动蛋白基因启动子。
“可操作地连接的”描述了两个大分子元件，它们排列成使得调节第一元件的活性诱导对第二元件的影响。以这种方式，对启动子元件活性的调节可用于改变或调节可操作地连接的编码序列的表达。例如，与启动子元件可操作地连接的编码序列的转录由激活启动子活性的因子诱导；与启动子元件可操作地连接的编码序列的转录被抑制启动子活性的因子抑制。因此，如果这类编码序列活性的转录受启动子活性的影响，则该启动子区与蛋白质的编码序列可操作地连接。
本文通篇使用的“符合读框”(in frame)是指在与启动子序列可操作地连接的DNA片段或编码序列内正确定位所需的核苷酸序列，从而产生最佳转录或翻译。
“融合构建体”是指编码融合蛋白的重组基因。
“融合蛋白”是杂合蛋白质，即，已构建为含有来自至少两种不同蛋白质的结构域的蛋白质。如本文所用，融合蛋白是杂合蛋白，其具有(a)来自转录调节蛋白质的转录调节域，或(b)来自DNA结合蛋白质的DNA结合域，其与待测定相互作用的异源蛋白质连接。融合蛋白的结构使得转录调节域和DNA结合域以允许两个结构域具有生物活性的方式排列。作为转录调节域来源的蛋白质与作为DNA结合域来源的蛋白质不同。换句话说，这两个结构域彼此是异源的。
融合蛋白的转录调节域可以激活或抑制靶基因的转录，这取决于该结构域的天然生物活性。本发明的诱饵蛋白质也是由融合基因编码的融合蛋白，该融合基因可含有与DNA结合部分可操作地连接的目的蛋白质。
术语“融合蛋白基因”是指编码融合蛋白的DNA序列。融合蛋白基因可以进一步提供用于其转录和翻译控制的转录和翻译调节元件。
“表达”是揭示基因内编码的信息的过程。如果该基因编码蛋白质，那么表达涉及将DNA转录成mRNA，将mRNA(如果需要)加工成成熟mRNA产物，以及将成熟mRNA翻译成蛋白质。
如果分子含有多肽的编码序列和在适当的宿主环境中提供将DNA中包含的遗传信息转录、加工并翻译成蛋白质产物的能力的表达控制序列，并且如果这类表达控制序列与编码该多肽的核苷酸序列可操作地连接，则称核酸分子如DNA或基因“能够表达”该多肽。
如本文所用，“克隆载体”是为了克隆目的能够将核酸序列递送到宿主细胞中的任何实体。克隆载体的实例包括质粒或噬菌体基因组。特别需要能够在宿主细胞中自主复制的质粒。或者，可以插入(整合)到宿主细胞的染色体DNA中的核酸分子是有用的，尤其是以稳定的方式，即以允许子细胞遗传这样的分子的方式插入宿主细胞染色体DNA内的分子。
如本文所述的“宿主细胞”可以是细菌、真菌或哺乳动物细胞。细菌宿主细胞的实例是大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。真菌细胞的实例是酿酒酵母(S.cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)。哺乳动物细胞的非限制性实例是无限增殖化的哺乳动物细胞系，如HEK293、A549、HeLa或CHO细胞，或已经在遗传上无限增殖化(例如通过用hTERT转染)的分离的患者原代组织细胞。
克隆载体通常以一个或少量核酸内切酶识别位点为特征，在该位点处可以通过可确定的方式切割此类DNA序列，而不丧失该载体的基本生物功能，并且可以将DNA剪接到其中，以实现其复制和克隆。
克隆载体可以进一步含有适用于鉴别用克隆载体转化的细胞的标记物。例如，标记基因可以是赋予宿主细胞对特定抗生素的抗性的基因。
术语“载体”可与“克隆载体”互换使用。
如本文所用，“表达载体”是与克隆载体类似的载体，但特别设计为提供允许克隆的基因在转化到宿主中后得到表达的环境。提供这样的环境的一种方式是在这类表达载体上包括转录和翻译调节序列，这类转录和翻译调节序列能够与克隆的基因可操作地连接。提供这样的环境的另一种方式是，在这样的载体上提供一个或多个克隆位点，其中可以克隆所需的克隆基因和所需的表达调节元件。
在表达载体中，待克隆的基因通常与某些控制序列如启动子序列可操作地连接。表达控制序列将根据载体被设计为是在原核宿主中还是在真核宿主中表达可操作地连接的基因而变化，并可另外含有转录元件，如增强子元件、终止序列、组织特异性元件或翻译起始和终止位点。
“宿主”是指作为克隆或表达载体的接受者的任何生物体。宿主可以是酵母细胞或培养的动物细胞，如哺乳动物或昆虫细胞。酵母宿主可以是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
“结合部分”或“DNA结合部分”是一段氨基酸，其能够引导特定多肽与特定DNA序列的结合(即“蛋白质结合位点”)。在本文中也称为DNA结合域，这些蛋白质可以是以序列特异性方式结合DNA的同型二聚体或单体。本发明的示例性DNA结合域包括LexA、cI、糖皮质激素受体结合域和Ume6结构域。
“基因活化部分”是一段氨基酸，其能够微弱地诱导与其控制区域结合的基因的表达(一个例子是来自转录因子的激活域)。如本文所用，“微弱地”是指低于由GAL4活化区II实现的活化水平，并且优选地等于或低于由B42活化域实现的活化水平。活化水平可以使用任何下游报告基因系统，以及在平行测定中比较由GAL4区II-多肽刺激的表达水平与由待测多肽刺激的表达水平来测量。
蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的筛选
形成两种蛋白质之间的接触界面的大而宽的表面可以是典范小分子抑制剂的潜在靶标。然而，所述大而宽的表面可能有尺寸限制，并且可能容易通过进化发生抗性。抗体的特异性可以与短肽形式的细胞渗透性组合，例如，小于25个残基的肽。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的短肽阻断剂可以用诸如噬菌体展示或mRNA展示等技术进行筛选；然而，这些筛选在体外进行，并且可能需要纯化一种感兴趣的相互作用蛋白质。在选择对一种蛋白质具有亲和力的肽序列后，可以进行二次筛选，以验证该肽干扰第二种蛋白质的结合界面。该二次筛选可以进一步依赖于蛋白质的正确折叠和该试验中细胞内生物物理条件的复制。
本发明的方法可涉及细胞内选择PPI的有效肽破坏物。可以使用模式生物，例如酿酒酵母，并且目的PPI与包含编码随机化肽文库的DNA序列的测试基因的共表达可以允许使用严格的选择机制来选择干扰PPI的无偏肽。该方法可以从酵母双杂交系统的排列开始，该系统可以依赖于转录因子的重构，这需要与DNA结合域(DBD)融合的第一测试蛋白质同与转录激活域(AD)或基因活化部分融合的第二测试蛋白质之间的相互作用。
两种目的蛋白质之间的有效相互作用可以将RNA聚合酶引导至特定的基因组位点，并允许遗传元件的表达。该遗传元件可以是，例如，编码使生物体能够在选择培养基上生长的蛋白质的基因。该选择培养基可以是例如ADE2、URA3、TRP1、KANR或NATR特定的。当相互作用不再存在时，例如被外部对象破坏时能够检测到的标记物可以被称为反选择标记物，如URA3基因，并且可能是较差或易漏的(leaky)(容易被逃避选择的突变体的选择所掩盖)。选择标记物的这种易漏性可导致较高的假阳性率。
本发明的方法可以将强阴性选择标记物与短肽产生的细胞内稳定化相组合，以筛选PPI阻断剂。可以使用诱导型双杂交方法，其可以驱动几种细胞毒性报告子(死亡剂)中的任何一种或组合的表达。涉及在双杂交系统中诱导表达细胞毒性报告子组合的本发明方法可以在降低双杂交分析的假阳性率方面产生倍增效应，因为所有细胞毒性报告子必须同时是“易漏的”才能允许诱导的细胞存活。该细胞毒性报告子可以是，例如：
Figure BDA0004110047230000181
Figure BDA0004110047230000191
Figure BDA0004110047230000201
Figure BDA0004110047230000211
Figure BDA0004110047230000221
Figure BDA0004110047230000231
Figure BDA0004110047230000241
Figure BDA0004110047230000251
Figure BDA0004110047230000261
Figure BDA0004110047230000271
Figure BDA0004110047230000281
本发明的细胞毒性报告子可以是，例如，核糖体编码的异生物质、核糖体编码的毒物、在轻度过表达时导致严重生长缺陷的核糖体编码的内源或外源基因、切除活力必需基因的核糖体编码的重组酶，或可能参与毒性次级代谢物的合成的限制因子(或多种因子)。
本发明系统可以使用由与AD(例如Dof1)融合的蛋白质同与DBD(例如TetR)融合的另一种蛋白质之间的相互作用介导的转录因子的重构。
为了鉴别可以破坏PPI的肽，可以使用PPI整合质粒(质粒1；图7)、选择和文库质粒(质粒2；图9)和确认质粒(质粒3；图11)。
质粒1可含有，例如，两个限制位点，所述限制位点能够整合构成目的PPI的两种蛋白质。目的PPI可涉及一对对癌发生具有已知重要性的结构域，如p53-MDM2、RAS-RASRBD和MYC-MAX。目的PPI还可以涉及癌基因(如Cdk1、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk6、c-MYC、EGFR、HER2、K-Ras、PDGFR、Raf激酶和VEGF)或肿瘤抑制物(如BRCA1、BRCA2、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物1C、PTEN、p16、p27、p53、p73和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb))与已知的细胞相互作用配偶体的相互作用。目的PPI可能涉及参与DNA修复途径的蛋白质(如ATM、ATRX、BRCA1、BRCA2、ERCC1、FANCB、FANCF、FEN1、HMGA1、HMGA1、MDC1、MGMT、MLH1、MSH2、MSH4、Mre11A、NBS1、NEIL1、PARP1、PARP2、PMS2、RAD51、RAD52、RAD54、RAD51AP1、WRN和XPF)与另一种细胞因子的相互作用。
当指定DNA序列时，N表示任何可能的脱氧核苷酸。
质粒1可以编码AD(如Dof1)或另一种基因活化部分和DBD(如TetR)与由强启动子和终止子(如ADH1)任一或由诱导型启动子(如GAL1)驱动的每种蛋白质的融合。其他示例性激活域包括VP16和B42AD的激活域。其他示例性DBD包括GAL4或LexA的DBD。每种蛋白质融合体都可以为了后续的生化实验用例如FLAG、HA或His标签来标记。质粒1还可包含细菌选择和繁殖标记物(即ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(即TRP1和CEN或2um)。该质粒也可以在指定的基因座处整合到基因组中。质粒1的序列可以是：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGTCTTCTGTCCCAGTTACCGAATCTAAGGGCACTACCACCAAAGAAACAGGTGTTACTACCAAACAAACCACAGCCAACCCAAGTCTAACCGTCTCCACAGTCGTCCCAGTTTCATCCTCTGCTTCTTCTCATTCCGTTGTCATCAACAGTAACGGTGCTAACGTCGTCGTTCCAGGTGCTTTAGGTTTGGCTGGTGTTGCTATGTTATTCTTATAAACGGTGGTGTTTGACACATCCGCCTTCTTAATGCTTTCTTTCAGTATTATGTTATTTTTTTGTTATTCGTTTTTCACTTCTAGGCTTTTTGACAGACTAGCCCCGTTATACCACCATCTTTGTGGGAAAGCCCCTAAATTGCCCTGAGCAGTATCGTTTCATGTCTAGTCTCTTTAAAGATGTTTCTTACACTTCTCCTATGCACATATATTAATTAAAGTCCAATGCTAGTAGAGAAGGGGGGTAACACCCCTCCGCGCTCTTTTCCGATTTTTTTCTAAACCGTGGAATATTTCGGATATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTCTGGCAACCAAACCCATACATCGGGATTCCTATAATACCTTCGTTGGTCTCCCTAACATGTAGGTGGCGGAGGGGAGATATACAATAGAACAGATACCAGACAAGACATAATGGGCTAAACAAGACTACACCAATTACACTGCCTCATTGATGGTGGTACATAACGAACTAATACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCCATCATCATATCGAAGTTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATCTATTGAAGTAATAATAGGCGCATGCAAC
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CCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC(SEQ ID NO.:63)。
质粒2可以包括，例如，用于整合由强启动子(如ADH1启动子)或诱导型启动子(如GAL1启动子)驱动的随机化肽文库(如随机化NNK 60-聚体序列)的限制位点。该文库还可以开始于固定序列，例如，甲硫氨酸缬氨酸天冬酰胺(MVN；SEQ ID NO.:66)或另一种高半衰期N末端残基的组合(参见，例如Varshavsky.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:12142-12149(1996))以使该肽的半衰期最大化，并终止于短蛋白质(如sORF1)的UTR。该肽也可以用蛋白质标签如Myc来标记。该肽还可以是核糖体合成的且翻译后修饰的肽(RiPP)的产物，由此核心肽的侧翼是包含前导肽的前原肽序列和识别序列，该识别序列发出信号以募集成熟、裂解和/或修饰酶，例如切除或环化酶，包括例如来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的羊毛硫肽(lanthipeptides)成熟酶(LanB、LanC、LanM、LanP)，来自蓝细菌的patellamide生物合成因子(PatD、PatG)，来自蝶豆(Clitoria ternatea)的蝶豆粘酶1(butelase 1)，和来自具缘盔孢伞(Galerina marginata)或双孢鹅膏(Amanita bisporigera)的POPB。
质粒2还可以编码一种或多种被概述为“死亡剂”(例如细胞毒性报道子)的物质，其由依赖于PPI整合质粒中存在的DBD的启动子驱动，例如，可以被TetR结合的TetO序列。为了确保“死亡剂”的抑制，质粒2可以包括沉默构建体，例如由强启动子(如ADH1)驱动的TetR'-Tup11融合体，以结合DBD并在多西环素的存在下使转录沉默。质粒2可包括细菌选择和繁殖标记物(即ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(即LEU2和CEN或2um)。质粒2的序列可以是：
TGCATGCCTGCAGGTCGAGATCCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAATGAAATAGGAAATCAAGGAGCATGAAGGCAAAAGACAAATATAAGGGTCGAACGAAAAATAAAGTGAAAAGTGTTGATATGATGTATTTGGCTTTGCGGCGCCGAAAAAACGAGTTTACGCAATTGCACAATCATGCTGACTCTGTGGCGGACCCGCGCTCTTGCCGGCCCGGCGATAACGCTGGGCGTGAGGCTGTGCCCGGCGGAGTTTTTTGCGCCTGCATTTTCCAAGGTTTACCCTGCGCTAAGGGGCGAGATTGGAGAAGCAATAAGAATGCCGGTTGGGGTTGCGATGATGACGACCACGACAACTGGTGTCATTATTTAAGTTGCCGAAAGAACCTGAGTGCATTTGCAACATGAGTATACTAGAAGAATGAGCCAAGACTTGCGAGACGCGAGTTTGCCGGTGGTGCGAACAATAGAGCGACCATGACCTTGAAGGTGAGACGCGCATAACCGCTAGAGTACTTTGAAGAGGAAACAGCAATAGGGTTGCTACCAGTATAAATAGACAGGTACATACAACACTGGAAATGGTTGTCTGTTTGAGTACGCTTTCAATTCATTTGGGTGTGCACTTTATTATGTTACAATATGGAAGGGAACTTTACACTTCTCCTATGCACATATATTAATCATAAGTTGAATTCGACAGGTTATCAGCAACAACACAGTCATATCCATTCTCAATTAGCTCTACCACAGTGTGTGAACCAATGTATCCAGCACCACCTGTAACCAAAACAATTTTACCTCGATCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTTAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAACAGTCAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTTAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTTAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAACAGTCAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAATTGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTCCAAGTCGAGCTCGGTACCCTATGGCATGCATGTGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGGAAAAGCTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCAGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGCAAAAATCTCATTCAGAAGAAGTGATTGTACCTGAGTTCAATTCTAGCGCAAAGGAATTACCAAGACCATTGGCCGAAAAGTGCCCGAGCGGTGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(毒素)TAATAGCATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGATACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGCGACAGCCCTCCGACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATTAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGGAAAAGCTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCAGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTCATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGTTAATNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNTAATAGACAAGCTACGTTGAAACAAGAACCCGCCTCCTTTCAGAACTCACTTACGGTACATTAGCGATGACTACGACTTCATTACTCTTTTTTTCAGAAAATTTTAATCAATATTCATTTATTCTACGAACAGTCTCCTTCACCTTAGTTTCTTTCTCTGCTCCTTTGAAACTATTATTGTATTTGGTACATTTTAGAGAAAATAAAACATATATAGAACAATGAGAAGGTACGTAATTTCTTAGCTAATTATTTGTAATCAATTAAGCGTCTTCCTTTAGCAAAGCGTCTCTCTTTTCAGCAACTCTTTGAGCTCTTCTGTCACGAGCAGCTCTGTTCTTCAATCTTCTAGCTTCAGCTTCTTCGTTCAAAGCCTTTTCACGTTGAGCATCAGCCTTAGCTTGAATAATGTGTTCAACCAAAGCTCTCTTGTGCTTGAAGGCGTTACCCTTGGATTCCTTGTACAAAACGTGGTACAAATGCTTGTCAATCTTACCAGCGTCACGGTACTTGGCCAATAATCTTCTCAAGACACGTAATCTTCTGATCCAGACGACTTGGGATGGTAAACGAGCTTCTCTAGTACCCTTTCTCTTACCGTAACCACTGTGACGACCTTCTCTCTTGGATTGAGCATGGGCTCTA
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AGCTACTAAAATATTGCGAATACCGCTTCCACAAACATTGCTCAAAAGTATCTCTTT
GCTATATATCTCTGTGCTATATCCCTATATAACCTACCCATCCACCTTTCGCTCCTTG
AACTTGCATCTAAACTCGACCTCTACATTTTTTATGTTTATCTCTAGTATTACTCTTT
AGACAAAAAAATTGTAGTAAGAACTATTCATAGAGTGAATCGAAAACAATACGAA
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AATTTTCTGACCAATGAAGAATCATCAACGCTATCACTTTCTGTTCACAAAGTATGC
GCAATCCACATCGGTATAGAATATAATCGGGGATGCCTTTATCTTGAAAAAATGCA
CCCGCAGCTTCGCTAGTAATCAGTAAACGCGGGAAGTGGAGTCAGGCTTTTTTTATG
GAAGAGAAAATAGACACCAAAGTAGCCTTCTTCTAACCTTAACGGACCTACAGTGC
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TAAGATGCTTTGTTAGAAAAATAGCGCTCTCGGGATGCATTTTTGTAGAACAAAAA
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TTTTACAAAAATGAAGCACAGATTCTTCGTTGGTAAAATAGCGCTTTCGCGTTGCAT
TTCTGTTCTGTAAAAATGCAGCTCAGATTCTTTGTTTGAAAAATTAGCGCTCTCGCGTTGCATTTTTGTTCTACAAAATGAAGCACAGATGCTTCGTTGCT(SEQ ID NO.:64)。
质粒3可用于证实报告子的表达和菌株的成功构建。质粒3可包括AD与DBD之间的直接融合。质粒3可进一步包括细菌选择和繁殖标记物(即ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(即TRP1和CEN或2um)。质粒3的序列可以是：
CGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTCTGGCAACCAAACCCATACATCGGGATTCCTATAATACCTTCGTTGGTCTCCCTAACATGTAGGTGGCGGAGGGGAGATATACAATAGAACAGATACCAGACAAGACATAATGGGCTAAACAAGACTACACCAATTACACTGCCTCATTGATGGTGGTACATAACGAACTAATACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCCATCATCATATCGAAGTTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATCTATTGAAGTAATAATAGGCGCATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCTCTCTCCCCCGTTGTTGTCTCACCATATCCGCAATGACAAAAAAATGATGGAAGACACTAAAGGAAAAAATTAACGACAAAGACAGCACCAACAGATGTCGTTGTTCCAGAGCTGATGAGGGGTATCTCGAAGCACACGAAACTTTTTCCTTCCTTCATTCACGCACACTACTCTCTAATGAGCAACGGTATACGGCCTTCCTTCCAGTTACTTGAATTTGAAATAAAAAAAAGTTTGCTGTCTTGCTATCAAGTATAAATAGACCTGCAATTATTAATCTTTTGTTTCCTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCAAGCTTTGCAAAGATGGGGTCAAAGGCCGAGCTAATCCCAGAGCCCCCTAAAAAAAAGAGAAAGGTCGAGCTGGGAACTGCGGCAGAGTACCCGTATGATGTACCGGACTATGCCGGAGGTATGTCTAGATTGGACAAGTCTAAGGTTATCAACTCTGCTTTGGAATTGTTGAACGAAGTTGGTATCGAAGGTTTGACTACTAGAAAGTTGGCTCAAAAGTTGGGTGTTGAACAACCAACTTTGTACTGGCACGTTAAGAACAAGAGAGCTTTGTTGGACGCTTTGGCTATCGAAATGTTGGACAGACACCACACTCACTTCTGTCCATTGGAAGGTGAATCTTGGCAAGACTTCTTGAGAAACAACGCTAAGTCTTTCAGATGTGCTTTGTTGTCTCACAGAGACGGTGCTAAGGTTCACTTGGGTACTAGACCAACTGAAAAGCAATACGAAACTTTGGAAAACCAATTGGCTTTCTTGTGTCAACAAGGTTTCTCTTTGGAAAACGCTTTGTACGCTTTGTCTGCTGTTGGTCACTTCACTTTGGGTTGTGTTTTGGAAGACCAAGAACACCAAGTTGCTAAGGAAGAAAGAGAAACTCCAACTACTGACTCTATGCCACCATTGTTGAGACAAGCTATCGAATTGTTCGACCACCAAGGTGCTGAACCAGCTTTCTTGTTCGGTTTGGAATTGATCATCTGTGGTTTGGAAAAGCAATTGAAGTGTGAATCTGGTTCTGGGCAACCATCTTTGAGATCTGAATACGAATACCCAGTTTTCTCTCACGTTCAAGCTGGTATGTTCTCTCCAGAATTGAGAACTTTCACTAAGGGTGACGCTGAAAG
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用于鉴别破坏PPI的肽的宿主细胞可以是接合型或二倍体的酿酒酵母，并且包括由质粒1使用的DBD(如TetO)识别序列驱动的遗传报告子(如ADE2、HIS3和/或URA3)的基因组整合。用于鉴别破坏PPI的肽的宿主细胞也可以是如本文先前所述的另一种宿主细胞，如细菌细胞(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)或哺乳动物细胞(例如无限增殖化的原代细胞或无限增殖化的细胞系)。该宿主细胞还可以表达肽的环化和甲基化所必需的酶(例如来自乳酸乳球菌的羊毛硫肽(lanthipeptides)成熟酶(LanB、LanC、LanM、LanP)，来自蓝细菌的patellamide生物合成因子(PatD、PatG)，来自蝶豆的蝶豆粘酶1，或来自具缘盔孢伞或双孢鹅膏的POPB)。肽的环化所必需的示例性POP也可包含以下表2中列出的任何序列。
Figure BDA0004110047230000461
Figure BDA0004110047230000471
在本公开范围内设想了包含质粒1、质粒2、质粒3、与质粒1-3相容的可转染宿主细胞或其任何组合的试剂盒。在一些实施方案中，提供已转染到宿主细胞内的质粒1或2。在一些实施方案中，根据本公开的试剂盒包括与用质粒1-3转染的宿主细胞一起使用的可选择试剂。在一些实施方案中，提供了质粒1的变体文库，其中表示了超过一对Y2H相互作用物。例如，这样的文库可用于针对被限定的物质抑制的蛋白质-蛋白质相互作用进行筛查。在一些实施方案中，提供了质粒1的变体文库，其中表示了用于筛选的多种不同的短测试多肽序列。可以通过任何方法(如NNK或NNN核苷酸随机化)随机产生多个不同的短肽序列。还可以通过针对与靶标的结合进行选择的先前实验，或从已经报道了合理设计的肽文库的科学文献中的现有数据集，预先选择多个不同的短肽序列。
质粒1、2和3可以按各种排列使用。在第一个示例中，将质粒1整合到宿主细胞的基因组中(如使用质粒3所确认的)之后可以使用例如NNK或NNN密码子用随机编码的肽转化质粒2的文库。
在该第一个示例中，为了进行筛选以鉴别可以破坏PPI的肽，可以在选择培养基中繁殖宿主细胞1，以确保质粒1的存在和发生可靠的PPI(例如在用于酵母的缺乏Trp的培养基上，或在用于人或细菌细胞的含有抗生素的培养基中)。然后可以用质粒2转化该宿主细胞，并立即转移到选择培养基中，以确保所有组分都存在(即在用于酵母的缺乏Trp和Leu的培养基上，或用于细菌或哺乳动物细胞的抗生素)，并诱导任何可诱导组分的表达(例如用Gal、多西环素等)。
在第二个示例中，可以使用质粒作为利用酵母接合型系统的“即插即用平台”(图12)，其中可以通过细胞融合，或在细胞融合后进行减数分裂而不是转染，将2种或更多种质粒(或其中的遗传元件)引入相同的细胞中。该细胞融合涉及携带不同遗传元件的两种不同的酵母宿主细胞。在该方法中，酵母宿主细胞1可以是MATa或MATalpha之一，并包括质粒1的整合。该菌株可以在阳性选择培养基上繁殖，以确保存在可靠的PPI。同样在该方法中，酵母宿主细胞2为相反的接合型。该菌株携带(或已整合)随机化的肽文库和“死亡剂”(例如细胞毒性报告子)质粒(质粒2)。酵母宿主细胞2可以通过大批量高效转化方案产生，该方案确保细胞培养中高度多样化的文库变化。然后可以冷冻该文库批次的等分试样，以保持一致性。
在该第二个示例中，将菌株分批接合，以产生携带所有标记物即PPI、“死亡剂”和肽的二倍体菌株。然后该批次培养物可以在固体培养基上繁殖，该培养基能够选择所有系统组分(即缺少Leu和Trp的培养基)，并诱导任何可诱导组分的表达(即用Gal)。
在带有Y2H和文库/细胞毒性构建体(通过转染或接合引入细胞中)的宿主细胞上进行的有限稀释实验后存活的菌落构成具有PPI的菌落，该PPI已被肽破坏，并且不再触发由编码的“死亡剂”(例如细胞毒性报告子)引发的死亡级联。肽序列可通过在每个存活的菌落中对质粒2的肽编码区进行DNA测序而获得。
为了确保存活是由于PPI的抑制，而不是随机机会或有缺陷的基因表达，可使用可诱导标记物使PPI或肽的产生失活，并确认特异性。例如，仅在含半乳糖的培养基上观察到细胞存活，其中所有组分均表达，而当肽的表达丧失时，在无半乳糖的培养基上无存活。
质粒还可以被分离并重新转化到新的宿主细胞中以确认特异性。对含有PPI、肽和“死亡剂”的活宿主细胞进行生化分级分离，然后进行下拉实验，可以确认肽序列与使用编码的标签(例如Myc-标签、HA-标签、His-标签)的任一PPI配偶体之间的相互作用。
一旦对足够的存活宿主细胞菌落进行测序，就会出现高度保守的序列模式，并且可以很容易地使用多序列比对进行鉴别。任何此类模式都可用于“锚定”文库肽插入序列中的残基，并置换可变残基，以产生多样性并实现更紧密的结合。这也可以使用为模式识别和文库设计而开发的算法来实现。汇集后，通过测序确定的破坏肽模式可用于定义必需且充分的肽破坏物序列。汇集被定义为相对于倒数第二次迭代，在最后一次迭代中缺少任何新序列的检索。
化合物
本文公开了非天然存在的化合物，其可以结合RAD51的蛋白质界面，并在体外或细胞中抑制RAD51的功能。该蛋白质界面可以是RAD51的ATP酶结构域的亚区域。该蛋白质界面可以是RAD51上RAD51AP1的结合位点。该蛋白质界面可以是人RAD51的氨基酸残基190-218。图22中呈现了蛋白质界面的示例性模型，其中根据本发明的非天然存在的化合物可以结合在RAD51上，其中化合物与以黑色突出显示的残基相互作用。灰色显示BRCA2与RAD51的结合。
在体外，本文公开的化合物可以抑制RAD51多聚化，RAD51与另一种已知的RAD51相互作用配偶体(例如BRCA2或RAD51AP1)的相互作用，或RAD51螯合/结合Ca2+离子。与另一种已知的RAD51相互作用配偶体的相互作用的抑制可能是竞争性的或变构的。RAD51多聚化、RAD51与另一种已知的RAD51相互作用配偶体(例如BRCA2或RAD51AP1)的相互作用或RAD51螯合/结合Ca2+离子的抑制可伴随RAD51 ATP酶活性的抑制。RAD51多聚化、RAD51与另一种已知的RAD51相互作用配偶体(例如BRCA2或RAD51AP1)的相互作用或RAD51螯合/结合Ca2+离子的抑制可能不会抑制RAD51 ATP酶活性。
在细胞中，本文公开的化合物可以抑制RAD51丝在DNA上的装配。在细胞中，本文公开的化合物可以抑制DNA损伤修复。在细胞中，本文公开的化合物可以抑制细胞同源重组。在细胞中，本文公开的化合物可导致对癌细胞的基因毒性化疗剂的致敏。在细胞中，本文公开的化合物可通过抑制DNA损伤修复或通过增加细胞内游离钙浓度而诱导细胞应激来降低对化疗剂的抗药性。在依赖于RAD51过表达的细胞中，本文公开的化合物可导致细胞死亡。在细胞中，本文公开的化合物可能在细胞条件下导致死亡，这取决于RAD51过表达。在一些实施方案中，细胞可以是癌细胞或具有遗传性良性增生病症(例如Cowden综合征)的患者的细胞。此外，为了诱导细胞死亡，本文公开的任何化合物都可以与例如免疫肿瘤剂或PARP抑制剂或其他化疗剂联合使用。
本文公开的化合物可在治疗如下病症或病况的方法中使用，在该病症或病况中因下调同源重组而导致细胞生长抑制，或者存在参与DNA损伤修复途径的蛋白质的过表达。本文公开的化合物可在治疗与异常RAD51活性相关的病症或病况的方法中使用。
本发明化合物可靶向的RAD51界面对于控制BRCA1/2同源重组DNA修复途径的活性可能是重要的。用本文公开的化合物阻断对于控制BRCA1/2同源重组DNA修复途径的活性至关重要的该界面可对数种治疗适应症具有临床意义。
本文公开的化合物可作为单一疗法用于治疗例如肝内胆管癌(ICC)、转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)和其他显示出RAD51/BRCA2 DNA损伤修复途径效应物上调的癌症。
ICC细胞的存活可依赖于BRCA2途径，并导致受试者无法医治。通过RAD51破坏化合物对同源重组途径的灭活可导致细胞死亡。这种细胞死亡对依赖于BRCA2途径的细胞如ICC细胞可能是选择性的。这种选择性的一个例子如图2所示，其中HeLa细胞(宫颈癌细胞)和SSP-25细胞(ICC来源的细胞)都用化合物1和5处理，在化合物处理后，与SSP-25细胞相比，在HeLa细胞中几乎没有发生细胞死亡。
在过表达BRCA2途径的去势抗性前列腺癌中，通过抑制本文公开的RAD51破坏化合物使BRCA2失活可导致细胞死亡。几种癌症表现出同源重组途径的上调，特别是RAD51和BRCA2，这可使癌细胞对基因毒性化疗产生抗性。自发过表达RAD51/BRCA2途径组分的癌症包括例如肝细胞癌、急性髓样白血病(AML)、侵袭性套细胞淋巴瘤、卵巢癌和伊马替尼抗性BCR/ABL癌症。
本文公开的化合物的作用机理可以涉及，例如，以急性方式去除由RAD51聚合物配位的一对钙离子，从而导致细胞内游离钙浓度急性增加。细胞内游离钙浓度的增加可导致细胞死亡。这种细胞死亡机制可能发生在过表达RAD51蛋白的细胞中，并且其细胞死亡可能比没有RAD51过表达的细胞高几个数量级。与本文公开的化合物接触的过表达RAD51蛋白的细胞中的细胞死亡可以是与本文公开的化合物接触的未过表达RAD51的细胞中的至少3倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。RAD51丝将钙离子螯合至例如微摩尔水平，以及随后在化合物结合时将钙离子池急剧释放到细胞溶胶中，可导致癌症的细胞死亡，这依赖于RAD51/BRCA2途径，如ICC和mCRPC，这种螯合/释放机制的证据可见图24和图25，其中细胞内钙螯合剂BAPTA-AM和钌红能够抵消化合物10的细胞死亡诱导作用，提示化合物10的细胞死亡机制涉及Ca2+离子的释放。这种细胞死亡可以在几分钟内急性发生，并且可以与p53和细胞周期无关。在图13和图14中可以看到这种快速细胞死亡的例子，其中化合物的施用(箭头)导致快速细胞死亡(细胞指数降低)。
本文公开的化合物在细胞死亡中的作用机制可涉及通过RAD51的重组途径失活，以及细胞游离钙浓度的增加。该化合物在细胞死亡中的作用机制可涉及细胞游离钙浓度的增加，而不通过RAD51抑制重组途径。该化合物在细胞死亡中的作用机制可涉及RAD51 ATP酶活性的抑制，以及细胞游离钙浓度的增加。该化合物在细胞死亡中的作用机制可涉及细胞游离钙浓度的增加而不抑制RAD51 ATP酶活性。
所述化合物还可用于治疗罕见病和孤儿疾病，包括例如布卢姆综合征、范科尼贫血、维尔纳综合征和Nijmegen断裂综合征，它们可显示出患者细胞中同源重组的增加。通过向个体细胞施用本文公开的RAD51破坏化合物来下调重组可逆转细胞的DNA损伤超敏反应。通过将本文公开的RAD51破坏化合物与细胞接触来下调重组可逆转细胞的DNA损伤超敏反应。在图6中可以看到这种现象的一个例子，其中化合物5能够挽救布卢姆细胞系(GM08505)对基因毒性应激(依托泊苷)的超敏反应。
所述化合物还可以与包括例如免疫肿瘤剂、PARP抑制剂和规范化疗剂在内的其他治疗剂联合使用。例如，对抗PD1治疗有反应的转移性黑素瘤患者可以高度富集患者肿瘤内BRCA2基因的体细胞突变。该相关性可以表明BRCA2途径的失活使细胞对抗PD1免疫疗法敏感。该抗PD1剂可以是例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或pidilizumab。本文所述化合物与靶向BRCA途径的其他治疗剂的协同作用的实例可见图26，其中化合物10与奥拉帕利(一种PARP抑制剂)的共同给药相对于任一种的单独给药会导致增强的细胞死亡。
PARP抑制剂可以对BRCA1和BRCA2突变的乳腺癌、卵巢癌和其他癌症表现出有效的和选择性活性。RAD51破坏化合物的使用可以模拟BRCA2突变的效果，并可能使PARP抑制剂可治疗更多的癌症。该PARP抑制剂可以是，例如，奥拉帕利、维利帕尼、尼拉帕利、他唑来巴(talazoparib)、卢卡帕尼(rucaparib)和CEP-9722。
本文公开的化合物可以与其他化疗剂联合使用。该化疗剂可包括，例如，抗PD1剂，派姆单抗、美法仑、多柔比星、阿霉素、依托泊苷、喜树碱、丝裂霉素C、顺铂、奥沙利铂、卡铂或吉西他滨。
所述化合物可以是，例如，小分子、生物制剂、抗体、拟肽或肽。该化合物可以是肽。
本文公开的化合物可带有细胞穿透实体(CPP)或蛋白质转导结构域(PTD)，以促进进入靶细胞。蛋白质转导可以指肽、蛋白质和其他分子穿过细胞质膜向细胞中的递送。该化合物可包括至少一个细胞穿透肽(CPP)信号序列。CPP的实例包括HIV-TAT(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO.:13)、R8(RRRRRRRR；SEQ ID NO.:14)、MAP(KLALKLALKALKAALKLA；SEQ ID NO.:15)、transportan(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL；SEQ ID NO.:16)、pegelin(RGGRLSYSRRRFSTSTGR；SEQ ID NO.:17)、penetrin(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO.:18)、cFΦR4(环七肽环(FΦRrRrK)，其中Φ是通过赖氨酸的ε氨基与肽序列中末端甘氨酸的羧基之间的异肽键连接的l-2-萘基丙氨酸，参见Qian等人，Biochemistry.2014年6月24日；53(24):4034-46)，及其衍生物或组合。根据本发明的各种化合物与各种细胞穿透肽的比较可见图18，其中用各种不同的细胞穿透肽测试类似的序列，并证明对SSP25细胞具有相似的细胞活性。
本文提到的任何肽化合物均可被N-末端(例如α-胺)乙酰化、C-末端酰胺化或骨架N-甲基化。本文提到的任何化合物都可以被修饰为包括通过6碳链与赖氨酸残基的ε氨基连接的5FAM(荧光素亚酰胺)标记。图17中可见根据本发明的化合物的实例，其包括各种氨基酸化学修饰并对SSP25细胞显示出活性。
本文公开的肽还可以通过转化为拟肽实体来稳定化。拟肽可以是包含通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。这类稳定化方法可包括，例如，环化成大环化合物、内酰胺酯化、骨架残基的N-甲基化、烃钉合及其组合。
本文公开的肽可通过转化为“逆反转(retro-inverso)”实体来稳定化或修饰。逆反转肽是线性肽，其氨基酸序列倒转，并且氨基酸亚单位的α-碳中心手性也被反转。已知当原始肽是(L)-肽时，这样的修饰增加肽的稳定性。
本发明化合物可具有例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的化合物不是抗体。在一些实施方案中，本发明的化合物是抗体，或其功能性结合片段/衍生物(例如Fab片段或ScFv)。本发明的化合物可含有RAD51相互作用基序，其具有以下共有序列：R-L-G-L/M/V-S-R-R/L/K-R/F/V(SEQ ID NO.:19)。
本发明的化合物可包含根据以下表3中的任一通式的序列，或其反向序列：
Figure BDA0004110047230000541
式I、II、III或IV包含的任何多肽可包括一个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个非天然存在的氨基酸或(D)-氨基酸。在一些实施方案中，整个肽由D-氨基酸或非天然存在的氨基酸组成。
因此，在一些实施方案中，本公开内容设想包含式I、II、III或IV的化合物，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
本发明的化合物可包含根据以下表4中任一SEQ ID的氨基酸序列：
Figure BDA0004110047230000551
SEQ ID NO:1-11或66-69中的任一个可包括一个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个非天然存在的氨基酸或(D)-氨基酸。在一些实施方案中，表4中描述的完整肽由(D)-氨基酸或非天然存在的氨基酸组成。
本公开内容的示例性化合物在以下表5中提供：
Figure BDA0004110047230000552
Figure BDA0004110047230000561
本文公开的化合物还可包括，例如，带有点突变的非结合阴性对照肽。阴性对照肽不会破坏RAD51与BRCA2之间的相互作用，并可以用作实验对照。
本文公开的化合物可以通过例如竞争性或变构抑制来抑制蛋白质-蛋白质相互作用。本文的化合物可以结合例如与DNA损伤修复途径相关的细胞靶标。这种结合可导致突变基因在DNA损伤修复途径中的有害作用降低。
本文公开的化合物可以靶向RAD51与BRCA2或RAD51AP1之间的相互作用。该化合物可以抑制RAD51与RAD51AP1之间的相互作用。
所述化合物可以在带有抗性突变的细胞系上进行测试，将其编程为对药物或凋亡具有抗性，或者具有对DNA损伤修复途径特异的突变。可以用本文公开的方法测试的细胞系包括，例如，HEK-293T、H1299、HCT-116、MCF-7、U2OS、U251、U87、T98G、人GBM、A549 NSCLC、H1993、H2073、MES-SA、MES-SA/Dx5、HT1080、HeLa、Saos-2、IMR90、SSP-25、PC3、LnCAP、Calu3、NciH1975、MDA_MB_231、A375和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。该测试的一个实例可见图20，其中化合物10在一组细胞系上进行测试，并显示出10-7至10-5范围内的IC50，提示多种癌细胞可能对本文公开的化合物引起的RAD51扰动敏感。
本文公开的化合物可以结合人RAD51的亚区。人RAD51可以包含以下序列：
MAMQMQLEANADTSVEEESFGPQPISRLEQCGINANDVKKLEEAGFHTVEAVAYAPKKELINIKGISEAKADKILAEAAKLVPMGFTTATEFHQRRSEIIQITTGSKELDKLLQGGIETGSITEMFGEFRTGKTQICHTLAVTCQLPIDRGGGEGKAMYIDTEGTFRPERLLAVAERYGLSGSDVLDNVAYARAFNTDHQTQLLYQASAMMVESRYALLIVDSATALYRTDYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFGVAVVITNQVVAQVDGAAMFAADPKKPIGGNIIAHASTTRLYLRKGRGETRICKIYDSPCLPEAEAMFAINADGVGDAKD(SEQ ID NO.:82)。
本文公开的化合物还可以与同人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)至少80％或至少90％相同的序列的亚区相互作用。本文公开的化合物可与RAD51上RAD51AP1的结合位点结合。本文公开的化合物可以结合在人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的亚区内，其中该亚区是人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的氨基酸190-339。本文公开的化合物可以与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的亚区相互作用，其中该亚区是人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的氨基酸190-218。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基202、205和206中的至少一个相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基202、205和206中的至少两个相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的所有三个残基202、205和206相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基187相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基187、202、205和206中的至少一个相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基187、202、205和206中的至少两个相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的残基187、202、205和206中的至少三个相互作用。本文公开的化合物可与人RAD51(例如SEQ ID NO.:82)的所有四个残基187、202、205和206相互作用。这些残基的说明可见图23，其中序列比对基于它们结合或不结合根据本发明的示例性肽(SEQ ID NO.:5)的能力进行聚类，并且残基187、202、205和206的突变与结合能力相关。
氨基酸
本文所述的任何化合物可包括亲水性氨基酸、疏水性氨基酸、带电荷的氨基酸、不带电荷的氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸、人工氨基酸、加帽氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸，以及氨基酸类似物、同源物和同系物。
本文的肽和多肽可包括一种或多种D-氨基酸或非天然存在的氨基酸或所有D-氨基酸或非天然存在的氨基酸。本文的肽和多肽可以是反向的，并且包括一种或多种D-氨基酸或非天然存在的氨基酸，或所有D-氨基酸或非天然存在的氨基酸。
本文的氨基酸可以用其单字母或三字母缩写来指定。IUPAC指定如下：
缩写 氨基酸名称
---------------------------
Ala A 丙氨酸
Arg R 精氨酸
Asn N 天冬酰胺
Asp D 天冬氨酸
Cys C 半胱氨酸
Gln Q 谷氨酰胺
Glu E 谷氨酸
Gly G 甘氨酸
His H 组氨酸
Ile I 异亮氨酸
Leu L 亮氨酸
Lys K 赖氨酸
Met M 甲硫氨酸
Phe F 苯丙氨酸
Pro P 脯氨酸
Ser S 丝氨酸
Thr T 苏氨酸
Trp W 色氨酸
Tyr Y 酪氨酸
Val V 缬氨酸
Asx B 天冬氨酸或天冬酰胺
Glx Z 谷氨酰胺或谷氨酸。
在本文所述化合物中使用的非天然氨基酸可以是，例如，化学制备或通过tRNA合成酶技术表达的氨基酸。可在本文所述化合物中使用的非手性氨基酸的非限制性实例是甘氨酸(G，Gly)。可在本文所述化合物中使用的L-对映体和D-对映体氨基酸的非限制性实例是：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；和缬氨酸(V，Val)。在一些实施方案中，氨基酸的保守或非保守置换可能是本文所述的任何化合物的置换。
本文所述的任何化合物都可通过保守氨基酸置换来修饰。保守氨基酸置换涉及将氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表可从各种参考文献获得(参见，例如，Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月))。以下八组各自包含相互保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(1)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
非天然氨基酸可以置换任何本文所述化合物中的天然/规范氨基酸，特别是当非天然氨基酸具有相似的化学性质(例如疏水性、亲水性)时。非天然氨基酸是指不属于20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)之一或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸；可以与术语“非天然氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然编码的氨基酸”、“非天然的氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”及其各种带有连字符和不带连字符的形式。术语“非天然氨基酸”包括但不限于通过修饰天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在的，但本身不通过翻译复合物而引入增长的多肽链中的氨基酸。非天然编码的天然存在的氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
非天然氨基酸包括氨基酸类似物。氨基酸类似物是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的中心碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
肽合成
如本文所述的化合物可以是合成肽。合成肽按照标准固相肽合成方案合成。通过RP-HPLC、MS/MS和肽含量分析对肽的身份和纯度进行证实和确定。为无毒盐形式(例如乙酸盐或HCl)更换三氟乙酸(TFA)，并且在实验中使用前肽的纯度至少为95％。
药学上可接受的盐
本发明提供了本文公开的任何治疗化合物的药学上可接受的盐的用途。药学上可接受的盐包括，例如，酸加成盐和碱加成盐。加入到化合物中形成酸加成盐的酸可以是有机酸或无机酸。加入到化合物中形成碱加成盐的碱可以是有机碱或无机碱。在一些实施方案中，药学上可接受的盐是金属盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐是铵盐。
金属盐可以通过向本发明化合物中加入无机碱而产生。无机碱由与诸如氢氧根、碳酸根、碳酸氢根或磷酸根等基本反离子配对的金属阳离子组成。该金属可以是碱金属、碱土金属、过渡金属或主族金属。在一些实施方案中，该金属是锂、钠、钾、铯、铈、镁、锰、铁、钙、锶、钴、钛、铝、铜、镉或锌。
在一些实施方案中，金属盐是锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、铈盐、镁盐、锰盐、铁盐、钙盐、锶盐、钴盐、钛盐、铝盐、铜盐、镉盐或锌盐。
铵盐可以通过向本发明化合物中加入氨或有机胺而产生。在一些实施方案中，该有机胺是三乙胺、二异丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、吗啉、N-甲基吗啉、哌啶、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、二苄胺、哌嗪、吡啶、吡唑、哌唑、咪唑、吡嗪或哌嗪。
在一些实施方案中，铵盐是三乙胺盐、二异丙胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、吗啉盐、N-甲基吗啉盐、哌啶盐、N-甲基哌啶盐、N-乙基哌啶盐、二苄胺盐、哌嗪盐、吡啶盐、吡唑盐、哌唑唑盐、咪唑盐、吡嗪盐或哌嗪盐。
酸加成盐可以通过向本发明化合物中加入酸而产生。在一些实施方案中，该酸是有机酸。在一些实施方案中，该酸是无机酸。在一些实施方案中，该酸是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、亚硝酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、龙胆酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸(glucaronic acid)、葡糖二酸(saccaric acid)、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、泛酸、乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、草酸或马来酸。
在一些实施方案中，所述盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、龙胆酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、葡糖二酸盐(saccarate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、泛酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐或马来酸盐。
化合物的纯度
本文的任何化合物都可以被纯化。本文的化合物可以是至少1％纯、至少2％纯、至少3％纯、至少4％纯、至少5％纯、至少6％纯、至少7％纯、至少8％纯、至少9％纯、至少10％纯、至少11％纯、至少12％纯、至少13％纯、至少14％纯、至少15％纯、至少16％纯、至少17％纯、至少18％纯、至少19％纯、至少20％纯、至少21％纯、至少22％纯、至少23％纯、至少24％纯、至少25％纯、至少26％纯、至少27％纯、至少28％纯、至少29％纯、至少30％纯、至少31％纯、至少32％纯、至少33％纯、至少34％纯、至少35％纯、至少36％纯、至少37％纯、至少38％纯、至少39％纯、至少40％纯、至少41％纯、至少42％纯、至少43％纯、至少44％纯、至少45％纯、至少46％纯、至少47％纯、至少48％纯、至少49％纯、至少50％纯、至少51％纯、至少52％纯、至少53％纯、至少54％纯、至少55％纯、至少56％纯、至少57％纯、至少58％纯、至少59％纯、至少60％纯、至少61％纯、至少62％纯、至少63％纯、至少64％纯、至少65％纯、至少66％纯、至少67％纯、至少68％纯、至少69％纯、至少70％纯、至少71％纯、至少72％纯、至少73％纯、至少74％纯、至少75％纯、至少76％纯、至少77％纯、至少78％纯、至少79％纯、至少80％纯、至少81％纯、至少82％纯、至少83％纯、至少84％纯、至少85％纯、至少86％纯、至少87％纯、至少88％纯、至少89％纯、至少90％纯、至少91％纯、至少92％纯、至少93％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、至少99.1％纯、至少99.2％纯、至少99.3％纯、至少99.4％纯、至少99.5％纯、至少99.6％纯、至少99.7％纯、至少99.8％纯或至少99.9％纯。
在一些实施方案中，本发明的化合物可局部施用于受试者的皮肤或体腔，例如口腔、阴道、膀胱、颅腔、脊柱、胸腔或盆腔。在一些实施方案中，本发明的化合物可以施用于可及的体腔。
本文公开的化合物可以增加细胞死亡或抑制细胞中的细胞生长，例如，与没有暴露于该化合物的细胞相比，增加或抑制约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍、约100倍、约110倍、约120倍、约130倍、约140倍、约150倍、约160倍、约170倍、约180倍、约190倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、约500倍、约550倍、约600倍、约650倍、约700倍、约750倍、约800倍、约850倍、约900倍、约950倍、约1000倍、约1500倍或约2000倍。
本文公开的化合物可以使细胞中的游离钙浓度增加例如约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。本文公开的化合物可以使细胞中的游离钙浓度增加例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍或至少约20倍。
本文公开的化合物可显示出例如约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM、约3.5nM、约4nM、约4.5nM、约5nM、约5.5nM、约6nM、约6.5nM、约7nM、约7.5nM、约8nM、约8.5nM、约9nM、约9.5nM、约10nM、约15nM、约20nM、约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约200nM、约250nM、约300nM、约350nM、约400nM、约450nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约45μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、约100μM、约150μM、约200μM、约300μM、约400μM、约500μM、约600μM、约700μM、约800μM、约900μM或约1mM的GI50值。
本文公开的化合物可用于治疗受试者的癌症。本文公开的化合物可以，例如，减缓癌细胞的增殖或杀死癌细胞。可以用本发明化合物治疗的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌如非小细胞和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨的恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性不明原发灶鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、merkel细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、不明原发部位癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
图19和图20提供了显示根据本发明的化合物的提示性癌症相关适应症和给药方法的数据。图19显示使用A549(非小细胞肺癌来源的细胞系)的异种移植模型中化合物10的活性，其中化合物10仅在治疗几天后对肿瘤体积表现出显著影响。图20显示化合物10对来源于上述癌症适应症的各种无限增殖化细胞系的活性，提示与10相关的化合物对各种癌症适应症的功效。
胆管癌是一种罕见的癌症，其发病率为每100,000人约1-2例，其特征在于源自胆管的上皮细胞突变。胆管癌可被表征为肝内、肝门周围或远端胆管癌。肝内胆管癌是胆管癌的一种形式，其发生在肝脏的胆管内。胆管癌可导致胆管阻塞和胆红素的积累。胆管癌的主要症状包括，例如，肝功能检验异常、腹部不适、黄疸、体重减轻、瘙痒、发热、食欲不振以及粪便或尿液颜色改变。
胆管癌的风险因素包括，例如，慢性炎症或胆管功能障碍。胆管功能障碍可表现为，例如，原发性硬化性胆管炎、胆管结石、胆总管囊肿、肝吸虫感染、多囊肝病、Caroli综合征、肝硬化、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。BRCA1/BRCA2的突变也可引起胆管癌。肝吸虫是亚洲国家在生鱼或未煮熟的鱼中常见的寄生虫。胆管癌的其他风险因素包括，例如，炎性肠病、年龄、肥胖、暴露于二氧化钍、糖尿病、吸烟、胰腺炎、HIV感染、石棉暴露或氡暴露。
胆管癌的治疗可包括，例如，治愈性手术、姑息性手术、腹腔镜手术、外束放疗、三维适形放疗、强度调制的放疗、立体定向全身放疗、近距离放疗、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、顺铂、卡培他滨或奥沙利铂。
在转移性去势抗性前列腺癌(CRPC)中，尽管雄激素水平丧失，但雄激素受体(AR)仍保持活性，并推动癌症进展。早期前列腺癌的主要症状包括，例如，排尿困难、排尿疼痛、尿频、血尿或骨盆疼痛。前列腺癌经常转移到骨骼和淋巴结。
激素依赖性前列腺癌在经过一至三年的治疗后，会对治疗产生抗性。CRPC的治疗包括，例如，抗有丝分裂化疗剂、多西他赛、卡巴他赛、贝伐珠单抗、沙利度胺、泼尼松、西普鲁塞(sipuleucel-T)、阿比特龙、恩杂鲁胺或其任何组合。
当胰腺细胞开始失控繁殖，并形成可以转移至身体其他部位的肿块时，就会出现胰腺癌。胰腺癌的主要症状包括，例如，上腹痛、背痛、黄疸、食欲不振、体重减轻和血栓。外分泌癌可以是，例如，胰腺腺癌、腺泡细胞癌、囊腺癌、胰腺母细胞瘤、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶体癌和胰腺粘液性囊性肿瘤。胰腺神经内分泌肿瘤(PanNET)可能出现在胰腺的其他部位。
胰腺癌的治疗可包括，例如，手术切除胰腺或胰腺的受影响区域、化疗、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、厄洛替尼、nab-紫杉醇、叶酸、伊立替康、奥沙利铂、FOLFIRINOX方案、奥曲肽、兰瑞肽、依维莫司、舒尼替尼、放疗或其任何组合。
小细胞癌发生于肺中，并且可能是高度恶性的。小细胞癌是一种神经内分泌癌，其可表现出侵袭性行为，生长迅速，早期扩散到远处部位，对化疗和放射敏感，常伴有明显的副肿瘤综合征，包括，例如，高钙血症、Eaton-lambert综合征或利尿激素不当综合征。小细胞癌的症状可包括，例如，咳嗽、呼吸困难、体重减轻和虚弱。小细胞癌的治疗可包括，例如，环磷酰胺、顺铂、多柔比星、依托泊苷、长春新碱、紫杉醇、放疗或其任何组合。
本文公开的化合物可用于治疗受试者的布卢姆综合征。布卢姆综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，由BLM基因突变引起，该基因编码DNA解旋酶。布卢姆综合征患者的细胞表现出显著的染色体不稳定性，导致对紫外线照射的敏感性增加，并且患癌症的风险较高。布卢姆综合征的特征包括，例如，异常小的身材、稀疏的脂肪组织、高亢的声音、长而窄的脸、突出的鼻子、突出的耳朵、阳光敏感、暴露在阳光下时的皮疹、色素沉着不足、色素沉着过多、女性生育能力降低、男性不育、糖尿病风险增加、慢性阻塞性肺病、轻度免疫系统异常和预期寿命缩短。
受试者可以是，例如，老年人、成人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿和非人类动物。在一些实施方案中，受试者是患者。
药物组合物
本文公开的药物组合物可以在例如用另一种药剂治疗受试者之前、期间或之后使用。
本文公开的药物组合物可以是本文公开的任何药物化合物与诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂等其他化学组分的组合。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。药物组合物可以通过各种形式和途径以治疗有效量作为药物组合物施用，该途径包括，例如，静脉内、皮下、肌肉内、口服、肠胃外、经眼、皮下、透皮、经鼻、阴道和局部给药。
药物组合物可以以局部方式施用，例如，通过将化合物直接注射到器官中，任选地以贮库或持续释放制剂或植入物的形式。药物组合物可以以快速释放制剂的形式、以延长释放制剂的形式或以中间释放制剂的形式提供。快速释放形式可以提供立即释放。延长释放制剂可提供控制释放或持续延迟释放。
对于口服给药，可以通过将活性化合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合来配制药物组合物。这类载体可用于配制液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液或悬浮液，以供受试者口服摄取。口服可溶解制剂中使用的溶剂的非限制性示例可包括水、乙醇、异丙醇、盐水、生理盐水、DMSO、二甲基甲酰胺、磷酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液(MOPS)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)缓冲液(PIPES)和盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)。口服可溶解制剂中使用的共溶剂的非限制性示例可包括蔗糖、尿素、cremaphor、DMSO和磷酸钾缓冲液。
可配制药物制剂用于静脉内施用。该药物组合物可以是作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液适合于肠胃外注射的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。活性化合物的悬浮液可以制备成油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。该悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。或者，活性成分可以是粉末形式，以供在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)重建。
活性化合物可以局部施用，并且可以配制成多种可局部施用的组合物，如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药棒、香脂、乳膏和软膏。此类药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
所述化合物还可以配制成直肠组合物，如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂、栓剂、胶冻栓剂或保留灌肠剂，其含有常规栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯，以及合成聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮和PEG。在栓剂形式的组合物中，低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯的混合物，任选地与可可脂组合，可以被熔化。
在实施本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文公开的化合物以药物组合物的形式施用于患有待治疗的疾病或病况的受试者。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物，如人类。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力以及其他因素而存在很大差异。该化合物可单独使用，或作为混合物的组分与一种或多种治疗剂联合使用。
药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体配制，该载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。制剂可以根据所选择的给药途径修改。例如，包含本文公开的化合物的药物组合物可以通过混合、溶解、乳化、包封、包埋或压缩工艺来制备。
药物组合物可包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及作为游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述化合物。药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
制备包含本文公开的化合物的组合物的方法包括将该化合物与一种或多种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体配制成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括，例如，粉末、片剂、可分散的颗粒、胶囊和扁囊剂。液体组合物包括，例如，溶解有化合物的溶液，包含化合物的乳液，或包含含有本文公开的化合物的脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括，例如，凝胶、悬浮液和乳膏。该组合物可以是液体溶液或悬浮液，适合于在使用前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳液。这些组合物还可含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其他药学上可接受的添加剂。
适用于本发明的剂型的非限制性示例包括液体、粉末、凝胶、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、水性或油性悬浮液、乳液及其任何组合。
适用于本发明的药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括粘合剂、崩解剂、抗粘附剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、滚圆剂及其任何组合。
组合物可以是，例如，立即释放形式或控制释放制剂。可以配制立即释放制剂，以使化合物迅速起作用。立即释放制剂的非限制性示例包括易溶解的制剂。控制释放制剂可以是这样的药物制剂，其经过调整，使得活性剂的释放速率和释放曲线可以与生理和时间治疗要求相匹配，或者，已经配制成以编程速率实现活性剂的释放。控制释放制剂的非限制性示例包括颗粒、延迟释放颗粒、水凝胶(例如，合成或天然来源的)、其他胶凝剂(例如，形成凝胶的膳食纤维)、基于基质的制剂(例如，包含其中分散有至少一种活性成分的聚合材料的制剂)、基质内的颗粒、聚合物混合物和颗粒状物质。
在一些实施方案中，控制释放制剂是延迟释放形式。可以配制延迟释放形式以延迟化合物的作用持续延长的一段时间。可以配制延迟释放形式以延迟有效剂量的一种或多种化合物的释放，例如，约4小时、约8小时、约12小时、约16小时或约24小时。
控制释放制剂可以是持续释放形式。可以配制持续释放形式以维持，例如，化合物在延长的一段时间内的作用。可配制持续释放形式以在约4小时、约8小时、约12小时、约16小时或约24小时内提供有效剂量的本文公开的任何化合物(例如，提供生理学上有效的血液分布)。
药学上可接受的赋形剂的非限制性示例可见于，例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第17版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，其全部内容通过引用并入本文。
多种治疗剂可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，本发明化合物与抗生素联合、在其之前或之后施用。如果同时，则多种治疗剂可以以单一、统一的形式，或以多种形式提供，例如，作为多个单独的丸剂。药剂可以一起或分开包装在单个包装或多个包装中。一种或所有治疗剂可以分多剂量给予。如果不同时进行，则多剂量之间的时间可以变化到至多约一个月。
本文公开的治疗剂可以在疾病或病况发生之前、期间或之后施用，并且施用含有治疗剂的组合物的时间可以变化。例如，该组合物可以用作预防剂，并且可以对具有病况或疾病倾向的受试者连续施用，以减少发生该疾病或病况的可能性。该组合物可以在症状发作期间或在症状发作后尽快施用于受试者。治疗剂的施用可以在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内或在症状发作的3小时内开始。初始施用可以通过任何可行的途径，如通过本文描述的任何途径，使用本文描述的任何制剂。在检测到或怀疑疾病或病况发作后，可在可行的情况下尽快施用治疗剂，并且持续治疗该疾病所必需的一段时间，例如约1个月到约3个月。治疗时间长度可因人而异。
本文公开的药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分为含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有离散量的制剂的包装的形式。非限制性示例是包装的注射剂、小瓶或安瓿。水性悬浮液组合物可以包装在不可重新封闭的单剂量容器中。可以使用可重新封闭的多剂量容器，例如，与防腐剂一起使用或不与防腐剂一起使用。注射制剂可以以单位剂型呈现于例如安瓿中，或含有防腐剂的多剂量容器中。
本文提供的药物组合物可以与诸如化疗、放疗、手术、抗炎剂和选定的维生素等其他疗法联合施用。其他药剂可以在药物组合物之前、之后或同时施用。
根据预期的给药方式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉末、液体、悬浮液、洗液、乳膏或凝胶，例如，适于单次施用精确剂量的单位剂型。
对于固体组合物，无毒固体载体包括，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。
适合与本公开的组合物组合的药物活性剂的非限制性示例包括抗感染药物，即氨基糖甙类、抗病毒剂、抗微生物药、抗胆碱能药/抗痉挛药、抗糖尿病药、抗高血压药、抗肿瘤药、心血管药、中枢神经系统药、凝血调节剂、激素、免疫制剂、免疫抑制剂和眼科制剂。
化合物可以通过脂质体技术递送。使用脂质体作为药物载体可以增加化合物的治疗指数。脂质体由天然磷脂组成，并可含有具有表面活性剂性质的混合脂质链(例如，卵磷脂酰乙醇胺)。脂质体设计可以使用表面配体以附着到不健康的组织上。脂质体的非限制性示例包括多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LUV)。可以调节脂质体的物理化学性质，以优化通过生物屏障的渗透和在施用部位的保留，并降低发生过早降解和对非靶组织的毒性的可能性。最佳脂质体性质取决于给药途径：大尺寸脂质体在局部注射时显示出良好的保留，小尺寸脂质体更适合于实现被动靶向。聚乙二醇化可降低肝脏和脾脏对脂质体的摄取，并增加循环时间，从而由于增强的渗透性和保留(EPR)效应而导致在发炎部位的定位增加。此外，可以修饰脂质体表面，以实现将包封的药物选择性递送至特定的靶细胞。靶向配体的非限制性示例包括单克隆抗体、维生素、肽和对集中在与疾病相关的细胞表面上的受体特异的多糖。
适用于本发明的剂型的非限制性示例包括液体、酏剂、纳米悬浮液、水性或油性悬浮液、滴剂、糖浆及其任何组合。适用于本发明的药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括造粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘附剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、调味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、植物纤维素材料和滚圆剂，及其任何组合。
本发明的组合物可以包装为试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括有关组合物的施用/使用的说明书。书面材料可以是，例如，标签。书面材料可以提出病况的给药方法。说明书为受试者和监督医师提供从疗法施用中获得最佳临床结果的最佳指导。书面材料可以是标签。在一些实施方案中，标签可以由管理机构，例如美国食品和药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)或其他管理机构批准。
给药
本文所述的药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分为含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有离散量的制剂的包装的形式。非限制性示例是小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可以包装在不可重新封闭的单剂量容器中。可以使用可重新封闭的多剂量容器，例如，与防腐剂组合使用。用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型呈现于例如安瓿中，或含有防腐剂的多剂量容器中。
本文公开的化合物可以以约1mg至约2000mg、约100mg到约2000mg、约10mg到约2000mg、约5mg至约1000mg、约10mg至约500mg、约50mg至约250mg、约100mg至约200mg、约1mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约150mg、约150mg至约200mg、约200mg至约250mg、约250mg至约300mg、约300mg至约350mg、约350mg至约400mg、约400mg至约450mg、约450mg至约500mg、约500mg至约550mg、约550mg至约600mg、约600mg至约650mg、约650mg至约700mg、约700mg至约750mg、约750mg至约800mg、约800mg至约850mg、约850mg至约900mg、约900mg至约950mg或约950mg至约1000mg的范围存在于组合物中。
本文公开的化合物可以以约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg或约2000mg的量存在于组合物中。
化合物的治疗有效量可以是，例如，约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM、约3.5nM、约4nM、约4.5nM、约5nM、约5.5nM、约6nM、约6.5nM、约7nM、约7.5nM、约8nM、约8.5nM、约9nM、约9.5nM、约10nM、约15nM、约20nM、约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM约200nM、约250nM、约300nM、约350nM、约400nM、约450nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约45μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、约100μM、约150μM、约200μM、约300μM、约400μM、约500μM、约600μM、约700μM、约800μM、约900μM或约1mM。
在一些实施方案中，剂量可以用药物的量除以受试者的质量表示，例如，每千克受试者体重的药物毫克数。在一些实施方案中，以约5mg/kg至约50mg/kg、250mg/kg至约2000mg/kg、约10mg/kg至约800mg/kg、约50mg/kg至约400mg/kg、约100mg/kg至约300mg/kg或约150mg/kg至约200mg/kg的量施用化合物。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种非天然存在的化合物，其与人RAD51上的RAD51AP1的结合位点相互作用。
2.如实施方式1所述的非天然存在的化合物，其中所述非天然存在的化合物与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。
3.如实施方式1所述的非天然存在的化合物，其进一步包括与人RAD51的残基187相互作用。
4.如实施方式1所述的非天然存在的化合物，其中所述非天然存在的化合物与RAD51的结合常数是Kd值为10-4M或更低。
5.如实施方式1所述的非天然存在的化合物，其中所述非天然存在的化合物包含多肽。
6.如实施方式5所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽包含非天然存在的氨基酸。
7.如实施方式5所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽既包含(L)-氨基酸也包含(D)-氨基酸。
8.如实施方式5所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽包含至少一种(D)-氨基酸。
9.如实施方式5所述的非天然存在的化合物，其中所述化合物包含式I的氨基酸序列或其反向序列：
[T/K/R/Q]1-3–[L/I/V/F/M/W/Y]–[R/G/S]–[L/I/V/F/M/W/Y](式I，SEQ ID NO.:70)，
其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
10.如实施方式9所述的非天然存在的化合物，其中所述化合物包含根据式II-IV中任一个的氨基酸序列或其反向序列：
[R/K]—[L]—[G]—[M/V](式II，SEQ ID NO.:71)，
[R]—[L]—[G]—[V]—[M/V]–-[L/I/V/F/M/A/W/Y](式III，SEQ ID NO.:72)，或
[T/K/R/Q]1-2—[R]—[L]—[G]—[V]—[M/V]–-[L/I/V/F/M/A/W/Y](式IV，SEQ IDNO.:73)，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
11.如实施方式9所述的非天然存在的化合物，其中所述化合物包含SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:10、SEQ ID NO.:66或SEQ ID NO.:67的氨基酸序列。.
12.如实施方式5所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽不是抗体。
13.如实施方式9所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽由少于30个氨基酸残基组成。
14.如实施方式9所述的非天然存在的化合物，其中所述多肽进一步包含细胞穿透肽序列。
15.如实施方式1所述的非天然存在的化合物，其中所述化合物在与细胞中的RAD51结合时表现出至少一种下列特性：
(a)抑制RAD51单体在DNA上的装配；
(b)抑制细胞同源重组；
(c)缺乏对RAD51 ATP酶活性的抑制；或
(d)降低RAD51对Ca2+的亲和力。
16.一种诱导细胞死亡的方法，该方法包括使细胞与结合细胞中的真核重组酶的多肽接触，其中该多肽与该真核重组酶的结合抑制该真核重组酶与该细胞中的蛋白质的结合，其中在该多肽与该真核重组酶结合时，该细胞表现出细胞内游离钙浓度的增加。
17.如实施方式16所述的方法，其中所述多肽包含根据式I的氨基酸序列或其反向序列：
[T/K/R/Q]1-3–[L/I/V/F/M/W/Y]–[R/G/S]–[L/I/V/F/M/W/Y](式I；SEQID NO.:70)，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
18.如实施方式16所述的方法，其中所述真核重组酶是RAD51。
19.如实施方式16所述的方法，其中所述蛋白质是BRCA2。
20.如实施方式16所述的方法，其中所述蛋白质是RAD51AP1。
21.如实施方式16所述的方法，其中所述细胞死亡是凋亡性细胞死亡。
22.如实施方式16所述的方法，其中所述多肽与所述细胞中的真核重组酶的结合使所述细胞对化疗剂敏感。
23.如实施方式16所述的方法，其进一步包括施用化疗剂。
24.如实施方式16所述的方法，其中所述化疗剂是PD-L1、抗PD1剂或PARP抑制剂。
25.如实施方式16所述的方法，其中所述真核细胞是癌细胞。
26.如实施方式16所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
27.如实施方式16所述的方法，其中所述多肽以一定的速率诱导所述细胞的死亡，该速率至少是不存在所述多肽时的10倍。
28.一种治疗与异常RAD51活性相关的病况的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的与人RAD51上RAD51AP1的结合位点相互作用的多肽。
29.如实施方式28所述的方法，其中所述多肽与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。
30.如实施方式28所述的方法，其中所述多肽包含根据式I的氨基酸序列：
[T/K/R/Q]1-3–[L/I/V/F/M/W/Y]–[R/G/S]–[L/I/V/F/M/W/Y](式I，SEQID NO.:70)，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
31.如实施方式28所述的方法，其中所述病况是布卢姆综合征。
32.一种降低细胞的抗药性的方法，其包括使细胞与同人RAD51上RAD51AP1的结合位点相互作用的多肽接触。
33.如实施方式32所述的方法，其中所述多肽与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。
34.如实施方式32所述的方法，其中所述多肽包含根据式I的氨基酸序列或其反向序列：
[T/K/R/Q]1-3–[L/I/V/F/M/W/Y]–[R/G/S]–[L/I/V/F/M/W/Y](式I，SEQID NO.:70)，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
35.如实施方式32所述的方法，其中所述药物是PD-L1、抗PD1剂或PARP抑制剂。
36.一种检测宿主细胞中第一测试蛋白质与第二测试蛋白质之间的相互作用的方法，其包括：
a)在宿主细胞中表达包含第一测试蛋白质和DNA结合部分的第一融合蛋白；
b)在宿主细胞中表达包含第二测试蛋白质和基因活化部分的第二融合蛋白；并且
c)在宿主细胞中表达死亡剂，其中细胞毒性报告子被所述DNA结合部分特异性的启动子DNA序列激活，
其中第一蛋白质与第二蛋白质之间的相互作用使所述基因活化部分激活所述细胞毒性报告子的表达。
37.如实施方式36所述的方法，其中所述宿主细胞包含超过一种被所述DNA结合部分特异性的启动子DNA序列激活的细胞毒性报告子。
38.如实施方式36所述的方法，其中所述宿主细胞包含a)编码第一融合蛋白的基因组DNA和编码第二融合蛋白的基因组DNA；以及b)编码所述细胞毒性报告子的质粒DNA。
39.如实施方式36所述的方法，其中所述DNA结合部分衍生自LexA、cI、糖皮质激素受体、TetR或Ume6。
40.如实施方式36所述的方法，其中所述基因活化部分衍生自GAL4、B42或Dof1。
41.如实施方式36所述的方法，其中所述细胞毒性报告子是核糖体编码的异生物质、核糖体编码的毒物、在轻度过表达时导致严重生长缺陷的核糖体编码的内源或外源基因、切除活力必需基因的核糖体编码的重组酶、参与毒性次级代谢物的合成的限制因素，或其任何组合。
42.如实施方式41所述的方法，其中所述细胞毒性报告子是霍乱毒素、SpvB毒素、CARDS毒素、SpyA毒素、HopU1、Chelt毒素、Certhrax毒素、EFV毒素、ExoT、CdtB、白喉毒素、ExoU/VipB、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoG、VopF、YopJ、AvrPtoB、SdbA、SidG、VpdA、Lpg0969、Lpg1978、YopE、SptP、SopE2、SopB/SigD、SipA、YpkA、YopM、鹅膏蕈毒素、类鬼笔毒环肽、杀伤毒素KP1、杀伤毒素KP6、杀伤毒素K1、杀伤毒素K28(KHR)、杀伤毒素K28(KHS)、炭疽致死因子内肽酶、志贺毒素、蓖麻毒素，或其任何组合。
43.如实施方式36所述的方法，其中所述宿主细胞是真菌或细菌细胞。
44.如实施方式36所述的方法，其进一步包括在包含编码随机化多肽文库的DNA序列的宿主细胞中表达测试基因。
45.如实施方式36所述的方法，其中所述随机化多肽文库包含长度为60个或更少氨基酸的多肽。
46.如实施方式44所述的方法，其中所述测试基因包含短蛋白质的3'UTR。
47.如实施方式46所述的方法，其中所述3'UTR是sORF1的3'UTR。
48.如实施方式44所述的方法，其中所述编码随机化多肽文库的DNA序列编码甲硫氨酸-缬氨酸-天冬酰胺的共同N-末端序列。
49.如实施方式44所述的方法，其中由随机化肽文库编码的多肽在所述宿主细胞中被加工成环肽。
50.一种质粒载体，其包含SEQ ID NO.:63的核苷酸序列。
51.如实施方式50所述的质粒载体，其中编码第一多肽的DNA序列与TetR-DBD符合读框地插入，并且其中编码第二多肽的DNA序列与Dof1-AD符合读框地插入。
52.一种宿主细胞，其包含如实施方式50或51所述的质粒载体。
53.一种质粒载体文库，每个质粒载体包含：
a)与第一开关启动子可操作地连接的编码不同肽序列的DNA序列；和
b)在第二开关启动子控制下的编码细胞毒性报告子的DNA序列。
54.如实施方式53所述的质粒载体文库，其中所述不同肽序列编码共同的N-末端稳定化序列。
55.如实施方式53所述的质粒载体文库，其中所述编码不同肽序列的DNA序列进一步编码3'UTR。
56.如实施方式53所述的质粒载体文库，其中所述不同肽序列的长度为60个氨基酸或更少。
57.如实施方式53所述的质粒载体文库，其中所述不同肽序列是随机的。
58.如实施方式53所述的质粒载体文库，其中所述不同肽序列是针对与靶标的结合而预富集的。
59.一种宿主细胞文库，每个宿主细胞包含0或1个拷贝的根据实施方式53所述的质粒载体。
60.一种宿主细胞，其表达：
a)包含DNA结合部分的第一融合蛋白；
b)包含基因活化部分的第二融合蛋白；
c)细胞毒性报告子，其中所述细胞毒性报告子的表达在所述DNA结合部分特异性的DNA结合序列的控制之下；以及
d)包含编码60个或更少氨基酸的多肽的核苷酸序列的mRNA，其中该mRNA包含位于多肽的3'侧的3'UTR，并且其中所述多肽编码用于肽稳定的N-末端序列。
61.如实施方式60所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌或细菌细胞。
62.如实施方式61所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是单倍体酵母细胞。
63.如实施方式61所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是二倍体酵母细胞。
64.如实施方式63所述的宿主细胞，其中所述二倍体酵母细胞通过将第一宿主细胞与第二宿主细胞接合而产生，第一宿主细胞包含编码第一嵌合基因和第二嵌合基因的DNA序列，第二宿主细胞包含编码细胞毒性报告子的DNA序列和包含编码多肽的核苷酸序列的mRNA。
65.一种试剂盒，其包含：
a)如实施方式50所述的质粒载体；以及
b)根据实施方式53所述的质粒载体文库。
实施例
实施例1：鉴别蛋白质-蛋白质相互作用破坏物的方法。
为了实现短肽的稳定，使用终止子序列和非翻译区(UTR)或短蛋白质(如sORF1)。使用蛋白质稳定性的N端规则，以使肽序列开始于使蛋白质水解最小化的残基(如Met、Gly、Ala、Ser、Thr、Val或Pro)。
PPI整合质粒(质粒1；图7)含有两个限制位点，使构成目的PPI的两种蛋白质能够整合。该质粒编码AD(如Dof1；图8(下方))和DBD(如TetR；图8(上方))与由强启动子和终止子(如ADH1)或由诱导型启动子(如GAL1)驱动的每种蛋白质的融合体。每个蛋白质融合序列用FLAG或HA标记。该质粒还包含细菌选择和繁殖标记物(即ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(即TRP1和CEN或2um)。该质粒还具有用于在指定基因座处整合到基因组中的位点。
选择和文库质粒(图9)包括用于整合由强启动子(如ADH1启动子)或诱导型启动子(如GAL1启动子)驱动的随机化肽文库(即随机化NNK 60-聚体序列)的限制位点。选择和文库质粒的起始序列是甲硫氨酸缬氨酸天冬酰胺(MVN)的固定序列，以使该肽的半衰期最大化，并终止于短蛋白质(sORF1)的UTR；(图10；SEQ ID NO.:62)。肽也用Myc标签标记。
选择和文库质粒另外编码一种或多种由启动子驱动的概括为“死亡剂”(例如细胞毒性报告子)的试剂，其依赖于PPI整合质粒中存在的DBD(图7)。选择和文库质粒中的TetO序列可以在PPI整合质粒中被TetR结合。随机文库被插入恰好在GAL1启动子与sORF-1终止子之间的PacI位点。
为了确保'死亡剂'的抑制，选择和文库质粒包括沉默构建体——由强启动子(ADH1)驱动的TetR'-Tup11融合体，以结合DBD并在多西环素存在下使转录沉默。
选择和文库质粒进一步包括细菌选择和繁殖标记物(ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(LEU2和CEN或2um)(图9)。
确认质粒(图11)用于确认报告子的表达和菌株的成功构建。它包括AD与DBD之间的直接融合。确认质粒包括细菌选择和繁殖标记物(即ori和AmpR)，以及酵母复制和选择标记物(即TRP1和CEN或2um)。确认质粒用于确认背景菌株中正确的启动子整合，例如在ADE2基因之前的TetO7启动子整合。只有在启动子被正确整合的情况下，用确认质粒转化才能允许ADE2的激活。
用于实验的酵母背景菌株是接合型或二倍体的酿酒酵母，并包括由PPI整合质粒(图7)中使用的DBD如TetO的识别序列驱动的遗传报告子(如ADE2、HIS3和/或URA3)的基因组整合。
背景菌株还表达肽的环化和甲基化所必需的酶(例如来自乳酸乳球菌的羊毛硫肽成熟酶(LanB、LanC、LanM、LanP)，来自蓝细菌的patellamide生物合成因子(PatD、PatG)，来自蝶豆的蝶豆粘酶-1，和来自具缘盔孢伞的GmPOPB)。
使用两种方法进行筛选。在第一种方法中，亲本菌株在选择培养基上繁殖，以确保PPI整合质粒的存在，并发生可靠的蛋白质-蛋白质相互作用，这通过使用确认质粒进行证实。在缺乏Trp的培养基上培养该菌株，以确保选择发生所需相互作用的菌落。然后用选择和文库质粒转化该菌株，并立即接种在选择培养基上，以确保所有组分都存在(即在缺乏Trp和Leu的培养基上)，并诱导任何可诱导组分的表达(即用Gal)。
在第二种方法中，将菌株分批接合，以产生二倍体菌株，其携带所有标记物、PPI、“死亡剂”和肽。然后将该分批培养物在固体培养基上繁殖，该固体培养基使得能够选择所有的系统组分(即缺乏Leu和Trp的培养基)，并诱导任何可诱导组分的表达(即用Gal)。
从上述任一选项中存活的菌落构成了具有PPI的菌落，该PPI已被肽破坏，并且不再触发由编码的“死亡剂”触发的死亡级联。
通过对每个存活菌落中的选择和文库质粒的肽编码区进行DNA测序，获得能够破坏PPI的肽序列。
为了证实特异性，使用诱导型标记物灭活PPI或肽的产生，并确认特异性。例如，仅在含有半乳糖的培养基上观察到细胞存活，其中所有组分均被表达，并且当肽的表达丧失时，在不含半乳糖的培养基上没有存活。然后分离质粒并重新转化到新的亲本菌株中，以确认特异性。
对含有PPI、肽和“死亡剂”的活菌株进行生物化学分级分离，然后进行下拉实验，证实了肽序列与使用编码的标签的任一PPI配偶体之间的相互作用。
实施例2：用本文公开的化合物对SSP-25细胞(胆管癌)的处理。
为评估本文公开的化合物的生长抑制性质，在细胞生长48小时后，使用MTT试验相对于水模拟处理检测5μM或10μM化合物1、3和5对SSP-25细胞的生长抑制。图1显示化合物1和3对SSP-25的生长具有剂量依赖性作用，而化合物5的抑制作用最强，与浓度无关。
图13显示化合物5处理的结果，其显示通过xCELLigenceTM仪器测得的SSP-25细胞中的急性细胞死亡动力学。首先，接种5000个SSP-25细胞，并使用xCELLigenceTM仪器实时测量通过板的电流阻抗，来测量粘附和生长20小时。在20小时标记处，将30μM化合物5或PBS对照加入SSP-25细胞，其在含有10％FBS的100μM RPMI培养基中培养。实时观察急性死亡动力学，并使细胞继续生长。在72小时，将30μM更多的化合物5加入预处理的孔和仅用PBS预先处理的孔中。图13显示初始处理后得到的细胞生长并非由于抗性，而是由于化合物的给药不足。此外，单一给药的细胞继续恢复，这表明化合物在培养基或裂解的细胞中的一般细胞毒性降低。该结果支持这样的观点，即由于钙浓度增加，可能需要剂量高于某一阈值的急性治疗来激活快速杀伤机制。此外，在72小时后用化合物5处理在PBS中生长的先前未处理的细胞，证明了化合物5在酸化培养基中的功效。
实施例3：用本文公开的化合物对PC3细胞(mCRPC细胞)的处理。
图14显示化合物5处理的结果，其显示通过xCELLigenceTM仪器测得的在mCRPC细胞中的急性细胞死亡动力学。首先，接种5000个PC3细胞，并使用xCELLigenceTM仪器实时测量通过板的电流阻抗，来测量粘附和生长24小时。在24小时标记处，将60μM化合物5、60μM化合物6或PBS对照加入在含有10％FBS的100μM DMEM中生长的PC3细胞。实时观察急性死亡动力学，并使细胞继续生长。在84小时，将100μM更多的化合物5加入预处理的细胞。124小时标记时再次重复。与化合物6和PBS对照相比，该方案成功地消除了75％以上的PC3细胞。
图14显示化合物5对PC3细胞非常有效，而化合物6则不然。此外，增加的给药对快速杀死PC3细胞更有效，但浓度高于杀死SSP-25细胞所需的浓度，表明由于细胞内钙浓度增加，化合物摄取动力学改变，或引发急性细胞死亡所需的阈值改变。
实施例4：细胞的选择性杀伤。
为了评估本文公开的化合物在靶向具有BRCA2途径突变的癌症中的特异性，针对HeLa(人宫颈癌)和SSP-25细胞(胆管癌细胞系)测试化合物1和5(图2)。为了测量化合物1和5对细胞的杀伤，使用细胞染色剂(CytoTox RedTM)，其可以通过分光光度法测量，并且指示细胞活力。首先，将5000个细胞在96孔培养板中孵育过夜。除去培养基(含有10％FBS的RPMI)，并用含有125nM CytoToxRedTM的无血清培养基(RPMI)代替。将FITC标记的化合物5和1分别加至浓度为5μM和10μM，并使用IncuCyteTM仪器15分钟时间点开始成像。孵育1小时后加入2x含血清培养基，每2小时对细胞进行成像。为了检测CytoTox RedTM，使用以下参数：激发波长：585nm；通带：[565,605]nm，发射波长：635nm；通带：[625,705]nm。为了使用FITC标记物检测化合物5和1，使用以下参数：激发波长：460nm；通带：[440,480]nm，发射波长：524nm；通带：[504,544]nm。
图2提供了染色的细胞的图像，其在处理前显示在HeLa(201)和SSP-25(203)细胞群体中几乎没有染色。用化合物1或5处理后，HeLa细胞中的细胞死亡很少(202)，而与使用PBS(204)的安慰剂处理相比，化合物在SSP-25细胞中表现出最大的效力，如细胞的较浅灰色染色(204)所示。HeLa和SSP-25细胞均表现出对化合物的高效吸收，如细胞的浅灰色染色所示。
使用10μM化合物1重复上述相同的活力测定。图3显示实验结果，并且显示与PBS的安慰剂处理相比，化合物1对SSP-25细胞具有特异性。
图3提供了染色的细胞的图像，其在处理前显示在HeLa(301)和SSP-25(302)细胞群体中几乎没有染色。用化合物1处理后，HeLa细胞中的细胞死亡很少(303)，而肝癌细胞显示出最大染色(304)，如深灰色染色所示(304)。
实施例5：化合物对RAD51的特异性。
使用5μM或10μM化合物1对SSP-25细胞进行生长试验。图4显示与PBS处理相比，化合物处理在测试时间内降低了细胞的汇合百分比。实施例3中描述的实验方案用于生长试验。
使用10μM化合物1和化合物2重复相同的生长试验。化合物2在核心共有序列内含有单个置换，其中断了化合物2与RAD51的结合。因此，如图5所示，化合物2不能使SSP-25细胞的生长减少到与化合物1相同的程度，表明化合物1对RAD51的特异性。
实施例6：抑制布卢姆细胞中对应激增加的敏感性
为了评估本文公开的化合物对挽救布卢姆综合征患者细胞GM08505的药物敏感性的能力，用PBS、5μM依托泊苷或5μM依托泊苷和10μM化合物5处理Blm细胞。图6显示Blm细胞的生长受5uM依托泊苷处理的影响。然而，用PBS或依托泊苷与化合物5的组合处理是相当的，表明化合物5抑制由依托泊苷诱导的细胞生长缺陷，如通过测试时间段内细胞的汇合百分比所测得的。
实施例7：通用肽制备及针对细胞活性的优化
根据通过实施例1的方法鉴别的共有RAD51结合序列，用多种修饰、氨基酸立体异构体、非天然氨基酸和细胞穿透肽制备合成肽化合物(化合物1、3、4、5、7、9、10、11、13、14、19和25；参见表5和图17)。按照标准固相肽合成方法合成肽。通过RP-HPLC、MS/MS和肽含量分析对肽的身份和纯度进行证实和确定。为无毒盐形式(例如乙酸盐或HCl)更换三氟乙酸(TFA)，并且在实验中使用前肽的纯度至少为95％。
为优化细胞活性，在针对各种细胞系的xCELLigence细胞死亡试验中测试化合物。图15和图16中使用A549细胞和化合物10显示了所用工作流程的示例。图15显示示例性xCELLigence处理实验，其中垂线表示化合物施用时间，细胞指数(Y轴)表示细胞活力。然后使用图15中来自不同化合物浓度的xCELLigence迹线的数据生成剂量-响应曲线，然后使用S形剂量-响应模型对其进行非线性回归，以生成每种化合物/细胞系组合的细胞死亡的IC50和R2值(图16)。
优化实验的实例在图17中示出，其中针对SSP-25细胞测试了化合物1、3、4、5、7、9、10、11、13、14、19和25。所述化合物的细胞死亡IC50在10-4M到10-6M的范围内变化。对掺入了不同细胞穿透肽序列的类似肽的分析(图18)表明，细胞活性很大程度上与选择哪种细胞穿透肽无关(由于化合物5、13、14、10和25均具有相似的IC50值)。
实施例8：在Y2H试验中使用突变分析定位RAD51结合肽的结合位点
使用“常规”Y2H试验测试RAD51结合肽与几种不同物种的RAD51的结合能力，其中双杂交对之间的相互作用驱动ADE2和HIS基因的表达。在该Y2H试验中，双杂交对是RAD51和化合物5肽序列(SEQ ID NO.:5)，因此具有该相互作用的细胞将存活(+)，而不具有该相互作用的细胞将在选择培养基(-ADE，-HIS)上死亡(-)。虽然肽成功结合智人(H.sapiens)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)RAD51，但其不与酿酒酵母RAD51结合，表明酿酒酵母与人之间的序列差异阻止了该肽的结合。表6总结了该数据的一部分。
Figure BDA0004110047230000881
基于酿酒酵母与智人RAD51的序列比较，构建了RAD51的多个酿酒酵母-智人杂合构建体，并在上述相同的RAD51/SEQ ID NO.:5杂合系统中测试其结合RAD51结合肽的能力。RAD51肽仅成功结合含有人RAD51的至少残基190-339的构建体，而不结合包含人RAD51的残基218-339的构建体，表明结合位点位于190-218区域的某处。数据总结在表7中。
Figure BDA0004110047230000882
Figure BDA0004110047230000891
然后通过Y2H试验测试肽结合具有各种突变的人RAD51的能力。所述突变包括文献中描述的已知影响RAD51相互作用配偶体如BRCA2和RAD51-AP1的结合的突变，以及通过对结合/不结合SEQ ID NO.:5的RAD51物种直向同源物的更广泛序列比对分析确定的残基(图23，见框出的残基“R”、“D”和“A”)。虽然影响BRCA2结合的突变对肽结合没有影响，但影响RAD51-AP1结合的突变确实破坏了肽结合。由于这些突变位于残基202、205和206处，它们与先前的融合数据一致，显示在190-218区域的某处结合，并表明肽SEQ ID NO.:5至少与RAD51的残基202、205和206接触。
Figure BDA0004110047230000892
(+)表示两个Y2H诱饵之间成功的相互作用，(-)表示缺乏相互作用
“BRCA2”表示用作Y2H诱饵的人BRCA2的残基1517-1551。
“RAD51AP1”表示用作Y2H诱饵的人RAD51AP1(GenBank AAH16330.1)的残基245-352。
“SEQ ID NO.:5”表示用作Y2H诱饵的SEQ ID NO.:5。
应当注意，图23的序列比对还表明，相对于人RAD51的残基187是在结合/不结合化合物的直向同源物之间的变体，提示人RAD51的残基187在化合物结合中起额外作用。
实施例9：RAD51结合肽与钙结合RAD51的相互作用
为了测试钙结合和肽与RAD51的结合之间的相互作用，通过微尺度热泳法试验测试活性(化合物5、10)肽对RAD51的Kd，并在1mM钙的存在下另外测定化合物5的Kd。
如前所述进行微尺度热泳(参见，例如，Jerabek-Willemsen,M.,Wienken,C.J.,Braun,D.,Baaske,P.&Duhr,S.Molecular interaction studies using microscalethermophoresis.Assay Drug Dev.Technol.9,342–353(2011))。使用来自NanotemperTechnologies的Monolith NT.115测量化合物的亲和力。根据制造商的方案对Rad51进行荧光标记，并且用于每次测定的标记蛋白质为约500nM。将未标记肽的溶液稀释至适当的连续浓度梯度。将样品装入二氧化硅毛细管(Polymicro Technologies)中。在室温下，在含有PBS、0.1％吐温20、0.5mM ATP、2.5μM ssDNA和1mM CaCl2(当提及时)的缓冲液中进行测量。测量使用12％的LED功率和60％的MST功率进行。对于每个亲和力测量，重复测定三次。数据分析使用制造商提供的Nanotemper Analysis软件和OriginPro 8.0软件进行。
表9微尺度热泳数据
Figure BDA0004110047230000901
微尺度热泳数据总结在表9中。两种活性肽(5和10)以约8纳摩尔的Kd结合。然而，当RAD51结合试验中钙(Ca2+)的体外浓度从0增加到1mM时，Kd增加了3.4倍，表明在RAD51上钙结合位点与肽结合界面之间存在变构通信。
实施例10：癌症的无胸腺异种移植小鼠模型中的化合物功效
雌性无胸腺nu/nu小鼠(6-8周龄)购自Simonsen实验室(n＝12)，并且饲养于Vallejo的Murigenics动物园。小鼠适应动物园的环境5天，并保持标准饲料饮食；12:12暗/光周期；在hepa-过滤的笼中分组饲养(每笼3只小鼠)。适应后，每只小鼠皮下注射(左下腹侧面)与与Matrigel溶液1：1(v/v)混合的5x106个A549(ATCC:CCL-185)细胞。当肿瘤体积达到～100mm3时，将小鼠分为单独的治疗组以进行所需的治疗。使用肿瘤内(IT)和腹膜内(IP)给药进行实验，数据在图19中报告。
实验1：肿瘤内(IT)给药
将如上所述准备的小鼠分为4组：
组1：未给予任何治疗(n＝3)
组2：接受肿瘤内注射50μL磷酸盐缓冲盐水(模拟)(n＝3)
组3：接受肿瘤内注射在磷酸盐缓冲盐水中的50μL 10mg/ml的化合物10(n＝3)
组4：接受肿瘤内注射在磷酸盐缓冲盐水中的50μL 20mg/ml化合物10(n＝3)
用(30g针头)进行50μL注射。在第0天进行注射，然后在第3天再次注射。用游标卡尺测量肿瘤块的长度(L)和宽度(W)，并计算肿瘤体积(V)为V＝(LxW^2)/2。将每个测量日的每个肿瘤块的相对肿瘤体积相对于临开始注射前第0天的相同肿瘤块的初始体积进行归一化。在第0、3和6天进行测量，数据总结在图19中，其显示早在第3天，肿瘤大小就有可测量的减小。
实验2：腹膜内(IP)给药
将如上所述准备的小鼠分为2组：
组1：接受腹膜内注射125μL磷酸盐缓冲盐水(模拟)(n＝2)
组2：接受腹膜内注射在磷酸盐缓冲盐水中的125μL 3mg/ml化合物10(n＝3)
用30g针头进行注射。在第7天进行注射。用游标卡尺测量肿瘤块的长度(L)和宽度(W)，并计算肿瘤体积(V)为V＝(LxW^2)/2。将每个测量日的每个肿瘤块的相对肿瘤体积相对于临开始注射前第0天的相同肿瘤块的初始体积进行归一化。在第0-10天进行测量，在第7天进行IP给药，数据总结在图19中，其显示早在注射后的第3天(第10天)，肿瘤大小就有可测量的减小。
实施例11：细胞内Ca2+螯合抑制化合物10在SSP-25细胞中的细胞毒性
为了进一步研究肽与细胞中RAD51的结合通过细胞内游离钙水平的增加导致细胞死亡的假设，在如实施例3所述的xCELLigenceTM细胞死亡试验中测试了单独的以及与两种不同的细胞内钙螯合剂(1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)，又名“BAPTA-AM”，和氨化的氯氧化钌，又名“钌红”)组合的化合物10。还在细胞上评价了单独的细胞内钙螯合剂。在这两种情况下，钙螯合剂的施用挽救了细胞死亡，提示此处的RAD51结合化合物由于细胞内游离Ca2+离子的增加而杀死细胞，并且抵消细胞内游离Ca2+离子的增加防止了由RAD51结合化合物引起的细胞死亡。
图23表明，相对于单独的化合物，将10μM BAPTA-AM加入用10μM化合物10处理的细胞挽救了细胞死亡(见图23中的曲线，其中代表BAPTA-AM+化合物组合的曲线大致等同于单独的PBS，而代表单独化合物10的曲线显示显著的细胞死亡)。
图24表明，相对于单独的化合物，将40μM钌红加入用10μM化合物10处理的细胞挽救了细胞死亡(见图24中的曲线，其中代表钌红+化合物组合的曲线大致等同于单独的PBS，而代表单独化合物的曲线显示显著的细胞死亡。)
实施例12：奥拉帕利与化合物10对SSP-25细胞协同作用
为了进一步研究与RAD51结合的肽导致DNA修复缺陷，从而与靶向DNA修复的其他试剂协同作用的假设，在如实施例3所述的xCELLigenceTM细胞死亡试验中测试了单独的或组合的化合物10或聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂奥拉帕利(AZD-2281，Lynparza，4-[4-氟-3-[(4-甲氧基哌啶-1-基)羰基]苄基]酞嗪-1(2H)-酮，4-[[4-氟-3-[(4-甲氧基-1-哌啶基)羰基]苯基]甲基]-1(2H)-酞嗪酮])。
图25表明，相对于单独的化合物或单独的奥拉帕利，将1μM奥拉帕利加入用10μM化合物10处理的细胞增强了细胞死亡(见图25中的曲线，其中相对于其他曲线，代表奥拉帕利+化合物组合的曲线显示出增强的细胞死亡)。
实施方案
以下非限制性实施方案提供了本发明的说明性示例，但不限制本发明的范围。
实施方案1.一种治疗病况的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的与细胞中的真核重组酶结合的多肽，其中该多肽与该真核重组酶的结合抑制该真核重组酶与该细胞中的蛋白质的结合，其中与未暴露于该多肽的细胞相比，对该真核重组酶与该蛋白质的结合的抑制减少或抑制了该细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)损伤修复。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述真核重组酶是RAD51。
实施方案3.如实施方案1-2中任一项所述的方法，其中所述多肽不是抗体。
实施方案4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是BRCA2。
实施方案5.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是RAD51AP1。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中对所述真核重组酶与所述蛋白质的结合的抑制通过所述多肽与所述蛋白质之间的竞争性抑制而发生。
实施方案7.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中对所述真核重组酶与所述蛋白质的结合的抑制通过对所述真核重组酶与所述蛋白质的结合的变构抑制而发生。
实施方案8.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述多肽与所述细胞中的真核重组酶的结合降低所述细胞的增殖。
实施方案9.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述多肽与所述细胞中的真核重组酶的结合诱导所述细胞的死亡。
实施方案10.如实施方案9所述的方法，其中所述细胞死亡是凋亡性细胞死亡。
实施方案11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其进一步包括所述细胞中的同源重组的减少。
实施方案12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞中DNA损伤修复的减少或抑制使所述细胞对化疗剂敏感。
实施方案13.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述多肽的长度为4-70个氨基酸。
实施方案14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述多肽的长度为15-30个氨基酸。
实施方案15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述多肽包含细胞穿透肽信号序列。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述多肽包含RAD51相互作用基序，其中该RAD51相互作用基序是SEQ ID NO.:19。
实施方案17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述多肽包含蛋白质转导结构域。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述多肽是SEQ ID NO.:1。
实施方案19.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述多肽是SEQ ID NO.:3。
实施方案20.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述多肽是SEQ ID NO.:5。
实施方案21.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其进一步包括施用化疗剂。
实施方案22.如实施方案21所述的方法，其中所述化疗剂是抗PD1剂。
实施方案23.如实施方案21所述的方法，其中所述化疗剂是PARP抑制剂。
实施方案24.如实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述病况是癌症。
实施方案25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述病况是肝内胆管癌。
实施方案26.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述病况是去势抗性前列腺癌。
实施方案27.如实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述病况是布卢姆综合征。
实施方案28.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述施用是口服。
实施方案29.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述施用是皮下施用。
实施方案30.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
实施方案31.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为约5μM至约1mM。
实施方案32.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案33.如实施方案1-32中任一项所述的方法，其中在所述多肽与所述真核重组酶结合时，所述细胞表现出钙浓度的增加。
实施方案34.如实施方案33所述的方法，其中所述钙浓度的增加诱导所述细胞的死亡。
实施方案35.一种诱导细胞死亡的方法，该方法包括使细胞与多肽接触，其中所述多肽与该细胞中的真核重组酶结合，其中该多肽与该真核重组酶的结合抑制该真核重组酶与该细胞中的蛋白质的结合，其中对该真核重组酶与该蛋白质的结合的抑制减少或抑制了该细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)损伤修复，其中与未与该多肽接触的细胞相比，对该真核重组酶与该蛋白质的结合的抑制诱导该细胞的死亡。
实施方案36.一种降低细胞中的抗药性的方法，该方法包括使细胞与多肽接触，其中所述多肽与该细胞中的真核重组酶结合，其中该多肽与该真核重组酶的结合抑制该真核重组酶与该细胞中的蛋白质的结合，其中对该真核重组酶与该蛋白质的结合的抑制减少或抑制了该细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)损伤修复，其中与未与该多肽接触的细胞相比，对该真核重组酶的结合的抑制降低了该细胞的抗药性。

Claims (34)

1.一种非天然存在的组合物，其与人RAD51上的RAD51AP1的结合位点相互作用，其中所述组合物包含式I的氨基酸序列或其反向序列：
[T/K/R/Q]1-3–[L/I/V/F/M/W/Y]–[R/G/S]–[L/I/V/F/M/W/Y](式I，SEQ ID NO.:70)，
其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
2.如权利要求1所述的非天然存在的组合物，其中所述非天然存在的组合物与RAD51的结合常数是Kd值为10-4M或更低。
3.如权利要求1或2所述的非天然存在的组合物，其中所述非天然存在的组合物与人RAD51的残基202、205和206中的至少一个相互作用。
4.如权利要求1-3中任一项所述的非天然存在的组合物，其进一步包括与人RAD51的残基187相互作用。
5.如权利要求1-4中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述氨基酸序列包含非天然存在的氨基酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述氨基酸序列既包含(L)-氨基酸也包含(D)-氨基酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述氨基酸序列包含至少一种(D)-氨基酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物包含根据式II-IV中任一个的氨基酸序列或其反向序列：
[R/K]—[L]—[G]—[M/V](式II，SEQ ID NO.:71)，
[R]—[L]—[G]—[V]—[M/V]–-[L/I/V/F/M/A/W/Y](式III，SEQ IDNO.:72)，或
[T/K/R/Q]1-2—[R]—[L]—[G]—[V]—[M/V]–-[L/I/V/F/M/A/W/Y](式IV，SEQ IDNO.:73)，其中任一或多个氨基酸任选为非天然氨基酸或(D)-氨基酸。
9.如权利要求8所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物包含SEQ ID NO.:1、SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:10、SEQ ID NO.:66或SEQ ID NO.:67的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物不包含抗体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物由少于30个氨基酸残基组成。
12.如权利要求1-11中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物进一步包含细胞穿透肽序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的非天然存在的组合物，其中所述组合物在与细胞中的RAD51结合时表现出至少一种下列特性：
(a)抑制RAD51单体在DNA上的装配；
(b)抑制细胞同源重组；
(c)缺乏对RAD51 ATP酶活性的抑制；或
(d)降低RAD51对Ca2+的亲和力。
14.一种筛选宿主细胞中第一测试蛋白质与第二测试蛋白质之间的相互作用的抑制剂的方法，所述方法包括：
a)在多个宿主细胞中表达包含第一测试蛋白质和DNA结合部分的第一融合蛋白；并且
b)在每个所述多个宿主细胞中表达包含第二测试蛋白质和基因活化部分的第二融合蛋白；
其中每个所述多个宿主细胞包含编码多个细胞毒性剂的核酸序列，所述多个细胞毒性剂在对所述DNA结合部分具有选择性亲和力的启动子的控制下，
其中所述第一测试蛋白质与所述第二测试蛋白质之间的相互作用使所述基因活化部分激活所述细胞毒性剂的表达。
15.如权利要求14所述的方法，其还包括在每个所述多个宿主细胞中表达随机化多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述随机化多肽破坏所述第一测试蛋白质与所述第二测试蛋白质之间的相互作用，阻止所述细胞毒性剂的表达。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是核糖体编码的异生物质、核糖体编码的毒物、在轻度过表达时导致严重生长缺陷的核糖体编码的内源或外源基因、切除活力必需基因的核糖体编码的重组酶、参与毒性次级代谢物的合成的限制因素，或其任何组合。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是霍乱毒素、SpvB毒素、CARDS毒素、SpyA毒素、HopU1、Chelt毒素、Certhrax毒素、EFV毒素、ExoT、CdtB、白喉毒素、ExoU/VipB、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoG、VopF、YopJ、AvrPtoB、SdbA、SidG、VpdA、Lpg0969、Lpg1978、YopE、SptP、SopE2、SopB/SigD、SipA、YpkA、YopM、鹅膏蕈毒素、类鬼笔毒环肽、杀伤毒素KP1、杀伤毒素KP6、杀伤毒素K1、杀伤毒素K28(KHR)、杀伤毒素K28(KHS)、炭疽致死因子内肽酶、志贺毒素、蓖麻毒素，或其任何组合。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述多个宿主细胞是原核宿主细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述多个宿主细胞是细菌宿主细胞。
21.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述多个宿主细胞是真核宿主细胞。
22.如权利要求21中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是原核细胞细胞毒性剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述多个宿主细胞是细菌宿主细胞。
24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，其中在每个所述多个宿主细胞中表达的所述随机化多肽的长度为或者低于60个氨基酸。
25.如权利要求15-24中任一项所述的方法，其中N-末端稳定化序列连接至所述随机化多肽。
26.一种宿主细胞，其被构建为表达：
a)包含DNA结合部分的第一融合蛋白；
b)包含基因活化部分的第二融合蛋白；
c)多个细胞毒性报告子，其中所述细胞毒性报告子的表达在所述DNA结合部分特异性的DNA结合序列的控制之下；以及
d)包含编码非天然存在的多肽的核苷酸序列的mRNA。
27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述非天然存在的多肽的长度为或者低于60个氨基酸。
28.如权利要求26或27所述的宿主细胞，其中所述非天然存在的多肽连接至用肽稳定的N-末端序列。
29.如权利要求26-28中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌。
30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是单倍体酵母细胞。
31.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是二倍体酵母细胞。
32.如权利要求26-28中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
33.如权利要求26-32中任一项所述的宿主，其中所述DNA结合部分衍生自LexA、cI、糖皮质激素受体、TetR或Ume6。
34.如权利要求26-33中任一项所述的宿主，其中所述基因活化部分衍生自GAL4、B42或Dof1。
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