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CN116200470A - 一种检测egfr基因t790m和c797s突变的引物组、应用、试剂盒以及方法 - Google Patents

一种检测egfr基因t790m和c797s突变的引物组、应用、试剂盒以及方法 Download PDF

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CN116200470A
CN116200470A CN202111443367.7A CN202111443367A CN116200470A CN 116200470 A CN116200470 A CN 116200470A CN 202111443367 A CN202111443367 A CN 202111443367A CN 116200470 A CN116200470 A CN 116200470A
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CN
China
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seq
probe
probe seq
mutations
detecting
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Application number
CN202111443367.7A
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李世学
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BOE Technology Group Co Ltd
Original Assignee
BOE Technology Group Co Ltd
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract

本申请涉及生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组、应用、试剂盒以及方法，该引物组包括正向引物SEQ ID No:1、反向引物SEQ ID No:2和探针SEQ ID No:3～SEQ ID No:6，本申请的引物组用于检测EGFR基因T790M和C797S突变。

Description

一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组、应用、试剂盒 以及方法
技术领域
本申请涉及生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组、应用、试剂盒以及方法。
背景技术
EGFR(表皮生长因子受体)是一种由EGF家族细胞外配体激活的跨膜受体。EGFR可与其他ErbB家族成员同二聚或异二聚以启动信号传导，激活下游信号通路，包括典型MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号级联，最终导致细胞增殖、迁移和分化。在肺癌中，EGFR的激活突变导致对EGFR酪氨酸激酶抑制敏感的受体的组成性激活形式。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂，包括阿法替尼、厄洛替尼和吉非替尼被称作第一/二代抑制剂，已被批准用于非小细胞肺癌患者的一线治疗。肺癌患者在使用第一/二代抑制剂治疗10个月后，部分肺癌患者即发生第二位点耐药突变，包括Met扩增、EGFR T790M突变和KRAS/NRAS/PIK3CA/HER2等突变，其中发生频率最高的即为EGFR T790M变异，占比超过50％。EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼，即第三代抑制剂药物，已被FDA批准用于EGFR耐药突变T790M的非小细胞肺癌复发患者。在奥希替尼治疗后，患者会再次出现继发耐药突变，以C797S突变为主。EGFR T790M与C797S突变若为顺式突变，则推荐第一代/二代抑制剂药物阿法替尼、厄洛替尼或吉非替尼联合第三代抑制剂药物奥希替尼治疗；若EGFR T790M与C797S为反式突变，则推荐Brigiation联合西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。
Sanger直接测序方法是检测EGFR T790M与C797S顺式/反式变异的有效方法，但是，Sanger直接测序法检测限高，只能检测20％以上频率突变；操作复杂、耗费时间久，检测时间需要24小时以上，不符合目前临床诊断要求快速的特点。另一种常用方法是NGS测序法，该方法存在成本高，是Sanger测序法的几十甚至上百倍，操作复杂，耗费时间久。
发明内容
本申请的实施例提供一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组、应用、试剂盒以及方法。该方法利用试剂盒对EGFR基因T790M和C797S突变进行检测。其特异性高，灵敏度高，检测周期短。
为达到上述目的，本申请的实施例采用如下技术方案：
第一方面，本申请实施例提供了一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，引物组包括扩增引物对与探针。
扩增引物对序列包括：
正向引物：5’-TGGGCATCTGCCTCACCTCCAC-3’SEQ ID No:1；以及，
反向引物：5’-GGTACTGGGAGCCAATATTG-3’SEQ ID No:2。
探针序列包括：
5’-CAGCTCATCATGCAGCTCATGCC-3’SEQ ID No:3。
5’-CGGCAGCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:4。
5’-CGGCTCCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:5。
5’-CGGAAGCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:6。
本申请实施例提供的引物组，利用该引物组检测EGFR T790M和C797S顺式或反式突变。该检测方法包括EGFR T790M和C797S扩增引物F和R，分别标记FAM和VIC的特异性探针FAM-Probe1-MGB和VIC-Probe2-MGB、VIC-Probe3-MGB、VIC-Probe4-MGB，采用TaqMan-qPCR法检测EGFR T790M和C797S突变。选择优化的特异性靶向EGFR T790M野生型序列的肽核酸PNA-Primer1，利用肽核酸与DNA结合稳定以及不被Taq酶降解的特性封闭EGFR T790M野生型位点，因此无法被有效扩增从而抑制GFR T790M野生型和C797S突变型(反式)DNA片段的扩增，GFR T790M和C797S同时突变型(顺式)可以被有效扩增，检测EGFR T790M和C797S顺式或反式突变。该检测方法且灵敏度高(0.1％)，特异性高，检测快速。
可选地，一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，还包括PNA。PNA序列包括：5’-CAGCTCATCACGCAGCTCATGCC-3’SEQ ID No:7。
可选地，探针SEQ ID No:3的5’端连接有荧光基团，探针SEQ ID No:3的3’端连接有淬灭基团；和/或探针SEQ ID No:4的5’端连接有荧光基团，探针SEQ ID No:4的3’端连接有淬灭基团；和/或探针SEQ ID No:5的5’端连接有荧光基团，探针SEQ ID No:5的3’端连接有淬灭基团；和/或探针SEQ ID No:6的5’端连接有荧光基团，探针SEQ ID No:6的3’端连接有淬灭基团。
可选地，探针SEQ ID No:3的5’端连接有荧光基团FAM，探针SEQ ID No:3的3’端连接有淬灭基团MGB。探针SEQ ID No:4的5’端连接有荧光基团VIC，探针SEQ ID No:4的3’端连接有淬灭基团MGB。探针SEQ ID No:5的5’端连接有荧光基团VIC，探针SEQ ID No:5的3’端连接有淬灭基团MGB。探针SEQ ID No:6的5’端连接有荧光基团VIC，探针SEQ ID No:6的3’端连接有淬灭基团MGB。
第二方面，本申请实施例提供了一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的试剂盒，包括PCR扩增试剂和上述的引物组。
可选地，正向引物的浓度为10μM，反向引物的浓度为10μM，探针SEQ ID No:3的浓度为10μM，探针SEQ ID No:4的浓度为10μM，探针SEQ ID No:5的浓度为10μM，探针SEQ IDNo:6的浓度为10μM，PNA的浓度为10μM。
第三方面，本申请实施例提供了一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的方法，包括：取待检测样本提取的DNA；使用权利要求5或6的试剂盒对DNA进行PCR扩增反应；检测PCR扩增产物。
可选地，DNA提取自肺癌石蜡包埋样本基因组DNA。
可选地，PCR扩增反应条件为：92～98℃预变性2～5min；92～98℃变性30s～1min，65～70℃第一次退火30s～1min，58～63℃第二次退火30s～1min，65～75℃延伸30s～1min，循环45次；65～75℃扩增后延伸2～5min，4～12℃保存。
可选地，PCR扩增反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s，67℃第一次退火30s，60℃第二次退火30s，72℃延伸30s，循环45次；72℃扩增后延伸5min，10℃保存。
第四方面，本申请实施例提供了一种如上述的引物组在检测EGFR基因T790M和C797S突变中的应用。该应用为非诊断目的的应用。
附图说明
图1为本申请实施例提供的一种T790M和C797S顺式突变与反式突变示意图；
图2为本申请实施例提供的一种检测T790M和C797S突变原理图；
图3为本申请实施例提供的一种检测T790M和C797S顺式突变与反式突变原理图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请实施例进行详细描述。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本申请中，DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即：腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)。
试剂盒，是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。当然，本领域技术人员能够理解的是，为了盛放化学试剂，该盒子也可以是管子等其他容器。
EGFR：Epidermal growth factorreceptor，简称为EGFR，是表皮生长因子受体(HER)成员，EGFR酪氨酸激酶区变异导致过度激活，与肺癌发生密切相关。相关突变包括EGFR T790M，L858R，19Exon Deletion；
TaqMan探针：TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如5-羧基荧光素(Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，5-FAM)、四氯-6-羧基荧光素(Tetrachloro fluorescein，6-TET)、VIC、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro fluorescein，HEX)等，3’端携带淬灭基团，如5-羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine，5-TAMRA)、BHQ羧酸(BHQ carboxylic acid，BHQ)等。PCR扩增过程中通过切割5’末端携带荧光基团释放荧光，从而检测目的突变。
肽核酸(PNA)：一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代DNA中戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。
EGFR(Epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)，是表皮生长因子受体家族成员之一，EGFR受体酪氨酸激酶结构域激活突变是肺癌发生的主要驱动因素之一。EGFR T790M突变是奥希替尼治疗靶点，但是不可避免耐药突变的出现即EGFRC797S，如图1所示T790M和C797S突变位于同一条染色体上即为顺式突变，分别位于等位染色体上则为反式突变。EGFR T790M和C797S反式突变患者对第一代和第三代EGFR-TKI药物联合治辽敏感，因此，检测EGFR T790M和C797S反式或顺式突变极为重要。
目前，检测EGFR T790M和C797S反式或顺式突变的方法主要为Sanger测序或新一代测序技术，Sanger测序检测灵敏度低以及新一代测序检测耗时且成本高昂的缺陷，TaqMan荧光探针法检测灵敏度高，操作简便，检测周期短，成本低。如图2所示TaqMan荧光探针法能够同时检测EGFR T790M和C797S突变，但是无法判断其为顺式或反式突变。本申请在已有检测方法的基础上设计靶向T790M突变位点对应野生型序列的肽核酸(Blocker)，对于顺式突变Blocker结合野生型位点对EGFR T790M和C797S突变没有影响，仍然能够释放FAM和VIC荧光；对于反式突变，Blocker封闭野生型位点，在PCR扩增过程中Blocker阻断位于其3’端C797S突变的检测，如图3所示只能检测到FAM荧光，因此，通过FAM和VIC信号即可判断EGFR T790M和C797S为顺式突变或反式突变。
本申请实施例提供了一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，该引物组包括正向引物(F)、反向引物(R)、探针以及肽核酸(PNA)，正向引物(F)与反向引物(R)的序列如下表1所示，探针的序列如下表2所示，肽核酸(PNA)的序列如下表3所示；以下实施例1与实施例2采用正向引物(F)、反向引物(R)、探针以及肽核酸对EGFR基因T790M和C797S进行突变检测以及灵敏度实验。
表1正向引物(F)与反向引物(R)序列
引物名称 序列(5’→3’) SEQ序列号
正向引物(F) TGGGCATCTGCCTCACCTCCAC SEQ ID NO：1
反向引物(R) GGTACTGGGAGCCAATATTG SEQ ID NO：2
表2探针序列
探针名称 序列(5’→3’) SEQ序列号
FAM-Probe1-MGB CAGCTCATCATGCAGCTCATGCC SEQ ID NO：3
VIC-Probe1-MGB CGGCAGCCTCCTGGACTATGT SEQ ID NO：4
VIC-Probe2-MGB CGGCTCCCTCCTGGACTATGT SEQ ID NO：5
VIC-Probe3-MGB CGGAAGCCTCCTGGACTATGT SEQ ID NO：6
表3肽核酸序列
肽核酸名称 序列(5’→3’) SEQ序列号
PNA-Primer1 CAGCTCATCACGCAGCTCATGCC SEQ ID NO：7
实施例1：
本实施例用于检测EGFR T790M和C797S顺式或反式突变，包括PCR扩增试剂，正向引物和反向引物，特异性探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB和VIC-Probe3-MGB，以及特异性肽核酸PNA-Primer1。
1、材料准备
1)PCR扩增试剂选自Thermo公司PlatinumTM Hot Start PCR Master Mix(2X)；
2)使用无核酸酶水(DNase-Free&RNase-Free Water)将正向引物和反向引物、探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB、VIC-Probe3-MGB以及肽核酸PNA-Primer1配置成10μM；
3)基因组DNA样本提取至肺癌石蜡包埋组织(FFPE)DNA，分别配置成浓度为32.5ng/μL、21.4ng/μL、25.6ng/μL和30.2ng/μL。
2、检测步骤
1)将PlatinumTM Hot StartPCRMasterMix(2X)、正向引物和反向引物、探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB和VIC-Probe3-MGB、肽核酸PNA-Primer1以及基因组DNA样本从冰箱中取出，置于冰块上自然溶解；
2)取8个PCR管分为4组，每组分别编号1-2号。所有编号1反应管中分别按照表4加入各组分，所有编号2反应管中分别按照表5加入各组分；其中第1组1-2号反应管中分别加入23.5ng/μL，体积为0.31μL的样本1DNA，第2组1-2号反应管中分别加入21.4ng/μL，体积为0.47μL的样本2DNA，第3组编号1-2反应管中分别加入25.6ng/μL，体积为0.39μL的样本3DNA，第4组编号1-2反应管中分别加入23.5ng/μL，体积为0.33μL的样本4DNA；针对表4与表5中正向引物、反向引物、探针与肽核酸的浓度也可以选择20μM、30μM或50μM，具体的实验过程同理。
表4各组分浓度与体积
Figure BDA0003384314130000071
Figure BDA0003384314130000081
表5各组分浓度与体积
Figure BDA0003384314130000082
Figure BDA0003384314130000091
3)打开荧光定量PCR仪(Roche 480或ABI7500)，按表6设置PCR反应程序，将PCR反应管并列放入PCR仪中，运行反应程序；
表6反应温度与时间
Figure BDA0003384314130000092
4)反应完成后，对检测结果进行分析。
3、结果
3.1 TaqMan PCR检测数据如下表7样本检测CT值表所示：
表7样本检测CT值表
Figure BDA0003384314130000093
3.2检测结果分析
1号样本1号管扩增FAM和VIC信号CT值均<42，同时存在T790M和C797S突变，2号管FAM和VIC信号CT值均＜42，表明T790M和C797S突变位于同一条染色体，即为顺式突变；2号样本1号管FAM信号CT值＜42，T790M突变阳性，VIC信号CT值＞42，C797S突变阴性；3号样本1号管FAM和VIC信号CT值均<42，同时存在T790M和C797S突变，2号管FAM信号CT值＜42，表明T790M和C797S突变位于不同染色体，即反式突变；4号样本同3号样本。结论1号样本为顺式突变，3和4号样本为反式突变。
实施例2：
本实施例用于检验检测EGFR T790M和C797S顺式或反式突变的灵敏度，包括PCR扩增试剂，正向引物和反向引物，特异性探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB和VIC-Probe3-MGB，以及特异性肽核酸PNA-Primer1。
1、材料准备
1)PCR扩增试剂选自Thermo公司PlatinumTM Hot Start PCR Master Mix(2X)；
2)使用无核酸酶水(DNase-Free&RNase-Free Water)将正向引物和反向引物、探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB、VIC-Probe3-MGB以及肽核酸PNA-Primer1配置成10μM；
3)选取EGFR T790M和C797S顺式突变和反式突变标准品样本各1例，突变频率为5％，作为标准品基因组DNA样本，采用野生型基因组稀释至1％、0.5％、0.2％和0.1％。核酸浓度20ng/μL。
2、检测步骤
1)将PlatinumTM Hot Start PCR MasterMix(2X)、引物F和R、探针FAM-Probe1-MGB、VIC-Probe1-MGB、VIC-Probe2-MGB和VIC-Probe3-MGB、肽核酸PNA-Primer1以及标准品基因组DNA样本从冰箱中取出，置于冰块上自然溶解。
2)取16个PCR管分为8组，每组分别编号1-2号。所有编号1反应管中分别按照表4加入各组分，所有编号2反应管中分别按照表5加入各组分；其中第1-4组反应管中分别加入EGFR T790M和C797S顺式突变样本1％-0.1％梯度稀释DNA，浓度为20ng/μL，体积为1μL，第5-8组反应管中分别加入EGFR T790M和C797S反式突变样本1％-0.1％梯度稀释DNA，浓度为20ng/μL，体积为1μL。
3)打开荧光定量PCR仪(Roche 480或ABI7500)，按表6设置PCR反应程序，将PCR反应管并列放入PCR仪中，运行反应程序。
4)检测完成后，对检测结果进行分析。
3、结果
3.1 TaqMan PCR检测数据如下表8样本检测CT值表所示
表8样本检测CT值表
Figure BDA0003384314130000111
3.2检测结果分析
由表8可知，突变频率为5％的顺式突变和反式突变标准品样本梯度稀释至1％、0.5％、0.2％和0.1％，0.1％突变频率样本均能够有效检测，表明该检测方法灵敏度达到0.1％。
在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 京东方科技集团股份有限公司
<120> 一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组、应用、试剂盒以及方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggcatctg cctcacctcc ac 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtactggga gccaatattg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagctcatca tgcagctcat gcc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggcagcctc ctggactatg t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggctccctc ctggactatg t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggaagcctc ctggactatg t 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagctcatca cgcagctcat gcc 23

Claims (12)

1.一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物对与探针；
所述扩增引物对序列包括：
正向引物：5’-TGGGCATCTGCCTCACCTCCAC-3’SEQ ID No:1；以及，
反向引物：5’-GGTACTGGGAGCCAATATTG-3’SEQ ID No:2；
所述探针序列包括：
5’-CAGCTCATCATGCAGCTCATGCC-3’SEQ ID No:3；
5’-CGGCAGCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:4；
5’-CGGCTCCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:5；
5’-CGGAAGCCTCCTGGACTATGT-3’SEQ ID No:6。
2.根据权利要求1所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，其特征在于，还包括：
PNA，所述PNA序列包括
5’-CAGCTCATCACGCAGCTCATGCC-3’SEQ ID No:7。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，其特征在于，
所述探针SEQ ID No:3的5’端连接有荧光基团，所述探针SEQ ID No:3的3’端连接有淬灭基团；和/或
所述探针SEQ ID No:4的5’端连接有荧光基团，所述探针SEQ ID No:4的3’端连接有淬灭基团；和/或
所述探针SEQ ID No:5的5’端连接有荧光基团，所述探针SEQ ID No:5的3’端连接有淬灭基团；和/或
所述探针SEQ ID No:6的5’端连接有荧光基团，所述探针SEQ ID No:6的3’端连接有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的引物组，其特征在于，
所述探针SEQ ID No:3的5’端连接有荧光基团FAM，所述探针SEQ ID No:3的3’端连接有淬灭基团MGB；
所述探针SEQ ID No:4的5’端连接有荧光基团VIC，所述探针SEQ ID No:4的3’端连接有淬灭基团MGB；
所述探针SEQ ID No:5的5’端连接有荧光基团VIC，所述探针SEQ ID No:5的3’端连接有淬灭基团MGB；
所述探针SEQ ID No:6的5’端连接有荧光基团VIC，所述探针SEQ ID No:6的3’端连接有淬灭基团MGB。
5.一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增试剂和权利要求1～4中任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的试剂盒，其特征在于，所述正向引物的浓度为10μM，所述反向引物的浓度为10μM，所述探针SEQ ID No:3的浓度为10μM，所述探针SEQ ID No:4的浓度为10μM，所述探针SEQ ID No:5的浓度为10μM，所述探针SEQ ID No:6的浓度为10μM，PNA的浓度为10μM。
7.一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的方法，其特征在于，包括：
取待检测样本提取的DNA；
使用权利要求5或6所述的试剂盒对DNA进行PCR扩增反应；
检测PCR扩增产物。
8.根据权利要求7所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的方法，其特征在于，所述DNA提取自肺癌石蜡包埋样本基因组DNA。
9.根据权利要求7所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应为：
92～98℃预变性2min～5min；
92～98℃变性30s～1min，65～70℃第一次退火30s～1min，58～63℃第二次退火30s～1min，65～75℃延伸30s～1min，循环45次；
65～75℃扩增后延伸2min～5min，4～12℃保存。
10.根据权利要求9所述的一种检测EGFR基因T790M和C797S突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应为：
98℃预变性5min；
98℃变性30s，67℃第一次退火30s，60℃第二次退火30s，72℃延伸30s，循环45次；
72℃扩增后延伸5min，10℃保存。
11.一种如权利要求1～4中任一项所述的引物组在检测EGFR基因T790M和C797S突变中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用为非诊断目的的应用。
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