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CN116200450A - 一种生态共存益生菌的筛选方法和系统 - Google Patents

一种生态共存益生菌的筛选方法和系统 Download PDF

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CN116200450A CN202310017210.0A CN202310017210A CN116200450A CN 116200450 A CN116200450 A CN 116200450A CN 202310017210 A CN202310017210 A CN 202310017210A CN 116200450 A CN116200450 A CN 116200450A
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probiotics
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刘智
邓云
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Hubei Chang'e Biological Co ltd
Original Assignee
Huazhong University of Science and Technology
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Abstract

本发明公开了一种生态共存益生菌的筛选方法和系统，所述筛选方法，包括：基于多靶点的高通量筛选，获得具有预设功能高通量的单一菌株；按照功能组合的方式将菌株进行组合，获得益生菌组合；体外共培养，检测益生菌组合的OD值，并按照若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9‑2.1。该筛选方法以功能组合的方式进行益生菌组合，并采用阈值法筛选，按照益生菌组合OD值大于预设阈值则体内协同共生可能性大的原则进行筛选，相比随机组合，该筛选方法及系统可快速的筛选有效益生菌组合。

Description

一种生态共存益生菌的筛选方法和系统
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种生态共存益生菌的筛选方法和系统。
背景技术
益生菌被联合国粮食及农业组织和世界卫生组织定义为“活的微生物”，当摄入足够量时，会对宿主产生有益的健康影响。但单种菌株往往效果一般，研究表明，将益生菌进行组合，其效果一般优于单种菌株，但益生菌组合的效果存在不确定性。现有的益生菌组合一般是将2-3种菌进行组合，且筛选的途径单一，筛选得到的菌株一般也只进行了单菌效果的验证，或着只是简单的将不同菌株进行随意组合，对其他菌株的组合没有什么参考意义。
而且这种菌株随意组合并不一定总是起到更有益的作用，如在益生菌改善肥胖的研究中发现，虽然VKL/VKB两种益生菌单独给药会降低喂小鼠的体重，但它们的组合却没有显著的抗肥胖作用；甚至发现单独的IMV B-7280菌株获得比VKL/VKB/IMV B-7280组合更好的效果。这主要是因为不同菌株可能存在多种相互作用关系，如代谢依赖、营养竞争、细菌素拮抗等，使得菌株之间不能很好的在体内共存，甚至菌株之间的相互作用有可能抵消甚至是降低益生菌有益的功能。
如果对益生菌组合进行功能验证和体内实验验证，虽然可以在一定程度上解决益生菌随意组合的带来的功能不确性问题，但是这种验证周期长、且费时费力，尤其是在新功效方面的益生菌组合，工作量极大，花费时间长。因此，如何快速有效的筛选出能够生态共存且效果显著的益生菌组合是亟需解决的难题。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种生态共存益生菌的筛选方法和系统，其目的在于通过按照功能组合将菌株进行组合，以益生菌组合的OD值大于预设阈值，筛选出在体内共生可能性较大的益生菌组合，所述阈值在1.9-2.1，由此解决现有筛选体内共生良好的益生菌组合操作复杂且周期长的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种生态共存益生菌的筛选方法，其包括以下步骤：
基于多靶点的高通量筛选，获得具有预设功能高通量的单一菌株；
按照功能组合的方式将不同高通量菌株进行组合，获得益生菌组合；
体外共培养，检测益生菌组合的OD值，并按照如下原则进行判断筛选：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选方法，其所述OD值，具体按照如下检测：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选方法，其在筛选具有减肥的益生菌组合时，按照具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中两种以上功能进行益生菌组合，体外共培养，检测OD值。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选方法，其在筛选具有减肥的益生菌组合时，按照具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中四种功能进行益生菌组合，并在波长600nm条件下检测OD值。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选方法，其在筛选具有减肥的益生菌组合时，所述OD值，具体按照如下检测：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
按照本发明的另一方面，还提供了一种生态共存益生菌的筛选系统，其包括OD值获取模块、判断模块；
所述OD值获取模块，用于获取益生菌组合的OD值，并提交给判断模块；
所述判断模块，用于依据获取的OD值，按照如下原则判断：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选系统，其所述OD值获取模块，获取的OD值按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选系统，其所述OD值获取模块，在筛选具有减肥的益生菌组合时，用于获取具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中两种以上功能益生菌组合，体外共培养，在600nm条件下的OD值。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选系统，其所述OD值获取模块，在筛选具有减肥的益生菌组合时，所述OD值，按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
优选地，所述生态共存益生菌的筛选系统，其所述判断模块，按照益生菌组合的OD值大于1.9，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小的原则，判断筛选生态共存益生菌。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的生态共存益生菌的筛选方法，以功能组合的方式获取益生菌组合，并以益生菌组合体外共培养的OD值大于预设阈值筛选在体内协调共生可能性大的组合，所述预设阈值为1.9-2.1。相比随机组合而言，功能组合能够获取更有效的益生菌组合，且以体外共培养的OD阈值法筛选体内能够协同共生的益生菌组合，能够有效缩短实验周期，利于快速筛选出兼具多种功能且在体内协同共生的益生菌组合。
附图说明
图1是胰脂肪酶抑制功能菌株的筛选结果；
图1中A为罗丹明平板显色情况，B为60株菌胰脂肪酶抑制功能筛选结果；
图2是具有胆盐水解酶活性菌株的筛选结果；
图2中A是平板沉淀圈形成情况，左侧：普通MRS平板，右侧：BSH活性检测平板，B为60株菌BSH活性筛选结果；
图3是刺激GLP-1激素分泌菌株的筛选结果；
图3中A是60株菌刺激情况的初步筛选；B是激素分泌量相比对照组增加的13株菌的重复实验；
图4是益生菌组合共培养OD值检测结果；
图5是菌株体内丰度实验设计示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
来自体外研究的数据表明，基于个体菌株的研究得出的最佳益生菌联合方案并不总是与体内实际情况相符。一些益生菌可能会对其他共同给药的菌株产生抑制作用并限制整体功效。不同微生物之间因为生态共存关系，会互相竞争稀缺的营养物质和有限的空间，如释放获取资源的分泌物，丢失可以从外界获得产物的重要基因，毒害邻近细胞，或阻止其他微生物定植等，这可能会影响其他菌的生长。
因此，尽管对单个益生菌菌株的许多研究提供了有关潜在作用机制的有用信息并确定了有效的候选菌株，但仍需要进一步的实验来确定其与其他益生菌组合时是否能保持有益效果。如何将不同菌株进行理性设计组合，快速筛选出菌株之间不存在相互抑制作用的组合，并能明确益生菌组合的效果，使得益生菌组合进一步发挥更大更有效的作用，是未来研究的重要方向。
本发明提供了一种生态共存益生菌的筛选方法，其包括以下步骤：
基于多靶点的高通量筛选，获得具有预设功能高通量的单一菌株，按照功能组合的方式将获得的高通量菌株进行组合，体外共培养，检测OD值，并按照如下原则进行判断筛选：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合协同共生的可能性大，反之则协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
所述OD值，具体按照如下检测：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
OD值是指光通过被测物前后的能量差异，即被检测物吸收的能量，在特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量存在定量关系，可以通过OD值测定被测物的浓度。实验统计显示，大部分菌株的OD值是在1.5-1.8，同时单一种菌生长较好的OD值约是1.8，所以此OD值只能表示组合中至少有一种菌生长状况好，而不能表征协同作用发生；而实验发现体外共培养中OD值在1.9以上的益生菌组合在体内具有良好的共生几率，更可能形成协同、平衡的生态环境；从而通过较为简单的体外筛选实验，代替体内应用评价，提高菌种组合的评价准确性，实现高通量筛选，从而降低体外、体内实验的盲目性，在理论指导和时间降低益生菌组合的开发成本和缩短开发周期上，都具有重大意义。
实验表明，在减肥益生菌组合筛选时，在体内共生验证试验中获得的益生菌组合其OD值均在1.9以上，所述OD值为600nm波长处检测的OD值，具体按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
在筛选减肥益生菌组合时，所述预设功能，包括胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化四种功能；所述高通量筛选，按照如下原则筛选：
(1)具有胰脂肪酶抑制功能菌株的筛选：采用罗丹明显色平板法，以光圈直径小于15mm作为有抑制效果的评价标准进行筛选，优于抑制效果显著的菌株；
(2)具有胆盐水解酶活性菌株的筛选：采用平板法定性检测，以沉淀圈直径大于12mm作为有BSH活性的评价标准进行筛选，优选活性显著的菌株；
(3)具有刺激GLP-1激素分泌菌株的筛选：采用细胞模型进行筛选，筛选GLP-1激素的分泌量优于对照组的菌株，优选GLP-1激素的分泌量显著增加的菌株；
(4)抑制前脂肪细胞分化菌株的筛选：采用3T3-L1前脂肪细胞模型，利用油红染色根据脂滴的形成情况判断菌株在细胞分化过程中的抑制效果，与对照组相比，以色脂滴比例显著减少为有抑制效果的评价标准进行筛选，优选抑制效果显著的菌株。
所述按照功能组合的方式将获得的不同菌株进行组合，具体的：
按照益生菌组合同时拥有上述功能两种以上进行组合，优选按照四种功能进行组合，菌株数量一般不超过4种。
将同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值，筛选OD值在1.9以上的益生菌组合。
进一步地，根据体外共培养-功能验证，筛选具有两种以上功能且效果好的组合，优选具有四种功能的组合；可采用体内定植实验在动物模型上验证益生菌组合的效果。
另外，本发明还提供了一种生态共存益生菌的筛选系统，其包括OD值获取模块、判断模块；
所述OD值获取模块，用于获取益生菌组合的OD值，并提交给判断模块；
所述判断模块，用于依据获取的OD值，按照如下原则判断：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
进一步地，所述OD值获取模块，获取的OD值按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
所述OD值获取模块，在筛选具有减肥的益生菌组合时，用于获取具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中两种以上功能益生菌组合，体外共培养，在600nm条件下的OD值。所述OD值，优选按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
所述判断模块，按照益生菌组合的OD值大于1.9，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小的原则，判断筛选生态共存益生菌。
以下为实施例：
实施例1
实验所用菌株，如下表所示(表1)：
表1实验所用菌株
Figure BDA0004040314150000081
Figure BDA0004040314150000091
1.1功能菌株筛选
(1)胰脂肪酶抑制功能菌株的筛选
采用罗丹明显色平板法进行筛选；
如图1A所示，在紫外光照射下，光圈直径越小表明菌株对胰脂肪酶的抑制效果越好。与对照组相比，菌株光圈直径明显变小，表明其对胰脂肪酶活性有较好的抑制作用。本实验对60株菌的上清液进行了平板显色实验，以光圈直径小于15mm作为有抑制效果的评价标准，结果如图1B所示，共筛选得到6株阳性菌株。
(2)BSH活性菌株的筛选
采用直接平板法对BSH活性进行筛选；
BSH活性测定平板：在MRS培养基中添加0.5％脱氧牛磺胆酸钠和1.5％琼脂，121℃15min灭菌，若配置对照平板，则不加入脱氧牛磺胆酸钠。灭菌完成后，倾倒入无菌平板中，待MRS培养基冷却凝固后，倒置放入厌氧操作间中48h进行除氧。实验前，将无菌滤纸片小心置于MRS培养平板上，每个滤纸片滴加5μl菌液，平板厌氧37℃培养48h。若滤纸片周围有白色沉淀物生成，即表明菌株有BSH活性，沉淀圈直径越大，说明酶活性越强，没有即为阴性。
BSH能水解平板中添加的脱氧牛磺胆酸钠盐，从而在平板上形成沉淀圈，根据沉淀圈的大小可以判断BSH活性的情况。如图2A所示，左侧是普通MRS平板，右侧是添加了脱氧牛磺胆酸钠盐的BSH检测平板，可以看到右侧的4株菌均在平板上形成了明显的沉淀圈，表明41-44号这四株菌菌具有BSH活性。本研究对60株候选菌进行了检测，以沉淀圈直径大于12mm作为有BSH活性的评价标准，结果如图2B所示，共筛选得到8株阳性菌株。
(3)刺激GLP-1激素分泌的菌株的筛选
利用细胞模型(肠分泌细胞STC-1)来进行刺激GLP-1激素分泌菌株的筛选；
实验前48h，将STC-1细胞以每孔2×105细胞密度接种于24孔板，培养至80％融合。在加菌刺激之前，用磷酸盐缓冲盐水轻柔地洗涤细胞两次，在无葡萄糖、无L-谷氨酰胺DMEM中饥饿30min。益生菌用PBS洗涤3次，7000rpm离心5min收集细菌颗粒，以不含葡萄糖，不含L-谷氨酰胺的DMEM悬液调节至107CFU，加入孔中。孵育2h后，收集上清液于1.5mL的离心管中，在1000×g，4℃下离心20min，去除细胞和细菌碎片，冻存于-20℃待测。
GLP-1含量的测定：按照小鼠GLP-1ELISA试剂盒说明书(Elabscience，中国)进行；
对60株菌进行初步筛选，结果如图3A所示，发现有部分菌株确实能刺激GLP-1激素的分泌。将所有激素分泌量相比对照组增加的共13株菌进行重复实验，结果发现(图3B)，有11株菌确实能显著刺激GLP-1激素的分泌。
(4)抑制前脂肪细胞分化的菌株筛选
此部分实验利用3T3-1细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)进行，该细胞在诱导剂的诱导下能分化成为脂肪细胞；在添加诱导剂诱导细胞分化的过程中，按照MOI＝10的比例添加菌进行干预。成功分化的脂肪细胞会分泌大量的脂滴，利用油红染色根据脂滴的形成情况可以判断菌在细胞分化过程中的抑制效果，相比于Control组，经b15m2干预处理的细胞分化程度明显受到抑制，被染色的脂滴显著减少。
本实验对60株菌进行了实验，染色结果拍照后利用Image-Pro Plus 6.0定量分析红色区域占总面积的比例，统计学分析后，有显著性差异的菌株共筛选到10株阳性菌株。
综上实验结果可知，在60株候选菌中共筛选到28株功能菌株，其中大部分菌仅具有一种功能，仅7种具有两种功能。
1.2益生菌组合筛选
(1)菌株按照功能组合
按照四种功能均包含的条件进行设计组合，且组合的菌株数量不多于四株，共得到653种组合，
(2)体外共培养筛选
将得到的653种组合进行体外共培养实验，所有菌株单独培养48h后，同一益生菌组合按1％接种量接种到同一个5mL规格的西林瓶中，厌氧条件下37℃培养，12h测OD值。对所有组合进行共培养实验，37℃培养12h后于600nm处检测OD值，如图4所示；
由图4可知，大部分组合的OD值均在1.5-1.8之间。然而，此范围的OD值仅表示组合中至少有一种菌生长状况好，并不能排除其他菌株有生长受到抑制的情况，同时也不能表明组合中四种功能均能够发挥作用。
本实验将各种益生菌组合进行体内定植实验，益生菌组合体内丰度实验流程示意图，如图5所示，结果发现OD值在1.9以上的63种益生菌组合在体内共生的可能性更大。
实施例2具有四种功能的益生菌组合体内定植验证
(1)从共培养实验挑选出的63个组合中进行四种不同功能的验证实验后，其中有4个组合拥有全部的功能作用，见表2；
表2组合体外筛选结果
Figure BDA0004040314150000111
Figure BDA0004040314150000121
(2)益生菌组合体内定植实验
采用PCR检测体内菌株定植的情况，以不同时间点粪便基因组DNA为模板，PCR检测粪便中细菌的存在情况；
结合体外共培养-功能验证及体内实验的结果，发现在体外筛选得到的4种组合中，3种组合中包含的菌都能在小鼠体内定植3天以上，组合包含菌株如表3所示；
表3体外、体内实验结合筛选的组合
Figure BDA0004040314150000122
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生态共存益生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
基于多靶点的高通量筛选，获得具有预设功能高通量的单一菌株；
按照功能组合的方式将不同高通量菌株进行组合，获得益生菌组合；
体外共培养，检测益生菌组合的OD值，并按照如下原则进行判断筛选：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
2.如权利要求1所述的生态共存益生菌的筛选方法，其特征在于，所述OD值，具体按照如下检测：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
3.如权利要求1所述的生态共存益生菌的筛选方法，其特征在于，在筛选具有减肥的益生菌组合时，按照具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中两种以上功能进行益生菌组合，体外共培养，检测OD值。
4.如权利要求3所述的生态共存益生菌的筛选方法，其特征在于，在筛选具有减肥的益生菌组合时，按照具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中四种功能进行益生菌组合，并在波长600nm条件下检测OD值。
5.如权利要求4所述的生态共存益生菌的筛选方法，其特征在于，在筛选具有减肥的益生菌组合时，所述OD值，具体按照如下检测：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
6.一种生态共存益生菌的筛选系统，其特征在于，包括OD值获取模块、判断模块；
所述OD值获取模块，用于获取益生菌组合的OD值，并提交给判断模块；
所述判断模块，用于依据获取的OD值，按照如下原则判断：
若益生菌组合的OD值大于预设阈值，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小，所述预设阈值在1.9-2.1。
7.如权利要求6所述的生态共存益生菌的筛选系统，其特征在于，所述OD值获取模块，获取的OD值按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照预设比例的接种量进行接种，培养至对数生长期，检测对应波长条件下的OD值；所述预设比例为1％-3％。
8.如权利要求7所述的生态共存益生菌的筛选系统，其特征在于，所述OD值获取模块，在筛选具有减肥的益生菌组合时，用于获取具有胰脂肪酶抑制、胆盐水解酶活性、刺激GLP-1激素分泌以及抑制前脂肪细胞分化功能中两种以上功能益生菌组合，体外共培养，在600nm条件下的OD值。
9.如权利要求8所述的生态共存益生菌的筛选系统，其特征在于，所述OD值获取模块，在筛选具有减肥的益生菌组合时，所述OD值，按照如下检测获得：
同一益生菌组合，按照接种量为1％进行接种，在厌氧条件下培养至对数生长期，检测600nm条件下OD值。
10.如权利要求9所述的生态共存益生菌的筛选系统，其特征在于，所述判断模块，按照益生菌组合的OD值大于1.9，则判断益生菌组合在体内协同共生的可能性大，反之则体内协同共生的可能性小的原则，判断筛选生态共存益生菌。
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