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CN116173245B - 一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116173245B CN202310163601.3A CN202310163601A CN116173245B CN 116173245 B CN116173245 B CN 116173245B CN 202310163601 A CN202310163601 A CN 202310163601A CN 116173245 B CN116173245 B CN 116173245B
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Abstract

本发明涉及生物医学纳米材料领域，公开了一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。该纳米探针为Au‑Mn2(CO)10@BSA‑N3，其纳米颗粒分布均匀，形貌为类球形结构；以金团簇为基础并负载一氧化碳释放分子Mn2(CO)10所形成的复合结构作为纳米复合物的内核、在其外部包覆牛血清白蛋白，并予以修饰叠氮化合物得到。该纳米探针可通过饥饿治疗、肿瘤内部多重ROS提升达到高效的化学动力学治疗、气体协同治疗杀伤肿瘤细胞策略，同时局部微量CO的释放及Mn2+有助于成骨细胞的分化。

Description

一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学纳米材料领域，具体为一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率正在迅速增长。乳腺癌作为一个重要的公共卫生问题，是女性死亡的第二大原因。而骨骼是晚期乳腺癌最常见的转移部位，高达75％的乳腺癌患者常常伴发骨转移，骨转移引起的严重骨骼相关事件(SRE)对乳腺癌患者的预期寿命有决定性影响。转移性乳腺癌细胞诱导的成骨细胞抑制和破骨细胞诱导分化，是骨转移和溶骨性骨病变的关键始动因素。因此，开发一种同时抑制癌细胞侵袭、促进成骨细胞分化并可监测治疗过程的荧光探针可能是有益的。
活性氧(ROS)，如单线态氧、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等，可通过破坏细胞内的DNA链、蛋白质等生物分子，有效杀灭肿瘤细胞。化学动力学治疗(CDT)作为一种新兴的治疗策略，依托肿瘤内源性H2O2通过铁基Fenton或类Fenton反应将其转变为高毒性的·OH，进而诱导细胞内氧化应激，杀伤肿瘤细胞。CDT不仅克服了传统肿瘤放、化疗的高毒性，也为肿瘤治疗提供了更多的替代选择。除了几种铁基纳米体系被报道为CDT试剂外，其他过渡金属化合物，包括Mn2+、Co2+和Cu2+，也可以用作催化离子。
气体疗法作为另一个新兴领域，因其在疾病治疗方面的显著作用而受到越来越多的关注。常见的气体治疗包括NO、CO和H2S等，但气体治疗的效果和生物学作用很大程度上取决于治疗部位浓度和持续时间。机体血红素酶代谢所生成的内源性CO作为一种重要的生理气体递质，在多种不同的组织和细胞中扮演着细胞保护和细胞内稳态调节有关的重要角色。然而，由于CO与血红蛋白有极强的亲和力，使得它同样是一种沉默的杀手，不可控的CO释放将对机体造成灾难性后果。这使得CO在机体内的高效传递备受关注，近年来纳米医学的蓬勃发展为新型气体递送方式提供了新的思路，纳米材料通常在肿瘤部位具有靶向递送的功能，可将一氧化碳释放分子(Mn2(CO)10)递送至特定部位，而Mn2(CO)10可以通过肿瘤微环境中的H2O2触发原位控制释放CO。但肿瘤微环境中的H2O2供应往往有限使得CO生成并不理想，而高含量的抗氧化剂对ROS生成的抑制作用，使上述治疗策略虽然理想但效果有限且不可持续进行。
因此，亟待开发一种新的纳米探针可通过纳米酶级联催化反应之间的耦合使该纳米酶实现高效的CDT和可持续治疗的策略。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。该纳米探针可通过饥饿治疗、肿瘤内部多重ROS提升达到高效的CDT、气体协同治疗杀伤肿瘤细胞策略，同时局部微量CO的释放及Mn2+有助于成骨细胞的分化。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供了一种诊疗一体化纳米探针，所述纳米探针为Au-Mn2(CO)10@BSA-N3(AM@BSAN)，其结构分布均匀，形貌为类球形；
所述纳米探针类球形结构的内核为金团簇负载一氧化碳释放分子Mn2(CO)10所形成的复合结构并选用还原型谷胱甘肽作为配体，在其外部包覆牛血清白蛋白并修饰叠氮化合物。内核蕴含的大量羧基可与骨的主要成分羟基磷灰石表面的Ca2+特异性结合，提升该探针对于骨组织的亲和力，外部包覆牛血清白蛋白既能提升该探针的生物相容性又可增加对于肿瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，其外在修饰的叠氮化合物可与巨噬细胞特异性结合，进一步提升对于肿瘤部位的聚集性。
进一步，所述纳米探针的水合粒径约为10-13nm。
本发明又提供一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，所述探针以金团簇为基础并负载Mn2(CO)10所形成的复合结构作为纳米簇的内核、在纳米簇外部包覆牛血清白蛋白，并予以修饰叠氮化合物得到。
进一步，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：将四氯金酸三水合物水溶液加入去离子水中，然后在高速搅拌下加入还原型谷胱甘肽水溶液，形成透明的由谷胱甘肽作为配体保护的金团簇水溶液；
S2：将用二甲基亚砜(DMSO)溶解的Mn2(CO)10化合物溶液的加入步骤S1所得溶液中，继续搅拌；
S3：在搅拌下，向步骤S2溶液中加入牛血清白蛋白水溶液，得到澄清的混合溶液；
S4：用氢氧化钾水溶液调节步骤S3溶液的pH；
S5：在步骤S4所得溶液中通入CO并继续搅拌，之后经过洗涤、离心、冷冻干燥，得到由牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
S6：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液(NHS)和3-叠氮基丙胺溶液混合后搅拌，加入步骤S5得到的纳米复合物AM@BSA的水溶液继续搅拌，然后产物经离心分离、洗涤，即可得到所述诊疗一体化纳米探针。
更进一步，所述步骤S1中四氯金酸三水合物水溶液的浓度为126-131.8mg/mL，用量为1mL；还原型谷胱甘肽水溶液的浓度为75.15-81.1mg/mL，用量为2-2.5mL；水的用量为275.5-278mL；搅拌转速为880r/min，搅拌时间为8min。
所述步骤S2中Mn2(CO)10溶液的浓度为5-24.96mg/mL，用量为0.5mL；搅拌转速为880r/min，搅拌时间为8min。
所述步骤S3中牛血清白蛋白水溶液的浓度为31.5mg/mL，用量为2-4mL；搅拌时间为15min。
所述步骤S4中氢氧化钾水溶液浓度为2mol/L，调节后的pH值为11。
所述步骤S5中CO通气压强为1bar，通气时间为15min；反应混合物搅拌温度为室温，搅拌时间为24h；离心采用超滤分离管10KD，转速为3500r/min，时间为10min。
所述步骤S6中EDC水溶液的浓度为1mg/mL，用量为1.116mL；NHS水溶液的浓度为1mg/mL，用量为0.99mL；3-叠氮基丙胺溶液的浓度为10mg/mL，用量为2-3mL；搅拌温度为室温，搅拌时间为60min；纳米复合物AM@BSA水溶液的浓度为2mg/mL，用量为5mL；加入纳米复合物AM@BSA水溶液继续搅拌条件为冰水浴搅拌12h；离心分离采用超滤分离管30KD，转速为3500r/min，时间为15min。
本发明还提供了一种诊疗一体化纳米探针的应用，用于制备骨转移瘤的诊疗一体化纳米试剂。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明公开了一种诊疗一体化纳米探针，该纳米探针具有在实体瘤区域EPR效应，可在肿瘤微酸及H2O2环境中响应并特异性释放出CO。CO作为气体信号分子调节线粒体呼吸引起ROS提升；而CDT的治疗效果的提升则模拟谷胱甘肽氧化酶(GSHOD)，通过Mn离子的产生，消耗肿瘤内部抗氧化体系GSH来进行的。纳米探针所释放出的Mn离子可被肿瘤内部抗氧化体系GSH所还原，在消耗抗氧化剂的同时依托Mn类Fenton反应产生高毒性的·OH。纳米探针中的Au纳米簇可发挥NIR-II成像的功能，此外Au所蕴含的类葡萄糖氧化酶活性可将肿瘤内部富余的葡萄糖转变为H2O2，达到对肿瘤饥饿治疗的同时，Au纳米簇的类葡萄糖氧化酶活性又使H2O2产生·OH，起到级联催化的作用诱导细胞内氧化应激。通过饥饿治疗、肿瘤内部多重ROS提升达到高效的CDT、气体协同治疗杀伤肿瘤细胞策略。同时局部微量CO的释放及Mn2+有助于成骨细胞的分化。
此外，由于该材料的吸收光谱位于近红外二区，故具有更深的穿透深度，可以达到更好的成像及治疗效果。同时以饥饿治疗、化学动力学及气体疗法作为辅助疗法，可以全面提高该材料在肿瘤治疗各阶段发挥的作用。
附图说明
图1为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的透射电子显微镜图。
图2为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的粒度及Zeta电位变化分析。
图3为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针Au元素的X射线光电子能谱图。
图4为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针Mn元素的X射线光电子能谱图。
图5为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针·OH生成能力。
图6为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针CO释放能力。
图7为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针在不同时间内的过氧化物酶活性。
图8为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针细胞毒性CCK-8研究。
图9为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针NIR-II活体成像图，图9上半部分为实验鼠的仰卧位荧光活体成像图，可观察到该探针在8-10h时对于病灶部位(左腿)呈现出最大的聚集效果；图9下半部分为实验鼠离体后荧光活体成像图，表明该纳米探针通过肾脏进行代谢，并对心、肝、脾、肺等组织无聚集性，而离体的异常腿骨中可检测到荧光信号的聚集。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽162mg，去离子水2mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物12.48mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白126mg，去离子水4mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水276mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加4mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺3mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
将制备得到的纳米探针溶于PBS缓冲液，通过鼠尾静脉注射进行给药，检测纳米探针的成像性能。
图1为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的透射电子显微镜图。由图可知所合成的诊疗一体化纳米探针的纳米颗粒分布均匀，形貌为类球形的团簇结构。
图2为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的粒度及Zeta电位变化分析。由图可知，所合成纳米探针的最终粒度约为12nm，大小分布均匀(10-13nm)，合成过程中纳米探针电荷介于-10mV左右。
图3为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针Au元素的X射线光电子能谱。
图4为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针为Mn元素的X射线光电子能谱。
图5为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针产生·OH的功能。利用四甲基联苯胺(TMB)作为过氧化物酶的显色底物，用于模拟纳米探针AM@BSAN过氧化物酶活性的检测。由图5可知，在H2O2存在的条件下，探针AM@BSAN可以催化H2O2分解产生·OH，随后·OH氧化TMB产生蓝色氧化物，并在652nm处具有吸收峰。
图6为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的CO释放能力。由图可知，脱氧血红蛋白紫外特征峰(430、560nm)逐渐变为碳氧血红蛋白特征峰(410、540、578nm)，表明本发明纳米探针AM@BSAN具备CO释放能力。
图7为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的类过氧化物酶能力。
图8为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的细胞毒性CCK-8研究。由图可知，不同浓度的AM@BSAN纳米探针对正常细胞的增值抑制率影响均不明显，表现为低毒性。
图9为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的NIR-II活体成像图。由图可知，在尾静脉给药后可见骨组织中荧光信号逐渐聚集，在8h左胫骨肿瘤建模部位药物聚集浓度最高，之后药物逐渐代谢，肿瘤及全身其他部位药物浓度减小。
综合以上结果，表明本发明纳米探针是一种响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针。
实施例2
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物131.8mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽150.3mg，去离子水2mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物2.5mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用。
取牛血清白蛋白126mg，去离子水4mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水276mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加4mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺3mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例3
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物128.9mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽150.3mg，去离子水2mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物2.5mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白63mg，去离子水2mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水278mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例4
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽162mg，去离子水2mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物12.48mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白63mg，去离子水2mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水278mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例5
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽152.3mg，去离子水2mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物4.2mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白63mg，去离子水2mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水278mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例6
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽200.5mg，去离子水2.5mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物12.48mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白126mg，去离子水4mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水275.5mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2.5mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加4mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例7
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽203.1mg，去离子水2.5mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物4.2mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白126mg，去离子水4mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水275.5mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2.5mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加4mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。
实施例8
一种诊疗一体化纳米探针的制备：
取氢氧化钾112g，去离子水1L，一起加入烧杯充分混合，将混合液移至容量瓶中，配成浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液备用；
取四氯金酸三水合物126mg，去离子水1mL，加入EP管充分混合，得到四氯金酸三水合物溶液备用；
取还原型谷胱甘肽203.1mg，去离子水2.5mL，加入EP管置于超声波分散仪内充分溶解分散，频率50KHz，分散时间10s，形成澄清的还原型谷胱甘肽溶液备用；
取Mn2(CO)10化合物2.5mg，避光条件中用0.5mL DMSO充分溶解备用；
取牛血清白蛋白126mg，去离子水4mL，充分溶解，得到牛血清白蛋白溶液备用；
称取EDC 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到EDC水溶液备用；
称取NHS 5mg，去离子水5mL，加入EP管充分混合，得到NHS水溶液备用；
将3-叠氮基丙胺溶液稀释至10mg/mL备用；
取去离子水275.5mL，置于三口圆底烧杯中；将先前配置好的四氯金酸三水合物溶液1mL加入去离子水中；在剧烈搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加2.5mL还原型谷胱甘肽溶液，880r/min搅拌8min，可见溶液由金黄色逐渐变为澄清透明；然后取用DMSO溶解的Mn2(CO)10化合物溶液0.5mL缓慢加入，880r/min搅拌8min，溶液颜色仍为澄清透明；在快速搅拌(880r/min)下向上述混合溶液中缓慢滴加4mL预先配好的牛血清白蛋白溶液，充分搅拌15min溶液颜色不变；取预先配好的2mol/L氢氧化钾溶液1.3mL将上述混合溶液的pH调节至11，调节过程中可见混合溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；之后用压强为1bar的CO对混合溶液通气15min进行还原和保护，室温缓慢搅拌24h，得到牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
上述步骤所得到的棕红色产物用10KD超滤分离管3500r/min，分离10min，用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，得到定量的牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
将EDC水溶液1.116mL，NHS水溶液0.99mL，3-叠氮基丙胺2mL配制混合溶液室温搅拌60min；将5mL浓度为2mg/mL纳米复合物AM@BSA溶液加入上述混合溶液冰浴搅拌12h，产物经30KD超滤分离管3500r/min，分离15min，去离子水洗涤3次后，得到最终响应释放CO，气体、化学动力学协同抑制骨转移瘤NIR-II诊疗一体化纳米探针AM@BSAN。

Claims (10)

1.一种诊疗一体化纳米探针，其特征在于：所述纳米探针为Au-Mn2(CO)10@BSA-N3，其结构分布均匀，形貌为类球形；
所述纳米探针结构的内核为金团簇负载一氧化碳释放分子羰基锰Mn2(CO)10所形成的复合结构并选用还原型谷胱甘肽作为配体，在其外部包覆牛血清白蛋白并修饰叠氮化合物。
2.根据权利要求1所述的一种诊疗一体化纳米探针，其特征在于：所述纳米探针的水合粒径为10-13 nm。
3.一种权利要求1所述诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述探针以金团簇为基础并负载Mn2(CO)10所形成的复合结构作为纳米探针的内核，并选用还原型谷胱甘肽作为配体，在其外部包覆牛血清白蛋白，并予以修饰叠氮化合物得到。
4.根据权利要求3所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：将四氯金酸三水合物水溶液加入去离子水中，然后在高速搅拌下加入还原型谷胱甘肽水溶液，形成透明的由谷胱甘肽作为配体保护的金团簇水溶液；
S2：将用二甲基亚砜溶解的Mn2(CO)10化合物溶液加入步骤S1所得溶液中，继续搅拌；
S3：在搅拌下，向步骤S2溶液中加入牛血清白蛋白水溶液，得到澄清的混合溶液；
S4：用氢氧化钾水溶液调节步骤S3溶液的pH；
S5：在步骤S4所得溶液中通入CO并继续搅拌，之后经过洗涤、离心、冷冻干燥，得到由牛血清白蛋白包裹的纳米复合物AM@BSA；
S6：将1-(3- 二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液和3-叠氮基丙胺溶液混合后搅拌，加入步骤S5得到的纳米复合物AM@BSA的水溶液继续搅拌，然后产物经离心分离、洗涤，即可得到所述诊疗一体化纳米探针。
5.根据权利要求4所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中四氯金酸三水合物水溶液的浓度为126-131.8 mg/mL，用量为1 mL；还原型谷胱甘肽水溶液的浓度为75.15-81.1 mg/mL，用量为2-2.5 mL；水的用量为275.5-278 mL；搅拌转速为880 r/min，搅拌时间为8 min。
6.根据权利要求4所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中Mn2(CO)10溶液的浓度为5-24.96 mg/mL，用量为0.5 mL；搅拌转速为880 r/min，搅拌时间为8 min。
7.根据权利要求4所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中牛血清白蛋白水溶液的浓度为31.5 mg/mL，用量为2-4 mL；搅拌时间为15 min。
8.根据权利要求4所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中氢氧化钾水溶液浓度为2 mol/L，调节后的pH值为11；所述步骤S5中CO通气压强为1bar，通气时间为15 min；反应混合物搅拌温度为室温，搅拌时间为24 h；离心采用超滤分离管10KD，转速为3500 r/min，时间为10 min。
9.根据权利要求4所述的一种诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中1-(3- 二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的浓度为1 mg/mL，用量为1.116 mL；N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度为1 mg/mL，用量为0.99 mL；3-叠氮基丙胺溶液的浓度为10 mg/mL，用量为2-3 mL；搅拌温度为室温，搅拌时间为60 min；纳米复合物AM@BSA水溶液的浓度为2 mg/mL，用量为5 mL；加入纳米复合物AM@BSA水溶液继续搅拌条件为冰水浴搅拌12 h；离心分离采用超滤分离管30 KD，转速为3500 r/min，时间为15 min。
10.一种权利要求1所述诊疗一体化纳米探针的应用，其特征在于：用于制备骨转移瘤的诊疗一体化纳米试剂。
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CN110404071A (zh) * 2019-08-23 2019-11-05 上海师范大学 一种谷胱甘肽触发的肿瘤诊疗试剂
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