CN116199737B

CN116199737B - 一种低分子人表皮细胞自噬调控肽dkx-9及其应用

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Publication number: CN116199737B
Application number: CN202111448183.XA
Authority: CN
Inventors: 王彦丰; 丁宇; 艾学龙; 陈辉龙; 王彦斌; 王媛媛; 姚翔; 丁克祥
Original assignee: Guangzhou Heyan Hemei Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Guangzhou Heyan Hemei Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2025-06-24
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN116199737A

Abstract

本发明提供了一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX‑9及其应用，根据通用细胞自噬调控机制及其理论，新设计与合成的一种可调控人体表皮细胞自噬活性和效应提升的小分子人工合成肽。本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX‑9采用五类氨基酸(苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和精氨酸)共9个氨基酸组成的肽序列，其氨基酸组成及其序列是SEQ ID No.1:TPYNRRRRY‑NH2。经将其对人永生化表皮细胞(HaCat)应用，证实其可上调正向自噬相关蛋白Beclin‑1、LC3‑II、LAMP1、TFEB的表达水平、并可下调负向自噬相关蛋白p62的表达水平。本发明的自噬调控肽DKX‑9未来对皮肤老化干预及防治某些皮肤病等具有积极意义和医学价值，且对推动或促进合成肽未来在细胞自噬等相关学科研发与应用发挥重要作用。

Description

一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术与精细化工及皮肤抗衰老美容化妆品交叉学科领域，具体涉及细胞自噬调控肽范畴，尤其是涉及一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9及其应用。

背景技术

人体皮肤表皮层组织和细胞，不仅可通过表皮屏障保护人体免受外界的侵害，而且，还可通过阻止皮肤组织水分挥发的保水或保湿作用机制等发挥延缓皮肤组织衰老的作用。皮肤表皮组织的屏障构建和皮肤表皮组织的保湿抗衰老这两个方面的作用对于机体生存与组织保护来说都至关重要、也必不可少。皮肤组织细胞与人体其它细胞类型一样，随着时间延续和机体年龄增长也会发生结构、组方、功能等衰老和衰退，且诸多代谢废物及失活、老化细胞及亚细胞结构不能有效地被清除，生理性细胞常态和稳态不断失衡加速皮肤老化和皮肤疾病。

细胞自噬能有效降解和清除皮肤组织及其细胞内老化变性或变异的蛋白、合成差错和突变的核酸、以及受损、无用的细胞亚结构及细胞器，并将其降解的蛋白、核酸和细胞器资源再次循环利用于细胞生存、生长、增殖、分化、再生和修复等细胞生物学过程。因此维持正常的自噬功能能延续机体寿命相关。最近线虫中发现了自噬与长寿的相关性，这更是为自噬和衰老的关系提供了相应的基因学证据。而表皮细胞的自噬效应在皮肤生理学方面具有重要作用，对于维持皮肤表皮组织细胞的正常结构状态(常态)、细胞稳定状态(稳态)和代谢平衡状态(衡态)等正常结构和功能等发挥着重要的影响和作用。这些作用的重要部分正是通过人体皮肤表皮细胞的自噬效应能够主动消化、降解已变性或变异的代谢蛋白及其聚合体、以及受损或老化的细胞器(如线粒体、高尔基体、内质网等)和基因突变的细胞核及其DNA 等作用效应实现的，尤其是对于人体表皮角质形成细胞的正确终末分化有极其重要的意义。而且，现代细胞学研究也证实，表皮细胞自噬在表皮颗粒层的终末分化过程中也起到了重要的作用。另外，目前还有研究也认为，表皮细胞的核滞留与自噬功能被破坏有很大的关系，也是导致皮肤老化和某些皮肤疾病特征性改变的重要原因之一。

细胞自噬对维持皮肤组织正常代谢平衡至关重要。细胞的自噬作用如果受到严重破坏，所带来的皮肤组织生物学后果是表皮细胞增殖能力降低，而表皮细胞增殖能力也是上皮干细胞最重要的特征功能之一。然而，随着年龄增长，细胞自噬活性通常会呈下降趋势，这种随增龄逐渐衰减的自噬作用对表皮细胞结构和功能的影响具有重要意义。特别是，目前医学美容术中“去死皮”“化学换肤”或“美白祛斑”等手段采用某些表皮化学腐蚀剂或剥脱剂(如羟基酸、果酸、维甲酸、三氯乙酸等)、物理磨削术、激光术、电灼术、冷冻术等广泛应用或滥用等，造成了人体皮肤表皮层理化损伤、正常皮肤屏障结构和功能被破坏、表皮组织变薄及角质层含水量减少及皮肤严重老化等。

HaCaT细胞是人类永生化表皮细胞，是非肿瘤来源的人体正常皮肤永生化角质形成细胞株，与正常人角质形成细胞分化特性相似，具有很强的增殖、生长、分化的能力。因此，为了防止人体皮肤损伤，防止正常皮肤屏障结构和功能被破坏，防止表皮组织变薄及角质层含水量减少及防止皮肤严重老化，开发更为高效，特异性的人表皮细胞自噬调控肽，对促进或推动皮肤抗老化和干预及防治某些皮肤疾病等无疑具有积极意义和医学价值，而且对于推动或促进人工合成多肽在细胞自噬及其相关学科领域的研制和应用起到重要作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9，根据通用细胞自噬调控机制及其理论，新设计与合成的一种可调控人体表皮细胞(以同学科领域公认的人体永生化表皮角质形成细胞--HaCat细胞为代表进行验证)自噬活性和效应提升的小分子人工合成肽。本发明的自噬调控肽DKX-9采用人工合成，工艺成熟，来源方便，批次均一，性能稳定，作用均衡，质量和数量易于掌控，加上分子量小，水溶性好，使用安全、且无副作用，未来将其作为表皮细胞自噬调控的功效成分在相应人体皮肤外用制剂和美容化妆品中应用，较目前采用稀少昂贵的转录组基因组中某些miRNA、或从天然植物或中草药繁琐提取且难以纯化的单体或复合成分、或者有一定细胞毒性的雷帕霉素等细胞自噬调控剂具有更多优势和特点。

本发明的另一个目的是为了未来可批量人工合成这种低分子人表皮细胞自噬调控肽 DKX-9、并在未来将其作为表皮细胞自噬调控剂在某些皮肤病的早期干预或临床防治、以及在皮肤抗老化制剂和美容化妆品应用研究提供新的功效成分奠定理论和物质基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9，所述自噬调控肽DKX-9的氨基酸序列为：苏氨酸(Thr)-脯氨酸(Pro)-酪氨酸(Tyr)-天冬酰胺(Asn)-精氨酸(Arg)-精氨酸(Arg)-精氨酸 (Arg)-精氨酸(Arg)-酪氨酸(Tyr)-NH2，通用缩写序列为：TPYNRRRRY-NH2(如SEQ ID No.1所示)。

在本发明中，本发明新设计与合成了这种用于人体表皮细胞的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9(以下简写DKX-9)，并将其应用于人体表皮细胞实验模型，即在HaCat细胞体外培养达到80％融合时更换培养液，并于这些细胞培养皿中分别按照终浓度为25μmol/L、50μ mol/L、100μmol/L的DKX-9加入其中并共培养24h后，采用倒置显微镜观察形态学、免疫蛋白印迹法(Western blotting，WB)和共聚焦免疫荧光显微镜法检测与细胞自噬密切相关的几种重要自噬标志性分子及自噬相关因子和溶酶体相关蛋白表达水平，以观察它对人表皮角质形成细胞应用时对其自噬调控的实际作用及其效果，从而摸索、并找出了这种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)自噬水平的最佳作用时间和有效剂量。

本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9采用五类氨基酸(苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和精氨酸)共9个氨基酸组成的肽序列，其氨基酸组成及其序列是SEQ IDNo.1： TPYNRRRRY-NH2，纯度为97.54％，实测分子量是1280.97道尔顿，与理论分子量值的误差仅在0.1％的范围之内。

作为本发明的一种优选方案，所述自噬调控肽DKX-9通过人工合成方法合成。

上述的自噬调控肽DKX-9在人表皮角质形成细胞的自噬调控上应用。

作为本发明的一种优选方案，所述自噬调控肽DKX-9在皮肤外用剂型或皮肤抗老化制剂中应用。

作为本发明的一种优选方案，所述自噬调控肽DKX-9可在面部美容化妆品中应用。本发明中所用的氨基酸都是皮肤组织所富含的基础氨基酸，理论上对皮肤组织及其细胞均无损害或毒性，亦无药理刺激和生物过敏性，且具有理化性质温和、合成质量稳定，分子量小，水溶性良好、易于其它天然药物及其原料匹配，有良好的相容性和配伍性，并具有反应温和、起效明显、作用持久等，且有可能以共价连接方式帮助原本透皮渗透或吸收率较低皮肤应用肽或生物活性成分等部分透入皮肤发挥作用提供了全新方法和有利条件，也为未来将其作为具有生物活性作用的功效成分、或者将其与某些共济协同和联合增效的天然药物、功效成分和活性物质等在皮肤外用制剂(包括医学美容和皮肤抗衰老制剂等)单独或联合应用奠定了基础和创新可能。自噬调控肽DKX-9在人表皮角质形成细胞的自噬调控上的应用效果明显。

作为本发明的一种优选方案，所述最佳使用剂量和作用时间的自噬调控肽DKX-9经 Western blotting法检测、分析与鉴定，可明显上调人表皮角质形成细胞正向调节自噬相关蛋白Beclin-1，LC3-II的表达水平，同时下调负向调节自噬蛋白p62的表达量从而实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

作为本发明的一种优选方案，所述最佳使用剂量和作用时间的自噬调控肽DKX-9可通过提高自噬溶酶体膜蛋白LAMP1的表达量来实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

作为本发明的一种优选方案，所述最佳使用剂量和作用时间的自噬调控肽DKX-9通过提高关键自噬调控转录因子TFEB的表达量来实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

作为本发明的一种优选方案，所述自噬调控肽DKX-9未来还可能在延缓皮肤老化、预防或者治疗皮肤病药物中配合应用。

作为本发明的一种优选方案，所述的自噬调控肽DKX-9的有效浓度范围为25-100μmol/L，最佳有效浓度范围为50μmol/L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与国际同学科领域所公认的、且经典的人体表皮细胞实验模型(HaCat细胞)，即将它与人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)进行体外共培养24小时，然后采用免疫蛋白印迹法(Western blotting，WB)和共聚焦免疫荧光显微技术分别检测几种重要与细胞自噬标志性分子及自噬相关因子和溶酶体相关蛋白表达水平测试与功效鉴定；

2)本发明不仅设计、合成和检测分析了低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的序列、氨基酸组成及纯度与实际分子质量，也不仅对人表皮角质形成细胞的自噬调控的实际作用及其效果进行了实验研究和功能鉴定，而且，还通过实验研究摸索、并找出了这种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)自噬水平提升的最佳作用时间和有效剂量；

3)本发明通过低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对人表皮角质形成细胞的自噬调控的实际作用及其效果观察时同时选择Beclin1、LC3、P62、溶酶体膜蛋白LAMP1、TFEB等指标观察和评价其对人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)自噬水平提升效果，采用上述指标阐明和解释本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对表皮细胞自噬机制调控具有积极意义；

4)本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9属于低分子量(约1280道尔顿左右)、且富含带正电荷的精氨酸，易于与皮肤表皮细胞、特别是表皮细胞中的角质形成细胞相互结合和作用，而且低分子量有利于皮肤渗透或吸收，而富含带正电荷的精氧酸则有利于通过其精氨酸侧基与表皮细胞膜上带负电荷成分形成电荷相吸作用，最后通过表皮细胞膜凹陷、或膜上受体及网格蛋白等协助，更加有利于其与表皮细胞膜以非共价的方式结合后进入表皮细胞的胞质内发挥其参与并介导表皮细胞自噬调控的生物学作用；

5)本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对皮肤组织及其细胞均无损害或刺激，亦无药理刺激和生物过敏性，且具有理化性质温和、合成质量稳定，分子量小，水溶性良好、易于其它天然药物及其原料匹配，有良好的相容性和配伍性，并具有反应温和、起效明显、作用持久，并有可能以共价连接方式帮助原本透皮渗透或吸收率较低皮肤应用肽或生物活性成分等部分透入皮肤发挥作用提供了全新方法和有利条件，也为未来将其作为具有生物活性作用的功效成分、或将其与某些共济协同和联合增效的天然药物、功效成分和活性物质等在皮肤外用制剂(包括医学美容和皮肤抗衰老制剂等)单独或联合应用奠定了基础和创新可能。

附图说明

图1是实施例1中步骤1)的示意图。

图2是实施例1中步骤2)-步骤5)的示意图。

图3是实施例1中步骤6)-步骤8)的示意图。

图4是实施例1中步骤9)-步骤14)的示意图。

图5是实施例1中步骤15)-步骤16)的示意图。

图6是本发明自噬调控肽DKX-9分子量的质谱分析鉴定。

图7是本发明自噬调控肽DKX-9实际纯度的HPLC分析鉴定。

图8是本发明DKX-9干预对人表皮细胞HaCat细胞的形态学影响。

图9是自噬相关蛋白Beclin 1、P62、LAMP1、LC3I、LC3II和内参GAPDH的表达水平变化。

图10是自噬调控因子TFEB和内参GAPDH的表达水平变化。

图11是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat共培养24h后对其自噬相关蛋白P62和溶酶体相关膜蛋白LAMP1表达水平影响。

图12是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat共培养24h后对其自噬相关蛋白LC3-II和溶酶体相关膜蛋白LAMP1表达的影响。

图13是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat细胞共培养24h后对其自噬溶酶体调控因子TFEB表达水平的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明选用的树脂载体为AM树脂，树脂上的活性位点为氨基，多肽固相合成首先需要把树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氨基反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来。

低分子自噬调控肽DKX-9合成所需要的主要原料和试剂：

Fmoc-L-Tyr(Tbu)-OH(酪氨酸)、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(天冬酰胺)、Fmoc-L-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-L-Thr(Tbu)-OH(苏氨酸)，以上保护性氨基酸均采购于成都诚诺新技术有限公司，Rink Amide-AM Resin(AM树脂)采购于浙江普尔树脂有限公司，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)采购于南京润凯化玻仪器有限公司，DCM(二氯甲烷)采购于南京润凯化玻仪器有限公司)，乙腈采购于南京润凯化玻仪器有限公司，HBTU(苯并三氮唑-N，N， N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯)采购于苏州昊帆生物股份有限公司)，DIEA(N，N-二异丙基乙胺) 采购于苏州昊帆生物股份有限公司，TFA(三氟乙酸)采购于济南瑞氟化工有限公司、TIS(三异丙基硅烷)采购于上海楚青新材料科技有限公司，EDT(1，2-乙二硫醇)采购于上海易势化工有限公司，乙醚采购于南京润凯化玻仪器有限公司，哌啶采购于南京古田化工有限公司，乙醇采购于南京润凯化玻仪器有限公司，茚三酮采购于上海强顺化学试剂有限公司，苯酚采购于济南汇世化工有限公司，吡啶采购于南京润凯化玻仪器有限公司，乙酸酐采购于南京晚晴化玻仪器有限公司。

低分子自噬调控肽DKX-9合成所需要的主要仪器和设备：

TDL-50台式低速大容量离心机(常州梅香仪器有限公司)，HY-2调速多用振荡器(常州朗越仪器制造有限公司)，FD-1A-50真空冷冻干燥机(南京普森仪器设备有限公司)，SHZ-D(Ⅲ) 型循环水真空泵(邦西仪器科技有限公司)，电子天平(常州锐品精密仪器有限公司)，人工设计多肽合成仪、工业用氮气、LC3000型高效液相色谱仪(北京科瑞海科学仪器有限公司)、 Agilent 6120LC/MS(安捷伦科技有限公司)等。

实施例1

低分子自噬调控肽DKX-9的化学固相合成方法及操作步骤：

参见图1至图5，低分子自噬调控肽DKX-9粗品合成技术路线的具体方法为：

(1)树脂的溶胀：称取AM树脂0.61g(合成目的肽为0.078mmol)，所用AM树脂的取代度为0.9mmol/g，按照多倍过量)，放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升DCM，振荡30min，活化待用；

(2)脱保护：通过沙芯抽滤掉DCM溶剂，加入20毫升20％哌啶/DMF溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20％哌啶/DMF溶液，振荡15min；

(3)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护；

(4)首次清洗:依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次；

(5)连接首个氨基酸：加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-L-Tyr(Tbu)-OH，3倍树脂摩尔量的 HBTU，用少量的DMF溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的DIEA，反应30min；

(6)检测：抽掉溶剂，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴， 105℃-110℃加热5min，无色为阳性反应，若为蓝色则需要重新缩合；

(7)脱保护：加入20毫升20％哌啶/DMF溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20％哌啶/DMF 溶液，振荡15min；

(8)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护；

(9)清洗：依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次；

(10)缩合：加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，3倍树脂摩尔量的HBTU，用少量的DMF溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的DIEA，反应30min；

(11)检测：抽掉溶剂，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴， 105℃-110℃加热5min，无色为阳性反应，若为蓝色则需要重新缩合；

(12)清洗:依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次；

(13)肽链的延伸：按照以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸；

(14)肽的收缩：等最后一个氨基酸接好以后整条肽的合成就反应完成了；

进入最后的收缩阶段，用DMF洗涤反应3遍，DCM洗涤反应3遍，甲醇洗涤反应3遍，最后抽干肽树脂即可；

(15)氨基酸侧链脱保护与树脂的切割：所合成的氨基酸序列为TPYNRRRRY-NH2，其中含有的侧链保护基有：Pbf、Trt、Tbu，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是 TFA，所以脱保护和切割树脂可以同时进行；

(16)配置切割液15mL，其中各组分的体积比为：TFA(94.5％)、水(2％)、EDT(2.5％)、 TIS(1％)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。

低分子自噬调控肽DKX-9纯品合成技术路线的具体方法：

(a)溶解：将粗品肽放入器皿中，用30-50mL浓度为50％的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min；

(b)过滤：用0.45μm滤膜过滤溶解液；

(c)分析：取3μL溶液用分析级HPLC分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水5％，乙腈95％；

(d)制备：将溶解好的样品做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。

实施例2

对实施例1制得的低分子自噬调控肽DKX-9进行高效液相色谱分析法与质谱分析：

表1为DKX-9合成所用的氨基酸及其保护性修饰的基本特性指标。

表1.DKX-9合成所用的氨基酸及其保护性修饰的基本特性指标

由表1可知，所用于人工化学合成DKX-9的氨基酸共5种9个，但氨基酸原料均带有相应保护基.其中，原有主链氨基分子结构均以Fmoc进行保护性修饰，而其中部分氨基侧链因含有活性基团也经过不同侧链保护基Pbf、Trt、Tbu等进行保护性修饰，以避免目标多肽合成过程中副反应干扰和影响。因此，表1结果所显示的负载保护基后的氨基酸分子量均较原有相对应的净分子量增大，故在计算理论所需要氨基酸原料用量时均以带保护基的相对分子量为准。

图6是低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9分子量的质谱分析鉴定，由图6可知，利用质谱分析技术对低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9实际分子量进行质谱分析鉴定，以测得该合成肽的实际分子量。通过质谱检测分析共得到2个带有不同电荷的目标峰，分别为： [M+2H]2+质荷比为641.43，其实测分子量为641.43*2-2＝1280.86道尔顿，[M+3H]3+质荷比为427.99，其实测分子量为427.99*3-3＝1280.97道尔顿。与该多肽理论分子量1280.42道尔顿相比，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1％内，证实两者基本一致。

HPLC测定分析：

利用高效液相色谱分析法(HPLC)，测得实施例1合成的低分子人表皮细胞自噬调控肽 DKX-9纯品的实际纯度，即利用HPLC技术对低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的纯度进行分析和鉴定，以测得该合成肽的实际纯度。所用LC3000型高效液相色谱仪，色谱分析条件:C18，反相，4.6mm*150mm，梯度洗脱。起始梯度为5％A+95％B，结束梯度为30％A+70％B，时间是30min，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为214nm，进样量为10μL。流动相A为0.1％三氟乙酸与100％乙腈，流动相B为0.1％三氟乙酸与100％水。结果见图7与表2。

表2.低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9纯度实验记录及计算

序号	出峰时间/min	纯度/％	峰面积/mV*min
				1	6.102	1.262	30918
2	6.895	97.54	2391112
				3	7.628	0.233	5711
4	8.913	0.965	23888

从表2和图7的结果可知，低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9纯品经HPLC分析，确定其出峰时间6.895的最高峰为面积最大峰，同时也是目标峰，此处为产物可达到的纯度，图 7产物峰通过积分可看出其纯度可达到97.54％。

本发明依据细胞自噬相关信号通路、特别是对人体表皮细胞自噬活性和功能及其其信号通路具有适度调控作用的分子机制，设计并合成了低分子人表皮细胞自噬调控剂DKX-9，其氨基酸组成及其序列是TPYNRRRRY-NH2，纯度为97.54％，实测分子量是1280.97道尔顿，与理论分子量值的误差仅在0.1％的范围之内，证实采用化学固相合成法合成的低分子人表皮细胞自噬调控剂DKX-9获得成功，为今后将其采用经皮传递载体修饰后制备成不同的皮肤外用剂型、以及将其应用于人体表皮细胞自噬调控与皮肤衰老及其相关分子机制研究、以及采用其寻找干预、治疗与延缓皮肤衰老新靶点等提供了科学依据和物质基础。

实施例3

本实施例将低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9应用于人体表皮细胞实验模型，即将它与人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)进行共培养，然后采用免疫蛋白印迹法(Western blotting，WB)检测几种重要的细胞自噬标志性分子及自噬相关因子和溶酶体相关蛋白的表达水平，观察它对人表皮角质形成细胞的自噬调控的实际作用及其效果，从而摸索、并找出了这种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9对人表皮角质形成细胞(HaCat细胞)自噬水平的最佳作用时间和有效剂量。

实施所需要的原料，试剂，主要仪器与设备，主要器皿与耗材如下：

人类永生化表皮细胞(HaCat)(中国科学院细胞库)，自噬调控肽DKX-9(上海淘普生物按照我们的设计合成)，高糖型DMEM培养基(Gibco)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Gibco)， RIPA裂解液(碧云天)，PMSF(碧云天)，100×磷酸酶抑制剂混合物(北京普利莱基因技术有限公司)，BCA蛋白试剂盒(Thermo)；预染标准蛋白Marker(BIO-RAD)，2×蛋白上样缓冲液 (BIO-RAD)，30％Acr-Bis(29:1)(Biosharp产品)，10％过硫酸铵(LEGGENE产品)，1.5M Tris 溶液(BIO-RAD)，1M Tris溶液(BIO-RAD)，10％SDS(VETEC产品)，多聚甲醛(上海生工)，脱脂奶粉(BIO-RAD)，TEMED(MP Biomedicals产品)，β-巯基乙醇(MACKLIN产品)；ECL发光液(BIO-RAD)，TBS-T漂洗缓冲液(博士德生物)，PBS磷酸盐缓冲液(迈新生物技术开发有限公司)，BSA牛血清白蛋白(BioFROXX)；GAPDH抗体(Proteintech)，LAMP1抗体(Mybiosource)，TFEB抗体(Affinity)，p62抗体(Cell Signaling)，Beclin 1抗体(Affinity)， LC3B抗体(Abcam)，DAPI染色液(Solarbio公司产品)，抗鼠FITC(MilliporeSigma)，抗兔 CY3(MilliporeSigma)，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天公司)，HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)(碧云天公司)。

二氧化碳细胞培养箱(Thermo)，超净化工作台(Thermo)，倒置显微镜(Leica)，倒置荧光显微镜(Leica)，万分之一电子天平(METTLER TOLEDO公司产品)，低温离心机(Eppendorf， 5804R)，酶标分析仪(BIO-RAD)，超低温冰箱(Thermo，907)，电泳仪(BIO-RAD)转膜仪(BIO-RAD)，加样枪(Eppendorf)等。

一次性25cm²塑料培养瓶(corning)，2mL塑料冻存管(corning)，0.22μm微孔滤器(corning)，15mL离心管(corning)，6孔培养板(corning)，24孔培养板(corning公司)，病理级显微镜载玻片(世泰公司)，显微镜盖玻片(世泰公司)，PVDF膜(Merck Millpore)，医用X射线胶片(Carestream)。

首先对HaCat细胞的培养及传代

采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基，在37℃，5％CO₂条件下，用25cm²的培养瓶进行培养。根据细胞生长速度和生长状态进行换液或者传代。当细胞生长融合至80％～90％左右时传代一次。传代时加入0.25％的胰酶消化约1min后，加入2mL含10％FBS的DMEM高糖培养基终止反应。将培养瓶内的所有溶液转移至离心管中，1000rpm/min，离心5min，后弃上清，重新加入含10％FBS的DMEM高糖培养基吹打混匀后分瓶培养，即完成传代。

应用DKX-9进行干预：

其浓度及配制方法：DKX-9储存液浓度为5mmol/L；DKX-9最终工作浓度为：25μmol/L， 50μmol/L，100μmol/L。使用方法：在人表皮细胞Hacat达到80％融合度时，更换培养液后，每个培养皿分别加入相应的浓度的药物，之后再“8”字轻轻摇匀，保证全覆盖；在24h后进行蛋白提取。

蛋白提取与Western blotting检测

细胞全蛋白的提取

加入2mL PBS轻轻冲洗细胞，然后加入120μL Lysis Buffer(已加入蛋白酶抑制剂)冰浴放置15min，用细胞刮片刮下细胞，于4℃10，000×g离心10min，吸取上清液转移至新的EP管，即为细胞全蛋白。

蛋白浓度的测定

(1)选用BCA蛋白定量测定试剂盒(Thermo Scientific)，包括A液、B液、蛋白标准液(浓度为2mg/mL)，其中，A：B液按50:1配制成Mix(A+B)工作液。按表3制备梯度蛋白标准品及制备标准曲线。

表3.梯度蛋白标准

(2)取干净消毒后白色96孔板，每孔加入199μL Mix(A+B)，加入稀释后的标准蛋白液1μL。充分混匀后置于37℃恒温水浴箱中水浴30min。使用紫外分光光度计，在562nm 处检测蛋白样品的吸光度，计算出标准曲线计算式。

(3)取干净消毒后白色96孔板，每孔加入199μL Mix(A+B)，加入待测的蛋白液1μL。充分混匀后置于37℃恒温水浴箱中水浴30min。使用紫外分光光度计，在562nm处检测蛋白样品的吸光度，以标准曲线计算式中计算出蛋白浓度。

Western blotting检测

试剂配置及保存如下：

1)制胶用

(1)10％SDS

SDS 10.0g，加蒸馏水至100mL；如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。

(2)10％过硫酸胺(AP)

过硫酸胺1.0g，蒸馏水10mL，配好后分装，-20℃避光保存。

(3)0.5MTrisHcl(pH6.8)，1.5MTrisHcl(pH8.8)，30％丙稀酰胺及TEMED皆4℃保存。

2)电泳与转膜缓冲液

(1)5×电泳液缓冲液

Tris(MW121.14)30.0g，甘氨酸(MW75.07)144.0g，SDS 10.0g，加蒸馏水至2000mL，溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取200mL配制成1000mL即可。

(2)10×转膜缓冲液

甘氨酸(MW75.07)144.0g，Tris(MW121.14)30.3g，SDS 1.5g，加蒸馏水至1000mL，溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20％。通常取200mL母液，加1400mL蒸馏水，最后加400mL甲醇，配制成2000mL即可，注意先加甲醇易产生沉淀。

3)洗膜液

(1)5×TBS缓冲液

Tris(MW121.14)22.4g，NaCl 292.0g，加蒸馏水至2000mL，浓盐酸调pH至7.6，溶解后室温保存。

(2)1×TBST缓冲液

5×TBS缓冲液200mL，蒸馏水800mL，Tween-20 0.75mL，混匀后室温保存。因Tween-20 比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。

4)封闭液

(1)封闭液(5％脱脂牛奶)：

1×TBST缓冲液50mL，脱脂奶粉2.5g，溶解后4℃保存，可于一周内使用。

SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、免疫反应和化学发光法检测：

1)灌制蛋白质聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)：配制5％浓缩胶和15％分离胶。步骤：先灌注分离胶，室温30min待胶聚合良好后再灌注浓缩胶，插入梳子，待30min左右浓缩胶聚合完全后可以开始电泳。

2)以5×上样缓冲液与样品以1：4混合，于100℃水浴5分钟，冰上冷却5分钟，逐孔加样。

3)用Bio-Rad垂直电泳仪，电泳参数为：浓缩胶恒压80V，分离胶V。

4)蛋白转膜：电泳结束后取下凝胶，切去浓缩胶，根据凝胶大小裁剪一张PVDF膜；将 PVDF膜在甲醇中浸泡2分钟后移至转膜缓冲液中，与海绵、滤纸一起浸泡10-15分钟；在一搪瓷盘中加入转移缓冲液，将凝胶支架打开放平，从阴极(黑色)板到阳极板依次叠放海绵、1张滤纸、凝胶、PVDF膜、1张滤纸、海绵，用干净玻棒驱除间隙中的气泡；将支架垂直放插入电泳槽，放入冰盒及预冷转移缓冲液，以100V恒压转移120分钟，起始电流约150-180mA，终止电流小于350mA。

5)转移完毕后，将PVDF膜置于稀释10倍的丽春红贮存液中，染色5分钟，观察目标蛋白条带是否转移上。

6) 按照所需要蛋白大小裁剪丽春红染色后的PVDF膜，之后用蒸馏水洗3次，再TTBS洗3 次，每次5分钟。

7)5％脱脂奶粉溶液室温封闭膜1h，摇床转速120rpm，之后TTBS洗3次，每次5分钟。

8)加入5％BSA稀释的一抗(兔源LC3B抗体1：3000，兔源P62抗体1：3000，兔源Beclin 1抗体1：2000，鼠源GAPDH抗体1：6000)，4℃孵育过夜(摇床转速80rpm，约14-16小时)。

9)吸走多余的一抗，用TTBS洗6次，摇床转速120rpm，每次5分钟。

10)加入二抗(羊抗兔抗体1:6000，羊抗鼠抗体1:6000)，室温下与膜孵育2h，TTBS洗 6次，每次5分钟。

11)配置发光液(1mL A液:1mL B液)，恢复至室温，在暗房中将膜置于发光液中反应。

12)直接将膜取出，用保鲜膜将其包裹，避免皱褶。滤纸吸取多余的发光液，放入暗盒中，将膜正面与胶片接触，压紧曝光，曝光时间取决于条带亮度。

13)显影并定影，胶片干燥后扫描成灰度图片，用灰度软件(Image J，NIH)进行定量分析。总蛋白选用GAPDH作为内参计算其相对表达值。

免疫荧光技术检测分析

细胞经过4％多聚甲醛固定30min，置于24孔板的漂洗盒中，每孔加入约150μL正常非特异山羊血清封闭液，室温下振荡孵育1h；加目的蛋白一抗(LAMP1，1:100；beclin1，1:100； P62，1:100；LC3B，1:100)，每孔约200μL，之后放入4℃冰箱振荡孵育过夜，次日拿出后室温用PBS漂洗5min×6次；每孔加入约200μL一抗相对应的荧光二抗(抗鼠FITC和抗兔CY3，1:100)，避光室温振荡孵育2h后，用PBS漂洗5min×3次。最后用含DAPI水性封片剂封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。

实施例4

按照实施例3的检测方法，本实施例对Western blotting法检测DKX-9对HaCat细胞自噬相关蛋白表达的影响进行说明，参见图8，图9与图10。

图8至图10中，A：DKX-9干预对人表皮细胞HaCat细胞的形态学影响；B-F：Westernblotting法检测DKX-9与HaCat细胞共培养24h后，自噬相关蛋白Beclin 1、P62、LAMP1、LC3I、LC3II和内参GAPDH的表达水平变化。G-H：Western blotting法检测DKX-9与HaCat 细胞共培养24hh后，自噬调控因子TFEB和内参GAPDH的表达水平变化。

参见图8，不同浓度的(终浓度为25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L)低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与HaCat细胞共培养24h，倒置显微镜下观察、拍片分析，未见HaCat 细胞出现毒性反应，该细胞形态和结构均正常。

参见图9与图10，HaCat细胞经过DKX-9干预处理24h后，DKX-9浓度分别为25μmol/L， 50μmol/L，100μmol/L的三种浓度均可促进正向自噬相关蛋白beclin1和自噬调控因子TFEB 蛋白表达升高；而DKX-9在为50μmol/L浓度时则可提高溶酶体相关蛋白LAMP1水平；另外， DKX-9在25μmol/L和100μmol/L浓度时则可下调负向自噬相关蛋白p62表达水平；同时，DKX-9在50μmol/L，100μmol/L浓度下则可促进正向自噬相关蛋白LC3II表达水平升高。

因此，低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9可以调控HaCat细胞自噬相关蛋白的表达水平，促进HaCat细胞自噬活性升高和自噬效应增强。

实施例5

按照实施例3的检测方法，本实施例采用共聚焦免疫荧光法检测DKX-9对HaCat细胞自噬相关蛋白表达的影响进行说明，参见图11，图12与图13。

图11是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat共培养24h后对其自噬相关蛋白P62和溶酶体相关膜蛋白LAMP1表达水平影响，图中，免疫荧光分别检测对照组N、DKX-9 25μmol/L组、DKX-9 50μmol/L组、DKX-9 100μmol/L 组中LAMP1、P62荧光强弱。N组：对照组；DKX-9：低分子自噬调控肽；LMAP1：溶酶体关联膜蛋白1；P62:Sequestosome-1，自噬选择性底物；DAPI:4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。

图12是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat共培养24h后对其自噬相关蛋白LC3-II和溶酶体相关膜蛋白LAMP1表达的影响，图中，免疫荧光分别检测对照组N、DKX-9 25μmol/L组、DKX-9 50μmol/L组、DKX-9 100μmol/L 组中LAMP1、LC3B荧光强弱。N组:对照组；DKX-9:低分子自噬调控肽；LMAP1:溶酶体关联膜蛋白1；LC3B:自噬体相关蛋白；DAPI:4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。

图13是采用共聚焦免疫荧光技术检测不同浓度低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9与 HaCat细胞共培养24h后对其自噬溶酶体调控因子TFEB表达水平的影响，图中，免疫荧光分别检测对照组N、DKX-9 25μmol/L组、DKX-9 50μmol/L组、DKX-9 100μmol/L组中TFEB 荧光强弱。N组：对照组；DKX-9：低分子自噬调控肽；TFEB：转录因子EB；DAPI：4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚。

图11，图12与图13的结果显示，采用共聚焦免疫荧光技术检测，发现HaCat细胞经过低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9干预处理24h后，TFEB、LAMP、LC3B荧光强度均出现明显增加，且TFEB由胞浆转移至核内。同时，荧光双标检测结果显示，在低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的作用下，Hacat细胞中溶酶体相关膜蛋白LMAP1与自噬体相关蛋白P62和LC3B的共标增加，同样提示其促进了HaCat细胞的自噬水平升高。

采用Western blotting检测的实验研究结果表明，终浓度为25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L低分子细胞自噬调控剂DKX-9均可上调HaCat细胞的beclin-1表达水平；50μmol/L浓度DKX-9可提高溶酶体相关蛋白LAMP1表达水平；而25μmol/L和100μmol/L的 DKX-9可降低p62蛋白水平；同时，50μmol/L和100μmol/L浓度的DKX-9均可促进LC3II 水平升高，表现出对HaCat细胞自噬效应的增强调控趋势。

低分子细胞自噬调控剂DKX-9还上调了TFEB总蛋白的表达水平，终浓度为25μmol/L， 50μmol/L，100μmol/L低分子细胞自噬调控剂DKX-9均可上调HaCat细胞的TFEB蛋白的表达水平；TFEB可通过核转位后调节自噬相关基因和溶酶体生成与成熟相关的多个关键基因的转录，进而增强细胞自噬活性和功能。可见，TFEB总蛋白的表达水平可能是DKX-9对人体表皮角质形成细胞发挥增强自噬生物学效应的重要原因之一。

此外，采用共聚焦免疫荧光技术的实验研究也表明，HaCat细胞经DKX-9干预24h后， TFEB、LAMP1、LC3II荧光强度呈现增加趋势，且TFEB由胞浆逐步转移至核内。同时，荧光双标结果显示，在DKX-9干预下，HaCat细胞中LMAP1和自噬体相关蛋白P62和LC3II的共标物均呈现增加趋势，提示DKX-9干预下HaCat细胞自噬水平升高。

由此可见，不同剂量的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9可不同程度调控HaCat细胞自噬相关蛋白的表达水平及其荧光强度，并可有效促进HaCat细胞的自噬活性提升及自噬效应提高。而DKX-9诱导人体表皮角质形成细胞增强自噬的生物学效应也很可能涉及其对TFEB 信号通路的调控机制等。

在现有制剂可接受范围内，本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9可以与其它天然药物及其原料匹配，或者将其与某些共济协同和联合增效的天然药物、功效成分和活性物质等在皮肤外用制剂(包括医学美容和皮肤抗衰老制剂等)单独或联合使用，本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9有效浓度范围为25-100μmol/L，最佳有效浓度范围为50μ mol/L。

而至于将本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9制成何种制剂，为现有技术中的一些常规方法，此处不再赘述。

本发明的低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9及其应用，不仅对促进或推动皮肤抗老化和干预及防治某些皮肤疾病等无疑具有积极意义和医学价值，而且对于推动或促进多肽在细胞自噬及其相关学科领域的研制和应用起到重要作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 广州好美生物工程技术有限公司

<120> 一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9及其应用

<141> 2021-11-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(DKX-9)

<400> 1

Thr Pro Tyr Asn Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5

Claims

1.一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9，其特征在于，所述自噬调控肽DKX-9的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9，其特征在于，所述自噬调控肽DKX-9通过人工化学固相合成法合成。

3.权利要求1所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的应用，其特征在于，所述低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9在制备用于人表皮角质形成细胞自噬调控的面部美容化妆品组合物中的应用，所述组合物为皮肤外用美容化妆品剂型或皮肤抗老化美容化妆品制剂。

4.根据权利要求3所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的应用，其特征在于，所述自噬调控肽DKX-9通过上调正向自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II的表达水平、下调负向自噬相关蛋白p62的表达水平实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

5.根据权利要求3所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的应用，其特征在于，所述自噬调控肽DKX-9通过提高LAMP1的表达量实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

6.根据权利要求3所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的应用，其特征在于，所述自噬调控肽DKX-9通过提高TFEB的表达量实现对人表皮角质形成细胞的自噬调控。

7.根据权利要求3所述的一种低分子人表皮细胞自噬调控肽DKX-9的应用，其特征在于，所述的自噬调控肽DKX-9的有效浓度范围为25-100μmol/L。