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CN116200520A - 利用四重实时荧光pcr快速鉴定转基因玉米品系的方法 - Google Patents

利用四重实时荧光pcr快速鉴定转基因玉米品系的方法 Download PDF

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CN116200520A
CN116200520A CN202211232186.4A CN202211232186A CN116200520A CN 116200520 A CN116200520 A CN 116200520A CN 202211232186 A CN202211232186 A CN 202211232186A CN 116200520 A CN116200520 A CN 116200520A
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corn
transgenic
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das
mir604
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王凤军
叶素丹
金浩然
杨伊平
徐润杰
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Zhejiang Economic & Trade Polytechnic
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Zhejiang Economic & Trade Polytechnic
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Abstract

本发明涉及遗传工程领域，具体是一种适用于四种转基因玉米品系的多重实时荧光PCR快速鉴定方法。本发明公开了一种利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定所用的引物和探针。本发明还同时公开了一种利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：1)、待测玉米样品中基因组DNA的提取；2)、利用上述引物和探针进行四重实时荧光PCR扩增体系设置；3)、判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。本发明为四种转基因玉米的进口贸易，市场流通情况，田间种植行为重点监控提供了参考方法，为转基因玉米的安全监管提供技术支撑。

Description

利用四重实时荧光PCR快速鉴定转基因玉米品系的方法
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体是一种适用于四种转基因玉米品系的多重实时荧光PCR快速鉴定方法，属于食品安全转基因检测领域。
背景技术
自1994年美国食品药品管理局通过全球第一例转基因作物进入商业化生产以来，转基因作物就开始在全球范围内快速推广。我国作为转基因作物消费国，大豆、菜籽会被加工成蛋白粕和植物油，粕类主要用于饲料，植物油则投入到食用油领域，棉花则是纺织企业、玉米全部用作饲料、甜菜主要用来制糖。不同国家批准数量最多的前十个转化体包括：耐除草剂玉米转化体NK603、耐除草剂大豆GTS 40-3-2、抗虫玉米MON810、耐除草剂和抗虫玉米TC1507、耐除草剂和抗虫玉米Bt11、抗虫玉米MON89034、耐除草剂玉米GA21、耐除草剂大豆A2704-12和耐除草剂和抗虫玉米MON88017。其中转化体获批数量最多为玉米，共有35个国家/地区批准了146个转化体。
MIR604利用农杆菌转化法转入苏云金芽孢杆菌(mCry3A)基因，通过选择性破坏鞘翅目昆虫，尤其是玉米根虫的中肠系统而具有鞘翅目昆虫抗性和甘露糖代谢特性；GA21是利用基因枪法将经过修饰的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(mepsps)基因导入玉米基因组中，赋予其对草甘膦除草剂耐受性；DAS-40278-9利用碳化硅纤维介导转化法将修饰的编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad-1)基因导入玉米基因组，通过侧链降解2,4-D除草剂和降解芳氧基苯氧基丙酸除草剂，而具有两种除草剂耐受性；98140是利用农杆菌转化法导入了经修饰的磺酰脲类和咪唑啉酮除草剂耐性基因(zm-hra)而具有草甘膦除草剂耐受性和磺酰脲类除草剂耐受性。这四种品系的玉米均已获得我国的许可，按照我国的转基因标识管理办法必须对其产品进行转基因成分标识，因此需对市场流通的转基因玉米进行品系鉴定，监控转基因品系流通的合法性。目前的检测方法主要有常规PCR方法，但需通过电泳，耗时较长，检测准确性不高，以及基因芯片和基因测序方法，但检测成本较高，且结果需进一步验证，因此需开发通量高，准确性强的多重实时荧光PCR检测方法，为依法依规严格监管，严肃查处非法制种等违法违规行为，保障农业转基因研发应用健康有序发展提供技术参考。
由于引物探针设计的特异性不够高、反应体系各反应物的配比容易引起交叉信号污染等原因，目前的现有技术尚不能在同一个反应管中检测MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140这四种转基因玉米。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用四重实时荧光PCR检测转基因玉米品系的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定所用的引物和探针：
转基因玉米品系MIR604的扩增引物和探针分别为：
MIR604-F:TCTGCGCACGCAATTCAA
MIR604-R:CTTAATTCTCCGCTCATGATCAGAT
MIR604-P：NED-AAGGCGGGAAACGA-MGB
转基因玉米品系GA21的扩增引物和探针分别为：
GA21-F：TCGCTCGCCTTTGGATTCT
GA21-R：GGGTGTGTTCGCCACCAT
GA21-P：VIC-CCAAAGCCGCTGATG-MGB
转基因玉米品系DAS-40278-9的扩增引物和探针分别为：
DAS-40278-9-F：CACGCGGAGCTCCATCA
DAS-40278-9-R：TACTCCTCTCGGTTCCCTATCTCA
DAS-40278-9-P：FAM-CGCTTCGCGCGACCGATGA-BHQ1
转基因玉米品系98140的扩增引物和探针分别为：
98140-F：CGTGACGATCGCCAAAGG
98140-R：GCGCGGACTTCGTTCTTCT
98140-P：Cy5-TTCAACATTCCAGCGGTCCGTGTG-BHQ3
本发明还同时提供了上述引物和探针的设计方法，包括如下步骤：
①、检测靶标基因的筛选与确定
选择MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个转基因玉米品系(为转基因食品安全监管关注的品系)；
②、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针。
作为本发明的引物和探针的设计方法的改进：
步骤②中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，主要有6-FAM、TET、HEX、VIC、NED、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red；探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
本发明还同时提供了利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法：利用上述引物和探针，包括以下步骤：
1)、待测玉米样品中基因组DNA的提取；
2)、四重实时荧光PCR扩增体系设置；
3)、判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。
作为本发明快速鉴定方法的改进：
步骤2)中，25μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～1μM，SuperRealPreMix(Probe)(2×，天根，货号FP206)，0.4μLPassive Refereence Dye(50×)，基因组DNA 1pg～100ng；ddH2O补足至25μL。
SuperRealPreMix(Probe)(2×，天根，货号FP206)，即，2×TaqMan UniversalMaster Mix。
作为本发明快速鉴定方法的进一步改进，25μL的四重实时荧光PCR扩增体系中：
Figure SMS_1
说明：单重实时荧光PCR为内源基因的检测，作为整个体系的质控。
作为本发明快速鉴定方法的进一步改进：
四重实时荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃退火兼延伸1min，共设置40个循环。
作为本发明快速鉴定方法的进一步改进：
所述步骤3)判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分，为：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品品系或是否含有某品系转化体成分；依次进行以下步骤：
3.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明样品基因组DNA提取有效(即，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常，则进入下述步骤3.2)；反之，则判定检测无效；
3.2)、针对品系特异性基因：
一、当MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个靶标序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为非MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140转基因玉米品系或不含有这四种品系的转化体成分；
当MIR604特异性基因序列Ct值＜35时，且GA21、DAS-40278-9、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米MIR604品系或含有该品系的转化体成分；
当GA21特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、DAS-40278-9、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米GA21品系或含有该品系的转化体成分；
当DAS-40278-9特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、GA21、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米DAS-40278-9品系或含有该品系的转化体成分；
当98140特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、GA21、DAS-40278-9特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米98140品系或含有该品系的转化体成分；
当出现两个及以上玉米品系的靶标序列Ct值均<35时，则判定待测样品为对应的多个玉米品系的混合样品或含有作为本发明快速鉴定方法的进一步改进：多个品系的转化体成分；
二、当35≤MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140转基因玉米品系靶标序列Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行检测，判定方式按照上述一。
说明：MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140转基因玉米品系靶标序列Ct值这4者之一满足该条件，就需要重新进行检测。
作为本发明快速鉴定方法的进一步改进：
待测玉米样品中基因组DNA的提取为：
玉米(即指未加工过的玉米果实、种子、叶片、玉米粉等)采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取；试剂盒可采用北京全式金(EE111)、天根(DP305)、百迈(NEP023)、北京鼎国(NEP003)、Qiagen(69104)、Koning(F1612)等6种植物DNA提取试剂盒；
玉米制品(即玉米深加工产品，包括玉米酥、爆米花等)采用天根深加工制品提取试剂盒(DP326)、德国Congen SureFood PREP Plant X(S1006)试剂盒进行提取。
本发明属于多重实时荧光PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测玉米样品进行品系快速、高效和精确鉴定。
在本发明中：
所述四重实时荧光PCR鉴定的靶标是通过国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站筛选出的全球较为常见的四种转基因玉米品系(DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140)的特异性基因序列。
实时荧光PCR反应适用于多通道的实时荧光PCR反应仪，主要包括ABI实时荧光PCR系统，BioRad实时荧光PCR系统，SmartCyclerII系统等。
本发明还需扩增玉米内源基因zSSIIb，作为核酸提取和扩增反应的对照。
zSSIIb-F:CACCTCCCAATCCTTTGACATC
zSSIIb-R:TCGTTCCGTTTTGCATTGC
zSSIIb-P:VIC-CCGAAGCAAAGTCA-MGB。
在本发明中，判定待检玉米是否为转基因玉米特定品系为：
根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品是否为转基因玉米DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140，主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，每个反应的Ct值是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。首先需确保所有的玉米样品中内源基因zSSIIb的Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常；否则检测无效(必须重做检测)；在此基础上查看DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140四个靶标序列的扩增情况。
在确定zSSIIb Ct值﹤35时，当且DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140四个靶标序列无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为非MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140转基因玉米品系或不含有这四种品系的转化体成分；当且MIR604特异性基因序列Ct值＜35时，GA21、DAS-40278-9和98140特异性基因序列无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米MIR604品系或含有该品系的转化体成分；当且GA21特异性基因序列Ct值＜35时，MIR604、DAS-40278-9和98140特异性基因序列无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米GA21品系或含有该品系的转化体成分；当且DAS-40278-9特异性基因序列Ct值＜35时，MIR604、GA21和98140特异性基因序列无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米DAS-40278-9品系或含有该品系的转化体成分；当且98140特异性基因序列Ct值＜35时，MIR604、GA21和DAS-40278-9特异性基因序列无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米98140品系或含有该品系的转化体成分；当出现两个及以上玉米品系的靶标序列Ct值均<35时，则判定待测样品为多个玉米品系的混合样品或不含有多个品系的转化体成分。当35≤DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140转基因玉米品系靶标序列Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行检测，重新进行检测所得的品系特异性基因Ct值≥40时，待测玉米样品的判定结果为非此四种转基因玉米品系或不含有这四种品系的转化体成分，重新进行检测所得的四个玉米品系靶标序列任一Ct值≤35时，待测玉米样品判定为该玉米品系或或含有该品系的转化体成分。
在本发明中，设置DNA提取质控，确保核酸样本制备环节有效，对下游试验无干扰；还设置三个复孔的重复和非模板空白对照(设置三个重复确保数据可靠准确，设置非模板对照避免出现假阴性结果)。实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysis software进行分析处理。
在本发明中，DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。
本发明属于四重实时荧光PCR转基因玉米品系快速鉴定技术，本发明针对玉米内源基因zSSIIb和四个国家重点监测的转基因玉米品系设计5组扩增引物和5条不同标记的荧光探针。
本发明在设计过程中，通过国际农业生物技术应用服务组织转基因数据库http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp信息，收集得到目前已公开报道的商品化生产的转基因玉米品系以及我国批准进口用于生产原料的转基因玉米品系信息。比较分析发现，DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140为我国批准进口仅能用于生产原料，不能商业化种植的转基因玉米品系，是国家重点监控的转基因流通产品。故本发明以转基因玉米DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140特异性靶标序列以及玉米内源基因zSSIIb为目标基因，本发明特设了TaqMan探针和TaqMan-MGB探针的设计原则，使用引物探针设计软件Primer Express 3.0(Primer Express Software for Real-time PCR,Version 3.0)设计相应的引物和探针，并委托invitrogen公司合成。
需要着重说明的是：在本发明中，由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。
在本发明中，所述的探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，第一条检测通道检测DAS-40278-9,其荧光染料的发射波长约为522nM；第二条检测通道检测GA21，其荧光染料的发射波长约为553nM；第三条检测通道检测MIR604，其荧光染料的发射波长约为582nM；第四条检测通道检测98140，其荧光染料的发射波长约为666nM。以ABIQuantStudio Q5实时荧光PCR仪(Applied biosystem)为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、VIC、NED和Cy5标记。探针的3’淬灭集团可以选择ECLIPSE或BHQ，VIC和NED荧光探针以MGB作为3’淬灭集团。
即，本发明根据波长来确定不同的靶标使用不同的通道(波长太近的话，信号会有干扰)。
本发明通过靶标基因筛选，转基因阳性样品采集，核酸样本制备，多重引物和荧光探针组合筛选，反应体系优化以及样品适用性检测等过程开发建立了四重重荧光定量PCR检测技术。
综上所述，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，同时检测转基因玉米DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140特异性靶标序列和玉米内源基因zSSIIb，建立了一整套合适的引物和探针、核酸提取及多重扩增和分析方法，对转基因玉米品(包括深加工食品)进行多重快速鉴定。与现有技术相比，本发明的技术优势在于：可以实现一管多检的实际需要，即，该技术的使用可实现一个反应管中同时检测DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140四个玉米品系的特异性基因序列，降低试剂成本，缩短检测时间；多重扩增体系中设置了内源基因的检测，可以判断核酸提取和扩增反应的有效性，避免出现假阴性反应结果；本发明为四种转基因玉米的进口贸易，市场流通情况，田间种植行为重点监控提供了参考方法，为转基因玉米的安全监管提供技术支撑。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对MIR604/GA21/DAS-40278-9/98140转基因玉米的混合样本进行鉴定的扩增曲线图谱。
图2为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对珍甜6号非转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图3使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对MIR162/NK603/1507/Mon810转基因玉米混合样本进行鉴定的扩增曲线图谱。
图4为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对Mon89034/Bt11/Mon863/Bt176转基因玉米混合样本进行鉴定的扩增曲线图谱。
图5混合样品中DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140基因多重荧光PCR反应的标准曲线图
具体实施方式
实施例1
1.1样品采集
MON810、Bt11、MON89034、MIR162、MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140、Bt-176、NK603、MON 863、1507、3272、59122、
Figure SMS_2
和
Figure SMS_3
转基因玉米品系标准品；Roundup-ready、356043、305423、DAS-68416-4、44406-6SOYA、DAS-81419-2转基因大豆品系标准品；281-24-236x 3006-210-23、XLZ30、XLZ48、C075、C072转基因棉花品系标准品；Huafan NO.1转基因番茄种子；华耐甜782A、金甜玉808、浙甜11、昌甜100、珍甜6、鄂甜玉3、金冠218、中农甜488、华美甜9、中甜300等非转基因玉米种子。
1.2基因组DNA提取
将玉米种子和果实等未加工样本采用Koning(F1612)植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5(表明核酸纯度较高，蛋白质残留较少)，OD260/230大于1.0(表明有机试剂和多糖的污染较低，提取的核酸较纯)，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
将玉米酥、玉米片、爆米花的等深加工制品采用德国Congen SureFood PREPPlant X试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取得到的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5，OD260/230大于1.0，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
1.3引物和探针设计
分别在转基因玉米DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140的基因组中外源插入载体3’端或5’端与玉米基因组的连接区序列(包括终止子或启动子序列和玉米基因组的部分序列)中使用Primer Express 3.0(ABI)软件设计多重引物和荧光探针，并在NCBI Blast中进行产物特异性验证。采用本发明特定的设计规则，探针分别使用荧光基团FAM、VIC、NED和Cy5作为发光基团，使用BHQ和MGB作为非荧光淬灭基团。引物探针可委托上海捷瑞公司合成。本发明设计的靶标DNA序列的检测引物和荧光探针见表1。
表1、用于荧光定量PCR反应的引物和探针信息
Figure SMS_4
本发明中，探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，例如：第一条检测通道检测DAS-40278-9,其荧光染料的发射波长约为522nM；第二条检测通道检测GA21，其荧光染料的发射波长约为553nM；第三条检测通道检测MIR604，其荧光染料的发射波长约为582nM；第四条检测通道检测98140，其荧光染料的发射波长约为666nM。以ABIQuantStudio Q5实时荧光PCR仪(Applied biosystem)为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、VIC、NED和Cy5标记。探针的3’淬灭集团可以选择ECLIPSE或BHQ，VIC和NED荧光探针以MGB作为3’淬灭集团。
1.4四重荧光PCR反应
将转基因玉米DAS-40278-9、GA21、MIR604和98140的基因组DNA按照1:1:1:1进行混合，做成四个转基因玉米品系的混合DNA样本，以此作为模板，在已设计合成并稀释到一定浓度的引物探针的作用下进行扩增，同时以玉米内参照基因zSSIIb的扩增情况作为质控。多重荧光定量PCR反应体系包括2×TaqMan Universal Master Mix 12.5μL，各引物探针终浓度为0.1～1μmol/L，DNA模板100ng，ddH2O补足至25μL(具体见表2)。荧光定量PCR反应参数为：95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃退火兼延伸1min，共设置40个循环。设置三个复孔的重复和非模板空白对照(模板为灭菌蒸馏水)。扩增反应在ABI QuantStudio Q5实时荧光PCR仪中进行，实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysis software进行数据分析和处理。
表2、快速鉴定转基因玉米品系的四重实时荧光PCR反应混合液组成
Figure SMS_5
说明：表2中的括号中的浓度是指该引物/探针的原始浓度，由于不同的报告集团，信号值不同，信号值强的引物探针体积需求量小，反之则大。
表3、内源基因zSSIIb单重实时荧光PCR反应混合液组成
Figure SMS_6
按照上述实施例1所述方法进行如下的检测。
实施例2、特异性检测
对实验室收集到的单转化体DNA、多转化体混合DNA以及非转基因玉米样本应用建立的多重实时荧光PCR检测技术进行特异性检测验证。
在MIR604/GA21/DAS-40278-9/98140转基因玉米的混合样本(按照1:1:1:1的比例进行混合，在25μl体系中每个DNA的浓度为100ng)中可同时检测到四个转化体的荧光信号，扩增曲线呈指数增长型，Ct值小于35，表明样品中含有这四种玉米品系的转化体成分(见图1)；在MIR604转基因玉米、GA21转基因玉米、DAS-40278-9转基因玉米、98140转基因玉米四个单转化体样本中有且仅能检测到相应引物探针组合扩增得到的荧光信号，扩增曲线呈指数增长型，Ct值小于35，表明设计的引物探针具有品系特异性。
在珍甜6非转基因玉米样本(在25μl体系中DNA的浓度约为100ng)，以及MIR162/NK603/1507/Mon810(按照1:1:1:1的比例进行混合，在25μl体系中每个DNA的浓度约为100ng)、Mon89034/Bt11/Mon863/Bt176(按照1:1:1:1的比例进行混合，在25μl体系中每个DNA的浓度约为100ng)非靶标的转化体混合样本中均未检测到荧光信号(见图2-4)，表明设计的引物探针和检测体系无信号干扰。
上述体系中，玉米内源基因zSSIIb在玉米样本中均得到有效扩增，在以灭菌蒸馏水为模板的空白对照管中无荧光信号，结果与已知样品信息结果一致，表明建立的四重实时荧光PCR反应体系具有转化体特异性，可用于转基因玉米品系及其转化体成分的快速鉴定。
实施例3、灵敏性检测
转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的基因组DNA混合样品进行10倍系列稀释后，使用建立的四重实时荧光PCR扩增，标准曲线如图5所示。MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140四个基因线性回归方程分别为y＝-3.263x+36.632，y＝-3.422x+36.384，y＝-3.294x+38.978和y＝-3.278x+37.514；Ct值变化范围分别在23.556～37.524，22.893～37.412，25.304～39.110和24.501～37.618之间；标准偏差分别在0.078～0.476，0.085～0.463，0.120～0.487和0.148～0.353之间；相关系数R2分别为0.997，0.996，0.995和0.993；经计算扩增效率分别为103％，96％，101％和103％。表明该四重实时荧光PCR扩增体系稳定灵敏，最低检测限可达到10个拷贝。
表4玉米转基因四重实时荧光PCR灵敏性检测的扩增数据
Figure SMS_7
Figure SMS_8
说明：理论拷贝数为10000，即，在25μl的反应体系中的浓度为26ng/μL。
对比实验1：改变多重实时荧光PCR反应的退火温度
将实时荧光PCR反应参数的退火温度降低，即由原来的从61℃降至55℃，其余参照实施例2，最终得到的结果为：所有实验组在四重实时荧光PCR的反应管里，由于退火温度过低，VIC标记的GA21和NED标记的MIR604两个基因出现荧光信号干扰，出现引物二聚体，因此体现的结果：在转基因玉米MIR604/GA21/DAS-40278-9/98140四重实时荧光PCR的空白对照管中出现荧光信号，Ct值为32，与实际检测结果不符，即，出现假阳性。
对比实验2：改变四重反应中GA21的探针浓度：
将四重荧光PCR反应中GA21的探针浓度增高，即由原来的0.1μmol/L升至0.2μmol/L，其余参照实施例2，最终得到的结果为：在MIR604/GA21/DAS-40278-9/98140四重实时荧光PCR体系的空白对照中出现扩增曲线(Ct值为33)，表明GA21探针过量导致出现非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，这与空白对照无荧光信号结果不符。
将四重荧光PCR反应中GA21的探针终浓度降低，即由原来的0.1μmol/L降至0.05μmol/L，其余参照实施例2，最终得到的结果为：在转基因玉米“GA21”和转基因玉米MIR604/GA21/DAS-40278-9/98140混合样本DNA中均获取不到GA21基因片段的扩增信号(无指数型扩增曲线产生)，该片段未检出，与实际检测结果不符。
对比实验3：改变DAS-40278-9转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将DAS-40278-9基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:
CACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTC，R-P:CAGTGAGTGGCTGGACAGCTAT，probe:CGACCATGGCTCATGCTGCCCT，扩增产物长度为115bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到DAS-40278-9基因片段的扩增信号(无指数型扩增曲线产生)。表明设计的DAS-40278-9基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到DAS-40278-9基因片段。
对比实验4-1、改变MIR604转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将MIR604基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:CGCGCCGGCTTCACT，R-P:AGCAACAAACGCTAGAAACCATT，probe:ACCACTAGCGCTTGTAC，扩增产物长度为62bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到MIR604基因片段的扩增信号(无指数型扩增曲线产生)，表明设计的MIR604基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到MIR604基因片段。
对比实验4-2、
若将MIR604基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:GCGCACGCAATTCAACAG，R-P:CTTAATTCTCCGCTCATGATCAGA，probe:AGGCGGGAAACGA，扩增产物长度为65bp，其余参照实施例2，所得结果为：bt11转基因玉米为模板的反应管中也扩增出了荧光信号(Ct值为32)，因此出现了非特异性扩增，表明设计的MIR604基因片段的引物和探针达不到特异性的效果。
对比实验5、改变98140转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将98140基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:GGGCCCAGCTTGCTGAGT，R-P:GCGGGACAAGCCGTTTTA，probe:CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAGT，扩增产物长度为73bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到98140基因片段的扩增信号(无指数型扩增曲线产生)。表明设计的98140基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到98140基因片段。
对比实验6、改变GA21转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将GA21基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:CGCGCCGGCTTCACTA，R-P:AGCAACAAACGCTAGAAACCATT，probe:CCACTAGCGCTTGTAC，扩增产物长度为62bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到GA21基因片段的扩增信号(无指数型扩增曲线产生)，经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增长度为20-30bp，为非特异性扩增产物。表明设计的GA21基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到GA21基因片段。
综上对比，只有本发明设计的引物和探针经特异性检测，较难形成引物二聚体，经试验验证品系特异性较强，在同一反应管中无交叉信号干扰。
实施例4、日常样本适用性检测
分别对28种不同品系的转基因作物标准品，实验室收集的10份非转基因玉米种子进行适用性检测分析，扩增结果如表5所示。结果表明建立的四重实时荧光PCR检测技术的检测准确性与《GB/T 19295.5-2018转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法》[23]中的单重实时荧光PCR结果一致，但通量高，成本低，准确性强。此外采用双盲验证法对17份盲样进行测试分析，结果见表6所示，结果表明检测结果与样品信息一致。建立的四重实时荧光PCR方法可适用于转基因玉米品系及其转化体成分的快速鉴定，尤其适用于大规模的转基因食品抽检或监测。
表5四重荧光定量PCR适用性检测结果
Figure SMS_9
Figure SMS_10
表6四重荧光定量PCR盲样检测结果
Figure SMS_11
备注说明：
MON 810、Bt11、MON89034、MIR162、MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140、Bt-176、NK603、MON 863、1507、3272、59122、
Figure SMS_12
为不同品系的转基因玉米。Roundup-ready、356043、305423、DAS-68416-4、44406-6SOYA、DAS-81419-2、281-24-236x 3006-210-23为不同品系的转基因大豆。XLZ30、XLZ48、C075、C072为不同品系的转基因棉花。Huafan NO.1为转基因番茄种子。华耐甜782A、金甜玉808、浙甜11、昌甜100、珍甜6、鄂甜玉3、金冠218、中农甜488、华美甜9、中甜300代表市售的经检测确认为非转基因玉米。

Claims (8)

1.利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定所用的引物和探针，其特征是：
转基因玉米品系MIR604的扩增引物和探针分别为：
MIR604-F:TCTGCGCACGCAATTCAA
MIR604-R:CTTAATTCTCCGCTCATGATCAGAT
MIR604-P：NED-AAGGCGGGAAACGA-MGB
转基因玉米品系GA21的扩增引物和探针分别为：
GA21-F：TCGCTCGCCTTTGGATTCT
GA21-R：GGGTGTGTTCGCCACCAT
GA21-P：VIC-CCAAAGCCGCTGATG-MGB
转基因玉米品系DAS-40278-9的扩增引物和探针分别为：
DAS-40278-9-F：CACGCGGAGCTCCATCA
DAS-40278-9-R：TACTCCTCTCGGTTCCCTATCTCA
DAS-40278-9-P：FAM-CGCTTCGCGCGACCGATGA-BHQ1
转基因玉米品系98140的扩增引物和探针分别为：
98140-F：CGTGACGATCGCCAAAGG
98140-R：GCGCGGACTTCGTTCTTCT
98140-P：Cy5-TTCAACATTCCAGCGGTCCGTGTG-BHQ3。
2.如权利要求1所述的引物和探针的设计方法，其特征是包括如下步骤：
①、检测靶标基因的筛选与确定
选择MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个转基因玉米品系；
②、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的引物和探针的设计方法，其特征是：所述步骤②中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
4.利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：利用如权利要求1所述的引物和探针，包括以下步骤：
1)、待测玉米样品中基因组DNA的提取；
2)、四重实时荧光PCR扩增体系设置；
3)、判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。
5.根据权利要求4所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
步骤2)中，25μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～1μM，SuperRealPreMix(2×)，0.4μLPassive Refereence Dye(50×)，基因组DNA 1pg～100ng；ddH2O补足至25μL。
6.根据权利要求5所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
Figure FDA0003881494010000021
7.根据权利要求6所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
四重实时荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃退火兼延伸1min，共设置40个循环。
8.根据权利要求4～7任一所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
所述步骤3)判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品品系或是否含有某品系转化体成分；依次进行以下步骤：
3.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明样品基因组DNA提取有效；反之，则判定检测无效；
3.2)、针对品系特异性基因：
一、当MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个靶标序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为非MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140转基因玉米品系或不含有这四种品系的转化体成分；
当MIR604特异性基因序列Ct值＜35时，且GA21、DAS-40278-9、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米MIR604品系或含有该品系的转化体成分；
当GA21特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、DAS-40278-9、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米GA21品系或含有该品系的转化体成分；
当DAS-40278-9特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、GA21、98140特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米DAS-40278-9品系或含有该品系的转化体成分；
当98140特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR604、GA21、DAS-40278-9特异性基因序列均无S曲线产生或均为Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米98140品系或含有该品系的转化体成分；
当出现两个及以上玉米品系的靶标序列Ct值均<35时，则判定待测样品为对应的多个玉米品系的混合样品或含有该对应的多个品系的转化体成分；
二、当35≤MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140转基因玉米品系靶标序列Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行检测，判定方式按照上述一。
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