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CN116173058B - 一种bp-pei@rna纳米药物复合体、制备方法及其在治疗癌症中的应用 - Google Patents

一种bp-pei@rna纳米药物复合体、制备方法及其在治疗癌症中的应用 Download PDF

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CN116173058B
CN116173058B CN202310214587.5A CN202310214587A CN116173058B CN 116173058 B CN116173058 B CN 116173058B CN 202310214587 A CN202310214587 A CN 202310214587A CN 116173058 B CN116173058 B CN 116173058B
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Abstract

本发明公开了一种BP‑PEI@RNA纳米药物复合体、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述BP‑PEI@RNA纳米药物复合体由RNA和经PEI修饰的BP复合而成，该纳米药物复合体可以实现RNA高效、稳定地递送，将外源性基因药物(RNA)转运到肿瘤细胞内；通过提高肿瘤细胞中抑癌基因的表达水平，发挥抑制前列腺癌进展的作用，具有良好的临床应用前景。

Description

一种BP-PEI@RNA纳米药物复合体、制备方法及其在治疗癌症 中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种BP-PEI@RNA纳米药物复合体、制备方法及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
恶性肿瘤的发生和发展是一个复杂的生物学过程，大量研究表明其受多种基因网络模式的调控。其中，内源竞争性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)网络调控模式已在多种恶性肿瘤中得到证实。该过程中，长度约为22个核苷酸的短链RNA(miRNA)可与对应信使RNA(message RNA，mRNA)的3'-UTR结合，通过剪切目的基因而抑制其转录翻译过程，发挥反向调控目的基因表达的作用。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，作为ceRNA网络调控模式中的重要成员，可竞争性结合miRNA，进而阻断miRNA与其靶基因的结合抑制作用，从而上调靶基因的表达水平。因此，lncRNA有望作为基因药物用于恶性肿瘤的治疗。但RNA自身不稳定，容易被降解，同时需要载体转运才能进入肿瘤细胞内发挥作用，本研究利用纳米材料的细胞内化效应将RNA高效地递送至肿瘤细胞内，同时提高RNA在体内外环境中的稳定性。纳米黑磷片层(blackphosphorus,BP)因其可降解性、良好生物相容性和较大比表面积等优势，被认为是一种较为理想的新型纳米药物运载体。
发明内容
本发明旨在以RNA序列作为基因药物，采用经PEI修饰的纳米BP，利用带正电荷的PEI通过正负电荷吸引力将带负电荷的基因药物装载到纳米BP载体上，构建BP-PEI@RNA纳米药物复合体。BP-PEI@RNA可以高效地将RNA递送至肿瘤组织和细胞中，同时还可保护RNA，减弱体内外核酸酶对其降解作用；进一步借助该基因药物与特定miRNA的竞争性结合作用，削减miRNA对目标基因mRNA的降解作用，从而提高肿瘤细胞中目标基因的表达水平，最终发挥抑制前列腺癌进展的作用。
本发明提供了一种BP-PEI@RNA纳米药物复合体，所述纳米药物复合体包括带正电荷的纳米材料以及带负电的核酸。
进一步，所述核酸是RNA。
进一步，所述RNA包括lncRNA、circRNA。
在本发明的具体实施方案中，所述RNA序列选自SEQ ID NO.1-4中的任一个或多个。
进一步，所述带正电荷的纳米材料是经PEI修饰的纳米材料。
进一步，纳米材料包括纳米黑磷片层、脂质体、氧化石墨烯、纳米金、明胶、丝素蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、纳米聚酯材料。
在本发明的具体实施方案中，所述纳米材料是纳米黑磷片层。
本发明还提供了一种带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体，所述带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体包括前面所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体，以及与RNA连接的荧光物质。
进一步，荧光物质是6-FAM或Cy3。
本发明还提供了前面所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)制备RNA；
2)制备带有负电荷的纳米材料；
3)将RNA基和带有负电荷的纳米材料共孵育。
进一步，步骤2)的具体制备过程如下：取纳米黑磷片层溶液，离心后去上清，无酶水重悬，混匀后超声，重复离心-无酶水重悬-超声步骤，得到纳米黑磷片层水相分散溶液。随后向上述纳米黑磷片层水相分散溶液中加入PEI溶液超声。经离心洗涤去除多余的PEI后重悬。
更进一步，纳米黑磷片层水相分散溶液与PEI溶液体积比是1:1.5。
更进一步，所述超声是冰水浴超声。
进一步，步骤2)的具体制备过程如下：取1mL纳米黑磷片层溶液(0.1mg/mL)于EP管中，4℃离心(16000rpm，20min)后去上清，等量无酶水重悬，吹打混匀后冰水浴超声(40kHz，100W，20min)，重复离心-无酶水重悬-冰水浴超声步骤2次后，得到分散良好的纳米黑磷片层水相分散溶液。随后向上述纳米黑磷片层水溶液中加入适量PEI(polyetherimide，PEI)(2.5k，10mg/mL，纳米黑磷片层与PEI体积比为1:1.5)冰水浴超声3-4h。经离心洗涤去除多余的PEI后重悬。
进一步，步骤3)的具体制备过程如下：经步骤2)获得经PEI修饰的纳米黑磷片层溶液，加入RNA，共孵育，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体。
进一步，纳米黑磷片层与RNA质量比为1:0.4。
进一步，步骤3)的具体制备过程如下：加入RNA(BP与RNA质量比为1:0.4)在4℃共孵育10分钟，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体。
本发明还提供了前面所述的带有荧光标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
a)制备带有荧光物质标记的RNA；
b)制备带有负电荷的纳米材料；
c)将RNA和带有负电荷的纳米材料共孵育。
进一步，步骤a)的具体制备过程如下：以RNA基因药物的线性化DNA为模板，以荧光物质标记的核糖核苷酸为荧光底物，经体外转录得到荧光物质标记的RNA基因药物。
进一步，步骤b)的具体制备过程如下：取纳米黑磷片层溶液，离心后去上清，无酶水重悬，混匀后超声，重复离心-无酶水重悬-超声步骤，得到纳米黑磷片层水相分散溶液。随后向上述纳米黑磷片层水相分散溶液中加入PEI溶液超声。经离心洗涤去除多余的PEI后重悬。
更进一步，纳米黑磷片层水相分散溶液与PEI溶液体积比是1:1.5。
更进一步，所述超声是冰水浴超声。
进一步，步骤b)的具体制备过程如下：取1mL纳米黑磷片层溶液(0.1mg/mL)于EP管中，4℃离心(16000rpm，20min)后去上清，等量无酶水重悬，吹打混匀后冰水浴超声(40kHz，100W，20min)，重复离心-无酶水重悬-冰水浴超声步骤2次后，得到分散良好的纳米黑磷片层水相分散溶液。随后向上述纳米黑磷片层水溶液中加入适量PEI(polyetherimide，PEI)(2.5k，10mg/mL，纳米黑磷片层与PEI体积比为1:1.5)冰水浴超声3-4h。经离心洗涤去除多余的PEI后重悬。
进一步，步骤c)的具体制备过程如下：经步骤b)获得经PEI修饰的纳米黑磷片层溶液，加入步骤a)获得的带有荧光物质标记的RNA，共孵育，期间持续旋转混匀，得到带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体。
进一步，纳米黑磷片层与RNA质量比为1:0.4。
进一步，步骤c)的具体制备过程如下：加入带有荧光物质标记的RNA(BP与RNA质量比为1:0.4)在4℃共孵育10分钟，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体。
本发明还提供了一种前面所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体在制备治疗疾病中的应用。
进一步，所述疾病是肿瘤。
进一步，所述肿瘤是前列腺癌。
本发明还提供了一种前面所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体在制备治疗疾病中的应用。
进一步，所述肿瘤是癌症。
进一步，所述肿瘤是前列腺癌。
本发明的优点和有益效果：
本发明利用纳米BP装载特定RNA序列构建BP-PEI@RNA纳米药物复合体，该纳米药物复合体可以实现RNA高效、稳定地递送，将外源性基因药物(RNA)转运到肿瘤细胞内；通过提高肿瘤细胞中抑癌基因的表达水平，发挥抑制前列腺癌进展的作用。
附图说明
图1显示BP和BP-PEI@RNA纳米药物复合体形貌结构表征结果图，其中(a)BP-PEI@RNA透射电子显微镜观察结果；(b)BP-PEI@RNA原子力显微镜观察结果；(c)BP-PEI@RNA的Zeta电位结果；(d)BP-PEI@RNA水合粒径结果；(e)为拉曼光谱结果图；
图2显示BP-PEI@RNA的细胞摄取及亚细胞定位的结果图，其中(a)不同时间点BP-PEI@RNA被细胞摄取情况；(b)不同时间点BP-PEI@RNA被细胞摄入后的亚细胞定位；
图3显示BP-PEI@RNA对前列腺癌细胞活力的影响的结果图，其中(a)CCK8结果图；(b)细胞活/死细胞染色法的细胞图；(c)细胞活/死细胞染色法的细胞存活率统计图；
图4显示BP-PEI@RNA对PC3细胞周期影响的结果图，其中(a)流式细胞图；(b)统计图；
图5显示BP-PEI@RNA对细胞凋亡影响的结果图，其中(a)流式细胞图；(b)统计图；
图6显示BP-PEI@RNA体内抗肿瘤效果的结果图，其中(a)肿瘤生曲线图；(b)肿瘤大小测量图；(c)肿瘤重量结果图；(c)细胞凋亡结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例
1.制备纳米黑磷片层(BP)
纳米黑磷片层购自中科墨磷科技有限公司(0.1mg/mL)，尺寸约为200-300nm。
2.RNA基因药物制备
4段RNA序列如SEQ ID NO:1-4所示。
RNA-1:
AGATGAGAGACAGAGACGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCGGCCCGGCCCGGCCTGAAGCCCCTCTCAGCAACCCGTGAGCATCCGCGGGGGCGGCGCCGGCAGCGGCGGCGTTTCTCGCTTCTTCTTCGTCTTTTCTAACTGTGCAGCCTCTTCCTCGGCTTCTCCTGAAAGGGAAGGTGGAAGCCGTGGGCTTGGGCGGGAGCCGGCTGAGGCGCGGCGGCGGCGGCACCTCCCCCTCCTGGAGCGGGGGGAGAAGCGGCGGCGGCGGCGCCCCCGGTGGCCCCGGCGGCTGCAGCTCCAGGGAGGGGGTCTGAGTCGCCTGTCACCATTTCCAGGGCTGGGAACGCCGGAGAGTTGGTCTCTCCCCTTCTACTGCCTCCAACACGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCACATGGAGGGACCCGGGCCGGTTTTAAACCTCTCGTCCGCCGCCGCCGCACCCCCCGTGGCCCGGGCTCCGGAGGCCGCTGGAGGAGGCAGCCGTTCGGAGGATTATTCGTCTTCTCCCCATTCCGCTGCCGCCGCTGCCAGGCCTCTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCCCAGTAGCTGCCACCATCCAGCAGCTGCTGCCGCAGCCATTACCCGGCTGCGGTCCAGAGCCAAGCAGCGGCTGAGCGAGGGGCATCAGCTACCGCCAAGTCCAGAGCCATTTCCATCCTGCAGAGCCCCGCCACCAGCAGCTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTCTTCAGCCACAGGCTCCCAGACAGGACAGCCATCATCAAAGAGATCGTTAGCAGAAACAAAAGGAGATATCAAGAGGATGGATTCGACTTAGACTTGACCTATATTTATCTAAACATTATTGCTATGGGATTTCCTGCAGAAAGACTTGAAGGCGTATACAGGAACAATATTGATGATGTAGTAAGGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATACACAATCTTTGTGCTGAAAGACATTATGACACCGCCAAATCTAATTACAG(SEQ ID NO:1)
RNA-2:
AGTTGCGCAATATCCTTTTGAAGACCATAACCCACCACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTTTGTGAAGATCTTGACCAATGGCTAAGTGAAGATGACAATCATGTTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGGGACGAACTGGTATAATGATTTATGCATATTTATTACATCGGGGCAAATTTTTAAAGGCACAAGAGGCCCTAGATTTCTATGGGGAAGTAAGGACCAGAGACAAAAAGGGAGTAACTATTCCCAGTCAGAGGCGCTATGTGTATTACTATAGCTACCTGGTAAAGAATCATGTGGATTATAGACCAGTGGCACTGTTGTTTCACAAGATGATGTTTGAAACTATTCCAATGTTCAGTGGCGGAACTTGCAATCCTCAGTTTGTGGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATGTATTCCTCCAATTCAGGACCCACACGATGGGAGGACAAGTTCATGTATTTTGAGTTCCCTCAGCCGTTACCTGTGTGTGGTGATATCAAAGTAGAGTTCTTCCACAAACAGAACAAGATGCTAAAAAAGGACAAAATGTTTCACTTTTGGGTAAATACATTCTTCATACCAGGACCAGAGGAAACCTCAGAAAAAGTAGAAAATGGAAGTCTATGTGATCAAGAAATTGATAGCATTTGCAGTATAGAGCGTGCAGATAATGACAAGGAGTATCTAGTACTTACTTTAACAAAAAATGATCTTGACAAAGCAAATAAAGACAAAGCCAACCGATACTTTTCTCCAAATTTTAAGGTGAAGCTGTACTTCACAAAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATCCAGAGGCTAGCAGTTCAACTTCTGTAACACCAGATGTTAGTGACAATGAACCTGATCATTATAGATATTCTGACACCACTGACTCTGATCCAGAGAATGAACCTTTTGATGAAGATCAGCATACACAAATTACAAAAGTCTGAATTTTTTTTTATCAAGAGGGATAAAACACCATGAAAACAAACTTGAATAAACTGAAAAG(SEQ ID NO:2)
RNA-3：
GGACCTTTTTTTTTAATGGCAATAGGACATTGTGTCAGATTACCAGTTATAGAAACAATTCTCTTTTCGTGACCAATCTTGTTTTACCCTATACATCCACAGGGTTTTGACACTTGTTGTCCAGTTGAAAAAAGGTTGTGTAGCTGTGTCATGTATATACCTTTTTGTGTCAAAAGGACATTTAAAATTCAATTAGGATTAATAAAGATGGCACTTTCCCATTTTATTCCAGTTTTATAAAAAGTGGAGACAGACTGGTGTGTATACGTAGGAATTTTTTCCTTTTGTGTTCTGTCACCAACTGAAGTGGCTAAAGAGCTTTGTGATATACTGGTTCACATCATACCCCTTTGCACTTGTGGCAACAGATAAGTTTGCAGTTAGCTAAGAGAAGTTTCTGAAGGGTTTTGCTGCATTCTTGCATGTATTTGGGTTAGGGGAATGGAGGGAATGCTCAGAAAGGAAATAATTTTATGCTGGACTCTGGACCATATACCATCTCCAGCTATTTACACACACCTTTCTTTAGCATGCTACAGTTATTAATCTGGACATTCGAGGAATTGGCTGCTGTCACTGCTTGTTGTTTTCGCATTTTTTTAAAAGCATATTGGTGCTAGAAAAGGCAGCTAAAGGAAGTGAATCTGTATTGGGGTACAGGAATGAACCTTCTGCAACATCTTAAGATCCACAAATGAAGGGATATAAAAATAATGTCATAGATAAGAAACACAGCAACAATGACTTAACCATATAAATGTGGAGGCTATCAACAAAGAATGGGCTTGAAACATTATAAAAATTGACAATGATTTGTTAAATATGTTTTCTTAATTGTAACGACTTCTCCATCTCCTGTGTAATCAAGGCCAGTGCTGAAAGTCAGATGCTATTAGTACCTACATCAGTCAACAACTTACACTTATTTTACTAGTTTTCAATCATATACCTGCTGTGAAT(SEQ ID NO:3)
RNA-4：
GCTTCATGTGCTGCCTGCAAGCTTCTTTTTTCTCATTAAATATAAAATATTTTGTAATGCTAAAAAAAAAAAAAAGAACATAGAAGACAAACATCAGAAATAAACCCATCCACTATGGTTAACTCATTTTTGAATATGGTGTAAAGTCAGTTTAATGATGAAATAATATTATTTTCAACAAATAGTACAGAAATTAAACTATGCAAAAATACTATTAATAATGATGTTGGATCATTACCTCACACCATACCCCCAAATTAACTCAGAACATGGCATACACCAAATATAAGAGCAAAAACTATGAAATTTCTAGAAGAAGACAGAAAAAAAATTATGACTTTGGCTTAGTTGTTTCTTAGAAGTAACAGGAAAAGCATAATTCATAAAAGATAAATTGAAAAATCGGACGTCATCAAAATAAAAAATGGTTTATCTTCAAAGTCACCTGTTAAGAAAATGAGAAGACAAATCATAAAGCAGGGAGAAATTTTTGAAAGTCATGTATCTGATAAGGGACAGTTAAAACTAAATAAAAACACAAACCATCCAATTAAAATGAATAAAGGGTTCGAATAGGTATGTCATCAGAGATCATATAGGAATAACCAATAAGCAAACAAAAGATGTTCAATATCATTAGTTATTAGAGAAACAAAATTTAAAAACCACAATGAGATGACACTACACATTTGCCAGAATGATGATTATTAAAAAAGACCAAGTATTGGAGAGGATGTGAAAAAACTGGAACCTCACACATTGACGATAGAAATGTAAAATGAAATAGCCAATTCAGAAAACATTTTACAAGTTTTCTTTGTTTTTGTTTTTAATTTATTATACCCTTACCCTATGACTCAGTAATTCCACTTCTAGATACCTACCAAATAAAATTAAAGTTTATAACTTCACAAAGA(SEQ ID NO:4)
提取前列腺癌PC3细胞mRNA并逆转录得到cDNA。以cDNA为模板对4段RNA进行PCR扩增。将所得基因产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。随后构建T载体，经过转化、摇菌扩增、提取质粒、测序、核实基因序列、线性化质粒、琼脂糖凝胶电泳、切胶回收等实验得到线性化DNA，最后经体外转录的方法获得4段RNA基因药物。
3.构建纳米药物复合体(BP-PEI@RNA)
取1mL BP溶液(0.1mg/mL)于EP管中，4℃离心(16000rpm，20min)后去上清，等量无酶水重悬，吹打混匀后冰水浴超声(40kHz，100W，20min)，重复离心-无酶水重悬-冰水浴超声步骤2次后，得到分散良好的BP水相分散溶液。随后向上述BP水溶液中加入适量聚醚酰亚胺(polyetherimide，PEI)(2.5k，10mg/mL，BP与PEI体积比为1:1.5)冰水浴超声3-4h。经离心洗涤去除多余的PEI后无酶水重悬，加入适量RNA-2(BP与RNA-2质量比为1:0.4)在4℃共孵育10分钟，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体。
BP和BP-PEI@RNA纳米药物复合体形貌结构表征结果图见图1所示：图1(a)为BP-PEI@RNA透射电子显微镜观察结果。如图所示，BP是超薄的纳米片层，平均横向尺寸主要在200-300nm之间。经PEI修饰和RNA-2装载后，BP形态未发生明显改变。图1(b)为BP-PEI@RNA原子力显微镜观察结果，结果与TEM一致，原始BP材料是超薄的纳米片层，平均横向尺寸主要在200-300nm之间。经PEI修饰和RNA装载后其粒径及形态为发生明显改变。图1(c)为BP-PEI@RNA的Zeta电位结果。BP、BP-PEI、BP-PEI@RNA的平均Zeta电位分别为-22.93±0.58、36.47±1.94和22.1±0.56mV。图1(d)为BP-PEI@RNA水合粒径结果。BP、BP-PEI、BP-PEI@RNA在其水相分散系中的平均粒径分别为178.67±7.00、318.10±2.18和592.7±6.45nm。图1(e)为拉曼光谱结果图。BP的三个典型拉曼光谱峰值出现在360.8cm–1、438.7cm–1和465.8cm–1。
4.RNA荧光标记
方法一：6-羧基荧光素(6-FAM)标记BP-PEI@RNA
在RNA基因药物制备过程中，经相关步骤得到线性化DNA，以6-FAM标记的核糖核苷酸为荧光底物，经体外转录得到6-FAM标记的RNA基因药物，随后重复步骤3，得到BP-PEI@RNA-6FAM纳米药物复合体。
方法二：Cy3荧光染料标记RNA
在RNA基因药物制备过程中，经相关步骤得到线性化DNA，以Cy3标记的核糖核苷酸为荧光底物，经体外转录得到Cy3标记的RNA基因药物，随后重复步骤3，得到BP-PEI@RNA-Cy3纳米药物复合体。
5.BP-PEI@RNA的细胞摄取及亚细胞定位
PC3细胞在1640培养基中扩增至细胞密度为50％-60％时，采用6-FAM和Cy3荧光染料标记的BP-PEI@RNA(BP浓度为1μg/mL；RNA浓度为0.4μg/mL)分别暴露细胞。于暴露后不同时间点通过激光共聚焦显微镜观察PC3细胞BP-PEI@RNA的摄取及亚细胞定位情况。BP-PEI@RNA的细胞摄取及亚细胞定位情况见如图2(图2中RNA是RNA-2)：图2(a)不同时间点BP-PEI@RNA被细胞摄取情况。6-FAM标记RNA并构建BP-PEI@RNA-6FAM纳米药物复合体，用该纳米药物复合体暴露PC3细胞后进行激光共聚焦观察，图中红色荧光为细胞骨架，绿色为6-FAM标记的BP-PEI@RNA-6FAM，蓝色为细胞核。BP-PEI@RNA-6FAM纳米药物复合体被细胞摄取，暴露3h和6h后，BP-PEI@RNA-6FAM纳米药物复合体的细胞摄取量逐渐增多。图2(b)不同时间点BP-PEI@RNA被细胞摄入后的亚细胞定位。图中红色为Cy3标记的RNA或BP-PEI@RNA，绿色为溶酶体。游离RNA暴露细胞后，细胞内未检测到外源性RNA。而BP-PEI@RNA暴露细胞后6h，大量外源性RNA被细胞摄取，且摄取的RNA主要分布在溶酶体中(图中橘黄色荧光为RNA和溶酶体共定位)。而当暴露时间延长至24h时，摄入溶酶体中的RNA被释放至胞质中。这表明BP-PEI@RNA被细胞摄取后进入溶酶体中，随后溶酶体裂解并将BP-PEI@RNA释放至胞质中。以上数据表明，游离RNA暴露细胞后，RNA可能因为自身的不稳定性或穿透细胞膜能力弱而无法进入细胞。当其装载至BP-PEI后，RNA可以被细胞高效摄取，摄取后的BP-PEI@RNA纳米药物复合体主要分布在溶酶体中，随后溶酶体裂解并将BP-PEI@RNA释放到胞质中发挥作用。
6.BP-PEI@RNA体外抗肿瘤功能评估
PC3细胞在1640培养基中生长至密度为50％-60％时，对其暴露BP-PEI@RNA(BP浓度为1μg/mL；RNA浓度为0.4μg/mL)24h，之后进行细胞功能评估。
装载四段不同RNA序列的BP-PEI分别暴露PC3细胞，通过CCK8、细胞活/死染色法评估BP-PEI@RNA对细胞活力的影响，实验结果如图3所示：由图3(a)可知，BP-PEI@RNA组的细胞活力较BP-PEI组和对照组显著减弱。在图3(b)中，绿色荧光指示活细胞，红色荧光指示死细胞，BP-PEI@RNA暴露组中细胞的死亡数量显著多于BP-PEI组和对照组；图3(c)为实验组中细胞的存活率，可见BP-PEI@RNA组中细胞存活率显著低于BP-PEI组和对照组。
装载四段不同RNA序列的BP-PEI分别暴露PC3细胞，通过检测细胞周期评估BP-PEI@RNA对细胞周期的影响。实验结果如图4所示：图4(a)和图4(b)为流式细胞术检测细胞周期实验结果。可见BP-PEI@RNA暴露细胞后，停滞在G0/G1期(DNA合成前期)的细胞占比显著增加，而进入G2/M期(DNA合成后期/有丝分裂期)的细胞占比明显降低，这表明BP-PEI@RNA阻滞细胞周期进程，从而抑制细胞增殖。
装载四段不同RNA序列的BP-PEI分别暴露PC3细胞，通过检测细胞凋亡评估BP-PEI@RNA对细胞凋亡的影响。实验结果如图5所示：图5(a)和图5(b)中，BP-PEI@RNA暴露细胞后，凋亡细胞比率较BP-PEI组和对照组均显著增加。这表明BP-PEI@RNA暴露PC3细胞后可以促进细胞凋亡。
7.BP-PEI@RNA体内抗肿瘤效果评估
向体重约为15g(4-5周龄，购自Vital River实验室)的雄性BALB/c-nude小鼠左下腹皮下注2×106个PC3细胞建立荷瘤鼠模型。两周后，向瘤内注射BP-PEI@RNA纳米药物复合体(每间隔四天注射一次，共计注射4次)，注射药物后每3天测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线图。于注射结束后第5天处死老鼠，剥离肿瘤组织后拍照、称重。同时通过Tunel实验检测肿瘤组织中细胞凋亡水平。实验结果如图6所示(图6中RNA是RNA-2)：在肿瘤生曲线图6(a)中，BP+RNA组的肿瘤体积显著低于Cont.、BP和RNA组；在图6(b)和(c)中，BP+RNA组中剥离出的肿瘤大小和重量显著低于其他实验组(Cont.、BP和RNA组)。图6(f)所示，BP+RNA组肿瘤组织的凋亡表达水平较对照组显著增高。以上数据表明，BP-PEI@RNA具有较强的体内抗肿瘤效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种BP-PEI@RNA纳米药物复合体，其特征在于，所述BP-PEI@RNA纳米药物复合体包括带正电荷的纳米材料以及带负电荷的RNA；所述RNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述纳米材料是纳米黑磷片层，所述PEI为聚醚酰亚胺。
2.一种带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体，其特征在于，所述带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体包括权利要求1所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体，以及与RNA连接的荧光物质。
3.根据权利要求2所述的带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体，其特征在于，所述荧光物质是6-FAM或Cy3。
4.一种权利要求1所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)制备RNA；
2)制备带有负电荷的纳米材料；
3)将RNA和带有负电荷的纳米材料共孵育；
步骤2)的具体制备过程如下：取纳米黑磷片层溶液，离心后去上清，无酶水重悬，混匀后超声，重复离心-无酶水重悬-超声步骤，得到纳米黑磷片层水相分散溶液；随后向上述纳米黑磷片层水相分散溶液中加入PEI溶液超声；经离心洗涤去除多余的PEI后重悬；
纳米黑磷片层水相分散溶液与PEI溶液体积比是1:1.5；
所述超声是冰水浴超声；
步骤2)的具体制备过程如下：取1mL浓度为0.1mg/mL的纳米黑磷片层溶液于EP管中，4℃16000rpm离心20min后去上清，等量无酶水重悬，吹打混匀后40kHz、100W冰水浴超声20min，重复离心-无酶水重悬-冰水浴超声步骤2次后，得到分散良好的纳米黑磷片层水相分散溶液；随后向上述纳米黑磷片层水溶液中加入2.5k、浓度为10mg/mL的PEI，纳米黑磷片层与PEI体积比为1:1.5，冰水浴超声3-4h；经离心洗涤去除多余的PEI后重悬；
步骤3)的具体制备过程如下：经步骤2)获得经PEI修饰的纳米黑磷片层溶液，加入RNA，共孵育，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体；
纳米黑磷片层与RNA质量比为1:0.4；
步骤3)的具体制备过程如下：加入RNA，使得纳米黑磷片层与RNA质量比为1:0.4，在4℃共孵育10分钟，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体；
所述PEI为聚醚酰亚胺。
5.一种权利要求2所述的带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
a)制备带有荧光物质标记的RNA；
b)制备带有负电荷的纳米材料；
c)将RNA和带有负电荷的纳米材料共孵育；
步骤a)的具体制备过程如下：以RNA的线性化DNA为模板，以荧光物质标记的核糖核苷酸为荧光底物，经体外转录得到荧光物质标记的RNA；
步骤b)的具体制备过程如下：取纳米黑磷片层溶液，离心后去上清，无酶水重悬，混匀后超声，重复离心-无酶水重悬-超声步骤，得到纳米黑磷片层水相分散溶液；随后向上述纳米黑磷片层水相分散溶液中加入PEI溶液超声；经离心洗涤去除多余的聚醚酰亚胺后重悬；
纳米黑磷片层水相分散溶液与PEI溶液体积比是1:1.5；
所述超声是冰水浴超声；
步骤b)的具体制备过程如下：取1mL浓度为0.1mg/mL的纳米黑磷片层溶液于EP管中，4℃16000rpm离心20min后去上清，等量无酶水重悬，吹打混匀后40kHz、100W冰水浴超声20min，重复离心-无酶水重悬-冰水浴超声步骤2次后，得到分散良好的纳米黑磷片层水相分散溶液；随后向上述纳米黑磷片层水溶液中加入2.5k、浓度为10mg/mL的PEI，纳米黑磷片层与PEI体积比为1:1.5，冰水浴超声3-4h；经离心洗涤去除多余的PEI后重悬；
步骤c)的具体制备过程如下：经步骤b)获得经PEI修饰的纳米黑磷片层溶液，加入步骤a)获得的带有荧光物质标记的RNA，共孵育，期间持续旋转混匀，得到带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体；
纳米黑磷片层与带有荧光物质标记的RNA质量比为1:0.4；
步骤c)的具体制备过程如下：加入带有荧光物质标记的RNA，使得纳米黑磷片层与带有荧光物质标记的质量比为1:0.4，在4℃共孵育10分钟，期间持续旋转混匀，得到BP-PEI@RNA纳米药物复合体；
所述PEI为聚醚酰亚胺。
6.权利要求1所述的BP-PEI@RNA纳米药物复合体在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
7.权利要求2所述的带有荧光物质标记的BP-PEI@RNA纳米药物复合体在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
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