CN116200483A - 耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法。该试剂盒包括前处理液、扩增反应液和突变检测液组，所述突变检测液组选自突变检测液A、突变检测液B、突变检测液C和突变检测液D中的至少一种；所述前处理液包括Tween20、NP‑40、Triton‑X100、PVP和NaOH；所述扩增反应液包括热启动Taq酶、UNG酶、dNTP、dUTP、5×PCR缓冲液，所述5×PCR缓冲液包括Tris‑HCl、MgCl2、BSA、甘露醇、(NH4)2SO4、Tween20和海藻糖。该试剂盒对微量血样(3ul血液或者3mm干血斑)进行一步处理，处理液直接进行后续扩增检测，不需要进行基因组DNA纯化等繁琐步骤，节约成本和时间，适合新生儿干血斑筛查检测。

Description

耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因 突变的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法。

背景技术

新生儿疾病筛查，在新生儿刚出生进行疾病的筛查和诊断，是出生缺陷三级防控重要措施，实现早发现、早诊断、早治疗，显著提高患儿预后和生活质量。耳聋是一种主要的出生缺陷，遗传因素是导致耳聋的主要原因，大量分子流行病学研究显示，GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA以及GJB3基因是中国人群最常见的耳聋遗传致病基因，这4个基因中的主要20个位点覆盖90％以上耳聋致病突变，因此临床上通常通过检测这些热点突变来进行耳聋基因检测。新生儿进行耳聋遗传基因检测意义尤为显著，将耳聋干预时间点提前，避免更多的耳聋发生。新生儿疾病筛查由各地区新生儿疾病筛查中心管理实施，通常在新生儿出生第三天采集足跟血，制作干血斑并传递到新生儿疾病筛查中心完成检测。因此，实现新生儿疾病筛查试剂盒必须是能实现通过干血斑进行检测。

对于耳聋基因进行检测方法主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、Taqman荧光定量、变性高效液相色谱(DHPLC)技术、等位特异性PCR、SNaP shot测序技术、高通量测序技术、基因芯片以及DNA直接测序等，这些方法一般在临床诊断实验室用的多，由于检测步骤繁琐、仪器昂贵、检测通量限制等原因，临床应用推广受到极大限制。

目前临床应用较多的耳聋基因检测试剂盒主要有北京博奥生物技术有限公司的十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)和潮州凯普生物的耳聋易感基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)，这两个试剂盒技术主要是液相芯片杂交的原理，实现多管PCR扩增检测15个突变热点，但这些方法需要专用仪器，价格昂贵，操作步骤多而且复杂，耗时费力，而且需要开盖处理PCR产物，极其容易引起PCR污染。

华大基因研发的耳聋基因检测试剂盒，基于高通量测序技术，虽然能检测20个突变热点，但高通量测序技术检测成本高，操作繁琐，而且需要较多样本量，并不适合大规模人群的新生儿筛查检测。

厦门大学相关专利《一种耳聋易感基因突变检测试剂盒极其制备方法与应用》(专利号CN104263848B)和深圳亚能生物《一种遗传性耳聋基因检测试剂盒》(专利号CN106811533B)，均采用荧光定量PCR平台，通过荧光探针熔解曲线方法，可同时检测20个以上突变热点，但均需使用抗凝血纯化的DNA，而新生儿筛查只能采集有限的干血斑，无法提供抗凝血，因此这两种试剂盒不适合进行新生儿耳聋基因筛查。

目前国内尚缺乏一种针对新生儿干血斑样本、操作简单、成本低、检测位点多、高通量的适合用于新生儿耳聋基因筛查的试剂盒，这极大制约了新生儿耳聋基因筛查的推广和普及。耳聋基因突变位点检测，最有意义的是新生儿筛查，因此开发直接针对干血斑样本检测的灵敏度更高的试剂盒非常有必要，随着目前新生儿筛查病种的增加，采血制作的干血斑的数量需求也相应增加，因此，开发微量干血斑样本检测技术，不增加新生儿干血斑采集数量，在现有血斑上完成检测，对新生儿普及耳聋基因遗传基因突变位点筛查检测非常重要。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术中存在的需要较多血液样本、前处理和检测操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供可以检测微量血液样本、快速处理、简便快捷、灵敏度高、可靠性强和/或成本较低的基于多色探针熔解曲线技术的一种耳聋易感基因突变检测试剂盒。

本发明提供了一种耳聋遗传基因突变检测试剂盒，包括前处理液、扩增反应液和突变检测液组，所述突变检测液组选自突变检测液A、突变检测液B、突变检测液C和突变检测液D中的至少一种；

所述前处理液包括Tween20、NP-40、Triton-X100、PVP和NaOH；

所述扩增反应液包括热启动Taq酶、UNG酶、dNTP、dUTP、5×PCR缓冲液，所述5×PCR缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、BSA、甘露醇、(NH4)₂SO₄、Tween20和海藻糖；

所述突变检测液A包括用于特异性扩增含有突变位点组合A的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合A包括选自GJB2基因35位点(c.35delG)、GJB2基因167位点(c.167delT)、GJB2基因176_191位点(c.176_191del 16)、GJB2基因299_300位点(c.299_300del AT)、GJB2基因235位点(c.235delC)和SLC26A4基因1707+5位点(c.1707+5G＞A)中至少一种；

所述突变检测液B包括用于特异性扩增含有突变位点组合B的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合B包括选自SLC26A4基因919位点(c.919-2A＞G)、SLC26A4基因1174位点(c.1174A＞T)、SLC26A4基因1226位点(c.1226G＞A)、SLC26A4基因1229位点(c.1229C＞T)、GJB3基因538位点(c.538C＞T)和GJB3基因547位点(c.547G＞A)中的至少一种；

所述突变检测液C包括用于特异性扩增含有突变位点组合C的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合C包括选自线粒体12S rRNA基因1494位点(c.1494C＞T)、线粒体12S rRNA基因1555位点(c.1555A＞G)、SLC26A4基因2162位点(c.2162C＞T)、SLC26A4基因2168位点(c.2168A＞G)、SLC26A4基因1975位点(c.1975G＞C)和SLC26A4基因2027位点(c.2027T＞A)中的至少一种；

所述突变检测液D包括用于特异性扩增含有突变位点组合D的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合D包括选自SLC26A4基因917位点(c.917insG)、SLC26A4基因281位点(c.281C＞T)、SLC26A4基因589位点(c.589G＞A)、GJB2基因427位点(c.427C＞T)和GJB2基因512位点(c.512513insAACG)中的至少一种。

可选地，探针类型为双探针淬灭系统(Dual-probe quenching system)。

本发明使用自主开发的多重相邻探针熔解曲线分析(Multiplex adjacentprobes melting curve analysis，MapMCA)技术，设计相邻淬灭双探针系统(即双探针淬灭系统)进行熔解曲线分析，原理如图1，相邻淬灭双探针系统由两条探针配合使用，一条突变检测探针标记荧光基团，配套的锚定探针标记淬灭基团，突变检测探针和锚定探针与靶标DNA结合位置相邻。通过非对称PCR扩增产生单链靶标产物DNA后，熔解曲线过程中，两条探针退火杂交在目标DNA序列上，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光基团的荧光被淬灭，荧光信号低，随着温度升高，杂交双链慢慢解链，荧光标记的突变检测探针与锚定探针分离，荧光基团与淬灭基团距离变大，淬灭效果逐渐减弱，荧光信号变强，荧光信号变化速率最快的温度就是探针检测的熔点(Tm)值。如图2所示，突变检测探针覆盖待检测的突变位点，因为突变位点的存在，突变检测探针与靶标中的突变型位点不能完全结合，造成双链结构稳定性降低，因此熔解曲线分析中，Tm下降，从而实现检测遗传基因突变位点的功能。

相邻淬灭双探针系统与目前市场常用的自淬灭探针原理(如图1所示)不一样，自淬灭探针是一条探针，两端分别标记荧光基团和淬灭基团，没有靶标存在时，探针自然卷曲，荧光基团和淬灭基团靠近，从而荧光基团荧光被淬灭，当有靶标存在时，探针退火与靶标杂交，荧光基团和淬灭集团距离拉开，从而荧光信号出现。

荧光探针熔解曲线检测靶标的灵敏度和效果取决于荧光基团解离淬灭基团时候产生的信号差，自淬灭探针在自然卷曲状态，荧光基团和淬灭基团仍会有较大距离空间，而相邻淬灭双探针通过杂交在靶标DNA相邻位置，荧光基团和淬灭基团通过双链杂交距离紧靠在一起，淬灭基团距离荧光基团更近，淬灭效果更佳，荧光信号在淬灭基团分离后产生的荧光信号差的强度要好于自淬灭探针熔解曲线，就是Tm峰值高，从而提升检测效果，实现更微量干血斑样本的检测。

上述耳聋遗传基因突变检测试剂盒还可包括标准对照液和/或阴性对照液。所述标准对照液含有正常人基因组DNA或者正常人干血斑，所述正常人基因组DNA即为不含有上述突变位点突变的人基因组DNA。所述阴性对照液不含有上述目标片段，例如所述阴性对照液可为去离子水。

可选地，根据上述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，所述前处理液包括0.5％-2.5％(体积百分比)Tween20、0.02％-1％(体积百分比)NP-40、0.05％-0.2％(体积百分比)Triton-X100、0.02％-1％(质量百分比)PVP、0.02-0.4M NaOH；6.55ul所述扩增反应液包括0.5-2U热启动Taq酶、0.025-0.25U UNG酶、5-10nmol dNTP、5-10nmol dUTP、5×PCR缓冲液；所述扩增反应液中的5×PCR缓冲液包括50-500mM Tris-HCl(pH 8.8)、15-30mM MgCl₂、0.25％-10％(质量百分比)BSA、0％-15％(质量百分比)甘露醇，50-200mM(NH4)₂SO₄、0.025％-0.5％(体积百分比)Tween20和5-30％(质量百分比)海藻糖。

可选地，根据上述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，所述探针由与所述目标片段特异结合的突变检测探针和与所述目标片段特异结合的锚定探针组成，所述突变检测探针与所述突变位点特异结合，所述突变检测探针和所述锚定探针这两种探针中，一种探针一端标记荧光基团，另一种探针一端标记相应的淬灭基团，所述突变检测探针和锚定探针与所述目标片段结合后，所述淬灭基团与所述荧光基团相互作用不产生荧光。

所述荧光基团可选自AMCA、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Atto 425、ATTO590、Cy3、Cy5、CY5.5、Cy7、6-FAM、HEX、JOE、NED、ROX、Pacific Blue、Quasar 570、Quasar670、TAMRA、TET、Texas Red和VIC至少一种。所述淬灭基团可选自DABCYL、BHQ类淬灭剂、ECLIPSE、MGB和TAMRA至少一种。

可选地，根据上述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，

所述杂交突变位点组合A的探针包括FP1-Q1探针、FP2-Q2探针、FP3-Q3探针、FP4-Q4探针和FP5-Q5探针中的至少一种，

FP1-Q1探针由序列为SEQ ID No.23的突变检测探针和SEQ ID No.24的锚定探针组成，

FP2-Q2探针由序列为SEQ ID No.25的突变检测探针和SEQ ID No.26的锚定探针组成，

FP3-Q3探针由序列为SEQ ID No.27的突变检测探针和SEQ ID No.28的锚定探针组成，

FP4-Q4探针由序列为SEQ ID No.29的突变检测探针和SEQ ID No.30的锚定探针组成，

FP5-Q5探针由序列为SEQ ID No.31的突变检测探针和SEQ ID No.32的锚定探针组成；

所述杂交突变位点组合B的探针包括FP6-Q6探针、FP7-Q7探针、FP8-Q7探针、FP9-Q8探针的至少一种，

FP6-Q6探针由序列为SEQ ID No.33的突变检测探针和SEQ ID No.34的锚定探针组成，

FP7-Q7探针由序列为SEQ ID No.35的突变检测探针和SEQ ID No.36的锚定探针组成，

FP8-Q7探针由序列为SEQ ID No.37的突变检测探针和SEQ ID No.36的锚定探针组成，

FP9-Q8探针由序列为SEQ ID No.38的突变检测探针和SEQ ID No.39的锚定探针组成，

所述杂交突变位点组合C的探针包括FP10-Q9探针、FP1 1-Q10探针、FP12-Q11探针、FP13-Q12探针、FP14-Q12探针的至少一种，

FP10-Q9探针由序列为SEQ ID No.40的突变检测探针和SEQ ID No.41的锚定探针组成，

FP11-Q10探针由序列为SEQ ID No.42的突变检测探针和SEQ ID No.43的锚定探针组成，

FP12-Q11探针由序列为SEQ ID No.44的突变检测探针和SEQ ID No.45的锚定探针组成，

FP13-Q12探针由序列为SEQ ID No.46的突变检测探针和SEQ ID No.47的锚定探针组成，

FP14-Q12探针由序列为SEQ ID No.48的突变检测探针和SEQ ID No.47的锚定探针组成，

所述杂交突变位点组合D的探针包括FP15-Q13探针、FP16-Q14探针、FP17-Q15探针、FP18-Q16探针、FP19-Q17探针的至少一种，

FP15-Q13探针由序列为SEQ ID No.49的突变检测探针和SEQ ID No.50的锚定探针组成，

FP16-Q14探针由序列为SEQ ID No.51的突变检测探针和SEQ ID No.52的锚定探针组成，

FP17-Q15探针由序列为SEQ ID No.53的突变检测探针和SEQ ID No.54的锚定探针组成，

FP18-Q16探针由序列为SEQ ID No.55的突变检测探针和SEQ ID No.56的锚定探针组成，

FP1P19-Q17探针由序列为SEQ ID No.57的突变检测探针和SEQ ID No.58的锚定探针组成。

可选地，所述突变检测探针的3’端标记荧光基团，所述锚定探针的5’端标记淬灭基团，或者突变检测探针的5’端标记荧光基团，所述锚定探针的3’端标记淬灭基团。可选地，无标记荧光基团或淬灭基团的3’端进行C3 Spacer修饰处理。

可选地，根据上述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合A的目标片段的扩增引物为A引物对组合物中的至少一种引物对，所述A引物对组合物由F1-R1引物对和F2-R2引物对组成，所述F1-R1引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.1-2所示，所述F2-R2引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.3-4所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合B的目标片段的扩增引物为B引物对组合物中的至少一种引物对，所述B引物对组合物由F3-R3引物对、F4-R5引物对和F5-R5引物对组成，所述F3-R3引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.5-6所示，所述F4-R4引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.7-8所示，所述F5-R5引物对的两条单链DNA的序列如SEQID No.9-10所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合C的目标片段的扩增引物为C引物对组合物中的至少一种引物对，所述C引物对组合物由F6-R6引物对、F7-R7引物对和F8-R8引物对组成，所述F6-R6引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.11-12所示，所述F7-R7引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.13-14所示，所述F8-R8引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.15-16所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合D的目标片段的扩增引物为D引物对组合物中的至少一种引物对，所述D引物对组合物由F3-R3引物对、F9-R9引物对、F10-R10引物对和F11-R11引物对组成，所述F9-R9引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.17-18所示，所述F10-R10引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.19-20所示，所述F11-R11引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.21-22所示，

每个引物对是两条单链DNA。

本发明还提供了一种应用于熔解曲线分析的试剂组合物，所述试剂组合包括上述的前处理液和上述的扩增反应液。

本发明还提供了一种提取DNA的试剂组合物，所述试剂组合包括上述的前处理液。

本发明还提供了一种用于检测耳聋遗传基因突变的探针组合物，包括上述的至少一种探针。

本发明还提供了一种用于检测耳聋遗传基因突变的探针引物组合物，包括上述的至少一种探针和上述的至少一种引物对。

上述耳聋遗传基因突变检测试剂盒、上述的试剂组合物、上述的探针组合物或上述的探针引物组合物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围之内。应用具体可为，

(1)遗传性耳聋基因筛查，例如新生儿遗传性耳聋基因筛查；

(2)致聋基因类型的识别，例如新生儿致聋基因类型的识别；

(3)预防耳聋疾病发生；

(4)制备遗传性耳聋基因筛查产品；

(5)制备致聋基因类型的识别产品；

(6)制备预防耳聋疾病发生产品。

本发明还提供了一种检测基因突变的方法，包括

(a1)通过非对称PCR扩增含有待检基因突变位点的核酸片段，在所述非对称PCR中，反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针结合，并且在扩增前在扩增反应中加入所述探针，所述探针由突变检测探针和锚定探针组成，所述突变检测探针与所述待检基因突变位点特异结合，所述突变检测探针和所述锚定探针这两种探针中，一种探针一端标记荧光基团，另一种探针一端标记相应的淬灭基团，所述突变检测探针和锚定探针与所述核酸片段结合后，所述淬灭基团与所述荧光基团相互作用不产生荧光；

(a2)扩增结束后，对步骤(a1)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，获得所述核酸片段的荧光信号；根据所述核酸片段的荧光信号确定所述核酸片段是否存在相应基因突变。

所述核酸片段不存在基因突变命名为野生型基因。所述核酸片段存在基因突变命名为突变基因。

可选地，上述方法中，根据所述核酸片段的荧光信号确定所述核酸片段是否存在相应基因突变包括根据所述核酸片段和标准对照的荧光信号差异确定是否存在相应基因突变。

所述标准对照为含有待检基因突变位点，且所述待检基因突变位点不存在基因突变(即野生型基因)的核酸片段，所述标准对照的荧光信号通过下述步骤获得：

(b1)通过非对称PCR扩增所述标准对照，在所述非对称PCR中，反应混合物中所述PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针结合，并且在扩增前在扩增反应中加入所述探针；

(b2)扩增结束后，对步骤(b1)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，获得所述标准对照的荧光信号。

可选地，所述突变检测探针一端标记荧光基团，所述锚定探针一端标记相应的淬灭基团。

所述突变检测探针与所述待检基因突变位点特异结合可为所述突变检测探针与所述野生型基因特异结合，也可为所述突变检测探针与所述突变基因特异结合。

所述荧光基团可选自AMCA、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Atto 425、ATTO590、Cy3、Cy5、CY5.5、Cy7、6-FAM、HEX、JOE、NED、ROX、Pacific Blue、Quasar 570、Quasar670、TAMRA、TET、Texas Red和VIC至少一种。所述淬灭基团可选自DABCYL、BHQ类淬灭剂、ECLIPSE、MGB和TAMRA至少一种。

上述检测基因突变的方法例如可为检测多个区域基因突变的方法，则该方法中的PCR扩增引物为多对分别对应不同区域的核酸片段的PCR扩增引物，探针为多个分别对应不同区域的核酸片段的探针。

上述检测基因突变的方法具体可以待测样本的基因组DNA为模板，采用上述的耳聋遗传基因突变试剂盒或上述的试剂组合物进行PCR扩增和熔解曲线分析；

所述PCR扩增程序包括50℃2min，95℃10min；95℃10s，62℃10s，72℃20s，15个循环；95℃10s，56℃15s，72℃20s，50个循环；

所述熔解曲线分析程序包括95℃1min，37℃3min，40℃到85℃以0.04℃/s的速度升温进行熔解曲线分析。

上述检测基因突变的方法还可包括混合所述前处理液和所述待测样本，95℃，10min获得混合液；离心所述混合液，2500rpm(500g)，5min获得提取液；混合所述扩增反应液、所述突变检测液组中的一种突变检测液和所述提取液获得检测反应体系；将所述检测反应体系进行所述PCR扩增获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行所述熔解曲线分析获得荧光信号；根据所述荧光信号确定所述待测样本是否存在相应基因突变。

上述检测基因突变的方法还可包括：以所述标准对照液为样本，采用上述的耳聋遗传基因突变试剂盒或上述的试剂组合进行PCR扩增和熔解曲线分析获得标准对照荧光信号，根据所述标准对照荧光信号确定Tm_标准对照值。则所述根据所述荧光信号确定所述待测样本是否存在相应基因突变包括：根据所述荧光信号确定所述熔解曲线的Tm值，根据ATm＝Tm-Tm_标准对照获得ΔTm值，根据ΔTm值确定所述待测样本是否存在相应基因突变。采用标准对照作为校正，可减少不同仪器和人员操作而引起的熔点误差。

可选地，根据ΔTm值确定所述待测样本是否存在相应基因突变具体为参照下述实施例中表9-表12确定所述待测样本是否存在相应基因突变。

待测样本可为血液或干血斑，例如微量血液或微量干血斑。

针对现有耳聋基因检测试剂需要较多血样并纯化基因组DNA，不适合应用于新生儿干血斑筛查检测等缺点，本发明提供的试剂盒对微量血样(3ul血液或者3mm干血斑)进行一步处理，处理液直接进行后续扩增检测，不需要进行基因组DNA纯化等繁琐步骤，节约成本和时间，适合新生儿干血斑筛查检测。

本发明提供的试剂盒、引物探针组合物以及检测方法可通过相邻淬灭双探针系统增强检测信号，灵敏度达1ng，实现微量血样(干血斑3mm，全血3u1)样本检测多个耳聋基因突变位点，不额外增加采血样本的情况下，有利于新生儿筛查检测。

本发明提供的试剂盒以及检测方法通过含扩增优化剂的反应体系，实现微量血样(干血斑3mm，全血3ul)免纯化基因组DNA进行PCR扩增，15分钟完成前处理，整个检测约2.5小时完成，节约时间和纯化费用，适合新生儿干血斑高通量耳聋基因突变位点筛查检测。

本发明提供的试剂盒高效便捷，检测位点多。一次反应通过4个反应体系检测23个常见耳聋基因突变位点。采用热启动Taq酶，降低非特异性扩增，采用UDG酶防污染处理，无需打开PCR产物，避免PCR产物气溶胶污染。

本发明提供的试剂盒不仅能检测线粒体基因突变位点c.1494C＞T、c.1555A＞G的均质突变，还能检测出异质性突变(突变检测比例10％以上)。

本发明提供的试剂盒探针序列进行优化，增加野生型和突变型位点的Tm值差异，有利于判读分辨，结合阳性样本曲线，自动分析样本突变位点检测结果。

附图说明

图1为自淬灭探针和相邻淬灭双探针原理。

图2为双探针检测区别基因野生型和突变型原理。

图3为本发明双探针体系和自淬灭探针检测对比熔解峰，图3A中1-5为本发明双探针体系检测熔解峰，6-10为自淬灭探针检测熔解峰，1和10为c.1707+5G＞A位点，2和6为c.235delC位点，3和9为c.299-300delAT位点，4和7为c.35delG位点，5和8为c.176-191del16位点，图3B中1-4为本发明双探针体系检测熔解峰，5-8为自淬灭探针检测熔解峰，1和5为c.919-2A＞G，2和6为c.1226G＞A/c.1229C＞T位点，3和8为c.1174A＞T位点，4和7为c.538C＞T位点，图3C中1-5为本发明双探针体系检测熔解峰，6-10为自淬灭探针检测熔解峰，1和7为c.1975G＞C位点，2和9为c.1555A＞G位点，3和6为c.2168A＞G位点，4和8为c.2027T＞A位点，5和10为c.1494C＞T位点，图3D中1-5为本发明双探针体系检测熔解峰，6-10为自淬灭探针检测熔解峰，1和6为c.917ins G位点，2和8为c.427C＞T位点，3和7为c.589G＞A位点，4和9为c.281C＞T位点，5和10为c.512513insAACG位点。

图4为双探针体系与自淬灭探针检测对比。

图5为干血斑直接提取与血液基因组纯化检测对比。

图6为本发明含扩增优化剂缓冲体系与酶通用缓冲剂检测对比，图6A检测反应体系A信号对比，图6B为检测反应体系D信号对比。

图7为检测反应体系A中各位点质粒检测。

图8为检测反应体系B中各位点质粒检测。

图9为检测反应体系C中各位点质粒检测。

图10为检测反应体系D中各位点质粒检测。

图11为c.2162C＞T和c.2168A＞G位点探针优化，图11A为突变检测探针FP12检测c.2162C＞T和c.2168A＞G位点，图11B为突变检测探针FP12b检测c.2162C＞T和c.2168A＞G位点。

图12为c.1226G＞A和c.1229C＞T位点探针优化，图12A为突变检测探针FP8检测c.1226G＞A和c.1229C＞T位点，图12B为突变检测探针FP8b检测c.1226G＞A和c.1229C＞T位点。

图13为线粒体c.1555A＞G和c.1494C＞T突变型不同比例检测，图13A为c.1555A＞G突变型不同比例检测，图13B为c.1494C＞T突变型不同比例检测。

图14为临床样本检测反应体系A中位点突变检测。

图15为临床样本检测反应体系B中位点突变检测。

图16为临床样本检测反应体系C中位点突变检测。

图17为临床样本检测反应体系D中位点突变检测。

图18为临床干血斑样本检测反应体系A中位点突变检测。

图19为临床干血斑样本检测反应体系B中位点突变检测。

图20为临床干血斑样本检测反应体系C中位点突变检测。

图21为临床干血斑样本检测反应体系D中位点检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验。

本发明中所述正常人基因组DNA中的GJB2基因的核苷酸序列为genbank登陆号为NC_000013.11的第20187470至第20192938位，2021年11月22日；GJB3基因的核苷酸序列为genbank登陆号为NC_000001.11的第34781214至第34786364位，2021年11月22日；SLC26A4基因的核苷酸序列为genbank登陆号为NC_000007.14的第107660828至第107717809位，2021年11月22日；线粒体12S rRNA基因的核苷酸序列为genbank登陆号为NC_012920.1的第648至第1601位，2020年9月2日。

热启动Taq酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B110003-2500。

UNG酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B110042-0200。

实施例1、耳聋遗传基因突变检测试剂盒的制备及使用方法

本试剂盒可同时检测4个遗传性耳聋基因的23个位点的突变，包括GJB2上的c.35del G、c.176_191del 16、c.167delT、c.235del C、c.299_300del AT、c.427C＞T、c.512_513insAACG，GJB3上的c.538C＞T、c.547G＞A，SLC26A4上的c.281C＞T、c.589G＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G、c.919-2A＞G(IVS7-2A＞G)、c.917ins G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1707+5G＞A(IVS15+5G＞A)、c.1975G＞C、c.2027T＞A，线粒体12SrRNA上的c.1494C＞T、c.1555A＞G。

一、引物的制备

针对23个突变位点的序列设计多对引物，通过筛选和组合，最终选择一批特异性和效果好的引物，各突变位点的扩增引物和优选组合序列见表1，根据下述表1中的引物序列合成引物。

表1引物相关信息

二、探针的制备

根据下述表2信息制备探针，其中，FP1-FP19为突变检测探针，Q1-Q17为锚定探针。

其中荧光基团为FAM、HEX、CY5、ROX中的一种，淬灭基团为能与荧光基团配套的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团中的一种，部分锚定探针标记MGB淬灭基团提高Tm值，C3 Spacer为封闭基团，在探针DNA序列3端防止探针作为引物延申。所述的突变检测探针和锚定探针配套使用，突变检测探针5’标记荧光基团同时3’进行C3 Spacer修饰处理，配套锚定探针3’标记淬灭基团；或者突变检测探针3’标记荧光基团，配套锚定探针5’标记淬灭基团同时3’进行C3 Spacer修饰处理。

其中，因为有的突变位点位置接近，c.1174A＞T和c.1226G＞A、c.1229C＞T位点共用一个淬灭探针Q7，c.1975G＞C和c.2027T＞A共用一个淬灭探针Q12。

表2探针的相关信息

三、耳聋遗传基因突变检测试剂盒的制备

耳聋遗传基因突变检测试剂盒(100人份)由前处理液15ml、扩增反应液700μl、突变检测液A 660μl、突变检测液B 660μl、突变检测液C 660μl、突变检测液D 660μl、标准对照液100μl、阴性对照液500μl组成。

前处理液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1.5％(体积百分比)Tween20、0.2％(体积百分比)NP-40、0.1％(体积百分比)Tiiton-X100、0.2％(质量百分比)PVP、0.2M NaOH，上述试剂采购之生工生物工程(上海)股份有限公司。

每个扩增反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：在6.55ul扩增反应液中，2U热启动Taq酶、0.25U UNG酶、10nmol dNTP、10nmol dUTP、5ul 5×PCR缓冲液和水组成，其中，5×PCR缓冲液含有扩增优化剂，由375mM Tris-HCl(PH 8.8)、20mM MgCl₂、2.5％(质量百分比)BSA、15％(质量百分比)甘露醇，80mM(NH4)₂SO₄、0.05％(体积百分比)Tween20、25％(质量百分比)海藻糖和水组成，上述试剂(除BSA)采购之生工生物工程(上海)股份有限公司，BSA采购之Sigma公司。

扩增反应液(1个扩增反应)用量如表3所示。

表3扩增反应液用量

试剂	1人份(μl)
		5xPCR缓冲液	5
5U/ul Hot-Taq酶(上海生工)	0.4
		10mM dNTP(上海生工)	1
100mM dUTP(上海生工)	0.1
		5U/ul UDG酶(上海生工)	0.05
共计	6.55

突变检测液A由表4所示引物储存液、探针储存液和去离子水混合制备而成。

表4突变检测液A配方

突变检测液B由表5所示引物储存液、探针储存液和去离子水混合制备而成。

表5突变检测液B配方

突变检测液C由表6所示引物储存液、探针储存液和去离子水混合制备而成。

表6突变检测液C配方

突变检测液D由表7所示引物储存液、探针储存液和去离子水混合制备而成。

表7突变检测液D配方

所述标准对照为正常人干血斑，即为野生型干血斑。

阴性对照液为去离子水。

四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法

1、待测样本前处理

在待测样本(3mm干血斑或3ul全血)中加入100ul前处理液，95℃加热处理10min获得混合液，对混合液进行2500rpm，5min的离心，获得提取液。

2、配置检测反应体系

将扩增反应液6.55ul、检测基因组模板(待测样本提取液、质粒或纯化基因组DNA)2ul分别与6ul突变检测液A、B、C、D混合，用去离子水补齐到25ul，离心去除气泡，获得检测反应体系A、检测反应体系B、检测反应体系C、检测反应体系D。

将扩增反应液6.55ul、标准对照血斑样本提取液2ul分别与6ul突变检测液A、B、C、D混合，用去离子水补齐到25ul，获得标准对照检测反应体系A、标准对照检测反应体系B、标准对照检测反应体系C、标准对照检测反应体系D。

将扩增反应液6.55ul、阴性对照2ul分别与6ul突变检测液A、B、C、D混合，用去离子水补齐到25ul，获得阴性对照检测反应体系A、阴性对照检测反应体系B、阴性对照检测反应体系C、阴性对照检测反应体系D。

3、检测

采用荧光定量PCR仪(上海宏石SLAN-96S)对上述检测反应体系进行PCR扩增和熔解曲线分析。

PCR扩增程序：

50℃2min，95℃10min；

95℃10s；62℃10s；72℃20s；15个循环

95℃10s；56℃15s；72℃20s；50个循环

熔解曲线分析程序：

95℃1min，37℃3min，40℃到80℃以0.04℃/s的速度升温进行熔解曲线分析，并同时收集FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号。

4、结果分析

由荧光定量PCR仪配置软件根据上述荧光信号获得上述反应检测体系各通道的Tm值。

Tm值以仪器自动判读值为准，但出现仪器无法给出Tm值时，可通过调整基线或人工判读获得Tm值。

标准对照反应体系A/B/C/D中的FAM/HEX/CY5/ROX通道均有Tm在参考值范围内的熔解峰(如表8所示)，且阴性对照反应体系的FAM/HEX/CY5/ROX通道无明确熔解峰，则本次检测扩增系统有效。

检测反应体系A/B/C/D中的FAM/HEX/CY5/ROX通道如缺失熔解峰，则说明对应的位点扩增失败，检测结果无效，需重新提取样本进行检测。

阴性对照检测反应体系有荧光通道出现熔解峰，则说明此次实验结果无效，建议重复实验。

标准对照检测反应体系的各通道无熔解峰，表示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。

表8标准对照熔解峰Tm的参考值范围

该方法检测原理为，检测反应体系A/B/C/D中的FAM/HEX/CY5/ROX通道中出现的熔解峰，与野生型熔解峰(即标准对照反应体系A/B/C/D中的FAM/HEX/CY5/ROX通道中出现的熔解峰)对比，根据Tm差异判断是否发生突变。在检测反应体系A/B/C/D中的FAM/HEX/CY5/ROX通道中出现的熔解峰中，只有野生型峰，则为待测样本的对应基因位点为野生型；只有突变型峰，则待测样本的对应基因位点为纯合突变型；同时出现野生型峰和突变型峰，则待测样本的对应基因位点为杂合突变型。

具体判断方法及标准如下所述。

根据多色探针熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm值的变化进行判断待检样本是否含有相应基因突变，以及基因突变的类型。将检测反应体系的各通道Tm值记为Tm，相应标准对照检测反应体系的各通道Tm值记为Tm_标准对照，通过公式ΔTm＝Tm-Tm_标准对照获得ΔTm值，根据ΔTm值参照表9-表12确定所述待测样本是否存在相应基因突变，以及突变类型。这其中涉及待测样本和标准对照Tm值的读取(由荧光PCR仪配置软件自动获得)，标准对照作为校正，用来减少不同仪器和人员操作而引起的熔点误差。

表9和表11中，ROX通道有两个熔解峰，Tm值低的为ROX1，Tm值高的为ROX2。表12中，FAM通道有两个熔解峰，Tm值低的为FAM1，Tm值高的为FAM2。

表9反应体系A突变判断标准

表10反应体系B突变判断标准

表11反应体系C突变判断标准

表12反应体系D突变判断标准

实施例2、相邻淬灭双探针与自淬灭探针对比检测

本实施例的待测样本为正常干血斑。

采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。

为比较相邻淬灭双探针与自淬灭探针检测效果，合成耳聋基因常见主要突变位点的自淬灭探针(上海生工生物公司)，序列与本发明试剂盒中各检测位点的检测突变探针DNA序列一样，FAM/HEX/CY5/ROX为标记的荧光基团，BHQ1/BHQ2为标记的淬灭基团，探针具体结构如表13所示。

表13主要突变位点和双探针检测体系对比的自淬灭探针

自淬灭检测反应体系配制，引物浓度和荧光检测探针浓度与本发明实施例1中保持一致。

自淬灭反应体系A具体配制方法如表14。

表14自淬灭反应体系A配方

自淬灭反应体系B具体配制方法如表15。

表15自淬灭反应体系B配方

自淬灭反应体系C具体配制方法如表16。

表16自淬灭反应体系C配方

自淬灭反应体系D具体配制方法如表17。

表17自淬灭反应体系D配方

按照实施例1中的方法配制PCR扩增体系：扩增反应液6.55ul，加入相同干血提取液2ul，分别用实施例1中本发明突变检测反应体系A/B/C/D，和自淬灭检测反应体系A/B/C/D各6ul，去离子水补加到25ul，按照实施例1中方法进行PCR扩增和分析。

结果显示，主要耳聋基因突变位点，本发明的相邻猝灭双探针检测熔解峰，c.176-191del16、c.538C＞T两个位点与自淬灭探针检测相近，其他位点均不同程度明显强于自猝灭探针，检测熔解峰效果对比见图3本发明双探针体系和自淬灭探针检测对比熔解峰，数据分析见图4双探针体系与自淬灭探针检测对比，具体数据见表18，检测1-8分别代表一次重复检测。

表18双探针体系与自淬灭探针检测结果

实施例3、灵敏度测试

按实施例1中配制反应体系，用天根基因组纯化试剂盒纯化血液DNA，梯度稀释，每个反应体系分别加入20ng、10ng、5ng、2.5ng、1.25ng、0.625ng、0.312ng、0.156ng的基因组DNA，检测方法参考实施例1中“四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法”。

结果表明，大部分位点在0.156ng信号良好，少数位点在0.312ng信号明显减弱，而0.625ng基因组DNA模板，所有位点信号良好，因此检测灵敏度设置1ng/25ul反应体系，确保检测信号质量。基因组DNA稀释每个反应加入1ng，20个重复反应检测，检测信号均良好。

实施例4、DNA提取实验

本实施例的样本为正常干血斑样本。

采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对样本进行DNA直接提取，提取方法和实施例1中“四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法1、待测样本前处理”相同。

采用基因组提取试剂盒对上述同样干血斑样本进行DNA提取，基因组提取试剂盒为干血斑基因组DNA提取试剂盒DP334-2(天根生化科技(北京)有限公司)。

对上述提取的DNA进行检测，检测方法参考实施例1中“四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法”，将扩增反应液6.55ul、通过基因组纯化试剂盒提取DNA样本2ul(2ng/ul)分别与突变检测液A、B、C、D混合，用去离子水补齐到25ul，离心去除气泡，获得检测反应体系A、检测反应体系B、检测反应体系C、检测反应体系D。PCR扩增和信号检测结果分析参考实施例1中“四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法”。

结果显示，如图5，具体数据见表19，检测1-6分别代表一次重复检测。加入2ul干血斑处理液，检测信号良好。干血斑直接处理液和纯化血液基因组DNA检测效果一致，本试剂盒直接对干血斑样本处理和采用商业基因组提取试剂盒获取纯化基因组进行检测的效果一致。

表19干血斑直接提取和血液纯化基因组检测结果

实施例5、优化剂效果

干血斑全血样本未经过核酸纯化，含有众多干扰成分，为实现干血斑样本直接提取进行检测分析，本发明反应体系加入了扩增优化剂，提高对血液抑制剂的抗抑制能力，试剂盒经过一系列优化筛选，最终确定含扩增优化剂的扩增反应缓冲液，与普通Taq酶自带反应缓冲液(上海生工生物公司)，进行对比测试。

本实施例的样本为正常干血斑样本。

实验分为2组，实验组和对照组。

实验组采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对样本进行检测，检测方法和实施例1中“四、应用耳聋遗传基因突变检测试剂盒的检测方法”相同。

对照组与实验组处理方法类似，不同之处仅在于其中的5×PCR缓冲液使用普通Taq酶自带反应缓冲液(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

结果如图6所示，对于血斑样本直接提取液，本发明的含扩增优化剂的扩增反应缓冲液，所有待测信号良好，而采用普通Taq酶自带反应缓冲液的反应体系有部分位点(反应体系A中的GJB2基因的c.35del G、c.176_191del 16、c.235del C、c.299_300del AT以及反应体系D中的GJB2基因的c.427C＞T，512_513insAACG)未检出信号，其他位点信号强度也低于本发明扩增反应体系的信号。

实施例6、检测质粒

本实施例的样本为质粒(相关信息如表20)，包含待检测基因位点野生型或突变型基因序列(委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成制备，采用基因合成方式合成各基因位点序列，克隆到PUC-57质粒上面)。

表20基因合成包含各耳聋基因位点序列质粒

将质粒Z1-Z30稀释成0.1pg/ul，Z31-Z33稀释成10pg/ul，取2ul作为扩增模板进行扩增检测，采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。

检测结果，如图7-图10，本试剂盒能有效检测出待测基因位点野生型和纯合突变型。

实施例7、前期探针优化

本发明采用相邻猝灭双探针系统对基因位点进行检测，探针与检测靶点互补，利用基因位点野生型和突变型的区别造成熔解Tm值差异，从而达到检测基因位点的目的，因为c.2162C＞T和c.2168A＞G以及c.1226G＞A和c.1229C＞T位点相近，设计的时候采用同一个突变检测探针，探针中的序列覆盖两个位点，与其中一个位点野生型互补，另一个位点突变型互补，这样可以同时分析两个位点，一个位点突变型Tm值会降低，另一个位点突变型Tm值会升高。因为探针序列会影响野生型与突变型Tm差异，Tm值差异太小，熔解峰难以区分影响检测效果。

1.c.2162C＞T和c.2168A＞G位点探针优化

待测样本为c.2162C＞T/c.2168A＞G野生型质粒Z18、c.2168A＞G纯合突变质粒Z19、c.2162C＞T纯合突变质粒Z20，稀释成0.1pg/ul，备用。

按实施例1中准备扩增反应液，c.2162C＞T、c.2168A＞G的扩增引物为上游引物F7、下游引物R7，

c.2162C＞T、c.2168A＞G突变检测探针1(FP12)序列为：

CY5-TTTTGATGGTCCATGATGCT-C3 Spacer，

c.2162C＞T、c.2168A＞G突变检测探针2(FP12b)序列为：

CY5-TCTTTTGATGGTCCATGATGC-C3 Spacer，

锚定探针(Q11)序列为：TTGACGACAACATTAGAAAGGACACATT-BHQ2。

检测反应体系为：

扩增反应液：6.55ul

上游引物F7(20uM)0.1ul

下游引物R7(20uM)1ul

突变检测探针1(FP12)或者突变检测探针2(FP12b)(10uM)0.7ul

锚定探针Q11：(10uM)0.7ul

待测样本(0.1pg/ul的质粒Z18、Z19、Z20)：1ul

去离子水：14.95ul，总体积25ul。

采用实施例1中的方法进行PCR扩增和熔解分析，结果如图11，c.2162C＞T、c.2168A＞G突变检测探针1(FP12)检测结果，c.2162C＞T、c.2168A＞G野生型Tm值为58.5℃，c.2168A＞G突变型Tm值为51℃，c.2162C＞T突变型Tm值为62℃，而突变检测探针2(FP12b)检测结果，c.2162C＞T、c.2168A＞G野生型Tm值为64.5℃，c.2168A＞G突变型Tm值为58℃，c.2162C＞T突变型Tm值为66.5℃，在突变检测探针2(FP12b)c.2162C＞T与野生型Tm差值仅为2℃，难以区分杂合状态，而突变检测探针1(FP12)c.2162C＞T与野生型Tm差值为3.5℃，区分效果更好，因此c.2162C＞T、c.2168A＞G位点优选突变检测探针1(FP12)。2.c.1226G＞A和c.1229C＞T位点探针优化

待测样本为正常野生型样本和c.1226G＞A、c.1229C＞T杂合突变样本，样本类型为抗凝血纯化DNA，稀释成2ng/ul，待测样本备用。

c.1226G＞A、c.1229C＞T的扩增引物为上游引物F4、下游引物R4，

c.1226G＞A、c.1229C＞T突变检测探针1(FP8)序列为：

ROX-TTTCCCACACGGCCGTCCA-C3 Spacer

锚定探针序列为：Q7：BHQ 1-TTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCT-BHQ2

c.1226G＞A、c.1229C＞T突变检测探针2(FP8b)序列为：CY5-ctctttcccacacggccgtcca-C3 Spacer，

锚定探针序列为：Q7b：ttcttctcttgttttgtggccaccac-BHQ2，

检测反应体系25ul：

扩增反应液：6.55ul

上游引物F4(20uM)0.1ul

下游引物R4(20uM)1ul

突变检测探针1(FP8)(10uM)0.7ul和锚定探针Q7(10uM)0.7ul

或者突变检测探针1(FP8b)(10uM)0.7ul和锚定探针Q7b(10uM)0.7ul

待测样本：1ul

去离子水：14.95ul

采用实施例1中的方法进行PCR扩增和熔解分析，结果如图12，突变检测探针1(FP8)检测结果，c.1226G＞A、c.1229C＞T野生型Tm值为62.5℃，c.1229C＞T突变型Tm值为50.2℃，c.1226G＞A突变型Tm值为69.2℃，而突变检测探针2(FP8b)检测结果，c.1226G＞A、c.1229C＞T野生型Tm值为66℃，c.1229C＞T突变型Tm值为57.5℃，c.1226G＞A突变型Tm值为71℃，在突变检测探针1(FP8)c.1226G＞A与野生型Tm差值为6.7℃，区分效果更好，因此c.1226G＞A、c.1229C＞T位点优选突变检测探针1(FP8)。

实施例8、线粒体位点突变比例检测

因为线粒体存在异质性突变，突变型占不同的比例，本实施例测试本发明试剂盒检测线粒体位点(c.1494C＞T和c.1555A＞G)突变比例，将合成的c.1494C＞T和c.1555A＞G的野生型和突变型质粒Z31-Z33，稀释10pg/ul，突变型：野生型按比例混合，突变型占0％、5％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，取2ul作为扩增模板进行扩增检测，采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。

部分检测结果如图13所示，结果表明采用本发明所述试剂盒，c.1494C＞T和c.1555A＞G在突变型比例10％及以上能有效检测出突变型。

实施例9、临床应用

本实施例的待测样本为31例临床耳聋患者抗凝血纯化基因组，稀释成2ng/ul，取1ul作为模板进行扩增检测。采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。采用Sanger测序验证作为对照。

部分检测结果见图14-图17，本发明试剂盒对临床阳性样本检测成功率和正确率100％，与Sanger测序验证结果一致。具体数据见表21。

表21实施例9临床应用检测结果

实施例10、临床应用

本实施例的待测样本为新生儿干血斑样本405份，均为新生儿出生72小时采集足跟血制作干血斑样本。

采用实施例1制备的耳聋遗传基因突变检测试剂盒对待测样本进行检测，检测方法和实施例1相同。采用博奥生物的十五项耳聋基因试剂盒(货号：300068-01)作为对照。

部分检测结果如图18-图21，检测新生儿临床样本405份，携带突变样本152份，纯合突变样本1例，具体数据参见表22，经过和博奥生物的十五项耳聋基因试剂盒比对检测，符合率100％。

表22实施例10临床应用检测结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州淦江生物技术有限公司

<120> 耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法

<130> GNCYZ220963

<160> 58

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cagagcaaac cgcccagagt agaag 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gagccttcga tgcggacctt ctg 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

tctgagcaac tgtgacttga ctccttg 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ggtctagggc ctattcctga t 21

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

agacacaaaa tcccagtccc tattccta 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

gtactaagag gaacaccaca ctcaccc 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

accaccacgc agagtaggca t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

cctctgttgc cattcctcga ct 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

ctgccccaac atcgtggac 19

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

cagatgaggt agcagagctc aca 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

accccagaaa actacgatag ccctt 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

agctacactc tggttcgtcc aag 23

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

cagcctgggc aatagaatga gactct 26

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

gaaccttgac cctcttgaga tttcacttg 29

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

tgacagtgtt ttcttcgttt agaatggcat c 31

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

aacccacatc attttactat tgccaaagct c 31

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

gctccccaaa taccgagtca agga 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

tctgccaaca tcttaccttg c 21

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

cagctagagt cctgattgcc agtg 24

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

agcacctgac ctaaaacaac gta 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

cagaaggtcc gcatcgaagg ctc 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

ggcaatgcgt taaactggct 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

gtttgttcac accccccagg a 21

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

cgtctgcagc gtgccccaat cca 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 25

tcgtagctgg ctgcagggtg tt 22

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 26

cagacaaagt cggcctgctc atctccccac 30

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 27

atcagctgca gggcccatag c 21

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 28

ggatgtggga gatggggaag tagt 24

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 29

ttcctcttct tctcatgtct ccggtaggcc acg 33

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 30

gcatggccac taggagcgct ggcgtggaca cg 32

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 31

ctagggataa aatacttact gtgg 24

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 32

gaagtctcaa aagaggttag aaaacaaatt 30

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 33

ttgttttatt tcagacgata attgcta 27

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 34

tgccatttca tatggagcca acctggaaa 29

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 35

tgggatcagc aacatcttct cagg 24

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 36

ttcttctctt gttttgtggc caccactgct 30

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 37

tttcccacac ggccgtcca 19

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 38

acattgcccg acctaccaag aa 22

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 39

aaaatcttca cctacttcat ggtgggcgcc tcc 33

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 40

caccgcccgt caccctcctc aagt 24

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 41

gttgaacagg gccctgaagc gcgtac 26

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 42

tatatagagg agacaagtcg ta 22

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 43

aggacattta actaaaaccc ctacgcat 28

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 44

ttttgatggt ccatgatgct 20

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 45

ttgacgacaa cattagaaag gacacatt 28

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 46

atccatagcc ttgtgcttga ct 22

<210> 47

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 47

tggagctata tctttcctgg acgttgttgg a 31

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 48

tgagatcact gcgggtggta 20

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 49

gaagtaattg tggtaagtag aata 24

<210> 50

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 50

gtagttagaa agttcagcat tatttggttg ac 32

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 51

agttagtact gggctagtgg c 21

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 52

ggctgcttag tgacgtcatt tcgg 24

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 53

tgtataattc caaccagcag a 21

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 54

ctatatttta cttgtaagtt cattac 26

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 55

catcttcttc cgggtcatct 20

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 56

cgaagccgcc ttcatgtacg tcttctatg 29

<210> 57

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 57

gtgaagtgca acgcctggcc ttgtcccaa 29

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 58

cgacggcttc tccatgcagc ggct 24

Claims (10)

1.耳聋遗传基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括前处理液、扩增反应液和突变检测液组，所述突变检测液组选自突变检测液A、突变检测液B、突变检测液C和突变检测液D中的至少一种；

所述前处理液包括Tween20、NP-40、Triton-X100、PVP和NaOH；

所述扩增反应液包括热启动Taq酶、UNG酶、dNTP、dUTP、5×PCR缓冲液，所述5×PCR缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、BSA、甘露醇、(NH4)₂SO₄、Tween20和海藻糖；

所述突变检测液A包括用于特异性扩增含有突变位点组合A的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合A包括选自GJB2基因35位点、GJB2基因167位点、GJB2基因176_191位点、GJB2基因299_300位点、GJB2基因235位点和SLC26A4基因1707+5位点中至少一种；

所述突变检测液B包括用于特异性扩增含有突变位点组合B的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合B包括选自SLC26A4基因919位点、SLC26A4基因1174位点、SLC26A4基因1226位点、SLC26A4基因1229位点、GJB3基因538位点和GJB3基因547位点中的至少一种；

所述突变检测液C包括用于特异性扩增含有突变位点组合C的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合C包括选自线粒体12S rRNA基因1494位点、线粒体12S rRNA基因1555位点、SLC26A4基因2162位点、SLC26A4基因2168位点、SLC26A4基因1975位点和SLC26A4基因2027位点中的至少一种；

所述突变检测液D包括用于特异性扩增含有突变位点组合D的目标片段的扩增引物和特异于所述目标片段的探针，所述突变位点组合D包括选自SLC26A4基因917位点、SLC26A4基因281位点、SLC26A4基因589位点、GJB2基因427位点和GJB2基因512位点中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述前处理液包括0.5％-2.5％Tween20、0.02％-1％NP-40、0.05％-0.2％Triton-X100、0.02％-1％PVP、0.02-0.4M NaOH；所述扩增反应液包括0.5-2U热启动Taq酶、0.025-0.25U UNG酶、5-10nmoldNTP、5-10nmol dUTP、5×PCR缓冲液；所述扩增反应液中的5×PCR缓冲液包括50-500mMTris-HCl(pH 8.8)、15-30mM MgCl₂、0.25％-10％(质量百分比)BSA、0％-15％(质量百分比)甘露醇，50-200mM(NH4)₂SO₄、0.025％-0.5％(体积百分比)Tween20和5-30％(质量百分比)海藻糖。

3.根据权利要求1或2所述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述探针由与所述目标片段特异结合的突变检测探针和与所述目标片段特异结合的锚定探针组成，所述突变检测探针与所述突变位点特异结合，所述突变检测探针和所述锚定探针这两种探针中，一种探针标记一端荧光基团，另一种探针一端标记相应的淬灭基团，所述突变检测探针和锚定探针与所述目标片段结合后，所述淬灭基团与所述荧光基团相互作用不产生荧光。

4.根据权利要求3所述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，其特征在于：

所述杂交突变位点组合A的探针包括FP1-Q1探针、FP2-Q2探针、FP3-Q3探针、FP4-Q4探针和FP5-Q5探针中的至少一种，

FP1-Q1探针由序列为SEQ ID No.23的突变检测探针和SEQ ID No.24的锚定探针组成，

FP2-Q2探针由序列为SEQ ID No.25的突变检测探针和SEQ ID No.26的锚定探针组成，

FP3-Q3探针由序列为SEQ ID No.27的突变检测探针和SEQ ID No.28的锚定探针组成，

FP4-Q4探针由序列为SEQ ID No.29的突变检测探针和SEQ ID No.30的锚定探针组成，

FP5-Q5探针由序列为SEQ ID No.31的突变检测探针和SEQ ID No.32的锚定探针组成；

所述杂交突变位点组合B的探针包括FP6-Q6探针、FP7-Q7探针、FP8-Q7探针、FP9-Q8探针的至少一种，

FP6-Q6探针由序列为SEQ ID No.33的突变检测探针和SEQ ID No.34的锚定探针组成，

FP7-Q7探针由序列为SEQ ID No.35的突变检测探针和SEQ ID No.36的锚定探针组成，

FP8-Q7探针由序列为SEQ ID No.37的突变检测探针和SEQ ID No.36的锚定探针组成，

FP9-Q8探针由序列为SEQ ID No.38的突变检测探针和SEQ ID No.39的锚定探针组成，

所述杂交突变位点组合C的探针包括FP10-Q9探针、FP11-Q10探针、FP12-Q11探针、FP13-Q12探针、FP14-Q12探针的至少一种，

FP10-Q9探针由序列为SEQ ID No.40的突变检测探针和SEQ ID No.41的锚定探针组成，

FP11-Q10探针由序列为SEQ ID No.42的突变检测探针和SEQ ID No.43的锚定探针组成，

FP12-Q11探针由序列为SEQ ID No.44的突变检测探针和SEQ ID No.45的锚定探针组成，

FP13-Q12探针由序列为SEQ ID No.46的突变检测探针和SEQ ID No.47的锚定探针组成，

FP14-Q12探针由序列为SEQ ID No.48的突变检测探针和SEQ ID No.47的锚定探针组成，

所述杂交突变位点组合D的探针包括FP15-Q13探针、FP16-Q14探针、FP17-Q15探针、FP18-Q16探针、FP19-Q17探针的至少一种，

FP15-Q13探针由序列为SEQ ID No.49的突变检测探针和SEQ ID No.50的锚定探针组成，

FP16-Q14探针由序列为SEQ ID No.51的突变检测探针和SEQ ID No.52的锚定探针组成，

FP17-Q15探针由序列为SEQ ID No.53的突变检测探针和SEQ ID No.54的锚定探针组成，

FP18-Q16探针由序列为SEQ ID No.55的突变检测探针和SEQ ID No.56的锚定探针组成，

FP19-Q17探针由序列为SEQ ID No.57的突变检测探针和SEQ ID No.58的锚定探针组成。

5.根据权利要求1-4任一项所述的耳聋遗传基因突变检测试剂盒，其特征在于：

所述用于特异性扩增含有突变位点组合A的目标片段的扩增引物为A引物对组合物中的至少一种引物对，所述A引物对组合物由F1-R1引物对和F2-R2引物对组成，所述F1-R1引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.1-2所示，所述F2-R2引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.3-4所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合B的目标片段的扩增引物为B引物对组合物中的至少一种引物对，所述B引物对组合物由F3-R3引物对、F4-R5引物对和F5-R5引物对组成，所述F3-R3引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.5-6所示，所述F4-R4引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.7-8所示，所述F5-R5引物对的两条单链DNA的序列如SEQ IDNo.9-10所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合C的目标片段的扩增引物为C引物对组合物中的至少一种引物对，所述C引物对组合物由F6-R6引物对、F7-R7引物对和F8-R8引物对组成，所述F6-R6引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.11-12所示，所述F7-R7引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.13-14所示，所述F8-R8引物对的两条单链DNA的序列如SEQ IDNo.15-16所示，

所述用于特异性扩增含有突变位点组合D的目标片段的扩增引物为D引物对组合物中的至少一种引物对，所述D引物对组合物由F3-R3引物对、F9-R9引物对、F10-R10引物对和F11-R11引物对组成，所述F9-R9引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.17-18所示，所述F10-R10引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.19-20所示，所述F11-R11引物对的两条单链DNA的序列如SEQ ID No.21-22所示，

每个引物对是两条单链DNA。

6.一种应用于熔解曲线分析的试剂组合物或提取DNA的试剂组合物，其特征在于：所述应用于熔解曲线分析的试剂组合物包括权利要求1-5任一项所述的前处理液和权利要求1-5任一项所述的扩增反应液，所述试剂组合包括权利要求1-5任一项所述的前处理液。

7.一种用于检测耳聋遗传基因突变的探针组合物或用于检测耳聋遗传基因突变的探针引物组合物，其特征在于：所述用于检测耳聋遗传基因突变的探针组合物包括权利要求4中所述的至少一种探针，一种用于检测耳聋遗传基因突变的探针引物组合物包括权利要求4中所述的至少一种探针和权利要求5中所述的至少一种引物对。

8.权利要求1-5任一项所述耳聋遗传基因突变试剂盒、权利要求6所述的试剂组合物、权利要求7所述的探针组合物或权利要求8所述的探针引物组合物在如下任一中的应用，

(1)遗传性耳聋基因筛查；

(2)致聋基因类型的识别；

(3)预防耳聋疾病发生；

(4)制备遗传性耳聋基因筛查产品；

(5)制备致聋基因类型的识别产品；

(6)制备预防耳聋疾病发生产品。

9.一种检测基因突变的方法，其特征在于：包括

(a1)通过非对称PCR扩增含有待检基因突变位点的核酸片段，在所述非对称PCR中，反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针结合，并且在扩增前在扩增反应中加入所述探针，所述探针由突变检测探针和锚定探针组成，所述突变检测探针与所述待检基因突变位点特异结合，所述突变检测探针和所述锚定探针这两种探针中，一种探针标记一端荧光基团，另一种探针一端标记相应的淬灭基团，所述突变检测探针和锚定探针与所述核酸片段结合后，所述淬灭基团与所述荧光基团相互作用不产生荧光；

(a2)扩增结束后，对步骤(a1)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，获得所述核酸片段的荧光信号；根据所述核酸片段的荧光信号确定所述核酸片段是否存在相应基因突变。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

根据所述核酸片段的荧光信号确定所述核酸片段是否存在相应基因突变包括根据所述核酸片段和标准对照的荧光信号差异确定是否存在相应基因突变，

所述标准对照为含有待检基因突变位点，且所述待检基因突变位点不存在基因突变的核酸片段，所述标准对照的荧光信号通过下述步骤获得：

(b1)通过非对称PCR扩增所述标准对照，在所述非对称PCR中，反应混合物中所述PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针结合，并且在扩增前在扩增反应中加入所述探针；

(b2)扩增结束后，对步骤(b1)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，获得所述标准对照的荧光信号。

Images