CN116199778A

CN116199778A - 抗4-1bb抗体及其用途

Info

Publication number: CN116199778A
Application number: CN202211543663.9A
Authority: CN
Inventors: 周进伟; 刘丹丹; 刘辉; 赵文亭; 林志妙; 吴纯; 陈素芬; 周昌全; 冯辉; 姚盛
Original assignee: Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd; Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd
Current assignee: Suzhou Zhonghe Biomedical Technology Co ltd; Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-12-01
Also published as: CN116199778B; WO2023098785A1

Abstract

本申请提供了能够与4‑1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段和包含其的药物组合物，还提供了编码本申请的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子，用于表达本申请的抗体或其抗原结合片段的表达载体和宿主细胞，以及本申请的抗体或其抗原结合片段的用途。

Description

抗4-1BB抗体及其用途

本申请要求于2021年12月01日提交中国专利局、申请号为202111455972.6发明名称为“抗4-1BB抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本申请属于生物医药领域，特别是涉及能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过人体免疫系统恢复或增强对肿瘤的自然防御的一种治疗方法。这种治疗通常针对癌细胞表面的特定生物分子，如肿瘤相关抗原(TAAs)。抗肿瘤活性是通过将宿主免疫系统导向TAAs来实现的，从而建立或诱导针对癌细胞的适应性免疫反应。在过去的几十年里，利用单克隆抗体(MAb)治疗癌症取得了巨大的成功，其中许多已经被批准用于癌症治疗或临床试验。

4-1BB(CD137/TNFRSF9)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质，在抗原启动的T细胞上表达，而在静止的T细胞上不表达。人4-1BB是具有255个氨基酸的蛋白质，包含信号序列(氨基酸残基1-17)、胞外结构域(169个氨基酸)、跨膜区(27个氨基酸)、以及胞内结构域(42个氨基酸)。4-1BB在细胞表面以单体或二聚体形式表达，与其配体(4-1BBL)结合后通过三聚体化进行信号传导。

此外，已知4-1BB在树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NKs)、活化的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤T细胞(NKT)和肥大细胞中表达，但骨髓源性抑制细胞(MDSCs)在其表面不表达该分子。抗4-1BB抗体具有激活细胞毒性T细胞和增加γ干扰素(IFN-γ)生成的能力，在抗癌方面显示出巨大的潜力。

目前，已有多个4-1BB相关药物研究项目正在进行中。已报道的4-1BB抗体序列在与4-1BB结合并激活4-1BB信号通路中，或过于激活导致肝脏中CD8⁺T细胞富集造成肝毒性，或者安全性良好但是激活不够导致杀伤肿瘤效果不佳。因此，亟需开发活性更好、毒副作用更低的新型4-1BB抗体药物。

发明内容

本申请的目的在于提供一种能够与4-1BB特异性结合的抗体(即抗4-1BB抗体)或其抗原结合片段，可作为独立的疗法或与其它疗法/或其他抗癌药剂联合，用于诸如癌症的治疗。

本申请第一方面提供了一种能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM、Contact或North编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:13或15所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:14或16所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个可以替换为与其具有1、2或3个氨基酸差异的变体。

在一些实施方式中，所述能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM、Contact或North编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:13所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:15所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方式中，根据Kabat编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者分别具有如SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或者分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；

其中，所述SEQ ID NO:1-12中的至少一个可以替换为与其具有1、2或3个氨基酸差异的变体。

在一些实施方式中，根据Kabat编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或者

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区；或

与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区；

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区；或

氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段还包含人重链恒定区和人轻链恒定区，所述人重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选为人IgG4的重链恒定区或者具有S228P氨基酸置换的人IgG4的重链恒定区；所述人轻链恒定区选自λ轻链或κ轻链的轻链恒定区。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或

与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的轻链；或

氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的轻链。

在一些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体和多特异性抗体的至少一种，所述抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和sdAb的至少一种。

本申请第二方面提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其具有以下特性中的至少一种：

(Ⅰ)与本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段结合相同的、或者完全重叠或部分重叠的人4-1BB蛋白的表位；

(Ⅱ)与本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合人4-1BB蛋白的表位。

本申请第三方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第一方面提供的抗体或其抗原结合片段，或编码本申请第二方面所提供的分离的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。

本申请第四方面提供了一种表达载体，其包含本申请第三方面提供的多核苷酸分子，优选地，所述表达载体为真核表达载体。

本申请第五方面提供了一种宿主细胞，其包含本申请第三方面提供的多核苷酸分子，或本申请第四方面提供的表达载体，优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞用于表达本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段。

本申请第六方面提供了一种制备本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在本申请第五方面所提供的宿主细胞中表达所述的抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。

本申请第七方面提供了一种药物组合物，其包含本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面所提供的分离的抗体或其抗原结合片段或本申请第三方面提供的多核苷酸分子或本申请第四方面提供的表达载体或本申请第五方面提供的宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请第八方面提供了本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段或本申请第三方面提供的多核苷酸分子或本申请第四方面提供的表达载体或本申请第五方面提供的宿主细胞或本申请第七方面提供的药物组合物在制备用于治疗或预防4-1BB介导的疾病的药物中的用途。

本申请第九方面提供了本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段或本申请第三方面提供的多核苷酸分子或本申请第四方面提供的表达载体或本申请第五方面提供的宿主细胞或本申请第七方面提供的药物组合物在治疗或预防4-1BB介导的疾病中的用途。

本申请第十方面提供了一种治疗或预防4-1BB介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面所提供的分离的抗体或其抗原结合片段或本申请第三方面提供的多核苷酸分子或本申请第四方面提供的表达载体或本申请第五方面提供的宿主细胞或本申请第七方面提供的药物组合物。

在一些实施方式中，所述4-1BB介导的疾病为癌症；优选地，所述的癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、食管癌、宫颈癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、胆囊癌和胶质母细胞瘤中的至少一种。

本申请第十一方面提供了一种试剂盒，其包括本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面所提供的分离的抗体或其抗原结合片段或本申请第三方面提供的多核苷酸分子或本申请第四方面提供的表达载体或本申请第五方面提供的宿主细胞或本申请第七方面所提供的药物组合物。

本申请第十二方面提供了一种使用本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段或本申请第二方面所提供的分离的抗体或其抗原结合片段检测4-1BB的方法，其包括使所述抗体或其抗原结合片段与样品接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与4-1BB形成的结合物，以及任选地对所述结合物进行定量测定。

本申请提供的能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，可以与人4-1BB特异性结合，具有低的肝毒性以及明显的肿瘤抑制作用，可用于治疗4-1BB介导的疾病，例如癌症。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。

图1显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6与人4-1BB的结合能力测试结果。

图2显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6与鼠4-1BB的结合能力测试结果。

图3显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照与Jurkat NFKB 4-1BB细胞的结合能力测试结果。

图4显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照阻断4-1BBL与Jurkat NFKB 4-1BB细胞结合的测试结果。

图5显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照在荧光素酶报告基因系统(CHO FCGR2B 4G6/Jurkat NFKB 4-1BB双细胞)中的活性检测结果。

图6显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照在荧光素酶报告基因系统(THP-1/Jurkat NFKB 4-1BB双细胞)中的活性检测结果。

图7显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照在荧光素酶报告基因系统(Raji/Jurkat NFKB 4-1BB双细胞)中的活性检测结果。

图8显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照在荧光素酶报告基因系统(Raji/Jurkat NFKB双细胞)中的活性检测结果。

图9A至图9F分别显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照引起的细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ释放量变化。

图10显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage6以及相关对照的肿瘤生长抑制作用。

图11显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage6以及相关对照在给药后第14天对荷瘤小鼠脾脏重量的影响。

图12A显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage6以及相关对照在给药后第14天对荷瘤小鼠单位重量肝脏中总淋巴细胞数量影响。

图12B至图12E分别显示了本申请实施例2中制备的抗4-1BB抗体JS011-phage 3和JS011-phage 6以及相关对照在给药后第14天对荷瘤小鼠肝脏中CD3⁺CD4⁺T细胞比例、CD3⁺CD8⁺T细胞比例、CD3⁺CD8⁺CD11c⁺T细胞比例以及CD3^-NK1.1⁺的NK细胞比例的影响。

具体实施方式

定义

除非另有说明，本申请的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。

为了可以更容易地理解本申请，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本申请所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocolsin MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于±5％、±2％、±1％和±0.1％。

术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。

术语“4-1BB”、“4-1BB受体”、“4-1BB蛋白”、“CD137”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)”是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，并且是活化诱导的T细胞共刺激分子。本申请中，术语“4-1BB”可以包括人4-1BB，及其变体、亚型、同源物、直系同源物和旁系同源物，因此，本申请所提供的抗体或其抗原结合部分也可以结合来自除人之外的物种的4-1BB，例如食蟹猴4-1BB或小鼠4-1BB。例如，在某些情况下，对人4-1BB蛋白具有特异性的抗体可以与来自除了人之外的物种的4-1BB交叉反应。在其它实施例中，对人4-1BB蛋白具有特异性的抗体可以对人4-1BB蛋白具有完全特异性，并且可以表现出物种或其它类型的交叉反应，或者可以与来自某些其它物种但并非所有其它物种的4-1BB交叉反应，例如，与猴4-1BB交叉反应，但不与小鼠4-1BB交叉反应。术语“人4-1BB”可以指具有NCBI登录号NP_001552.2的人4-1BB的完整氨基酸序列的4-1BB；“人4-1BB”的序列也可以与NCBI登录号NP_001552.2的人4-1BB的氨基酸序列不同，例如可以在非保守区中具有保守的突变，并且具有与NCBI登录号NP_001552.2的人4-1BB基本上相同的生物学功能。术语“小鼠4-1BB”可以指具有NCBI登录号NP_033430.1或NP_035742.1的小鼠4-1BB的完整氨基酸序列的4-1BB。术语“食蟹猴4-1BB”可以指具有Genbank登录号NP_001253057.1的食蟹猴4-1BB的完整氨基酸序列的4-1BB。

术语“百分比(％)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

术语“免疫应答”是指通过例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或者在自体免疫或病理性炎症的情况下，对正常人细胞或组织的损害、破坏或清除。

术语“信号转导途径”或“信号转导活性”是指通常由蛋白质间相互作用诸如生长因子对受体的结合启动的生化因果关系，所述关系导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般地，传递包括引起信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。倒数第二过程通常包括细胞核事件，从而导致基因表达的变化。

术语“活性”或“生物活性”或术语“生物性质”或“生物特征”在本申请中可互换使用，其包括但不限于表位或抗原亲和力、特异性、在体内或体外中和或拮抗4-1BB活性的能力、半抑制浓度(IC₅₀)、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性等。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物性质或特征包括，例如，交叉反应性(如与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于酶联免疫吸附(ELISA)、流式细胞分选(FACS)或BIACORE等离子体共振分析、任意的体外或体内中和测定、受体结合测试、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌测试、信号转导测试以及不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学分析等。

术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体等。已知基本的抗体结构单位包含四聚体，每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每各多肽链对具有一条“轻”链(L，约25kDa)和一条“重”链(H，约50-70kDa)。每条链的氨基端部分或片段可包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分或片段可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常将人轻链归类为κ轻链和λ轻链。此外，通常将人重链归类为μ、δ、γ、α或ε五类，并依据重链的不同将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，各自的可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.主编，第2版。Raven Press，N.Y.(1989))。

相对于抗体，术语“分离的抗体”表示该抗体基本上不含与其天然状态相关的其他细胞组分，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。可以理解为，所述分离的抗体为基本上纯化的状态，优选所述分离的抗体处于均质状态，所述分离的抗体可以是干燥或水性溶液。通常可以使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定抗体的纯度和均质性。术语“分离(的)”并非意指完全不存在上述物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本申请的抗体的实验或治疗应用的量存在。

术语“单克隆抗体”是由高度一致的免疫细胞制成的抗体，这些免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体具有单价亲和力，因为它们结合相同的表位(抗体识别抗原的部位)。所述单克隆抗体也可能包括少量天然存在的突变。相比之下，术语“多克隆抗体”结合多个表位，通常由几个不同的浆细胞(分泌抗体的免疫细胞)谱系组成，可以理解为是多种单克隆抗体的混杂物。修饰语“单克隆”不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

术语“多特异性抗体”意指包含两个或更多个抗原结合结构域，能够结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个、四个或更多个不同的表位)的抗体。可特异性抗体结合的表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的示例包括结合两个不同表位的“双特异性抗体”。

术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”系指抗体中能够特异地与抗原的一部分或全部结合，并与抗原的一部分或全部互补的区域。当抗原很大时，抗体可能只能结合到抗原的一个特定的部分，该部分被称为表位。结合结构域可包含重链和轻链的可变结构域，即重链可变区VH和轻链可变区VL，其各自包括四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。CDR在序列上可变化并确定对特定抗原的特异性。

术语“全长”抗体，是指在天然存在时包含四条肽链的免疫球蛋白分子：两条重链(全长约50-70kDa)和两条轻链(全长约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和与互补决定区间隔分布的，具有更高保守性的框架区(FR)。每一个VH或VL从氨基末端至羧基末端的结构域排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区分别含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导抗体对宿主的组织或免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。

术语“重链恒定区”或“CH”在本申请中可互换使用，其包含至少三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。示例性的，人重链恒定区包括γ、δ、α、ε和μ，各重链恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步再分成亚类，例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)；IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。同种型还可以包括一些修饰形式，所述修饰可以改变Fc功能，例如增强或减弱效应子功能或增强或减弱其对Fc受体的结合。

术语“轻链恒定区”或“CL”在本申请中可互换使用，其包含1个轻链恒定结构域CL。示例性的，根据轻链恒定区的不同，轻链可分为λ和κ两类。

术语抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或抗体的衍生物，所述“抗原结合片段”对应的抗体可称为亲代抗体。抗体的抗原结合片段通常包含亲代抗体的抗原结合区或可变区的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和单链Fv片段，双抗体，线性抗体，结构域抗体，单链抗体分子，例如scFv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体等。相同摩尔浓度下，抗原结合片段至少能够保持亲代抗体抗原结合活性的10％，至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。此外，抗体的抗原结合片段还可以包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中，这些结构域存在于单条多肽链中。Fv多肽一般还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。

术语“结构域抗体”是指只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个VH区可靶向相同或不同的抗原。

术语“抗原”系指能够被本申请的抗体所结合的分子或分子的一部分。抗原可有一个或多于一个表位。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中，与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，两个所述片段通过短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一片段中的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。

术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人4-1BB或其表位作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10^-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原或其表位结合，并且抗体与预定抗原或其表位结合的亲和力是其与其他非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原”在本申请中可以与术语“特异性结合”互换使用。

术语“表位”是指抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。

“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员(如抗原和抗体)之间相互作用的固有结合亲和力。亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)表示，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，例如可采用ForteBio生物学分子相互作用工作站测定。

术语“不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0×10^-6M或更高，更优选1.0×10^-5M或更高，更优选1.0×10^-4M或更高、1.0×10^-3M或更高，更优选1.0×10^-2M或更高。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10^-6M或更低，优选5.0×10^-8M或更低，更优选1.0×10^-8M或更低、5.0×10^-9M或更低，更优选1.0×10^-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M或更低，优选10^-7M或更低，更优选10^-8M或更低。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语“核酸”或“多核苷酸”还包括含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。

“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)，其可衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，其可以以可操作的方式连接一或多个多核苷酸分子。本申请中，构建体通常本申请的多核苷酸分子，其可操作地连接至转录起始调节序列，这些序列会导引本申请的多核苷酸分子在宿主细胞中的转录。可使用异源启动子或内源启动子导引本申请的核酸的表达。

“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)中自主复制。另一些载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后，被整合至宿主细胞的基因组中，与宿主基因组一起复制。

本文所用术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体通常包含一或多个表型选择标记和复制起点，用于维护载体及在需要的情况下在宿主内进行扩增。

本申请中，除非另有明确规定，用于细胞或受体的“活化”、“刺激”和“处理”可具有相同含义，例如细胞或受体用配体活化、刺激或处理。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体或类似物、突变蛋白以及来源于抗体的结合化合物(如抗体及其结合片段)。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指通过内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。“应答”或“反应”，例如细胞、组织、器官或生物体的应答，包括生化或生理行为的改变，例如生物区室(如组织、细胞、细胞器等)内的部分成分浓度、密度、粘附或迁移、基因表达速率或分化状态的改变，其改变可以与活化、刺激或处理相关。

如本文中所用，术语任何疾病或病症的“治疗”或“医治”在一个实施方式中可以是指改善疾病或病症，例如减缓、阻止或减少疾病的进展，或疾病的临床症状等；在另一个实施方式中，可以是指缓解或改善至少一个身体参数，这些参数可能并不表现出明显的疾病症状的改善；在另一个实施方式中，其可以是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或在这两方面调节疾病或病症。除非在本文中明确描述，否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法在本领域中通常是已知的。

本申请中，所述“受试者”包括任何的人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时施用或共同施用，或任意次序的连续施用。

“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指该剂量下，本申请的抗4-1BB抗体或其抗原结合片段单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，能够有效预防或改善至少一种疾病或病况的症状，或预防或改善至少一种疾病或病况的发展。治疗有效剂量还可以指足以导致症状改善(例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度)的抗体或其抗原结合片段的量。当对个体施用单独给予的活性成分(如抗体或其抗原结合片段)时，治疗有效剂量仅是指该成分；当组合施用时，不论是依次药还是同时给药，治疗有效剂量是均指引起治疗效果的所有活性成分的综合量。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。

“癌症”和“癌性”指哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患，此定义中包括良性肿瘤、恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌)、腹膜癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、黄疸型肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(如低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、成免疫细胞性NHL、成淋巴细胞性NHL、小无核裂细胞性NHL、贮积病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，与脑瘤有关的水肿和梅格斯氏综合征(Meigs)有关的异常血管增殖。

抗体

本申请提供了一种能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

在一些实施方式中，根据Kabat编号系统，所述能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，或者分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列；

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

在一些实施方式中，本申请提供了一种能够与4-1BB特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，并具有以下特性中的至少一种：

(Ⅰ)与本申请第一方面所述的抗体或其抗原结合片段结合相同的、或者完全重叠或部分重叠的人4-1BB蛋白的表位；

(Ⅱ)与本申请第一方面所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合人4-1BB蛋白的表位。

其中，与本申请的抗体或其抗原结合片段结合完全重叠的表位表示该抗体结合的抗原表位包含了本申请的抗体或其抗原结合片段的结合表位；与本申请的抗体或其抗原结合片段结合部分重叠的表位表示该抗体结合的抗原表位的一部分与本申请的抗体或其抗原结合片段的结合表位的一部分相同。

对于抗体的互补决定区CDR的精确氨基酸序列边界，可根据公知方法来定义，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等，Nature 342:877-883，1989；Al-Lazikani等，Journal of Molecular Biology，273:927-948，1997)；或者基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health，1987)、AbM(University of Bath)、Contact(University College London)以及IMGT(theinternational ImMunoGeneTics database，1999Nucleic Acids Research,27,209-212)；或者基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。本申请中抗体的CDR可以由本领域技术人员根据本领域的任何方案(例如上述任选的定义方法)确定边界。

应该注意的是，基于不同定义方式获得的同一抗体的CDR的边界可能有所差异，即不同定义方式下获得的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，当采用本申请定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体还包括其互补决定区序列包含本申请所述的CDR的序列，只是由于采用了不同的CDR边界定义方式而导致其所声称的CDR边界与本申请所定义的具体CDR边界不同的抗体。

具有不同特异性(即，针对不同的抗原结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合，抗体CDR与抗原结合的最小重叠区域也称为用于抗原结合的“最小结合单位”，可使用Kabat、IMGT、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种来确定。最小结合单位可以是CDR的一部分。正如本领域技术人员所明了的，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基，因此，本申请也考虑任何CDR的变体，例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

本申请所述的人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠源CDR区插入人种系框架区。参见Winter等人的美国专利No.5225539及Queen等人的美国专利No.5530101；5585089；5693762和6180370。

在一些实施方式中，氨基酸差异可以由氨基酸的变化造成，所述变化包括氨基酸缺失、插入或置换。在一些实施方式中，本申请的抗4-1BB抗体或其抗原结合片段包括具有已通过氨基酸缺失、插入或置换突变的，但仍与所述抗体或其抗原结合片段(特别地在上述序列中描述的CDR区中)具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的抗体。

在一些实施方式中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处存在氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括经半胱氨酸工程改造的抗体或其抗原结合片段，例如“硫代MAb”，其中所述抗体或其抗原结合片段的一或多个残基被半胱氨酸残基置换。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可进一步经修饰为含有本领域已知且可轻易获得的其他非蛋白质部分，例如水溶性聚合物。所述水溶性聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

抗体表达

本申请另一个方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请所提供的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。本申请中的多核苷酸分子包括双链或单链的DNA或RNA。本申请所提供的抗体或其抗原结合片段包括了本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段和本申请第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，编码本申请的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子还可以包括存在核苷酸缺失、插入或置换突变的，但仍与本申请的抗体或其抗原结合片段的CDR对应的编码区具有至少约60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性的多核苷酸序列。

在又一个方面，本申请提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸分子，优选地，所述表达载体为真核表达载体。

在又一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含本申请的多核苷酸分子或表达载体；优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞用于表达本申请所提供的抗体或其抗原结合片段。

本申请所提供的用于表达本申请的抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的多种永生化细胞系。示例性的，可以包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞、A549细胞、293T细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞可以包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。本领域技术人员可以通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。

在又一个方面，本申请提供了一种制备本申请的抗体或其抗原结合片段的方法，包括在本申请所提供的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。

具体地，本申请提供了一种制备本申请的抗体或其抗原结合片段的方法可以包括：

将本申请的多核苷酸分子或表达载体采用公知的方法，例如脂质体转染、电转染、转化等方式导入本申请所述的宿主细胞中；在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养所述的宿主细胞，使所述宿主细胞表达所述抗体或其抗原结合片段；采用本领域公知的方法，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳，从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。

需要说明的是，由于采用的表达载体或宿主细胞的不同，本领域技术人员可根据具体情况选择适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件，本申请在此不做限定。

本申请中的用于表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可以是分离的细胞，也可以是仍存在与宿主体内的细胞，例如可以采用不同细胞系表达所述抗体或其抗原结合片段，或者采用转基因动物表达所述抗体或其抗原结合片段。

由不同细胞系表达或在不同转基因动物中表达的抗体或其抗原结合片段可能具有不同的糖基化修饰。需要说明的是，不论这些抗体的糖基化如何，这些由本申请提供的多核苷酸分子编码的，或包含本申请提供的氨基酸序列的所有抗体均是本申请的组成部分。同样，在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段优选为非岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段，发明人发现，非岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段在体外和体内比岩藻糖基化的抗体或其抗原结合片段具有更强力的功效，此外，由于这些不同的糖结构都是天然人血清IgG的正常组分，因此其免疫原性并无明显差异。

药物组合物或药物制剂

在又一个方面，本申请提供了一种药物组合物(或称为药物制剂、制剂)，其包含本申请所提供的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋形剂。

应理解，本申请提供的抗体或其药物组合物可以整合制剂中合适的载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而提供改善的转移、递送、耐受性能等。

本申请中，所述药物组合物中的活性成分以其生物学活性有效的形式存在，并且不包含对所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的成分。

在本申请的一些实施方式中，可以通过将具有所需纯度的本申请的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑，1980)混合来制备本申请的药物组合物，优选地，本申请的药物组合物可以是水溶液或冻干制剂的形式。

本申请的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分可以根据特定适应症选择，优选地，所述活性成分不会不利地影响彼此的活性。在一些实施方式中，其它的活性成分可以为化疗剂、免疫检查点抑制剂、生长抑制剂、抗生素或已知的各种抗肿瘤或抗癌剂，所述活性成分可以以对于目的用途有效的量组合存在。

在又一个方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括本申请的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。

医药用途

在又一个方面，本申请提供了本申请的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防4-1BB介导的疾病或病症的药物中的用途。

在又一个方面，本申请提供了本申请的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞或药物组合物用于治疗或预防4-1BB介导的疾病或病症的用途。

在又一个方面，本申请提供了一种治疗或预防4-1BB介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所提供的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。

在一些实施方式中，所述4-1BB介导的疾病为癌症；优选的，所述的癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、食管癌、宫颈癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、胆囊癌和胶质母细胞瘤中的至少一种。

在一些实施方式中，给药方式包括但不限于口服、静脉内给药、皮下给药、肌内给药、动脉内给药、关节内给药(例如在关节炎关节中给药)、吸入给药、气雾剂递送或肿瘤内给药等。

在一些实施方式中，本申请还提供了一种联合疗法，其包括向受试者联合本申请的抗体或其抗原结合片段以及联合一种或多种其它疗法或治疗剂。在一些实施方式中，所述疗法可以包括手术治疗和/或放射疗法。在一些实施方式中，所述治疗剂可以包括PD-1抗体、CD4抗体和/或CTLA-4抗体等。

用于诊断和检测的方法

在又一个方面，本申请提供了一种使用本申请的抗体或其抗原结合片段检测4-1BB的方法，包括使所述抗体或其抗原结合片段与样品接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与4-1BB形成的结合物，以及任选地对所述结合物进行定量测定。术语“检测”用于本申请中时，可以包括定量或定性检测。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在某些实施方式中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方式中，生物样品包含细胞或组织。本申请对检测所述抗体或其抗原结合片段与4-1BB形成的结合物的方法不做限定；本申请对所述“对所述结合物进行定量测定”的方法不做限定。

为使本申请的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本申请进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1、抗4-1BB抗体的筛选

1.1噬菌体库的建立

把40个不同个体来源的人的50mL外周血混合在一起，分离外周血单核细胞PBMC，Trizol提取总RNA，用反转录试剂盒(Thermo，18080051)合成cDNA 第一条链。以合成的cDNA为模板通过PCR扩增出抗体重链的可变区VH，抗体轻链κ链和λ链的可变区Vκ和Vλ。通过第一轮重叠PCR(overlap PCR)组装成VH-CH1，Vκ-CK，Vλ-Cλ，之后通过第二轮overlap PCR组装成Fab，Fab片段酶切回收连接入噬菌粒载体。构建好的质粒载体电转TG1感受态细胞得到噬菌体展示文库。

1.2噬菌体库筛选

将构建好的噬菌体展示文库包装成噬菌体。第一轮淘选取10¹³-10¹⁴个噬菌体加入生物素化的4-1BB孵育结合，之后加入链霉亲和素偶连的磁珠结合4-1BB，先用PBST洗掉不结合的噬菌体，再用pH 2.0的甘氨酸洗脱结合在4-1BB上的噬菌体，用以感染TG1，扩增包装出噬菌体用于第二轮的淘选。通过四轮淘选，第四轮的噬菌体感染TG1并铺板成单克隆，挑取单克隆于96深孔板中，IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达。第二天提取周质腔上清，用于4-1BB的结合酶联免疫吸附(ELISA)分析。阳性的克隆通过测序得到其序列。最终获得两组噬菌体，分别命名为phage3和phage6用于进一步分析，其中，噬菌体phage3表达的抗体命名为JS011-phage3；噬菌体phage6表达的抗体命名为JS011-phage6。

实施例2、抗4-1BB抗体的分子构建与生产

从人B淋巴细胞(来自北京血液研究所)中克隆IgG4的重链恒定区(hIgG4 CH1-CH3)和κ轻链恒定区(human Kappa LC)的编码序列，引入pTT5质粒中，分别形成载体HXT4S和HXT2。

载体HXT4S的主要元件依次包括：BSPQI酶切位点、CMV Promoter(目的基因表达的启动子)、AmpR(氨苄抗性基因)、pMB1ori(复制起始)、ori p、signal peptide(目的基因表达的信号肽)和目的基因hIgG4 CH1-CH3。

载体HXT2的主要元件依次包括：BSPQI酶切位点、CMV Promoter(目的基因表达的启动子)、AmpR(氨苄抗性基因)、pMB1ori(复制起始)、ori p、signal peptide(目的基因表达的信号肽)和目的基因human Kappa LC。

2.1JS011-phage3轻链表达载体的构建

以phage3感染TG1菌株，摇菌后提取的质粒为模板，合成首尾引物，如下表1中SEQID No:21和SEQ ID No:22所示，进行PCR，得到的PCR产物通过SapI酶切并连接至HXT2载体，得到表达载体HXT2-JS011-3-LC。

2.2JS011-phage3重链表达载体的构建

以phage3感染TG1菌株，摇菌后提取的质粒为模板，合成首尾引物，如下表1中SEQID No:23和SEQ ID No:24所示，进行PCR，得到的PCR产物通过SapI酶切并连接至HXT4S载体，得到表达载体HXT4S-JS011-3-HC。

2.3JS011-phage6轻链表达载体的构建

以phage6感染TG1菌株，摇菌后提取的质粒为模板，合成首尾引物，如下表1中SEQID No:25和SEQ ID No:26所示，进行PCR，得到的PCR产物通过SapI酶切并连接至HXT2载体，得到表达载体HXT2-JS011-6-LC。

2.4JS011-phage6重链表达载体的构建

以phage6感染TG1菌株，摇菌后提取的质粒为模板，合成首尾引物，如下表1中SEQID No:23和SEQ ID No:24所示，进行PCR，得到的PCR产物通过SapI酶切并连接至HXT4S载体，得到表达载体HXT4S-JS011-6-HC。

表1

引物名称	引物序列
		JS011-3VL F BSPQI：	gatcgctcttcatgtgagctcgagctgactcagccaccctca(SEQ ID No:21)
JS011-3VL R BSPQI：	gatcgctcttcttcgtaggacggtcagtctggtccctccgccga(SEQ ID No:22)
		JS011-3/6VH F BSPQI	gatcgctcttcatctcaggtgcagctggtgcagtctggggct(SEQ ID No:23)
JS011-3/6VH R BSPQI	atgcgctcttctagctgaggagacggtgaccagggttccctgg(SEQ ID No:24)
		JS011-6VL F BSPQI：	atgcgctcttcatgtgagctcgccctgactcagcctccctccg(SEQ ID No:25)
JS011-6VL R BSPQI：	atgcgctcttcttcgtaggacggtcagcttggtccctccgccg(SEQ ID No:26)

2.5JS011-phage3和JS011-phage6抗体的表达及纯化

将CHO-K1细胞(ATCC,CCL-61)经悬浮无血清驯化及筛选使细胞适用于瞬转表达，命名为CHO-18，将CHO-18细胞使用CD CHO培养基(Gibco)，在36.5℃，120rmp，7％CO₂条件下培养，当细胞密度达到(2-6)×10⁶/mL时，用CD CHO培养基进行传代扩增。转染前一天，将CHO-18细胞密度稀释至(1.5-2.0)×10⁶/mL，放置摇床(培养条件为36.5℃，120rmp，7％CO₂)培养，次日当细胞密度达到约3.5×10⁶/mL时进行转染。转染时，先向反应器中加入十分之一转染体积的CD CHO培养基，依次加入1-2ug/mL转染体积的上述表达载体HXT2-JS011-3-LC和HXT4S-JS011-3-HC，或者HXT4S-JS011-3-HC和HXT4S-JS011-6-HC，3-14ug/mL的PEI(聚乙烯亚胺)，混匀后室温孵育20-30min，然后将得到的混合物缓慢加入到预先处理好的上述CHO-18细胞中，形成转染混合物，边加边混匀。将转染混合物放入摇床培养，培养条件为36.5℃，120rmp，7％CO₂。培养周期为转染后6-10天，每两天补料一次。

上述转染混合物培养结束后，1000rmp离心10min弃去沉淀，然后12000rmp离心30min收集细胞上清并进行无菌过滤。第一步，用AKTA Avant纯化仪进行纯化，先用0.1MNaOH对装填mabselect sure LX柱子进行消毒15-20min，然后用PBS缓冲液平衡3-5个柱体积后上样，上样完成后，用pH 5.5醋酸钠缓冲液进行淋洗，最后用pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱目的蛋白；第二步，用Eshmuno CPX进行精纯，平衡液为pH5.5，50mM醋酸-醋酸钠体系，洗脱液为pH5.5，50mM醋酸-醋酸钠+1M NaCl缓冲体系，采用线性洗脱方式，收集目的蛋白，经SEC-HPLC测定，单体纯度可达到95％以上，即得到单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6。

通过基因测序获得抗体JS011-phage3和JS011-phage6的基因序列，进而得到本申请抗体的氨基酸序列。

抗体JS011-phage3的氨基酸序列如下：

重链(JS011-phage3-HC，斜体字表示VH，下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):

其中包括重链可变区JS011-phage3-VH:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPQSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGGEWLAIPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)；

其中根据Kabat编号系统，包括：

HCDR1:GYYMH(SEQ ID NO:1)；

HCDR2:WINPQSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:2)；

HCDR3:EGGEWLAIPFDY(SEQ ID NO:3)；

轻链(JS011-phage3-LC，斜体字表示VL，下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):

其中包括轻链可变区JS011-phage3-VL:

ELELTQPPSVSVSPGQTASITCSADKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVLYEDSKRPSGIPERISGSNSGNTATLTIRGTQPMDEADYYCQTWDTNTVLFGGGTRLTVL(SEQ ID NO:14)；

其中根据Kabat编号系统，包括：

LCDR1:SADKLGDKYAS(SEQ ID NO:4)；

LCDR2:EDSKRPS(SEQ ID NO:5)；

LCDR3:QTWDTNTVL(SEQ ID NO:6)。

抗体JS011-phage6的氨基酸序列如下：

重链(JS011-phage6-HC，斜体字表示VH，下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):

其中包括重链可变区JS011-phage6-VH:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGQYIHWARQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDKAGADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；

其中根据Kabat编号系统，包括：

HCDR1:GQYIH(SEQ ID NO:7)；

HCDR2:WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:8)；

HCDR3:DKAGADY(SEQ ID NO:9)；

轻链(JS011-phage6-LC，斜体字表示VL，下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):

其中包括轻链可变区JS011-phage6-VL:

ELALTQPPSVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYDYVSWYQQYPGKAPKLMISGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLIISGLQAEDEGDYYCSSYTSRSTRWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:16)；

其中根据Kabat编号系统，包括：

LCDR1:TGTSSDIGGYDYVS(SEQ ID NO:10)；

LCDR2:GVSNRPS(SEQ ID NO:11)；

LCDR3:SSYTSRSTRWV(SEQ ID NO:12)。

实施例3、抗4-1BB抗体的结合能力检测

3.1Elisa检测候选抗体与4-1BB蛋白的结合能力：

使用Thermo Scientific的酶标仪，用固定浓度的含有His标签的人4-1BB(将4-1BB胞外区序列融合His标签构建表达质粒，并通过瞬转293细胞表达纯化得到)或含有His标签的鼠4-1BB(厂家Sino Biological，货号50811-M08H)抗原(1.0μg/mL)包板，2％BSA封闭后，加入梯度稀释的JS011抗体JS011-phage3和JS011-phage6(与人4-1BB结合：1μg/ml起始，3倍梯度稀释，共12个浓度；与鼠4-1BB结合：1μg/ml起始，2.5倍梯度稀释，共12个浓度)；将鼠抗人IgG4 Fc HRP(Southern Biotech，9200-05)稀释5000倍作为检测抗体进行检测，然后用0.1mg/ml TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色，最后用2M HCl终止反应，在450nm/620nm下读板。使用四参数对数回归(4PL)模型拟合半数效应浓度EC₅₀。采用Anti-KLH-IgG4(CB25772663，或将编码抗血蓝蛋白KLH的人IgG4抗体重轻的基因序列分别构建表达质粒，并通过瞬转CHO-18细胞表达纯化得到)作为阴性对照。

JS011-phage3和JS011-phage6与人4-1BB的结合曲线如图1所示，JS011-phage3和JS011-phage6与鼠4-1BB的结合曲线如图2所示。从图1中可以看出，JS011-phage3及JS011-phage6均可以与人4-1BB结合且结合活性接近，EC₅₀分别为1.5ng/ml及1.6ng/ml；从图2中可以看出，JS011-phage3可与鼠4-1BB结合，EC₅₀为6.1ng/ml，JS011-phage6与鼠4-1BB的不结合。

实施例4：抗4-1BB抗体与Jurkat NFKB 4-1BB细胞的结合

将Jurkat NFKB 4-1BB细胞(稳定表达4-1BB，将NFKB融合荧光素酶报告基因构建表达质粒，并电转染Jurkat细胞，经加压筛选获得稳定表达NFKB的Jurkat细胞，命名为Jurkat NFKB细胞。再将4-1BB全长基因构建表达质粒，电转至Jurkat NFKB细胞，经加压筛选获得稳定表达4-1BB的Jurkat NFKB 4-1BB)与不同浓度的抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6(起始浓度为100μg/ml，3倍稀释，共12个浓度梯度)在4℃孵育30min，然后洗涤并与荧光素PE标记的抗人IgG的二抗(SouthernBiotech，Cat#2040-09)在4℃条件下避光孵育30min。最后用流式细胞仪(BD CantoⅡ)收集细胞，检测细胞表面结合的荧光抗体。用FlowJo分析原始数据得到MFI值(记为MFI-PE)，并通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线，结果如图3所示，并计算EC₅₀，其中阳性对照为Urelumab(BMS对照抗体，参见专利CN1867585B)和Utomilumab(Pfizer对照抗体，参见专利CN103221428B)抗体；阴性对照为Anti-KLH-IgG4。

如图3所示，JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab和Utomilumab抗体均能够以高亲和力与Jurkat NFKB 4-1BB细胞表面的4-1BB结合，EC₅₀分别为3.442μg/mL、6.961μg/mL、1.532μg/mL和0.01656μg/mL。

实施例5：抗4-1BB抗体阻断4-1BB配体(4-1BBL)与Jurkat NFKB 4-1BB细胞的结合

将Jurkat NFKB 4-1BB细胞与不同浓度的抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6(起始浓度为100μg/ml，3倍稀释，共12个浓度梯度)和2μg/ml生物素标记的4-1BBL-hFc(为4-1BB配体，将4-1BBL胞外区序列融合人FC(hFC)序列构建表达质粒，并通过瞬转CHO-18细胞表达纯化得到)在4℃孵育30min，然后洗涤并与荧光素FITC标记的二抗(BioLegend，Cat#405202)在4℃条件下避光孵育30min。最后用流式细胞仪(BD CantoⅡ)收集细胞，检测细胞表面结合的荧光抗体。用FlowJo分析原始数据得到MFI值(记为MFI-FITC)，并通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的抑制曲线并计算IC₅₀，结果如图4所示，其中阳性对照为Urelumab(BMS对照抗体，参见专利CN1867585B)和Utomilumab(Pfizer对照抗体，参见专利CN103221428B)；阴性对照为Anti-KLH-IgG4。

如图4所示，JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab抗体均不能阻断4-1BBL与Jurkat NFKB 4-1BB细胞表面的4-1BB结合，Utomilumab能够有效阻断4-1BBL与JurkatNFKB4-1BB细胞表面的4-1BB结合，IC₅₀为0.3431μg/ml。

实施例6：抗4-1BB抗体在荧光素酶报告基因系统(CHO FCGR2B 4G6/JurkatNFKB4-1BB双细胞)中的活性检测

将CHO FCGR2B 4G6细胞(稳定高表达人CD32B，将CD32B基因构建表达质粒，并电转染CHO-K1细胞，经加压筛选获得稳定表达CD32B的单克隆细胞，命名为CHO FCGR2B 4G6细胞)按照每孔3×10⁴个细胞数加入96孔平底白板中(Corning，Cat#3917)，37℃培养箱孵育过夜。第二天将效应细胞Jurkat NFKB 4-1BB(稳定表达NlucP/NFKB-RE和4-1BB)按照每孔1×10⁵个细胞数加到细胞板中。之后用实验缓冲液(RPMI 1640(1×)+2％FBS)将抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6(起始浓度为25μg/ml，4倍稀释，共9个浓度梯度)加入到细胞板中，并在37℃培养箱中共孵育4-6小时。最后在细胞抗体混合体系中加入Nano-Glo荧光素酶检测试剂(Promega)并用多功能酶标仪(TECAN M1000 pro)检测化学发光信号(记为RLU)。通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线，计算EC₅₀值，结果如图5所示。阳性对照为Urelumab(BMS对照抗体，参见专利CN1867585B)和Utomilumab(Pfizer对照抗体，参见专利CN103221428B)。

如图5所示，JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab和Utomilumab在CHOFCGR2B4G6细胞和效应细胞Jurkat NFKB 4-1BB构成的荧光素酶报告基因系统中有很强的激活T细胞的活性，EC₅₀分别为0.03888μg/mL、0.4499μg/mL、1.038μg/mL和0.02391μg/mL，JS011-phage3与Utomilumab活性相当；JS011-phage6与Urelumab活性相当，JS011-phage3对T细胞的激活能力强于JS011-phage6。

实施例7：抗4-1BB抗体在荧光素酶报告基因系统(THP-1/Jurkat NFKB 4-1BB双细胞)中的活性检测

将THP-1细胞(一种人髓系白血病单核细胞，CD32B阳性)和效应细胞JurkatNFKB4-1BB(稳定表达NlucP/NFKB-RE和4-1BB)分别按照每孔5×10⁴个细胞数和每孔1×10⁵个细胞数加入96孔平底白板中(Corning，Cat#3917)。之后用实验缓冲液(RPMI 1640(1×)+2％FBS)将抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6(起始浓度为100μg/ml，4倍稀释，共10个浓度梯度)加入到细胞板中，并在37℃培养箱中共孵育4-6小时。最后在细胞抗体混合体系中加入Nano-Glo荧光素酶检测试剂(Promega)并用多功能酶标仪(TECAN M1000pro)检测化学发光信号(记为RLU)。通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线，计算EC₅₀值，结果如图6所示。阳性对照为Urelumab(BMS对照抗体，参见专利CN1867585B)和Utomilumab(Pfizer对照抗体，参见专利CN103221428B)。

如图6所示，JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab和Utomilumab在THP-1细胞和效应细胞Jurkat NFKB 4-1BB构成的荧光素酶报告基因系统中有很强的激活T细胞的活性，EC₅₀分别为0.006642μg/mL、0.2826μg/mL、218.6μg/mL和0.04173μg/mL。

实施例8：抗4-1BB抗体在荧光素酶报告基因系统(Raji/Jurkat NFKB 4-1BB双细胞或Raji/Jurkat NFKB双细胞)中的活性检测

将Raji细胞(一种人髓系白血病单核细胞，CD32B阳性，4-1BBL阳性)按照每孔5×10⁴个细胞数加入96孔平底白板中(Corning，Cat#3917)，Jurkat NFKB 4-1BB细胞(稳定表达NlucP/NFKB-RE和4-1BB)或Jurkat NFKB细胞(稳定表达NlucP/NFKB-RE)分别按照每孔1×10⁵个细胞数加入细胞板中。之后用实验缓冲液(RPMI 1640(1×)+2％FBS)将抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3和JS011-phage6(起始浓度为100μg/ml，4倍稀释，共10个浓度梯度)加入到细胞板中，并在37℃培养箱中共孵育4-6小时。最后在细胞抗体混合体系中加入Nano-Glo荧光素酶检测试剂(Promega)并用多功能酶标仪(TECAN M1000 pro)检测化学发光信号(记为RLU)。通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线，计算EC₅₀值，结果分别如图7和图8所示。其中，阳性对照为Urelumab(BMS对照抗体，参见专利CN1867585B)和Utomilumab(Pfizer对照抗体，参见专利CN103221428B)。

如图7所示，JS011-phage3、JS011-phage6和Urelumab在Raji细胞和效应细胞Jurkat NFKB 4-1BB(4-1BB高表达)构成的荧光素酶报告基因系统中具有激活T细胞的活性，EC₅₀分别为9.446μg/mL、2.713μg/mL和7.240μg/mL，Utomilumab在此系统中存在阻断4-1BBL结合效应从而表现出活性下降。

如图8所示，在Raji细胞和效应细胞Jurkat NFKB(4-1BB低表达)构成的荧光素酶报告基因系统中，JS011-phage3和Urelumab分别与Raji细胞表面的4-1BBL对激活T细胞起到协同作用，EC₅₀分别为9.450μg/mL和86.01μg/mL。JS011-phage6和Utomilumab在此系统中无活性。

实施例9：抗4-1BB抗体细胞因子风暴研究

将两个不同志愿者的PBMC(志愿者1ID#:LP191225，志愿者2ID#：LP190812)按照每孔3×10⁵个细胞数分别加入96孔圆底板中，再将抗4-1BB单克隆抗体JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab和Utomilumab按照10μg/mL浓度加到细胞板中，37℃，5％ CO₂条件下孵育24h后，离心收集上清用BD CBAhuman Th1/Th2 cytokine kitⅡ检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ细胞因子释放量，结果如图9A至图9F所示。阳性对照为OKT3抗体(可从登录号ATCC CRL 8001保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤获得)；阴性对照为Anti-KLH-IgG4。

如图9A至图9F所示，在10μg/mL浓度条件下，JS011-phage3、JS011-phage6、Urelumab和Utomilumab均不会引起细胞因子风暴。

实施例10：抗4-1BB抗体对h41BB人源化小鼠移植MC38肿瘤生长的抑制作用

1、测试目的

评价本申请抗4-1BB单克隆抗体在h41BB人源化小鼠移植小鼠结肠癌MC38皮下肿瘤模型中的抗肿瘤作用。

2、测试过程

6-8周龄雌性h41BB人源化小鼠(购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，于右侧背部皮下接种1×10⁶MC38细胞。待平均肿瘤体积约为90mm³时，选取合适的动物，根据肿瘤体积随机分为5组，每组6只动物。分别为

1、生理盐水对照组(溶剂对照组)；

治疗组：

2、Urelumab(1mg/kg体重)组；

3、Utomilumab(1mg/kg体重)组；

4、JS011-phage3(1mg/kg体重)组和

5、JS011-phage6(1mg/kg体重)组。

腹腔注射，每周给药2次，连续给药3周，末次给药4天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，将小鼠安乐死，计算肿瘤抑制率TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％。(Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。

如图10所示，在给药后第20天，生理盐水对照组平均肿瘤体积为2213mm³，Urelumab(BMS，参见专利CN1867585B)组的平均肿瘤体积为430mm³，与生理盐水对照组相比，显著性抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率为83.9％；Utomilumab(Pfizer，参见专利CN103221428B)组的平均肿瘤体积为1937mm³，未见明显肿瘤抑制作用，肿瘤抑制率为13.0％；JS011-phage3组的平均肿瘤体积为506mm³，显著性抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率为64.7％；JS011-phage6组的平均肿瘤体积为674mm³，显著性抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率为50.6％。结果表明在h41BB人源化小鼠移植MC38 WT模型中，在1mg/kg的剂量水平，JS011-phage3和JS011-phage6均表现出显著的肿瘤抑制作用。

实施例11：抗4-1BB抗体对h41BB人源化小鼠移植MC38肿瘤荷瘤鼠毒性研究

1、测试目的

评价本申请抗4-1BB单克隆抗体在h41BB人源化小鼠移植小鼠结肠癌MC38细胞皮下肿瘤荷瘤鼠的毒性作用。

2、测试过程

6-8周龄雌性h41BB人源化小鼠(购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，于右侧背部皮下接种1×10⁶MC38细胞。待平均肿瘤体积约为115mm³时，选取合适的动物，根据肿瘤体积随机分为5组，每组6只动物。分别为

1、Anti-KLH-IgG4(图中标记为Anti KLH hIgG4，阴性对照组)；

治疗组：

2、JS011-phage3(10mg/kg体重)组；

3、JS011-phage6(10mg/kg体重)组；

4、Urelumab(10mg/kg体重)组和

5、Utomilumab(10mg/kg体重)组。

腹腔注射，每周给药2次，连续给药3次，末次给药7天后安乐死动物。称取小鼠脾脏重量。采集小鼠肝脏，通过流式细胞术检测不同组动物肝脏中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD8⁺CD11c⁺以及CD3^-NK1.1⁺细胞比例，以观察抗4-1BB单克隆抗体的体内毒性。

如图11所示，在给药后第14天，与Anti KLH hIgG4阴性对照组相比，Urelumab(BMS，参见专利CN1867585B)组小鼠脾脏重量明显增加，JS011-phage3组、JS011-phage6组和Utomilumab(Pfizer，参见专利CN103221428B)组小鼠脾脏重量未见显著变化。表明10mg/kg的Urelumab会引起小鼠脾脏肿大现象，JS011-phage3和JS011-phage6不会引起动物脾脏肿大现象。该结果提示本申请的JS011-phage3和JS011-phage 6不会引起脾脏中免疫细胞过度活化，可能在临床中具有更好的安全性。

如图12A所示，在给药后第14天分析肝脏单位重量中所含淋巴细胞数量，与AntiKLH hIgG4阴性对照组相比，JS011-phage3组、JS011-phage6组、Utomilumab组和Urelumab组小鼠肝脏中淋巴细胞数量增加，且Urelumab组小鼠肝脏中淋巴细胞数量显著高于JS011-phage3组、JS011-phage6组和Utomilumab组，表明10mg/kg的Urelumab会导致小鼠肝脏中淋巴细胞数量显著增加。如图12B至图12E所示，在给药后第14天分析肝脏淋巴细胞不同亚群比例的变化，与Anti KLH hIgG4阴性对照组相比，JS011-phage3组、JS011-phage6组、Utomilumab组和Urelumab组小鼠肝脏中CD3⁺CD4⁺T细胞比例降低，CD3⁺CD8⁺T细胞比例升高且Urelumab组CD3⁺CD8⁺T细胞比例显著高于JS011-phage3组、JS011-phage6组和Utomilumab组，Urelumab组小鼠肝脏中的CD3⁺CD8⁺CD11c⁺T细胞比例显著增加，说明Urelumab组小鼠肝脏中过度活化的CD3⁺CD8⁺T细胞比例显著增加，而Urelumab组小鼠肝脏中的CD3^-NK1.1⁺的NK细胞比例降低，表明10mg/kg的Urelumab会导致小鼠肝脏中CD3⁺CD8⁺T细胞比例数量显著增加。小鼠肝脏中淋巴细胞数量增加的原因是CD3⁺CD8⁺T细胞绝对数量显著增加，CD3⁺CD4⁺T和NK细胞绝对数量增加，但是由于CD3⁺CD8⁺T细胞比例大幅度升高导致CD3⁺CD4⁺T和NK细胞比例下降。从给药后的CD3⁺CD8⁺T细胞在肝脏中的绝对值和相对值来看，JS011-phage3和JS011-phage6显著优于Urelumab，提示在临床中可能会有更低的肝毒性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims

1.一种能够与4-1BB特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，根据Kabat编号系统，

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，或者分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，或者分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；

4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，根据Kabat编号系统，

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或者

所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

优选地，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含人重链恒定区和人轻链恒定区，所述人重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选为人IgG4的重链恒定区或者具有S228P氨基酸置换的人IgG4的重链恒定区；所述人轻链恒定区选自λ轻链或κ轻链的轻链恒定区。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：

8.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括单克隆抗体和多特异性抗体的至少一种，所述抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和sdAb的至少一种。

9.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其具有以下特性中的至少一种：

(Ⅰ)与权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合相同的、或者完全重叠或部分重叠的人4-1BB蛋白的表位；

(Ⅱ)与权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合人4-1BB蛋白的表位。

10.一种多核苷酸分子，其包含编码权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或编码权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。

11.一种表达载体，其包含根据权利要求10所述的多核苷酸分子，优选地，所述表达载体为真核表达载体。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的多核苷酸分子，或包含根据权利要求11所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其用于表达根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段。

14.一种制备根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在权利要求12所述的宿主细胞中表达所述的抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求10所述的多核苷酸分子或根据权利要求11所述的表达载体或根据权利要求12所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋形剂。

16.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求10所述的多核苷酸分子或根据权利要求11所述的表达载体或根据权利要求12所述的宿主细胞或根据权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗或预防4-1BB介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述4-1BB介导的疾病为癌症；更优选地，所述的癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、食管癌、宫颈癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、胆囊癌和胶质母细胞瘤中的至少一种。

17.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片或根据权利要求10所述的多核苷酸分子或根据权利要求11所述的表达载体或根据权利要求12所述的宿主细胞或根据权利要求15所述的药物组合物。

18.一种使用根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段检测4-1BB的方法，其包括使所述抗体或其抗原结合片段与样品接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与4-1BB形成的结合物，以及任选地对所述结合物进行定量测定。