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CN116200320A - 一种辅因子平衡的高产d-泛酸的基因工程菌、构建及应用 - Google Patents

一种辅因子平衡的高产d-泛酸的基因工程菌、构建及应用 Download PDF

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CN116200320A
CN116200320A CN202211739932.9A CN202211739932A CN116200320A CN 116200320 A CN116200320 A CN 116200320A CN 202211739932 A CN202211739932 A CN 202211739932A CN 116200320 A CN116200320 A CN 116200320A
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bacteria
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张政
柳志强
郑裕国
牛坤
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Zhejiang University of Technology ZJUT
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Abstract

本发明涉及一种辅因子平衡的高产D‑泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。所述基因工程菌通过以下步骤构建获得：(1)以大肠杆菌Escherichia coli ZJB18003(CCTCC NO：M 2018914)为出发菌株，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因在底盘菌中过表达，获得基因工程菌DPA11A01；(2)将来源于谷氨酸棒杆菌中NAD+激酶基因ppnk和酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A01菌中过表达，获得基因工程菌株DPA11A15；(3)对酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A15菌中过表达时进行了RBS优化，采用弱RBS“L”时，获得所述辅因子平衡的高产D‑泛酸的基因工程菌。利用本发明的重组大肠杆菌基因工程菌及利用其制备D‑泛酸的方法，能够更简单、更低成本、高产率的制备D‑泛酸。

Description

一种辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌、构建及应用
(一)技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
D-泛酸(D-pantothenic acid,D-PA)，又名遍多酸、维生素B5，是生物体维持正常生理功能所必需的微量营养素，作为CoA和ACP的前体物质，它在体内对碳水化合物，脂质，蛋白质和核酸的代谢调节中起着明显的作用。D-泛酸的名称来自希腊语“pantothen”，意思是“来自所有方面”。顾名思义，D-泛酸在饮食中广泛可用，通常，花生酱(5-8mg/100g)，动物肝脏和肾脏(4-7mg/100g)，杏仁(2-3mg/100g)，麦麸(2-3mg/100g)和龙虾(1.5mg/100g)是D-泛酸的主要贡献者。此外，牛奶，谷物，牛肉，鸡蛋，坚果和蔬菜也是这种维生素的主要来源，因此，D-泛酸缺乏症很少见。但是，由于D-泛酸在食品加工或烹饪过程中的损失及不同群体对D-泛酸的吸收程度不同，仍然有部分人群的D-泛酸的摄入量低于维持正常人体功能所需的D-泛酸的充分摄入量，这可能导致记忆力减退，肾上腺功能衰竭和关节炎，以及其他症状。考虑到D-泛酸的重要生理功能，近年来它在临床研究中的作用日益突出，例如高脂血症，骨关节炎，类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。较前沿的研究包括D-泛酸有助于健康大脑所需的髓磷脂的合成，并且适当的摄入可以在早期阶段预防甚至逆转神经退行性疾病(例如亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病)。另外，口服含D-泛酸的膳食补充剂是安全缓解面部痤疮病变的有效策略。破骨细胞中D-泛酸的潜在调节作用使其在预防骨丢失相关疾病方面具有令人满意的潜力。D-泛酸缺乏可能是导致溃疡性结肠炎的潜在因素。临床研究表明，D-泛酸可以增加CoA的水平，并在抗炎机制中起抗氧化剂的作用。在饲料方面，添加一定量的D-泛酸可以满足动物的需求。在化妆品领域，D-泛酸具有增强的保湿和抗衰老作用。
由于D-泛酸的不稳定性，D-泛酸钙作为D-泛酸的主要应用形式，其目前的工业化生产主要是依赖化学合成。经典的化学过程包括DL-泛解酸内酯的合成、外消旋泛解酸内酯的光学拆分以及D-泛解酸内酯和β-丙氨酸的聚合反应。其中涉及剧毒原料(氢氰酸或氰化钠)的使用，繁琐的光学拆分以及含氰化物的废水污染。随着环境污染和能源短缺的加剧，通过生态友好且可持续的方法生产D-泛酸受到了研究人员的广泛关注。
天然可再生资源的微生物发酵生产D-泛酸由于具有环境友好和可持续的特征被认为是一种有吸引力的替代方法。随着代谢工程技术的发展，微生物途径的修饰使工程化大肠杆菌(Escherichia coil)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产D-泛酸成为可能。以葡萄糖作为碳源为例，D-泛酸的生物合成途径由两部分组成：泛解酸合成途径和β-丙氨酸合成途径。其中，由panB编码的酮戊酸酯羟甲基转移酶(KPHMT)和由panC编码的泛酸合成酶(PS)是D-泛酸生物合成途径中的关键限速步骤。此外，辅因子调控对很对代谢产物的合成都有重要的作用，是驱动胞内许多分解与合成反应的重要分子。辅因子的供给不足又常常是影响生物转化的限制因素，选择正确的辅因子调控策略来调控辅因子长期有效的平衡是实现代谢流高效化导向目标代谢产物的必要手段。尽管目前已经进行了各种努力来增加微生物中D-泛酸生物合成途径的代谢通量。然而，由于D-泛酸生物合成途径的复杂性和严格的控制，较低的产量和生产率仍然是D-泛酸微生物发酵生产的缺陷，这直接降低了微生物发酵合成D-泛酸的市场竞争力。
申请人前期的专利申请(公开号为CN109868254A的发明申请)中公开了一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用，通过强化D-泛酸生物生成途径中关键基因panB、panC、panE和ilvC的表达，通过修复ilvG基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，通过avtA基因的敲除和ilvE基因的敲降对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，高产泛酸的基因工程菌Escherichia coli ZJB18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M2018914。鉴于目前D-泛酸的发酵菌株积累量依然较低，亟需针对大肠杆菌中D-泛酸合成的代谢途径开发新的生产者改善微生物发酵中低产量和产率的D-泛酸生产问题。
(三)发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌，及其构建方法与应用。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以大肠杆菌Escherichia coli ZJB18003(CCTCC NO：M 2018914)为底盘菌，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因在底盘菌中过表达，获得基因工程菌DPA11A01；
(2)将来源于谷氨酸棒杆菌中NAD+激酶基因ppnk和酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A01菌中过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15；
(3)对酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A15菌中过表达时进行了RBS优化，通过采用H、M、L高中低三种不同强度的RBS进行优化调节，在采用弱的RBS“L”，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15-1，即为所述辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌。
具体的，所述panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；ppnK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pos5p基因核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述RBS“L”序列如SEQ ID NO.5所示。
大肠杆菌中复杂的代谢途径和严格的调控机制是影响D-泛酸生物合成的主要因素。辅因子调控对很对代谢产物的合成都有重要的作用，是驱动胞内许多分解与合成反应的重要分子。辅因子的供给不足又常常是影响生物转化的限制因素。一般认为，选择正确的辅因子调控策略来调控辅因子长期有效的平衡是实现代谢流高效化导向目标代谢产物的必要手段。本发明在基于辅因子工程，建立了简单有效的双激酶共表达的辅因子调控策略，D-泛酸的积累得到提升；辅助因子是非蛋白质化合物或金属离子，对于所有生物有机体中无数酶的生物学功能和催化活性都是必需的，它们可以有效地促进生化转化。NADP(H)和NAD(H)是细胞代谢中常见的辅因子，其作为所有生物有机体中必需的电子供体或受体，在分解反应与合成代谢反应中起着重要的作用。此外，它在维持细胞内氧化还原稳态中发挥关键作用。NADPH主要参与细胞代谢中合成反应，是氨基酸生物合成以及细胞生长和其他天然产物合成代谢途径的重要辅助因子。NAD和NADP是辅助因子的关键类别，在所有生物有机体中起着重要的电子供体或受体的作用，可引起大量的分解代谢和合成代谢反应。此外，它们在维持细胞内氧化还原稳态中起关键作用。对生产菌株进行代谢工程改造时，常常会改变原有代谢或引入代谢途径，特别是涉及辅因子的消耗，产生或转化的那些代谢工程，经常引起氧化还原状态的波动，其显著阻碍细胞代谢，导致生长性能降低和生物合成能力。在D-泛酸合成途径中每生成1mol D-泛酸需要消耗2mol的NADPH，为避免菌株因NADPH供应不足，利用质粒表达系统分别表达不同促进NADPH再生的基因，筛选出最适的表达基因。结合以上策略，构建的基因工程菌株的D-泛酸产量在摇瓶发酵中提高至6.25g/L，提高了51.7％；在分批补料发酵过程中D-泛酸积累提高至63.58g/L，糖酸转化率达到0.33g/L。
本发明还涉及构建所述高产D-泛酸的基因工程菌的方法，所述方法如下：
(1)以大肠杆菌为底盘菌，应用质粒表达系统，将panB与panC克隆到pTrc99a质粒中，获得pTrc99a-panBC，将质粒pTrc99a-panBC转入底盘菌中进行独立过表达，获得基因工程菌DPA11A01；
(2)应用双质粒表达系统，将ppnK基因、pos5p基因同时克隆到与pTrc99a质粒兼容的pTN质粒中，获得质粒pTN-ppnk-pos5p，将质粒pTN-ppnk-pos5p转入菌株DPA11A01中进行独立过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15；
(3)对酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A15菌中过表达时进行了RBS优化，将pTN-ppnk-pos5p质粒中pos5p基因表达进行了RBS调节，通过采用H、M、L高中低三种不同强度的RBS进行优化调节，在采用弱的RBS“L”，获得质粒pTN-ppnk-L-pos5p，将质粒pTN-ppnk-L-pos5p转入菌株DPA11A15中进行独立过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15-1，即为所述辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌。
具体的，所述panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；ppnK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pos5p基因核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述RBS“L”序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还涉及所述的基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，在28～30℃、pH6.6～6.8条件下发酵培养60～72h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO4 12～16g/L、KH2PO41～2g/L、MgSO4 0.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、甜菜碱1～2g/L，微量元素溶液0.5～1.0ml/L，Kan抗生素50～75mg/L，Cm抗生素50～75mg/L，IPTG 0.1～0.2mM，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5～10g/L CoCl2、5～10g/L FeSO4·7H2O、0.5～1g/L ZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
发酵起始时使用发酵培养基，并依据20％溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，补料培养基组成如下：葡萄糖400～500g/L，yeast extract 1～2g/L，硫酸铵8～10g/L，硫酸镁6～8g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，β-丙氨酸35～40g/L，甜菜碱2～4g/L，异亮氨酸0.1～0.16g/L，VB1 8～10mg/L，VB12 2～4mg/L，Kan50～75mg/L，Cm抗生素50～75mg/L，IPTG 72～96mg/L，金属盐溶液1～2mL/L，消泡剂1～2mL/L。
在发酵前期可添加40mg/L的异亮氨酸，弥补菌体营养缺陷，在发酵中后期进行IPTG的二次诱导，提高诱导强度。
本发明有益效果主要体现在：本发明建立了简单有效的双激酶共表达的辅因子调控策略，D-泛酸的积累得到提升，构建的基因工程菌株的D-泛酸产量在摇瓶发酵中提高至6.25g/L，提高了51.7％；在分批补料发酵过程中D-泛酸积累提高至63.58g/L，糖酸转化率达到0.33g/L，具有较好的生产应用价值。
(四)附图说明
图1为重组大肠杆菌中D-泛酸生物合成途径及菌株开发示意图。
图2为重组大肠杆菌DPA11A01与DPA11A15的摇瓶发酵结果；误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
图3为重组大肠杆菌DPA11A15进行pos5p基因表达的RBS优化的摇瓶发酵结果；误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
图4为重组大肠杆菌DPA11A01与DPA11A15的摇瓶发酵48h时胞内辅因子NADPH含量及(NADP++NADPH)/(NAD++NADH)的比值。误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
图5为在不同时间段添加异亮氨酸发酵过程中的D-泛酸产品的产量，菌体生物量和副产物积累的变化。其中，a：0h添加异亮氨酸；b：6h添加异亮氨酸；c：12h添加异亮氨酸。误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
申请人之前的专利技术“CN109868254A”、“CN201911418780.0”已经证明了D-泛酸途径基因panB与panC基因表达的增强对D-泛酸发酵生产的有益作用，以同专利技术“CN201911418780.0”中的方法在质粒pTrc99A质粒上过表达来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，构建质粒pTrc99A-panBC。将质粒pTrc99A-panBC导入本发明中所使用的底盘菌株Escherichia coli ZJB 18003进行过表达，获得D-泛酸生产菌株DPA11A01，在此基础上进行后续步骤。
本申请中使用的引物汇总如表1。
表1
Figure BDA0004031985030000061
Figure BDA0004031985030000071
实施例1：表达质粒pTN-ppnk的构建
以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，In-ppnK-F与In-ppnK-R为引物扩增获得目的片段ppnK(ppnK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；以pTN质粒为模板，pTN-V-F与pTN-V-R为引物扩增获得线性载体；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTN质粒与ppnK片段连接在一起，通过测序验证得到pTN-ppnK质粒。
实施例2：表达质粒pTN-ppnk-pos5p的构建
以酿酒酵母基因组为模板，In-pos5p-F与In-pos5p-R为引物扩增获得目的片段pos5p(pos5p基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；以pTN-ppnK质粒为模板，pTNP-V-F与pTNP-V-R为引物扩增获得线性载体；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTN-ppnK质粒与pos5p片段连接在一起，通过测序验证得到pTN-ppnk-pos5p质粒。
实施例3：表达质粒pTN-ppnk-L-pos5p的构建
以质粒pTN-ppnk-pos5p为模板，pos5p-L-F与pos5p-L-R为突变引物进行PCR扩增(RBS“L”核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；之后采用Dpn I(NEB公司，北京)消化PCR产物，去除残余模板，采用PCR Cleanup试剂盒处理消化后的PCR产物，进行转化培养，通过测序验证得到pTN-ppnk-L-pos5p质粒。
实施例4：表达质粒pTN-ppnk-M-pos5p的构建
以质粒pTN-ppnk-pos5p为模板，pos5p-M-F与pos5p-M-R为突变引物进行PCR扩增(RBS“M”核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；之后采用Dpn I(NEB公司，北京)消化PCR产物，去除残余模板，采用PCR Cleanup试剂盒处理消化后的PCR产物，进行转化培养，通过测序验证得到pTN-ppnk-M-pos5p质粒。
实施例5：表达质粒pTN-ppnk-H-pos5p的构建
以质粒pTN-ppnk-pos5p为模板，pos5p-H-F与pos5p-H-R为突变引物进行PCR扩增(RBS“H”核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)；之后采用Dpn I(NEB公司，北京)消化PCR产物，去除残余模板，采用PCR Cleanup试剂盒处理消化后的PCR产物，进行转化培养，通过测序验证得到pTN-ppnk-H-pos5p质粒。
实施例6：菌株DPA11A01、菌株DPA11A15的发酵培养及细胞量和D-泛酸积累的检测
将菌株DPA11A15或DPA11A15-1，以DPA11A01(Escherichia coli ZJB18003)为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作种子液；8-12h后，接种200μL预培养物和0.2mM的IPTG到装有20mL的发酵培养基的250mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm条件下培养48h；发酵结束后进行取样检测细胞量和D-泛酸积累。
发酵结束后，取200μL发酵液于2mL离心管，加1.8mL无菌水稀释10倍。在常温状态下，12000rpm离心1min。去上清，加200ml 0.3M的盐酸用于溶解碳酸钙，同样的加1.8mL无菌水恢复至2mL。分光光度计，波长600nm测OD600值，测量值×稀释倍数即为实际OD600值。
D-泛酸积累量检测：将稀释后的发酵液上清使用0.22μm有机滤膜过膜，用于高效液相色谱(HPLC)检测。D-泛酸高效液相色谱检测条件如下：A流动相成分：95％超纯水、4.9％乙腈、0.1％磷酸，使用0.22μm微孔有机系滤膜过滤并超生波除气泡；B色谱柱型号：C18色谱柱(250×4.6mm，5μm，安捷伦科技公司)；C检测参数：进样量10μL，柱温30℃，流速0.9mL/min，检测波长200nm，D-PA出峰时间14.5min。发酵结果由图2、图3可见，质粒过表达ppnK和pos5p，并采用弱RBS“L”调控pos5p的表达会对D-泛酸积累有一定促进作用，这说明辅因子NADPH的供应可有效增加胞内D-泛酸的积累。
实施例7：实施例6中构建菌株的摇瓶发酵培养
将实施例6中获得的菌株，DPA11A01为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种200μL预培养物和0.1～0.2mM的IPTG到装有20mL的发酵培养基的250mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm条件下培养40～48h；发酵结束后进行取样检测细胞量和D-泛酸积累。结果如图2、图3、图4所示，与DPA11A01菌株相比，在所有策略情况下相应的NADPH和(NADP++NADPH)/(NAD++NADH)的比值均显示出显着增加。同时，菌株DPA11A15和DPA11A15-1在发酵48h分别积累6.15±0.21g/L和6.25±0.11g/L的D-泛酸，而对照菌株DPA11A01积累4.14±0.10g/L D-泛酸。这些结果表明，ppnK与pos5p的共过表达更有效地改善了D-泛酸的产生，表明在增强D-泛酸的生物合成方面，充足的NADPH的供应有利于D-泛酸的生产。D-泛酸生产的提高可能归因于潜在的动态氧化还原平衡，包括(NADP++
NADPH)/(NAD++NADH)的比值而非单独的NADPH供应。
实施例8：DPA11A15-1菌株在5L发酵罐中的分批补料发酵培养异亮氨酸补加时间
D-泛酸的分批补料发酵包括以下步骤：
(1)DPA11A15-1菌株的种子培养：
将-80℃甘油保藏的DPA11A15-1菌株划线于平板培养基上，培养箱中37℃活化培养12h，得到活化菌；平板培养基：蛋白胨8～10g/L、酵母提取物8～10g/L、NaCl 3～5g/L、琼脂粉18～20g/L。挑取新鲜的、生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的试管中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10～12h，获得一级种子液；之后，以1％的接种量转接到三瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10～12h，获得二级种子液。
(2)DPA11A15-1菌株的分批补料发酵培养：
分批补料发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(1)得到的二级种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值10％。在发酵初始糖即将耗尽时开始流加补料培养基，直至发酵结束。中间取样测细胞生长量。所有分批补料培养均以初始葡萄糖浓度为20g/L的分批培养开始。初始糖即将耗尽时，使用发酵罐控制系统控制蠕动泵将补料培养基溶液泵入发酵罐。发酵条件：pH6.8，温度30℃，通气速率和搅拌速度用于调控溶解氧浓度。在分批补料发酵过程中，溶氧反馈值设置为20％，当溶氧浓度高于设定的饱和值20％时(表明由于细胞活力降低而增加的溶氧浓度)，实施了溶氧反馈策略以向发酵培养基中添加丰富的补料培养基。此外，当溶解氧浓度降至设定的饱和值时，自动进料系统将终止(指示由于细胞生长速率增加而降低的溶解氧浓度)。
由于本研究中所使用的重组大肠杆菌的异亮氨酸合成途径被衰减，因此在发酵过程中添加异亮氨酸以维持正常的细胞生长是必需的。另一方面，异亮氨酸的碳骨架是由丙酮酸提供的，丙酮酸转化为异亮氨酸须通过三羧酸循环(TCA)。因此异亮氨酸的添加一定程度上促进了TCA循环，这将有利于减少乙酸的代谢通量和细胞生长。由于在补料培养基中添加了一定量的异亮氨酸来补充细胞内合成的不足，而对其实培养基发酵阶段并未做过任何的优化，因此对初始的分批发酵阶段进行不同时间的异亮氨酸补加对D-泛酸发酵的影响，补加时间分别为0h、6h、12h。
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨8～10g/L、酵母提取物8～10g/L、NaCl 3～5g/L；发酵培养基包括以下成分：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO412～16g/L、KH2PO4 1～2g/L、MgSO4 0.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、甜菜碱1～2g/L，微量金属离子溶液0.5～1.0ml/L，50～75mg/L Kan抗生素，50～75mg/LCm抗生素，0.1～0.2mM的IPTG，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5～10g/L CoCl2、5～10g/L FeSO4·7H2O、0.5～1g/LZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水；
补料培养基：葡萄糖400～500g/L，yeast extract 1～2g/L，硫酸铵8～10g/L，硫酸镁6～8g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，β-丙氨酸35～40g/L，甜菜碱2～4g/L,异亮氨酸0.1～0.16g/L，VB1 8～10mg/L，VB12 2～4mg/L，Kan 50～75mg/L，50～75mg/L Cm抗生素，IPTG 72～96mg/L，金属盐溶液1～2mL/L，消泡剂1～2mL/L。
如图5(a-c)所示，在不同的时间补加异亮氨酸条件下OD600、D-泛酸浓度和乙酸盐积累的曲线。当在发酵12h补加异亮氨酸时，最大D-泛酸浓度、OD600和乙酸积累分别达到54.54g/L、144.7、20.56g/L。
实施例9：DPA11A15-1菌株在5L发酵罐中的分批补料发酵培养过程中二次诱导
D-泛酸的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)DPA11A15-1菌株的种子培养：
将-80℃甘油保藏的DPA11A15-1菌株划线于平板培养基上，培养箱中37℃活化培养12h，得到活化菌；平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L。挑取新鲜的、生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的试管中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养12h，获得一级种子液；之后，以1％的接种量转接到三瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10h，获得二级种子液。
(2)DPA11A15-1菌株的分批补料发酵培养：
分批补料发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(1)得到的二级种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值10％。在发酵初始糖即将耗尽时开始流加补料培养基，直至发酵结束。中间取样测细胞生长量。所有分批补料培养均以初始葡萄糖浓度为20g/L的分批培养开始。初始糖即将耗尽时，使用发酵罐控制系统控制蠕动泵将补料培养基溶液泵入发酵罐。发酵条件：pH6.8，温度30℃，通气速率和搅拌速度用于调控溶解氧浓度。在分批补料发酵过程中，溶氧反馈值设置为20％，当溶氧浓度高于设定的饱和值20％时(表明由于细胞活力降低而增加的溶氧浓度)，实施了溶氧反馈策略以向发酵培养基中添加丰富的补料培养基。此外，当溶解氧浓度降至设定的饱和值时，自动进料系统将终止(指示由于细胞生长速率增加而降低的溶解氧浓度)。为了研究发酵中后期IPTG二次诱导时间的影响，在分批补料发酵过程中分别选择三个阶段，发酵60h、发酵60h和发酵60h添加IPTG到发酵体系中进行二次诱导。
结果显示，当在发酵60h添加IPTG二次诱导时，最大D-泛酸浓度、OD600和乙酸积累分别达到49.16g/L、120.36、12.45g/L；当在发酵72h添加IPTG二次诱导时，最大D-泛酸浓度、OD600和乙酸积累分别达到64.16g/L、144.12、5.58g/L；当在发酵84h添加IPTG二次诱导时，最大D-泛酸浓度、OD600和乙酸积累分别达到49.68g/L、136.65、10.66g/L。

Claims (6)

1.一种辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以大肠杆菌Escherichia coli ZJB18003(CCTCC NO：M 2018914)为底盘菌，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因在底盘菌中过表达，获得基因工程菌DPA11A01；所述panB基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示，panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将来源于谷氨酸棒杆菌中NAD+激酶基因ppnk和酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A01菌中过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15；所述ppnK基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，pos5p基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)对酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A15菌中过表达时进行RBS优化，采用低强度的RBS“L”进行优化调节，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15-1，即为所述辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌；所述RBS“L”序列如SEQ ID NO.5所示。
2.构建权利要求1所述高产D-泛酸的基因工程菌的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)以大肠杆菌Escherichia coli ZJB18003(CCTCC NO：M 2018914)为底盘菌，应用质粒表达系统，将panB与panC克隆到pTrc99a质粒中，获得pTrc99a-panBC，将质粒pTrc99a-panBC转入底盘菌中进行独立过表达，获得基因工程菌DPA11A01；所述panB基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示，panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)应用双质粒表达系统，将ppnK基因、pos5p基因同时克隆到与pTrc99a质粒兼容的pTN质粒中，获得质粒pTN-ppnk-pos5p，将质粒pTN-ppnk-pos5p转入菌株DPA11A01中进行过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15；所述ppnK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pos5p基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)对酿酒酵母菌中NADH激酶基因pos5p在DPA11A15菌中过表达时进行RBS优化，将pTN-ppnk-pos5p质粒中pos5p基因表达进行了RBS调节，采用低强度的RBS“L”进行优化调节，获得质粒pTN-ppnk-L-pos5p，将质粒pTN-ppnk-L-pos5p转入菌株DPA11A15中进行过表达，获得辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌株DPA11A15-1，即为所述辅因子平衡的高产D-泛酸的基因工程菌；所述RBS“L”序列如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述的基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，在28～30℃、pH6.6～6.8条件下发酵培养60～72h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO4 12～16g/L、KH2PO4 1～2g/L、MgSO4 0.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、甜菜碱1～2g/L，微量元素溶液0.5～1.0ml/L，Kan抗生素50～75mg/L，Cm抗生素50～75mg/L，IPTG0.1～0.2mM，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5～10g/L CoCl2、5～10g/LFeSO4·7H2O、0.5～1g/L ZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：发酵起始时使用发酵培养基，并依据20％溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，补料培养基组成如下：葡萄糖400～500g/L，yeast extract 1～2g/L，硫酸铵8～10g/L，硫酸镁6～8g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，β-丙氨酸35～40g/L，甜菜碱2～4g/L，异亮氨酸0.1～0.16g/L，VB1 8～10mg/L，VB12 2～4mg/L，Kan 50～75mg/L，Cm抗生素50～75mg/L，IPTG 72～96mg/L，金属盐溶液1～2mL/L，消泡剂1～2mL/L。
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