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CN116171153B - 用于调节剪接的组合物 - Google Patents

用于调节剪接的组合物

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CN116171153B
CN116171153B CN202180062419.8A CN202180062419A CN116171153B CN 116171153 B CN116171153 B CN 116171153B CN 202180062419 A CN202180062419 A CN 202180062419A CN 116171153 B CN116171153 B CN 116171153B
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Skihawk Therapy
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Abstract

本文描述了调节基因编码的mRNA例如前mRNA的剪接的小分子剪接调节剂化合物，以及使用小分子剪接调节剂化合物调节剪接和治疗疾病和病症的方法。

Description

用于调节剪接的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请第63/061,742号的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
人类基因组中的大多数蛋白质编码基因由被内含子(非编码区)分开的多个外显子(编码区)组成。基因表达产生单一前体信使RNA(前mRNA)。内含子序列随后通过称为剪接的过程从所述前mRNA去除，这导致成熟的信使RNA(mRNA)。通过包含不同的外显子组合，选择性剪接产生了编码不同蛋白质同种型的多个mRNA。剪接体(多种蛋白质和核糖核蛋白的细胞内复合物)催化剪接。
目前用于指导和控制mRNA表达的治疗方法需要诸如基因疗法、基因组编辑或多种寡核苷酸技术(反义，RNAi等)的方法。基因疗法和基因组编辑通过影响DNA编码并由此改变mRNA表达而在mRNA转录的上游起作用。寡核苷酸通过规范的碱基/碱基杂交来调节RNA的作用。这种方法的吸引力在于寡核苷酸的基本药效团的设计，其可以通过与靶序列对象的已知碱基配对而以直接的方式定义。这些治疗方式中的每一种都面临着巨大的技术、临床和监管挑战。寡核苷酸作为治疗剂(,例如反义，RNAi)的一些局限性包括不利的药物动力学、口服生物利用度不足和血脑屏障穿透不足，后者阻止在胃肠外药物施用后递送至脑或脊髓用于治疗疾病(例如神经疾病，脑癌)。此外，如果没有复杂的递送系统(如脂质纳米颗粒)，则寡核苷酸不能有效地吸收到实体瘤中。此外，吸收到细胞和组织中的大多数寡核苷酸保留在非功能性区室(例如内体)中，无法进入靶标所位于的细胞质和/或细胞核。
此外，为了退火至靶标，寡核苷酸疗法需要接近靶标的互补碱基对。该方法假定前mRNA序列作为RNA的线性链存在于细胞中。然而，前mRNA很少是线性的；它具有复杂的二级和三级结构。此外，顺式作用元件(例如蛋白质结合元件)和反式作用因子(例如剪接复合物组分)可以产生另外的二维和三维复杂性(例如，通过与前mRNA结合)。这些特征可能是寡核苷酸疗法的效力和功效限制。
发明内容
本文所述的新型小分子剪接调节剂(SMSM)没有上述限制，也没有极大地限制寡核苷酸治疗的结构和空间障碍(例如，通过阻断与前mRNA靶标的杂交)。小分子对于揭示许多细胞过程(包括DNA复制/转录和翻译)的机制、调控和功能至关重要。尽管最近的若干篇报道描述了对小分子剪接效应子的筛选，但仅鉴定了少量的组成型或替代性剪接调节剂，许多小分子抑制剂缺乏特异性、缺乏选择性、缺乏效力、展示毒性或口服不可用。用小分子调节剂靶向RNA转录组代表了一种未开发的治疗方法以治疗多种RNA介导的疾病。因此，仍然需要开发用作治疗剂的小分子RNA调节剂。在本领域中需要剪接或剪接依赖性过程的新型调节剂。本文提供了满足该需求的小分子剪接调节剂及其用途。
一方面，本文描述了式(I)的化合物:
式(I)
其中，Q是取代或未取代的C1-C7亚烷基或取代或未取代的C1-C7亚杂烷基；X是氢、CH3或取代或未取代的C3-C6环烷基；每个R1和R2独立地是氢、卤素或CH3，每个R3和R4独立地是氢或卤素；每个A1、A2、A3和A4独立地是N、-NRY1-、-O-、-S-或CRA1，每个独立地是单键或双键；每个RA1独立地是氢、卤素、＝O或取代或未取代的C1-C6烷基；并且每个RY1独立地是氢或取代或未取代的C1-C6烷基；或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
本文还提供了药物组合物，其包含本文公开的化合物或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
本文还提供了调节剪接的方法，所述方法包括使本文所公开的化合物与细胞接触，其中所述化合物调节在编码mRNA的前mRNA的剪接位点序列处的剪接，其中所述mRNA编码靶蛋白或功能性RNA。
本文还提供了治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
本文还提供了本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物在制造用于治疗病症或疾病的药物中的用途。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均通过引用并入，其程度如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入一样。
具体实施方式
阐述了本说明书的某些特定细节，以提供对各种实施例的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开。在其他情况下，未示出或详细描述公知的结构，以避免不必要地混淆实施方案的描述。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。
定义
术语“公开的化合物”、“本公开的化合物”、“小分子空间调节剂”、“小分子剪接调节剂”、“空间调节剂”、“剪接调节剂”、“修饰剪接的化合物”和“修饰剪接化合物”、“SMSM”或“结合靶RNA的小分子”在本文可互换使用，并且是指如本文所公开的化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂化物及盐(例如，药学上可接受的盐)。术语“公开的化合物”、“本公开的化合物”、“小分子空间调节剂”、“小分子剪接调节剂”、“空间调节剂”、“剪接调节剂”、“修饰剪接的化合物”和“修饰剪接化合物”，“SMSM”或“结合靶RNA的小分子”表示结合细胞组分(例如，DNA、RNA、前mRNA、蛋白质、RNP、snRNA、碳水化合物、脂质、辅因子、营养物和/或代谢物)并调节目标多核苷酸(例如前mRNA)的剪接的小分子化合物。例如，SMSM可以直接或间接经突变的、非突变的、凸起的和/或异常的剪接位点结合于靶多核苷酸，例如RNA(例如前mRNA)，从而导致靶多核苷酸的剪接的调节。例如，SMSM可以直接或间接结合于蛋白质，例如剪接体蛋白质或核糖核蛋白，导致蛋白质的空间调节以及靶RNA剪接的调节。例如，SMSM可以直接或间接结合于剪接体组分，例如剪接体蛋白或snRNA，从而导致剪接体蛋白或snRNA的空间调节以及靶多核苷酸剪接的调节。这些术语明确地排除了由寡核苷酸组成的化合物。这些术语包括可与靶RNA的一个或多个二级或三级结构元件结合的小分子化合物。这些位点包括RNA三链体、3WJ、4WJ、平行Y结、发夹、凸起环、假结、内部环和其他高阶RNA结构基序。
如本文所用的术语“RNA”(核糖核酸)是指独立于来源(例如，RNA可以由人、动物、植物、病毒或细菌产生或可为合成来源)、生物学背景(例如，RNA可能在细胞核中、在血液中循环、在体外、细胞裂解物或者分离或纯净形式)或物理形式(例如，RNA可以是单链、双链或三重链形式(包括RNA-DNA杂合物)的天然存在的或合成的寡核糖核苷酸，其可能包括表观遗传修饰、天然转录后修饰、人工修饰(例如，通过化学或体外修饰获得)或其他修饰，可能结合于例如金属离子、小分子、蛋白质例如伴侣蛋白或辅因子，或可能处于变性、部分变性或折叠状态，包括任何天然或非天然的二级或三级结构，例如四链体、发夹、三链体、三向连接(3WJ)、四向连接(4WJ)、平行Y结、发夹、凸起环、伪结和内部环等，以及RNA所采用的任何瞬时形式或结构)。在一些实施方案中，RNA的长度为20、22、50、75或100或更多个核苷酸。在一些实施方案中，RNA的长度为250或更多个核苷酸。在一些实施方案中，RNA的长度为350、450、500、600、750或1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500，10,000、15,000、25,000、50,000或更多个的核苷酸。在一些实施方案中，RNA的长度在250和1,000个核苷酸之间。在一些实施方案中，RNA是前RNA、前miRNA或前转录物。在一些实施方案中，RNA是非编码RNA(ncRNA)、信使RNA(mRNA)、微-RNA(miRNA)、核酶、核糖开关、lncRNA、lincRNA、snoRNA、snRNA、scaRNA、piRNA、ceRNA、假基因、病毒RNA、真菌RNA、寄生RNA或细菌RNA。
本文中的“空间改变”、“空间修饰”或“空间调节”是指化学部分相对于彼此的空间取向的变化。本领域普通技术人员将认识到，空间机制包括但不限于空间位阻、空间屏蔽、空间吸引、链交叉、空间排斥、共振的空间抑制和质子化的空间抑制。
本文结构中的碳、氧、硫或氮原子上出现的任何开放价均表示存在氢，除非另有说明。
不论所讨论的术语是单独出现还是结合出现，本文所述的定义均适用。可以预期的是，本文所述的定义可以附加以形成化学相关的组合，例如“杂环烷基芳基”、“卤代烷基杂芳基”、“芳基烷基杂环烷基”或“烷氧基烷基”。组合的最后一个成员是与分子其余部分结合的基团。就文字序列而言，组合的其他成员以相反的顺序附接到结合基团上，例如芳基烷基杂环烷基的组合是指被芳基取代的烷基取代的杂环烷基基团。
当表示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基到最高可能的取代数目的范围，即，被取代基取代一个氢直至取代所有氢。
术语“取代基”表示取代母体分子上的氢原子的原子或原子团。
术语“取代的”表示指定基团带有一个或多个取代基。在任何基团可以带有多个取代基并提供各种可能的取代基的情况下，取代基是独立选择的且不必相同。术语“未取代的”是指指定的基团不带有取代基。术语“任选取代的”是指指定的基团未被取代或被一个或多个独立选自可能的取代基的取代基取代。
在整个说明书中使用以下缩写：乙酸(AcOH)；乙酸乙酯(EtOAc)；丁醇(n-BuOH)；1,2-二氯乙烷(DCE)；二氯甲烷(CH2Cl2,DCM)；二异丙基乙胺(Diipea)；二甲基甲酰胺(DMF)；氯化氢(HCl)；甲醇(MeOH)；甲氧基甲基溴化物(MOMBr)；N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)；碘甲烷(MeI)；正丙醇(n-PrOH)；对甲氧基苄基(PMB)；三乙胺(Et3N)；[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)；(Pd(dppf)Cl2)；乙硫醇钠(EtSNa)；乙酸钠(NaOAc)；氢化钠(NaH)；氢氧化钠(NaOH)；四氢吡喃(THP)；四氢呋喃(THF)。
如本文所用，C1-Cx包括C1-C2、C1-C3...C1-Cx。仅作为示例，命名为“C1-C4”的基团表示在该部分中具有1-4个碳原子，即含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子或4个碳原子的基团。因此，仅作为示例，“C1-C4烷基”表示烷基中具有1-4个碳原子，即，烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“氧代”是指＝O取代基。
术语“硫代”是指＝S取代基。
术语“卤代”、“卤素”和“卤化物”在本文中可互换使用，并表示氟代、氯代、溴代或碘代。
术语“烷基”是指直链或支链的烃链基团，具有一个至二十个碳原子，并且通过单键附接至分子的其余部分。同样地，包含至多10个碳原子的烷基被称为C1-C10烷基，例如，包含至多6个碳原子的烷基是C1-C6烷基。包含其他数量的碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)类似地表示。烷基包括但不限于C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基和C4-C8烷基。代表性的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基-丙基等。在一些实施方案中，烷基为甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基为-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非在说明书中另有特别说明，否则烷基可任选地被取代。为避免疑问，术语“烷基”不包括烯基或炔基。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基为-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基为-CH2-。在一些实施方案中，亚烷基为-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基为-CH2CH2CH2-。除非在说明书中另有特别说明，否则亚烷基可任选地被取代。为避免疑问，术语“亚烷基”不包括亚烯基或亚炔基。
术语“烯基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链烃基，其中存在至少一个碳-碳双键。在一个实施方案中，烯基具有式-C(R)＝CRa 2，其中Ra是指烯基的其余部分，其可以相同或不同。在一些实施方案中，Ra为H或烷基。在一些实施方案中，烯基选自乙烯基(即，乙烯基)、丙烯基(即，烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基等。烯基的非限制性实例包括-CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-CH＝CHCH3、-C(CH3)＝CHCH3和-CH2CH＝CH2。术语“亚烯基”是指二价烯基。
术语“炔基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链烃链基团，其中存在至少一个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有式-C≡C-Ra，其中Ra是指炔基的其余部分。在一些实施方案中，Ra为H或烷基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH3-C≡CCH2CH3、-CH2C≡CH。术语“亚炔基”是指二价炔基。
术语“烷氧基”是指式-ORa的基团，其中Ra是如所定义的烷基。除非在说明书中另有特别说明，否则烷氧基可任选地被取代。代表性烷氧基基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基。在一些实施例中，烷氧基为甲氧基。在一些实施方案中，烷氧基为乙氧基。
术语“芳族”是指具有离域的π电子系统的平面环，所述π电子系统包含4n+2π个电子，其中n是整数。芳族可以任选地被取代。术语“芳族”既包括芳基(例如，苯基、萘基)又包括杂芳基(例如，吡啶基、喹啉基)。
术语“芳基”是指芳族环，其中形成该环的每个原子是碳原子。芳基可以任选地被取代。芳基的实例包括但不限于苯基和萘基。在一些实施例中，芳基是苯基。取决于结构，芳基可以是单价或双价的(即亚芳基)。除非在说明书中另有具体说明，否则术语“芳基”或前缀“芳”(例如在“芳烷基”中)旨在包括任选地被取代的芳基基团。在一些实施例中，芳基包括本文定义的部分还原的环烷基(例如，1,2-二氢萘)。在一些实施例中，芳基包括本文定义的完全还原的环烷基(例如，1,2,3,4-四氢萘)。当芳基包含环烷基时，芳基通过芳环碳原子与分子的其余部分键合。
术语“卤代烷基”表示烷基，其中所述烷基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤原子，特别是氟原子取代。卤代烷基的实例包括一氟、二氟或三氟甲基、乙基或丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟甲苯、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。术语“全卤代烷基”表示烷基，其中所述烷基的所有氢原子均被相同或不同的卤原子取代。
术语“双环环系”是指通过共同的单键或双键(退火双环环系)，通过三个或更多个共同原子的序列(桥联双环环系)或通过共同的单个原子(螺双环环系)彼此稠合的两个环。双环环系可以是饱和的、部分不饱和的、不饱和的或芳族的。双环环系可包含选自N、O和S的杂原子。
术语“碳环”或“碳环”是指环或环系，其中形成环骨架的原子都是碳原子。因此，所述术语将碳环与其中环主链含有至少一个不同于碳的原子的“杂环”环或“杂环”相区分。在一些实施例中，双环碳环的两个环中至少一个是芳香族的。在一些实施例中，双环碳环的两个环都是芳香族的。碳环包括环烷基和芳基。
术语“环烷基”是指单环或多环非芳族基团，其中形成环的每个原子(即骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烷基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烷基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烷基与芳环稠合(在这种情况下，环烷基通过非芳族环碳原子键合)。环烷基基团包括具有3至10个环原子的基团。代表性的环烷基包括但不限于具有3至10个碳原子、3至8个碳原子、3至6个碳原子或3至5个碳原子的环烷基。单环环烷基基团包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施例中，单环环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施例中，单环环烷基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基。多环基团包括例如金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基(tetrainyl)、萘烷基(decalinyl)、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基和双环[1.1.1]戊基。除非说明书中另有特别说明，否则环烷基可以任选地被取代。
术语“桥接”是指具有两个或更多个环的任何环结构，其包含连接两个桥头原子的桥。桥头原子定义为该分子的骨架结构的一部分，并且与三个或更多个其他骨架原子键合的原子。在一些实施例中，桥接原子为C、N或P。在一些实施例中，桥是连接两个桥头原子的单个原子或原子链。在一些实施例中，桥是连接两个桥头原子的价键。在一些实施例中，桥环系统是环烷基。在一些实施例中，桥环系统是杂环烷基。
术语“氟代烷基”是指其中一个或多个氢原子被氟原子替代的烷基。在一个方面，氟代烷基是C1-C6氟代烷基。在一些实施方案中，氟代烷基选自三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基等。
术语“杂烷基”是指直链或支链烃链基团，其中烃链的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子，例如、氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-)、硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2)或其组合。在一些实施方案中，杂烷基在杂烷基的碳原子处与分子的其余部分附接。在一些实施方案中，杂烷基在杂烷基的杂原子处与分子的其余部分附接。在一些实施方案中，杂烷基为C1-C6杂烷基。代表性的杂烷基包括但不限于-OCH2OMe、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe或-OCH2CH2OCH2CH2NH2。
术语“杂亚烷基”或“杂亚烷基链”是指将分子的其余部分连接到基团的直链或支链二价烃链，其中烃链的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子，例如、氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-)、硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-)或其组合。除非在说明书中另有特别说明，否则亚杂烷基可任选地被取代。代表性的亚杂烷基包括但不限于-OCH2CH2O-、-OCH2CH2OCH2CH2O-或-OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-。
术语“杂环烷基”是指包括选自氮、氧和硫中的至少一个杂原子的环烷基。除非在说明书中另有特别说明，否则所述杂环烷基可以是单环或双环环系，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烷基通过非芳族环原子键合)或桥环系统。杂环基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烷基是部分或完全饱和的。杂环烷基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烷基还包括糖类的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另有说明，否则杂环烷基具有环中的2至12个碳。在一些实施例中，杂环烷基具有环中的2到10个碳。在一些实施例中，杂环烷基具有环中的2到10个碳和1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有环中的2至10个碳和3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳，0-2个N原子，0-2个O原子，0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。可以理解的是，当提及杂环烷基中的碳原子数时，杂环烷基中的碳原子数与构成杂环烷基(即，杂环烷基环的骨架原子)的原子总数(包括杂原子)不同。除非在说明书中另有特别说明，否则杂环烷基可任选地被取代。
术语“杂环”或“杂环的”是指杂芳族环(也称为杂芳基)和杂环烷基环(也称为杂脂族环基团)，其包括至少一个选自氮、氧和硫的杂原子，其中每个杂环基在其环系中具有3至12个原子，并且条件是任何环均不含有两个相邻的O或S原子。非芳族杂环基团(也称为杂环烷基)包括在其环系中具有3至12个原子的环，并且芳族杂环基团包括在其环系中具有5至12个原子的环。杂环基包括苯并稠合环系。非芳族杂环基团的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷二酮基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代噁烷基、哌嗪基、氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂环庚烷基(oxazepinyl)、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、1,2,3,6-四氢吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、3h-吲哚基、吲哚啉-2-酮基、异吲哚啉-1-酮基、异吲哚啉-1,3-二酮基、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮基、3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮基、异吲哚啉-1,3-二硫酮基、苯并[d]噁唑-2(3H)-酮基、1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮基和喹嗪基。芳族杂环基团的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和氟吡啶基。在可能的情况下，前述基团是C-附接的(或C-连接的)或N-附接的。例如，衍生自吡咯的基团包括吡咯-1-基(N-附接的)或吡咯-3-基(C-附接的)。另外，衍生自咪唑的基团包括咪唑-1-基或咪唑-3-基(均为N-附接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(均为C-附接的)。杂环基包括苯并稠合环系。非芳族杂环任选地被一个或两个氧代(＝O)部分取代，例如吡咯烷-2-酮。在一些实施方案中，双环杂环的两个环中至少一个是芳族的。在一些实施方案中，双环杂环的两个环都是芳族的。
术语“杂芳基”是指包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基。在一些实施例中，杂芳基是单环或双环的。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基为吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基为C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基为C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基为5元或6元杂芳基。在一些实施例中，杂芳基包括本文定义的部分还原的环烷基或杂环烷基(例如，7,8-二氢喹啉)。在一些实施例中，杂芳基包括本文定义的完全还原的环烷基或杂环烷基(例如，5,6,7,8-四氢喹啉)。当杂芳基包含环烷基或杂环烷基时，杂芳基通过杂芳环碳或杂原子与分子的其余部分键合。
术语“部分”是指分子的特定片段或官能团。化学部分通常是嵌入或附至分子的已知化学实体。
术语“互变异构体”是指质子从分子的一个原子到相同分子的另一个原子的转移。本文提出的化合物可以互变异构体形式存在。互变异构体是通过氢原子迁移可相互转化的化合物，同时伴随着单键和相邻双键的转换。在可能发生互变异构的键合结构中，将存在互变异构体的化学平衡。考虑了本文公开的化合物的所有互变异构形式。互变异构体的确切比例取决于若干因素，包括温度、溶剂和pH。互变异构互换的一些实例包括：
如本文所用，术语“施用”等是指可用于使化合物或组合物递送至所需的生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于口服途径(p.o.)、十二指肠内途径(i.d.)、胃肠外注射(包括静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)、血管内或输注(inf.))、局部(top.)和直肠(p.r.)施用。所属领域技术人员熟悉可与本文所述的化合物和方法一起使用的施用技术。在一些实施方案中，本文所述的化合物和组合物经口服施用。
如本文所用，术语“共同施用”等意在包括将选择的治疗剂施用于单个患者，并且意图包括其中通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间施用药剂的治疗方案。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的足以在某种程度上减轻正在治疗的疾病或病症的一种或多种症状的药剂或化合物的量；例如减轻和/或缓解疾病的一种或多种体征、症状或原因或任何其他任何希望的生物系统改变。例如，用于治疗用途的“有效量”可以是在临床上显著减轻一种或多种疾病症状的药剂的量。在个体情况下，可以使用诸如剂量递增研究的技术来确定适当的“有效”量。
如本文所用，术语“增强”是指增加或延长所需效果的量、效力或持续时间。例如，关于增强靶标的剪接，术语“增强”可以指增加或延长靶标的剪接(无论是在数量、效力还是持续时间上)的能力。
术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类别的任何成员：人、非人灵长类如黑猩猩以及其他猿类和猴类物种；牲畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一个方面，哺乳动物是人。如本文所用，术语“动物”包括人和非人动物。在一个实施方案中，“非人动物”是哺乳动物，例如啮齿动物如大鼠或小鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换使用，并表示待施用于受试者(例如，有此需要的人)的包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液。
如本文所用，术语“药物组合”是指通过混合或组合超过一种活性成分而得到的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分，例如本文所述的化合物和助剂，均以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指活性成分，例如本文所述的化合物和助剂，作为单独的实体同时、并存或依次施用于患者而没有特定的间隔时间限制，其中这种施用提供了患者体内两种化合物的有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如，三种或更多种活性成分的施用。
术语“药学上可接受的”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，该材料通常是安全、无毒的，在生物学上或其他方面都不是不期望的，并且对于兽药以及人用药是可接受的。“药学上可接受的”可以指不消除化合物的生物学活性或特性并且相对无毒的材料(例如载体或稀释剂)，即可以在不引起不良生物学效应或与含有其的组合物的任何组分以有害方式相互作用的情况下施用于个体的材料。
术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的载体”和“治疗惰性赋形剂”可以互换使用，并且表示药物组合物中的任何药学上可接受的成分均不具有治疗活性并且对所施用的受试者无毒，如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂或润滑剂。
术语“药学上可接受的盐”表示在生物学上或其他方面不是不期望的盐。药学上可接受的盐包括酸和碱加成盐。“药学上可接受的盐”可以指不会对所施用的生物体造成明显刺激和/或不会消除化合物的生物学活性和特性的化合物制剂。在一些实施方案中，通过使式(I)-(Io)中任一项的SMSM化合物与酸反应来获得药学上可接受的盐。还可以通过使式(I)-(Io)中任一项的化合物与碱反应形成盐来获得药学上可接受的盐。
如本文所用，术语“核酸”通常是指一种或多种核碱基、核苷或核苷酸，并且它们包括多核碱基、多核苷和多核苷酸。
如本文所用，“小分子量化合物”可以与“小分子”或“小有机分子”互换使用。小分子是指除肽或寡核苷酸以外的化合物；并且分子量通常小于约2000道尔顿，例如小于约900道尔顿。
核糖核蛋白(RNP)是指含有RNA的核蛋白。RNP可以是核糖核酸和RNA结合蛋白的复合物。这种组合也可以称为蛋白质-RNA复合物。这些复合物可以发挥多种生物学功能，包括但不限于DNA复制、基因表达、RNA代谢和前mRNA剪接。RNP的实例包括核糖体、端粒酶、穹顶核糖核蛋白、核糖核酸酶P、异质核RNP(hnRNP)和小核RNP(snRNP)。
来自蛋白质编码基因和mRNA加工中间体的新生RNA转录物统称为前mRNA，通常与真核细胞核中的蛋白质结合。从新生转录物自RNA聚合酶(例如，RNA聚合酶II)首次出现直至成熟的mRNA被转运入细胞质的时间，RNA分子与大量的剪接复合物组分(例如，核蛋白和snRNA)相关联。这些蛋白质可以是hnRNP的组分，其可以包含各种大小的异质核RNA(hnRNA)(例如前mRNA和核RNA复合物)。
剪接复合物组分在剪接和/或剪接调节中起作用。剪接复合物组分可以包括但不限于核糖核蛋白(RNP)、剪接蛋白、小核RNA(snRNA)、小核核糖核蛋白(snRNP)和异质核核糖核蛋白(hnRNP)。剪接复合物组分包括但不限于剪接可能所需的那些，例如组成型剪接、选择性剪接、调控剪接和特定信息或信息组的剪接。一组相关蛋白，富丝氨酸精氨酸蛋白(SR蛋白)，可以在组成型前mRNA剪接中起作用，并且还可以以浓度依赖性方式调节选择性剪接位点选择。SR蛋白通常具有模块化结构，该结构由一个或两个RNA识别基序(RRM)和一个富含精氨酸和丝氨酸残基的C末端(RS结构域)组成。它们在选择性剪接中的活性可能被hnRNPA/B蛋白家族成员拮抗。剪接复合物组分也可以包括与一种或多种snRNA缔合的蛋白质。人类中的SR蛋白包括但不限于SC35、SRp55、SRp40、SRm300、SFRS10、TASR-1、TASR-2、SF2/ASF、9G8、SRp75、SRp30c、SRp20和P54/SFRS11。人类中可参与剪接位点选择的其他剪接复合物组分包括但不限于U2 snRNA辅助因子(例如U2AF65、U2AF35)、Urp/U2AF1-RS2、SF1/BBP、CBP80、CBP 20、SF1和PTB/hnRNP1。人类中的hnRNP蛋白包括但不限于A1、A2/B1、L、M、K、U、F、H、G、R、I和C1/C2。编码hnRNP的人类基因包括HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA1L1、HNRNPA1L2、HNRNPA3、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPB1、HNRNPC、HNRNPCL1、HNRNPD、HNRPDL、HNRNPF、HNRNPH1、HNRNPH2、HNRNPH3、HNRNPK、HNRNPL、HNRPLL、HNRNPM、HNRNPR、HNRNPU、HNRNPUL1、HNRNPUL2、HNRNPUL3和FMR1。剪接复合物组分可以与snRNP或转录物稳定或短暂缔合。
术语“内含子”是指基因内的DNA序列和未加工的RNA转录物中的相应序列。作为RNA加工途径的一部分，内含子可以在转录后不久或与转录同时通过RNA剪接除去。内含子存在于大多数有机体和许多病毒的基因中。它们可以存在于广泛的基因中，包括产生蛋白质、核糖体RNA(rRNA)和转移RNA(tRNA)的那些。
“外显子”可以是基因的任何部分，其编码内含子通过RNA剪接除去后该基因产生的最终成熟RNA的一部分。术语“外显子”是指基因内的DNA序列和RNA转录物中的相应序列。
“剪接体”可以由snRNA和蛋白质复合物装配而成。剪接体可以从转录的前mRNA中去除内含子。
小分子剪接调节剂(SMSM)
本公开提供了意想不到的发现，即某些小化学分子可以修饰前mRNA分子中的剪接事件，在本文中称为小分子剪接调节剂(SMSM)。这些SMSM可以调节特定前mRNA分子中的特定剪接事件，因此可用于治疗、预防或改善与特定RNA相关的疾病或病症。这些SMSM可以通过多种机制进行操作以修饰剪接事件。例如，本公开的SMSM可以：1)干扰剪接复合物、剪接体和/或其组分如hnRNP、snRNP、SR-蛋白和其他剪接因子或元件的形成和/或功能和/或其他性质，导致前mRNA分子中剪接事件的预防或诱导。作为另一实例；2)防止和/或修饰诸如hnRNP、snRNP、SR-蛋白和其他剪接因子的基因产物的转录后调控(例如剪接)，其随后可能参与剪接体或剪接复合物组分的形成和/或功能；3)防止和/或修饰基因产物的磷酸化、糖基化和/或其他修饰，所述基因产物包括但不限于hnRNP、snRNP、SR-蛋白和其他剪接因子，其随后可能参与剪接体或剪接复合物组分的形成和/或功能；4)结合和/或另外影响特定前mRNA，从而例如通过不涉及以序列特异性方式与RNA碱基配对的机制来预防或诱导特定剪接事件。本公开的小分子不同于反义或反基因寡核苷酸且与之无关。
本文描述了修饰基因产物剪接的化合物，其用于治疗、预防疾病或病症和/或延迟其进展。
一方面，本文描述了具有式(I)结构的化合物:
式(I)
其中，Q是取代或未取代的C1-C7亚烷基或取代或未取代的C1-C7亚杂烷基；X是氢、CH3或取代或未取代的C3-C6环烷基；每个R1和R2独立地是氢、卤素或CH3，每个R3和R4独立地是氢或卤素；每个A1、A2、A3和A4独立地是N、-NRY1-、-O-、-S-或CRA1，每个独立地是单键或双键；每个RA1独立地是氢、卤素、＝O或取代或未取代的C1-C6烷基；并且每个RY1独立地是氢或取代或未取代的C1-C6烷基；或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ia)的结构：
式(Ia)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iaa)的结构：
式(Iaa)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iaa*)的结构：
式(Iaa*)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iaaa)的结构：
式(Iaaa)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iaaa*)的结构：
式(Iaaa*)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ib)的结构：
式(Ib)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ibb)的结构：
式(Ibb)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ibb*)的结构：
式(Ibb*)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ibbb)的结构：
式(Ibbb)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ibbb*)的结构：
式(Ibbb*)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ic)的结构：
式(Ic)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Icc)的结构：
式(Icc)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Id)的结构：
式(Id)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Idd)的结构：
式(Idd)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ie)的结构：
式(Ie)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iee)的结构：
式(Iee)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ieee)的结构：
式(Ieee)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(If)的结构：
式(If)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Iff)的结构：
式(Iff)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ig)的结构：
式(Ig)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ih)的结构：
式(Ih)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ihh)的结构：
式(Ihh)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ii)的结构：
式(Ii)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ij)的结构：
式(Ij)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ik)的结构：
式(Ik)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Il)的结构：
式(Il)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Im)的结构：
式(Im)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(In)的结构：
式(In)。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ij)、式(Ij)、式(Ik)、式(Il)、式(Im)或式(In)化合物的一些实施方案中，带有X基团的氮原子相对于带有R1、R2、R3和R4取代基的杂环位于平伏位置
在式(Iaa)、式(Iaaa)、式(Ibb)、式(Ibbb)、式(Icc)、式(Idd)、式(Iee)、式(Ieee)、式(Iff)或式(Ihh)化合物的一些实施方案中，带有X基团的氮原子相对于带有R1、R2、R3和R4取代基的杂环位于平伏位置。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ij)、式(Ij)、式(Ik)、式(Il)、式(Im)、式(In)、式(Iaa)、式(Iaaa)、式(Ibb)、式(Ibbb)、式(Icc)、式(Idd)、式(Iee)、式(Ieee)、式(Iff)或式(Ihh)化合物的一些实施方案中，带有X基团的氮原子和N-H基团在平面的同一侧。在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ij)、式(Ij)、式(Ik)、式(Il)、式(Im)、式(In)、式(Iaa)、式(Iaaa)、式(Ibb)、式(Ibbb)、式(Icc)、式(Idd)、式(Iee)、式(Ieee)、式(Iff)或式(Ihh)化合物的一些实施方案中，带有X基团的氮原子和Q基团在平面的相对侧。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Io)的结构：
式(Io)。
在一些实施方案中，R3或R4中的至少一者是氟。在一些实施方案中，R3为氟并且R4为氢。在一些实施方案中，R3为氢并且R4为氟。在一些实施方案中，R3为氢或F。在一些实施方案中，R3为氢。在一些实施方案中，R3为F。在一些实施方案中，R4为氢或F。在一些实施方案中，R4为氢。在一些实施方案中，R4为F。
在一些实施方案中，A1为CH、CF、C(CH3)、N、O或C(＝O)。在一些实施方案中，A1为CH。在一些实施方案中，A1为CF。在一些实施方案中，A1为C(CH3)。在一些实施方案中，A1为N。在一些实施方案中，A1为O。在一些实施方案中，A1为C(＝O)。在一些实施方案中，A1为S。在一些实施方案中，A1为CRA1。在一些实施方案中，A1为CRA1并且RA1为H。在一些实施方案中，A1为CRA1并且RA1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RA1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RA1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RA1为H。在一些实施方案中，RA1为甲基。在一些实施方案中，RA1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RA1为CD3或CD2CD3。在一些实施方案中，RA1为卤素。在一些实施方案中，RA1为F。在一些实施方案中，A1为NRY1。在一些实施方案中，A1为NRY1并且RY1为H。在一些实施方案中，A1为NRY1并且RY1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RY1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RY1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RY1为H。在一些实施方案中，RY1为甲基。在一些实施方案中，RY1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RY1为CD3或CD2CD3。
在一些实施方案中，A2为CH、C(CH3)、N或C(CH3)。在一些实施方案中，A2为CH。在一些实施方案中，A2为C(CH3)。在一些实施方案中，A2为N。在一些实施方案中，A2为C(CH3)。在一些实施方案中，A2为S。在一些实施方案中，A2为CRA1。在一些实施方案中，A2为CRA1并且RA1为H。在一些实施方案中，A2为CRA1并且RA1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RA1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RA1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RA1为H。在一些实施方案中，RA1为甲基。在一些实施方案中，RA1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RA1为CD3或CD2CD3。在一些实施方案中，RA1为卤素。在一些实施方案中，RA1为F。在一些实施方案中，A2为NRY1。在一些实施方案中，A2为NRY1并且RY1为H。在一些实施方案中，A2为NRY1并且RY1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RY1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RY1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RY1为H。在一些实施方案中，RY1为甲基。在一些实施方案中，RY1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RY1为CD3或CD2CD3。
在一些实施方案中，A3为CH、C(CH3)、N或C(CH3)。在一些实施方案中，A3为CH。在一些实施方案中，A3为C(CH3)。在一些实施方案中，A3为N。在一些实施方案中，A3为C(CH3)。在一些实施方案中，A3为S。在一些实施方案中，A3为CRA1。在一些实施方案中，A3为CRA1并且RA1为H。在一些实施方案中，A3为CRA1并且RA1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RA1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RA1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RA1为H。在一些实施方案中，RA1为甲基。在一些实施方案中，RA1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RA1为CD3或CD2CD3。在一些实施方案中，RA1为卤素。在一些实施方案中，RA1为F。在一些实施方案中，A3为NRY1。在一些实施方案中，A3为NRY1并且RY1为H。在一些实施方案中，A3为NRY1并且RY1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RY1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RY1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RY1为H。在一些实施方案中，RY1为甲基。在一些实施方案中，RY1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RY1为CD3或CD2CD3。在一些实施方案中，A3为N(CH3)。
在一些实施方案中，A4为CH、C(CH3)、N、O或C(＝O)。在一些实施方案中，A4为CH。在一些实施方案中，A4为C(CH3)。在一些实施方案中，A4为N。在一些实施方案中，A4为O。在一些实施方案中，A4为C(＝O)。在一些实施方案中，A4为S。在一些实施方案中，A4为CRA1。
在一些实施方案中，A4为CRA1并且RA1为H。在一些实施方案中，A4为CRA1并且RA1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RA1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RA1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RA1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RA1为H。在一些实施方案中，RA1为甲基。在一些实施方案中，RA1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RA1为CD3或CD2CD3。在一些实施方案中，RA1为卤素。在一些实施方案中，RA1为F。在一些实施方案中，A4为NRY1。在一些实施方案中，A4为NRY1并且RY1为H。在一些实施方案中，A4为NRY1并且RY1是取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C6烷基，其任选被一个或多个卤素(如F)取代。在一些实施方案中，RY1为任选取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，RY1为C1-C3烷基，其任选被一个或多个F取代。在一些实施方案中，RY1中的一个或多个氢中的一个或多个氢被氘替换。在一些实施方案中，RY1为H。在一些实施方案中，RY1为甲基。在一些实施方案中，RY1为甲基、乙基、CF3、CHF2或CH2CF3。在一些实施方案中，RY1为CD3或CD2CD3。
在一些实施方案中，A1、A2、A3和A4中的一者是C(＝O)。
在一些实施方案中，式(I)的化合物包含至少20个碳原子、5个氮原子和1个氟原子。在一些实施方案中，式(I)的化合物包含至少18个碳原子(例如，18、19或20个碳原子)、6个氮原子和1个氟原子。在一些实施方案中，式(I)的化合物包含至少18个碳原子(例如，18、19或20个碳原子)、7个氮原子和1个氟原子。
在一些实施方案中，X为氢。在一些实施方案中，X为-CH3。在一些实施方案中，X为-CD3。在一些实施方案中，X是取代或未取代的C3-C6环烷基。在一些实施方案中，X是取代或未取代的环丙基、取代或未取代的环丁基、或取代或未取代的环戊基。在一些实施方案中，X是环丙基、环丁基或环戊基，其各自被1、2或3个各自独立地选自氟、OH、CH3和OCH3的取代基取代。在一些实施方案中，X为环丙基。
在一些实施方案中，R1为氢或CH3。在一些实施方案中，R1为氢。在一些实施方案中，R1为CH3。
在一些实施方案中，R2为氢或CH3。在一些实施方案中，R2为氢。在一些实施方案中，R2为CH3。
在一些实施方案中，Q是取代或未取代的C1-C7亚烷基。在一些实施方案中，Q是取代或未取代的C1-C7亚杂烷基。在一些实施方案中，Q任选被一个或多个选自C1-C3烷基和卤素的取代基取代。在一些实施方案中，Q是取代或未取代的C2-C4亚烷基。在一些实施方案中，Q是取代或未取代的C2-C4亚烷基。在一些实施方案中，Q为被1、2、3或4个各自独立地选自下列的取代基取代的C2-C4亚烷基：氟、OH、CH3、和OCH3。在一些实施方案中，Q为-CH2CH2-。在一些实施方案中，Q为-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，Q为-CH2OCH2-。在一些实施方案中，Q为任选被卤素取代的C2-C4亚烷基。在一些实施方案中，Q为任选被一个或多个F取代的C2-C4亚烷基。在一些实施方案中，Q为任选被一个或多个F取代的C2-C3亚杂烷基。
在一些实施方案中，选自
在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自
在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自 在一些实施方案中，选自
在一些实施方案中，式(I)化合物选自
在一些实施方案中，式I化合物选自表1中的化合物。在一些实施方案中，式I化合物选自表2中的化合物。在一些实施方案中，式(I)的化合物为：6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-1,2-二氢异喹啉-1-酮；7-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基-3,4-二氢喹唑啉-4-酮；7-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮；6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-1,2-二氢酞嗪-1-酮；7-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-4H-色烯-4-酮；或6-(6-{[(1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-[[(1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基]-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-[[(1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基]-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇。在一些实施方案中，式(I)化合物为7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇。在一些实施方案中，式(I)化合物为4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1-酮。在一些实施方案中，式(I)化合物为2-乙基-4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基异喹啉-1-酮。在一些实施方案中，本文描述了任何所述化合物的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，本文描述了任何所述化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个方面，本文公开了一种调节剪接的方法，包括使前述权利要求中任一项所述的化合物与细胞接触，其中所述化合物调节编码mRNA的前mRNA的剪接位点序列处的剪接，其中所述mRNA编码靶蛋白或功能性RNA。
一方面，本文公开了一种治疗疾病或病症的方法，其包括施用本发明的化合物。
在一些实施方案中，本文所述的SMSM具有一个或多个立体中心，并且每个立体中心独立地以R或S构型存在。本文提出的化合物包括所有非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式及其适当的混合物。本文提供的化合物和方法包括所有顺式(cis)、反式(trans)、顺(syn)、反(anti)、entgegen(E)和zusammen(Z)异构体，以及它们的适当的混合物。在某些实施例中，通过使化合物的外消旋混合物与旋光拆分剂反应形成一对非对映异构体化合物/盐，分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体，将本文描述的化合物制备成其单独的立体异构体。在一些实施例中，对映异构体的拆分使用本文所述化合物的共价非对映异构体衍生物进行。在另一个实施例中，基于溶解度的差异，通过分离/拆分技术分离非对映异构体。在其他实施方案中，立体异构体的分离的进行是通过色谱法或通过形成非对映异构体盐并通过重结晶或色谱或其任意组合而分离。Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,John Wiley And Sons,Inc.,1981。在一个方面，通过立体选择性合成获得立体异构体。
在一些实施例中，本文所述的化合物被制备为前药。“前药”是指在体内转化为母体药物的试剂。前药通常是有用的，因为在某些情况下，它们可能比母药更易于施用。例如，它们通过口服施用可为生物可用的，而母体药物则不能。前药在药物组合物中的溶解度也可能高于母体药物。在一些实施方案中，前药的设计增加了有效水溶性。前药的一个实例是，但不限于，本文所述的化合物，其以酯(“前药”)的形式施用，以促进其中水溶性不利于迁移的细胞膜上的传递，但一旦在水溶性有益的细胞内侧，其随后代谢水解为羧酸活性实体。前药的另一个实例可以是与酸性基团结合的短肽(聚氨基酸)，其中所述肽经代谢以显示出活性部分。在某些实施方案中，在体内施用时，前药被化学转化为该化合物的生物学、药学或治疗学活性形式。在某些实施方案中，前药通过一个或多个步骤或过程被酶促代谢为该化合物的生物学、药学或治疗学活性形式。
在一个方面，设计前药以改变药物的代谢稳定性或转运特性，以掩盖副作用或毒性，以改善药物的风味或改变药物的其他特性或性质。利用体内药代动力学、药效学过程和药物代谢的知识，一旦知晓药物活性化合物，就可以设计该化合物的前药(参见，例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford UniversityPress,New York，388-392页；Silverman(1992),The Organic Chemistry of Drug Designand Drug Action,Academic Press,Inc.,San Diego，352-401页，Rooseboom等人.,Pharmacological Reviews,56:53-102,2004；Aesop Cho,“Recent Advances in OralProdrug Discovery”,Annual Reports in Medicinal Chemistry，第41卷，395-407,2006；T.Higuchi和V.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems,A.C.S.SymposiumSeries，第14卷)。
在某些情况下，本文所述的某些化合物可能是另一衍生物或活性化合物的前药。
在一些实施方案中，本文所述的化合物的芳环部分上的位点易于发生各种代谢反应，因此在芳环结构上引入适当的取代基将减少、最小化或消除该代谢途径。在特定的实施方案中，减少或消除芳环对代谢反应的敏感性的合适的取代基是卤素或烷基(仅举例而言)。
在另一实施方案中，本文所述的化合物经同位素标记(例如，采用放射性同位素)或通过其他方式标记，其包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
本文所述的化合物包括同位素标记的化合物，其与本文呈现的各种式和结构中所述的那些相同，但事实上一个或多个原子被原子质量或质量数与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子替代。可掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，例如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F和36Cl。在一个方面，本文所述的同位素标记的化合物，例如其中掺入有放射性同位素如3H和14C的那些，可用于药物和/或底物组织分布测定。在一个方面，用同位素如氘取代获得了由更大的代谢稳定性所导致的某些治疗优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量要求。
在附加的或另外的实施方案中，本文所述的化合物在施用于有需要的生物时代谢以产生代谢产物，其然后用于产生期望的作用，包括期望的治疗作用。
本文所述的化合物可以形成为和/或用作为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的类型包括但不限于：(1)酸加成盐，通过化合物的游离碱形式与药学上可接受的以下各项反应而形成：无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、偏磷酸等；或者有机酸，例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、三氟乙酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4’-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、丁酸、苯乙酸、苯基丁酸、丙戊酸等；(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子(例如锂、钠、钾)、碱土金属离子(例如镁或钙)或铝离子)替代时形成的盐。在某些情况下，本文所述的化合物可与有机碱配位，所述有机碱例如但不限于乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺、二环己基胺、三(羟甲基)甲胺。在其他情况下，本文所述的化合物可与氨基酸形成盐，所述氨基酸例如但不限于精氨酸、赖氨酸等。用于与包括酸性质子的化合物形成盐的可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
应当理解的是，对药物上可接受的盐的提及包括溶剂加成形式，特别是溶剂化物。溶剂化物包含化学计量的或非化学计量的溶剂，并且可以在采用药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)的结晶过程中形成。当溶剂是水时形成水合物，或者当溶剂是醇时形成醇化物。在一些实施例中，本文所述化合物的溶剂化物可在本文所述方法期间方便地制备或形成。另外，本文提供的化合物可以以非溶剂化物以及溶剂化物形式存在。通常，出于本文提供的化合物和方法的目的，溶剂化形式被认为等同于非溶剂化形式。
在一些实施方案中，SMSM的分子量为至多约2000道尔顿、1500道尔顿、1000道尔顿或900道尔顿。在一些实施方案中，SMSM的分子量至少为100道尔顿、200道尔顿、300道尔顿、400道尔顿或500道尔顿。在一些实施方案中，SMSM不包含磷酸二酯键。
制备化合物的方法
可以使用标准合成技术或使用所属领域已知的方法与本文描述的方法的组合来合成本文描述的化合物。除非另有说明，否则可以使用常规的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。可以使用标准有机化学技术制备化合物，例如，March’s Advanced Organic Chemistry，第6版，John Wiley and Sons，Inc.中所述的那些。可以采用本文所述的合成转化的替代反应条件，例如变化溶剂、反应温度、反应时间以及不同的化学试剂和其他反应条件。起始物质可以从商业来源获得或可以容易地制备。仅作为实例，提供了用于制备SMSM的方案。
在一些实施方案中，用于制备本文所述的SMSM的方案为方案1。
方案1。
其中，PG1是合适的保护基1，并且PG2是合适的保护基2。在一些实施方案中，PG1和PG2如实施例中所述。
在一些实施方案中，本文所述的SMSM化合物选自表1或表2。表1和表2中的化合物可以使用以上通用方案1和以下实施例1-8中概述的工序制备。
表1-示例性化合物
表2-示例性化合物
在一些实施方案中，本文公开了来自表1或表2的SMSM化合物的药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
药物组合物
在一些实施例中，将本文描述的化合物配制成药物组合物。药物组合物以常规方式使用一种或多种促进活性化合物加工成可药用制剂的药学上可接受的非活性成分配制。适当的制剂取决于所选的施用途径。例如，本文所述的药物组合物的汇总可以在例如以下中找到：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.、Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)，其公开内容通过引用并入本文。
药物组合物可以是本文描述的SMSM与一种或多种其他化学成分(即药学上可接受的成分)的混合物，所述其他化学成分为例如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、增润剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或它们的一种或多种组合。该药物组合物促进化合物到生物体的施用。
本文所述的组合物可以多种方式施用于受试者，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施方案中，小分子剪接调节剂或其药学上可接受的盐通过受试者的腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射施用。在一些实施例中，药物组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。包含小分子剪接调节剂的口服剂可以是任何适合口服施用的形式，例如液体、片剂、胶囊等。可以将口服制剂进一步包衣或处理以防止或减少其在胃中的溶解。可以使用本领域已知的任何适当方法将本公开的组合物施用于受试者。用于本公开的合适制剂和递送方法通常是本领域众所周知的。例如，本文所述的小分子剪接调节剂可以配制成具有药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，包括pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等、例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本文所述的药物制剂可以通过多种施用途径以多种方式向受试者施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内、鼻内注射)、鼻内、口腔、局部或经皮施用途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉剂、速释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲式释放制剂、多颗粒制剂以及速释和控释混合制剂。
在一些实施方案中，药物制剂为片剂形式。在其他实施例中，包含本文所述的SMSM的药物制剂为胶囊形式。在一个方面，用于口服施用的液体制剂剂型是水性悬浮液或溶液形式，其选自但不限于水性口服分散液、乳剂、溶液剂、酏剂、凝胶剂和糖浆剂。
对于通过吸入施用，可以将本文所述的SMSM配制用作气雾剂、雾剂或粉剂。对于经颊或舌下施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶剂的形式。在一些实施例中，本文所述的SMSM可以制备为透皮剂型。在一些实施方案中，可以将本文所述的SMSM配制成适用于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的SMSM可以局部施用，并且可以配制成多种局部可施用的组合物，例如溶液、悬浮液、洗液、凝胶、糊剂、药用棒、香膏、乳膏或软膏。在一些实施方案中，本文所述的SMSM可以配制成直肠组合物，例如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂、栓剂、胶体栓剂或滞留型灌肠剂。
剪接调节
本公开预期使用具有有利的药物性质的小分子，其调节靶RNA的剪接活性。本文提供了调节靶多核苷酸剪接的小分子剪接调节剂(SMSM)。在一些实施方案中，SMSM结合并调节靶RNA。在一些实施例中，本文提供了一种SMSM库，所述SMSM结合并调节一个或多个靶RNA。在一些实施例中，靶RNA是mRNA。在一些实施方案中，靶RNA为非编码RNA的mRNA。在一些实施方案中，靶RNA为前mRNA。在一些实施方案中，靶RNA为hnRNA。在一些实施例中，小分子调节靶RNA的剪接。在一些实施例中，本文提供的小分子在靶RNA的序列处调节剪接。在一些实施方案中，本文提供的一个小分子在靶RNA的隐蔽剪接位点序列处调节剪接。在一些实施方案中，本文提供的一个小分子与靶RNA结合。在一些实施例中，本文提供的小分子与剪接复合物组分结合。在一些实施方案中，本文提供的小分子与靶RNA和剪接复合物组分结合。
因此，本文提供了预防或诱导前mRNA分子中的剪接事件的方法，其包括使前mRNA分子和/或剪接系统的其他元件(例如，在细胞内)与本文提供的化合物接触以预防或诱导前mRNA分子中的剪接事件。预防或诱导的剪接事件可以是例如异常剪接事件，组成型剪接事件或选择性剪接事件。
本文进一步提供了一种鉴定能够预防或诱导前mRNA分子中的剪接事件的化合物的方法，其包括使该化合物与如本文所述的涉及可变、异常和/或组成型剪接的剪接元件和/或因子在由此产生并检测阳性(预防或诱导剪接)或阴性(未预防或诱导剪接)作用的条件下接触(例如，在细胞内)，并将产生阳性作用的化合物鉴定为能够预防或诱导剪接事件的化合物。
在一些实施方案中，在药学上可接受的载体中的本文所述的小分子化合物预防或诱导前mRNA分子中的可变或异常剪接事件。如上所述，本文提供的小分子化合物不是反义或反基因寡核苷酸。
在一些实施方案中，一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法包括向患有疾病或病症的受试者施用小分子剪接调节化合物(SMSM)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，多核苷酸是前mRNA。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用另外的治疗性分子。在一些实施方案中，SMSM是本文所述的化合物。
本文所述的化合物和制剂也可用作治疗涉及异常和/或选择性剪接的疾病的治疗剂。因此，在一些实施方案中，一种治疗患有与前mRNA分子中的选择性或异常剪接事件相关的病症或障碍的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物以调节选择性剪接事件或预防异常剪接事件，从而治疗该受试者。所述方法可以例如在前mRNA分子中恢复正确的剪接事件。所述方法可以例如在药学上可接受的载体中利用本文所述的小分子化合物。
包含本文所述的小分子的制剂可以包含生理或药学上可接受的载体，例如水性载体。因此，本文所述方法中使用的制剂包括但不限于适于口服施用，胃肠外施用，包括皮下、皮内、肌内、静脉内和动脉内施用以及局部施用(例如，将可吸入颗粒物的雾化制剂施用于患有囊性纤维化或肺癌的患者的肺部，或用于牛皮癣患者的经皮施用的乳膏或洗剂制剂)的那些制剂。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过本领域公知的任何方法制备。在任何给定情况下，最合适的施用途径可能取决于受试者、所治疗疾病的性质和严重程度以及所使用的特定活性化合物，这将很容易被本领域技术人员确定。
本文还提供了具有上述特征的本文所述的化合物用于制备用于上调或下调患有如上所述的与前mRNA分子的异常或选择性剪接相关的疾病的患者中的RNA表达的药物中的方法。在一些实施方案中，药物上调基因表达。在其他实施方案中，药物下调基因表达。在根据本公开的药物的制造中，所述化合物可以与尤其是药学上可接受的载体混合。载体可以是固体或液体。一种或多种化合物可以以任何组合掺入本文所述的制剂中，所述制剂可以通过任何众所周知的药学技术来制备，例如将组分混合和/或包括一种或多种辅助治疗成分。
本公开鉴定了低分子量化合物(本文有时称为小分子)，其阻断mRNA剪接和/或增强(促进、增加)mRNA剪接。可由本文所述方法调节的剪接包括选择性剪接、例如、外显子跳跃、内含子保留、假外显子跳跃、外显子排除、部分内含子排除等。根据剪接序列和RNA(或编码RNA的基因)或涉及的外显子等因素，剪接的调节可以在存在或不存在对感兴趣的剪接序列特异的反义寡核苷酸(AOs)的情况下完成。在一些实施方案中，小分子和AO协同作用。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗患有与前mRNA的异常剪接相关的疾病或病症的受试者的方法。所述方法可以包括向受试者施用SMSM或包含SMSM的组合物，其中所述SMSM结合前mRNA或剪接复合物组分并调节前mRNA的剪接以抑制转录物的一种或多种同种型的表达。所述方法可以包括向受试者施用SMSM或包含SMSM的组合物，其中所述SMSM结合前mRNA或剪接复合物组分并调节前mRNA的剪接以增加转录物的一种或多种同种型的表达。
许多疾病与基因的异常基因产物(例如，RNA转录物或蛋白质)的表达相关。例如，由于蛋白质表达的相应变化，异常数量的RNA转录物可能导致疾病。特定RNA转录物数量的变化可能是多种因素导致的。首先，RNA转录物数量的变化可能是由于特定基因的转录水平异常所致，例如转录因子或转录过程的一部分的扰动，从而导致特定RNA转录物表达水平的变化。其次，特定RNA转录物的剪接变化，例如由于特定剪接过程的扰动或导致修饰剪接的基因突变，可能会改变特定RNA转录物的水平。特定RNA转录物稳定性的改变或维持RNA转录物稳定性的组分的改变，例如聚-A尾并入过程或对某些结合和稳定RNA转录物的因子或蛋白质的影响，可能会导致特定RNA转录物的水平改变。特定RNA转录物的翻译水平也会影响这些转录物的数量，影响或上调RNA转录物的衰变过程。最后，异常的RNA运输或RNA螯合也可能导致RNA转录物功能水平的改变，并可能影响RNA转录物的稳定性、进一步加工或翻译。
在一些实施方案中，本文提供了调节前mRNA编码的一种，两种，三种或更多种RNA转录物的量的方法，其包括使细胞与SMSM化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，在细胞培养物中使细胞与SMSM化合物或其药学上可接受的盐接触。在其他实施方案中，在受试者(例如，非人类动物受试者或人受试者)中，使细胞与SMSM化合物或其药学上可接受的盐接触。
在一些实施方案中，本文提供了用于治疗、预防疾病或病症和/或延缓其进展的方法，其包括向受试者，特别是哺乳动物，施用有效量的如本文所述的小分子剪接调节剂。
在一些实施方案中，SMSM化合物与前mRNA的结合预防自前mRNA群体剪接出一个或多个外显子和/或内含子和/或其蛋白以产生编码靶蛋白或功能性RNA的mRNA。在一些实施方案中，细胞包含自编码靶蛋白或功能性RNA的基因转录的前mRNA群体，其中前mRNA群体包含导致剪接出一个或多个外显子的突变，并且其中SMSM化合物或其药学上可接受的盐结合于导致前mRNA群体中剪接出一个或多个外显子的突变。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐结合于导致剪接出一个或多个外显子的突变预防自前mRNA群体剪接出一个或多个外显子以产生编码靶蛋白或功能性RNA的mRNA。在一些实施方案中，状况是疾病或障碍。在一些实施方案中，所述方法还包括评估蛋白质表达。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐与前mRNA的靶向部分结合。
在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的结合催化包含缺失的外显子或去除不需要的保留内含子或其部分，从而产生健康的mRNA和蛋白质。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的结合对未患病细胞的作用很小至没有作用。
SMSM靶标
mRNA(例如前mRNA)的异常剪接可导致蛋白质缺陷，并可能导致受试者中的疾病或障碍。本文描述的组合物和方法可以减少这种mRNA(例如前mRNA)的异常剪接，并且治疗由这种异常剪接引起的疾病或障碍。
与RNA转录物量变化相关的疾病通常以异常的蛋白质表达为重点来治疗。然而，如果可以通过用小分子处理来靶向导致RNA水平异常变化的过程(例如剪接过程的组分或相关的转录因子或相关的稳定性因子)，则有可能恢复蛋白质表达水平，例如RNA转录物或相关蛋白异常表达的不良影响。因此，需要一种调节某些基因编码的RNA转录物的量的方法，以预防或治疗与RNA转录物或相关蛋白异常表达相关的疾病。
治疗方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗与异常剪接(例如异常的前mRNA剪接)相关的人类疾病或病症。本文所述的组合物和方法可通过调节mRNA(例如前mRNA)而用于治疗人类疾病或病症。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可通过调节核酸的剪接而用于治疗人类疾病或病症，即使当该核酸在所治疗的疾病或病症的发病机理中未被异常剪接时。
在一些实施方案中，在施用SMSM化合物或其药学上可接受的盐或其组合物或药物的背景中，有效量是指对患者具有治疗作用和/或有益作用的SMSM化合物或其药学上可接受的盐的量。在某些具体实施方案中，在向患者施用SMSM化合物或其药学上可接受的盐或其组合物或药物的背景中的有效量导致以下作用中的一种、两种或多种：(i)降低或改善疾病的严重程度；(ii)延迟疾病发作；(iii)抑制疾病的发展；(iv)减少受试者的住院；(v)缩短受试者的住院时间；(vi)增加受试者的存活；(vii)改善受试者的生活质量；(viii)减少与疾病有关的症状数量；(ix)减轻或改善与疾病有关的症状的严重程度；(x)减少与疾病有关的症状的持续时间；(xi)预防与疾病有关的症状的复发；(xii)抑制疾病症状的发展或发作；和/或(xiii)抑制与疾病相关的症状的进展。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效地恢复基因的RNA转录物的量至健康患者或健康患者细胞中可检测的RNA转录物量的量。在其他实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效地恢复基因的RNA同种型和/或蛋白质同种型的量至健康患者或健康患者细胞中可检测的RNA同种型和/或蛋白质同种型量的量。
在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效减少与疾病相关的基因的RNA转录物的异常量的量。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效减少基因的同种型的异常表达的量。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效导致RNA转录物(例如，mRNA转录物)，选择性剪接变体或同种型的量的实质性改变的量。
在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效增加或减少有益于预防和/或治疗疾病的基因的RNA转录物(例如，mRNA转录物)量的量。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效增加或减少有益于预防和/或治疗疾病的基因的RNA转录物的选择性剪接变体量的量。在一些实施方案中，SMSM化合物或其药学上可接受的盐的有效量是有效增加或减少有益于预防和/或治疗疾病的基因的同种型量的量。在一些实施方案中，基因是SMN2。在一些实施方案中，调节多核苷酸的剪接包括抑制外显子7的跳跃。在一些实施方案中，本文所述的SMSM化合物及其使用方法可以调节SMN2的前mRNA的剪接。例如，本文所述的SMSM化合物及其使用方法可以调节SMN2的前mRNA的外显子7的剪接。在一些实施方案中，SMSM化合物和方法通过公开的剪接序列调节多核苷酸的剪接，并治疗表3中公开的疾病。
表3
在一个实施方案中，本文所述的SMSM可以用于制备用于治疗本文所述的疾病或病症的药物。另外，在需要此种治疗的受试者中治疗本文所述的任何疾病或病况的方法可以涉及以治疗有效量向受试者施用包括本文所述的至少一种SMSM或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在某些实施方案中，可以施用本文所述的SMSM用于预防和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分阻止至少一种疾病或病症症状的量施用于已经患有疾病或病症的患者。有效用于该用途的量取决于疾病或病症的严重程度和病程、既往治疗、患者的健康状况、体重、对药物的反应以及治疗医师的判断。治疗有效量任选地通过包括但不限于剂量递增临床试验的方法来确定。在预防性应用中，可以将含有本文所述的SMSM的组合物施用于易患特定疾病、障碍或病症或处于其风险中的患者。在某些实施方案中，可以暂时减少或暂时中止所施用的药物剂量某一时间长度(即“休药期”)。用于成人治疗的剂量通常为每天0.01mg-5000mg或每天约1mg至约1000mg的范围。在一些实施方案中，所需剂量可以方便地以单剂量或分剂量呈现。
对于本文所述的组合疗法，共同施用的化合物的剂量可以根据所使用的共同药物的类型、所使用的特定药物、所治疗的疾病或病症等而变化。在另外的实施方案中，当与一种或多种其他治疗剂共同施用时，本文提供的化合物与一种或多种其他治疗剂同时施用或顺序施用。如果同时施用，则可以以单一、统一形式或以多重形式提供多种治疗剂，以上仅作为示例。
施用方法
本文所述的组合物可以多种方式施用于受试者，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施例中，小分子剪接调节剂或其药学上可接受的盐通过受试者的腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射施用。在一些实施例中，药物组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。包含小分子剪接调节剂的口服剂可以是任何适合口服施用的形式，例如液体、片剂、胶囊等。可以将口服制剂进一步包衣或处理以防止或减少其在胃中的溶解。可以使用本领域已知的任何适当方法将本公开的组合物施用于受试者。用于本公开的合适制剂和递送方法通常是本领域众所周知的。例如，本文所述的小分子剪接调节剂可以配制成具有药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可以包含近似生理条件所需的药学上可接受的助剂、包括pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等、例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本文所述的药物制剂可以通过多种施用途径以多种方式向受试者施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内、鼻内注射)、鼻内、口腔、局部或经皮施用途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉剂、速释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲式释放制剂、多颗粒制剂以及速释和控释混合制剂。
在一些实施方案中，口服施用本文描述的药物组合物。在一些实施方案中，局部施用本文描述的药物组合物。在这样的实施方案中，本文所述的药物组合物被配制成各种局部可施用的组合物、例如溶液、悬浮液、洗液、凝胶、糊剂、洗发剂、擦剂、搓剂、涂片、涂药片、药用绷带、绷带、香脂、乳膏或软膏。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物局部施用于皮肤。在一些实施例中，本文所述的药物组合物通过吸入施用。在一些实施例中，配制本文所述的药物组合物用于鼻内施用。此类制剂包括鼻喷雾剂，鼻雾剂等。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物配制成滴眼剂。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物为：(a)全身性施用于哺乳动物；和/或(b)口服施用于哺乳动物；和/或(c)静脉内施用于哺乳动物；和/或(d)通过吸入施用于哺乳动物；和/或(e)经鼻施用于哺乳动物；和/或(f)通过注射施用于哺乳动物；和/或(g)局部施用于哺乳动物；和/或(h)通过眼科施用而施用；和/或(i)直肠施用于哺乳动物；和/或(j)非全身性或局部施用于哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物口服施用于哺乳动物。在某些实施例中，本文所述的SMSM以局部施用而非全身性施用的方式施用。在一些实施例中，本文所述的SMSM为局部施用。在一些实施例中，本文所述的SMSM为全身施用。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以装入明胶胶囊中或压成片剂。为了口服治疗性施用的目的，活性化合物可以与赋形剂结合，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下任何成分或性质相似的化合物：粘合剂如微晶纤维素，黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入施用，将化合物以气溶胶喷雾的形式自加压容器或分配器递送，该容器或分配器包含合适的推进剂，例如诸如二氧化碳的气体或喷雾器。
全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂是所属领域公知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成所属领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
适于注射使用的SMSM包括无菌水溶液(在水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应以易于注射的程度流动。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须进行防腐处理，以免受到细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层，在分散液的情况下通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。
给药和时间表
在本公开的方法中使用的SMSM可以例如以可以根据受试者的需要、所治疗和/或成像的疾病的严重性和/或所采用的SMSM而改变的剂量施用。例如，可以根据经验来确定剂量，其考虑到在特定受试者中诊断出的疾病的类型和阶段和/或结合SMSM使用的成像方式的类型。在本公开的上下文中，施用于受试者的剂量应足以影响受试者中的有益诊断或治疗反应。剂量的大小还可以根据在特定受试者中施用SMSM所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。
以剂量单位形式配制组合物是有利的，其易于施用且剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算预定量的活性化合物，以与所需的药物载体结合产生期望的治疗效果。本公开的剂量单位形式的规范决定于并直接取决于活性化合物的独特特性和所要达到的特定治疗效果，以及配混此类活性化合物以治疗个体的领域中固有的限制。此类化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的工序来确定，例如，确定LD50(对50％群体致命的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的工序。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但应谨慎设计将这类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
从细胞培养测定和/或动物研究中获得的治疗指数数据可用于预测体内治疗指数并制定用于受试者(例如人类受试者)的剂量范围。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，该循环浓度包括几乎没有或没有毒性的ED50。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。对于本公开的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，该范围包括如在细胞培养中确定的达到症状的最大半数抑制的测试化合物的浓度。此类信息可用于更准确地确定人中有用的剂量。例如，可以通过高效液相色谱测量血浆中的水平。用于评价特定SMSM在预防或减轻疾病或病症中的有效性的各种动物模型和临床测定是本领域已知的，并且可以在本公开中使用。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。确切的配方、给药途径和剂量可由个体医师根据患者的状况来选择。(参见例如Fingl等人,1975,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics.Ch.1pi)。
本公开的组合物可以根据需要频繁地施用，包括每小时、每天、每周或每月施用。
在任何前述方面中的是另外的实施方案，其包括单次施用有效量的本文所述的SMSM，包括其中(i)化合物施用一次；(ii)化合物在一天的时间内多次施用于哺乳动物；(iii)持续施用；或者(iv)连续施用的另外的实施方案。
在任何前述方面中的是另外的实施例，其包含多次施用本文所述的有效量的SMSM，包括其中(i)以单剂量连续或间歇地施用化合物；(ii)多次施用之间的间隔时间为每6小时；(iii)每8小时向哺乳动物服用化合物；(iv)每12小时向哺乳动物施用化合物；(v)每24小时向哺乳动物施用化合物的另外的实施例。在其他或替代实施例中，所述方法包含休药期，其中本文所述的SMSM的施用被暂时中止或所施用的化合物的剂量被暂时降低；在休药期结束时，继续给予所述化合物。在一个实施方案中，休药期的长度从2天至1年不等。
组合疗法
在某些情况下，将本文所述的至少一种SMSM与另一种治疗剂组合施用是合适的。例如，本文所述的化合物SMSM可以与第二治疗剂共同施用，其中SMSM和第二治疗剂调节所治疗的疾病、病症或病状的不同方面，因此与施用任何一种单独的治疗剂相比，提供了更大的总体益处。
在一些实施方案中，SMSM可以与一种或多种其他SMSM组合施用。
可以在其他治疗剂的施用之前、同时或之后将SMSM施用于有此需要的受试者。例如，可以在施用其他治疗剂的开始时间之前至少8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1.5小时、1小时或30分钟将SMSM施用于受试者。在某些实施方案中，它们可以与其他治疗剂同时施用。换言之，在这些实施方案中，在开始施用其他治疗剂的同时施用SMSM。在其他实施方案中，可以在施用其他治疗剂的开始时间后施用SMSM(例如，施用其他治疗剂的开始时间后至少30分钟，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时)。或者，可以在化学治疗剂的施用完成后至少30分钟，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时施用SMSM。通常，将这些SMSM施用足够的时间，以预防或减轻疾病或病症。这样的足够的时间可以与其他治疗剂的施用时间相同或不同。在某些实施方案中，对于另一种治疗剂或多种其他治疗剂的组合的每次施用，施用多剂量的SMSMs。
在某些实施方案中，将适当剂量的SMSM与特定时机和/或特定途径结合以达到预防或减少疾病或病症的最佳效果。例如，在开始或完成施用另一种治疗剂或其他治疗剂的组合之前或之后，至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时8小时、9小时、10小时、11小时或12小时；或者至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天；或者至少1周、2周、3周或4周；或者至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月向人口服施用SMSM。
受试者
可以用本文描述的SMSM和方法治疗的受试者可以是产生经受选择性剪接的mRNA的任何受试者，例如，所述受试者可以是真核生物受试者，例如植物或动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，例如人类。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人类动物。在一些实施方案中，受试者是胎儿、胚胎或儿童。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物，例如黑猩猩以及其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一些实施方案中，受试者为产前(例如胎儿)、儿童(例如新生儿、婴儿、学步儿童、青春期前)、青少年、青春期或成人(例如，早期成年人，中年成年人，老年人)。
实施例
提供这些示例仅出于说明目的，并且不限制本文提供的权利要求的范围。可以使用标准合成技术或使用所属领域已知的方法与本文描述的方法的组合来合成本文描述的化合物。除非另有说明，否则可以使用常规的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。可以使用标准有机化学技术制备化合物，例如，March’s AdvancedOrganic Chemistry，第6版，John Wiley and Sons，Inc.中所述的那些。可以采用本文所述的合成转化的替代反应条件，例如变化溶剂、反应温度、反应时间以及不同的化学试剂和其他反应条件。用于合成本文所述化合物的起始物质和试剂可以合成或从商业来源获得，所述商业来源例如但不限于，Sigma-Aldrich、Acros Organics、Fluka和FischerScientific。起始物质可以从商业来源获得或可以容易地制备。仅作为示例，提供了用于制备本实施例的方案。
使用以下缩写：DCM-二氯甲烷；DIPEA-N,N-二异丙基乙胺；DMSO-二甲基亚砜；DMF-N,N-二甲基甲酰胺；EDCI-N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺；Et2O-乙醚；EtOAc-乙酸乙酯；EtOH-乙醇；HOBt-1-羟基苯并三唑；LCMS－液相色谱质谱仪；MeCN－乙腈；MeOH-甲醇；Ms－甲磺酸酯；MTBE-甲基叔丁基醚；Selectfluor-1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷二(四氟硼酸盐)；SFC-超临界流体色谱法；THF-四氢呋喃；TMSCl-三甲基氯甲硅烷；h-小时；min-分钟；rt-室温(22-25℃)；g-克；mL-毫升；mg-毫克；和mmol-毫摩尔。
详述可用于制备本文所述化合物的反应物的合成或提供描述该制备的文章的参考的合适的参考书和论文包括例如，“Synthetic Organic Chemistry”,John Wiley&Sons,Inc.,New York；S.R.Sandler等人.,“Organic Functional Group Preparations,”第2版，Academic Press,New York,1983；H.O.House,“Modern Synthetic Reactions”,第2版，W.A.Benjamin,Inc.Menlo Park,Calif.1972；T.L.Gilchrist,“HeterocyclicChemistry”,第2版，John Wiley&Sons,New York,1992；J.March,“Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms and Structure”,第4版，Wiley Interscience,NewYork,1992。详述可用于制备本文所述化合物的反应物的合成或提供描述该制备的文章的参考的另外的合适的参考书和论文包括例如，Fuhrhop,J.和Penzlin G.“OrganicSynthesis:Concepts,Methods,Starting Materials”,第二修订和增补版(1994)JohnWiley&Sons ISBN:3 527-29074-5；Hoffman、R.V.“Organic Chemistry,An IntermediateText”(1996)Oxford University Press,ISBN 0-19-509618-5；Larock、R.C.“Comprehensive Organic Transformations:A Guide to Functional GroupPreparations”第2版(1999)Wiley-VCH,ISBN:0-471-19031-4；March,J.“AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure”第4版(1992)John Wiley&Sons,ISBN:0-471-60180-2；Otera,J.(编辑)“Modern Carbonyl Chemistry”(2000)Wiley-VCH,ISBN:3-527-29871-1；Patai,S.“Patai’s1992Guide to the Chemistry ofFunctional Groups”(1992)Interscience ISBN:0-471-93022-9；Solomons,T.W.G.“Organic Chemistry”第7版(2000)John Wiley&Sons,ISBN:0-471-19095-0；Stowell,J.C.,“Intermediate Organic Chemistry”第2版(1993)Wiley-Interscience,ISBN:0-471-57456-2；“Industrial Organic Chemicals:Starting Materials andIntermediates:An Ullmann’s Encyclopedia”(1999)John Wiley&Sons,ISBN:3-527-29645-X，共8卷；“Organic Reactions”(1942-2000)John Wiley&Sons，超过55卷；和“Chemistry of Functional Groups”John Wiley&Sons，共73卷。
在所述反应中，可能需要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基，在最终产物中所需要它们的情况下，以避免它们不希望地参与反应。适用于创建保护基以及它们的去除的技术的详细说明描述于Greene and Wuts,Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons,New York,NY,1999和Kocienski,Protective Groups,Thieme Verlag,New York,NY,1994，其公开内容通过引用并入本文)。
SMSM可以使用已知技术制备，并进一步经化学修饰，在一些实施方案中，以促进核内转移至例如剪接复合物组分、剪接体或前mRNA分子。本领域普通技术人员将理解用于核内转移的化学修饰的标准药物化学方法(例如，减少电荷、优化大小和/或改变亲脂性)。
立体化学:
(±)或外消旋表示产物是对映异构体的外消旋混合物。例如，(±)(1S,2S,3R,5R)或外消旋(1S,2S,3R,5R)表示所示的相对产物立体化学是基于相似化合物和或反应的已知立体化学，且产物是(1S,2S,3R,5R)和(1R,2R,3S,5S)立体异构体的对映异构体的外消旋混合物。其中分离的对映异构体的绝对立体化学未确定的化合物表示为单一对映异构体中的任一种，例如(1S,2S,3R,5R)或(1R,2R,3S,5S)，或绘制为可能的单一对映异构体。在这种情况下，产物是纯的，并且是单一对映体，但是没有鉴定绝对立体化学，但是相对立体化学是已知的并且被指出。
实施例1:制备6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮和6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮(化合物1A和1B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和n-BuOH(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备1-(5-溴-2,4-二羟基苯基)乙烯酮。
向2000mL三颈圆底烧瓶中加入2,4-二羟基苯乙酮(35.00g,230.04mmol)、三溴化四丁基铵(122.01g,253.04mmol)和CHCl3(600mL)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。然后用水(400mL)淬灭反应。分离有机相，将所得水相用2×300mL二氯甲烷萃取。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物进行色谱分离(硅胶:乙酸乙酯/石油醚(20/80))，分离后得到37g的1-(5-溴-2,4-二羟基苯基)乙酮，为白色固体。
步骤5：制备1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]乙烯酮。
向2000mL三颈圆底烧瓶中加入1-(5-溴-2,4-二羟基苯基)乙酮(37g,160.14mmol)、丙酮(500mL)、碳酸钾(35.41g,256.23mmol)和溴甲基甲醚(25.81g,208.19mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将固体过滤，然后浓缩滤液。将所得残余物与400mL H2O混合，并用2×500mL二氯甲烷萃取。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并进行色谱分离(硅胶柱:石油醚/乙酸乙酯(20/1)，分离后得到约30g 1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]乙酮，为白色固体。
步骤6：制备1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]丁烷-1,3-二酮。
向1000mL三颈圆底烧瓶中加入1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]乙酮(28g,101.78mmol)，四氢呋喃(300mL)。在干燥氮气气氛下，在0℃下，在搅拌下向混合物中分批加入氢化钠(9.77g,407.13mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1小时，随后加入无水乙酸乙酯(17.94g,203.57mmol)。加入乙酸乙酯后，移开冷却浴，然后将所得混合物搅拌2小时。然后通过添加100mL水来小心地淬灭反应。用2×200mL乙酸乙酯萃取所得混合物，将有机相合并，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，直接得到约25g 1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]丁烷-1,3-二酮，为淡黄色固体。
步骤7：制备6-溴-7-羟基-2-甲基色烯-4-酮。
向1000mL圆底烧瓶中加入1-[5-溴-2-羟基-4-(甲氧基甲氧基)苯基]丁烷-1,3-二酮(25g,78.83mmol)、Amberlyst-15(20.00g)、i-PrOH(300mL)。将所得混合物置于预热的油浴中，回流搅拌2小时。将反应从热源移开，使其冷却。过滤固体并用3×200mL MeOH洗涤。合并滤液并浓缩，得到残余物，其在干燥时固化。残余物通过从甲醇(～200mL)结晶来纯化，分离后得到15g 6-溴-7-羟基-2-甲基色烯-4-酮，为灰色固体。
步骤8：制备6-溴-7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基色烯-4-酮。
向用氮气吹扫的500mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-7-羟基-2-甲基色烯-4-酮(15g,58.81mmol,1.00)、四氢呋喃(150mL)和二甲基甲酰胺(15mL)。将混合物冷却至0℃，然后在氮气氛下小心地分批加入氢化钠(2.12g,88.21mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1小时，随后加入甲氧基甲基溴(11.02g,88.212mmol)。移开冷却浴，然后将所得混合物在环境温度下再搅拌1小时。加入水(100mL)来淬灭反应，将所得溶液用2×200mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物固化，通过从乙酸乙酯/石油醚(4:1)重结晶来纯化，分离后得到15g(85.27％)6-溴-7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基色烯-4-酮，为淡粉色固体。
步骤9：制备7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)色烯-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的100mL圆底烧瓶中，加入6-溴-7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基色烯-4-酮(3.00g,10.03mmol)、二噁烷(30mL)、4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(3.06g,12.035mmol)、1,1-双(二苯基膦)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(0.37g,0.501mmol)和乙酸钾(1.97g,20.06mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在100℃下搅拌12小时。将反应从热源移开，冷却，然后加入50mL水淬灭反应。将所得混合物用3×50mL乙酸乙酯萃取，合并有机层。用1×50mL盐水洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/石油醚(0-80％梯度)纯化，分离后得到0.8g(23.04％)7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)色烯-4-酮，为黄色固体。
步骤10：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-4-氧代-4H-色烯-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-4-氧代)-4H-色烯-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的8mL小瓶中加入异构体1(150mg,0.391mmol)、四氢呋喃(3.00mL)、7-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)色烯-4-酮(406.23mg,1.173mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(251.92mg,1.173mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(22.60mg,0.020mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在氮气下在70℃下搅拌12小时。然后将反应混合物从热源移开，并使其冷却。然后通过添加20mL水来淬灭反应。将所得溶液用3×20mL乙酸乙酯萃取，合并有机层。将所得有机混合物用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/石油醚(0-80％)梯度)纯化，分离后得到80mg(36.8％)INT 10A，为黄色固体。
按照上述工序，但从异构体2(150mg,0.391mmol)开始，分离后得到81mg INT 10B，为黄色固体。
步骤11：制备6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮和6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的8mL圆底烧瓶中加入INT 10A(80.00mg,0.144mmol)和HCl的二噁烷溶液(2.00mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。然后通过添加20mL饱和碳酸氢钠水溶液来淬灭反应。用二氯甲烷(3×20mL)萃取所得混合物，合并有机层。然后用饱和盐水(20ml)洗涤所得混合物。将有机混合物经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速制备型HPLC(柱，C18流动相，0.01％ NH4HCO3/H2O:ACN＝20％在30分钟内增加到0.01％NH4HCO3/H2O:ACN＝60％；检测器，254nm，分离后得到25mg化合物1A6，为黄色固体，(ES,m/z)[M+H]+＝412.20.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.91-8.80(m,1H),8.53(s,1H),7.10(s,1H),6.40-5.91(m,1H),5.30(d,J＝15.5Hz,1H),4.75(dd,J＝49.2,7.7Hz,1H),3.66(s,2H),3.18-2.92(m,3H),2.33(d,J＝31.4Hz,3H),2.11(d,J＝10.2Hz,1H),1.85-1.72(m,4H),1.34(s,1H)。
按照上述工序，但从INT 10B开始，得到25mg化合物1B，为黄色固体(ES,m/z)[M+H]+＝412.20。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.85(d,J＝8.9Hz,1H),8.53(s,1H),7.11(s,1H),6.39-5.93(m,1H),5.34-4.90(m,1H),4.86-4.55(m,1H),3.61(d,J＝28.7Hz,2H),3.19-2.92(m,3H),2.33(d,J＝31.8Hz,3H),2.23(s,1H),1.88-1.50(m,4H),1.29(d,J＝29.6Hz,1H)。
实施例2:制备6-(6-[[(1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基]-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1-酮和6-(6-[[(1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基]-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1-酮(化合物2A和2B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和n-BuOH(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备4-溴-3-甲氧基-N-甲基苯甲酰肼。
在氮气下，在0℃下，向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入4-溴-3-甲氧基苯甲酸(15.00g,65mmol)、甲基肼(11.96g,260mmol)、DMF(150mL)、EDCI(14.93g,78mmol)和HOBT(10.53g,78mmol)。将所得溶液在氮气下搅拌4小时，并使其达到室温。然后用300mL水淬灭反应。将混合物用3×200mL乙酸乙酯萃取。合并有机层，用3×500mL饱和盐水洗涤。然后经无水硫酸钠干燥混合物并浓缩。通过快速制备型HPLC(IntelFlash-1:柱：C18柱；流动相A：水(10MMOL/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：80mL/min；梯度：25分钟内从20B到80B),得到12.0g淡黄色油状物的4-溴-3-甲氧基-N-甲基苯甲酰肼。
步骤5：制备4-溴-3-甲氧基-N-甲基-N'-亚甲基苯甲酰肼。
在氮气下，向氮气吹扫的250mL三颈圆底烧瓶中加入4-溴-3-甲氧基-N-甲基苯甲酰肼(12.00g,46mmol)、羟基亚甲基(1.67g,0.055mmol)和甲苯(150mL)。将所得混合物置于120℃的预热的油浴中，搅拌16小时。将反应混合物从热源移开，在水/冰浴中冷却。然后将混合物浓缩成残余物并进行色谱分离(硅胶柱:乙酸乙酯/石油醚(1:3))，得到12g(95.57％)4-溴-3-甲氧基-N-甲基-N’-亚甲基苯甲酰肼，为白色固体。
步骤6：制备6-溴-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1-酮。
将4-溴-3-甲氧基-N-甲基-N(10g,36.89mmol)、醌(5.98g,55.33mmol)、乙酸钯(0.83g,3.69mmol)和乙酸(200mL)放入用干燥氮气吹扫的500mL三颈圆底烧瓶中。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌12小时。将反应混合物从热源移开，用水/冰浴冷却。浓缩所得混合物，用NaHCO3将残余物的pH调节至8。用3×150mL乙酸乙酯萃取所得混合物，合并有机层，经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤、浓缩并纯化(硅胶∶乙酸乙酯/石油醚(1:3))，得到6g(60.45％)6-溴-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1-酮，为淡黄色固体。
步骤7：制备7-甲氧基-2-甲基-1-氧代酞嗪-6-基硼酸。
向用干燥氮气吹扫的500mL三颈圆底烧瓶中放入将6-溴-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1-酮(6g,22mmol)、4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(8.5g,33mmol)、1,1-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(0.91g,1mmol)、乙酸钾(4.38g,44mmol)和二噁烷(120mL)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在氮气下在100℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，在水/冰浴中冷却。将所得混合物浓缩并在硅胶上色谱分离(1:2乙酸乙酯/石油醚)。分离出固体残余物，用乙醚-石油醚重结晶，分离后得到3.5g 7-甲氧基-2-甲基-1-氧代酞嗪-6-基硼酸，为白色固体。
步骤8：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(7-甲氧基-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢酞嗪-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(7-甲氧基-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢酞嗪-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气吹扫的40mL密封管中放入异构体1(150mg,0.391mmol)、7-甲氧基-2-甲基-1-氧代酞嗪-6-基硼酸(183.1mg,0.782mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(22.6mg,0.02mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(168mg,0.782mmol)和四氢呋喃(3.00mL)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在氮气下在70℃下搅拌3小时。将反应混合物从热源移开，在水/冰浴中冷却。将粗反应物浓缩并直接通过快速制备型HPLC((IntelFlash-1)纯化：柱：C18柱；流动相A：水(10MMOL/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：80mL/min；梯度：25分钟内从20B到70B),得到100mg呈黄色固体的INT 8A。
按照上述工序，但从异构体2(150mg,0.391mmol)开始，得到100mg(48.64％)呈黄色固体的INT 8B。
步骤9：制备6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1(2H)-酮和6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基酞嗪-1(2H)-酮(化合物2A和2B)。
将INT 8A(120mg，0.228mmol)放入用氮气吹扫的40mL密封管中，与二氯甲烷(5mL)合并并搅拌。在0℃下滴加三溴化硼(3mL)，将所得溶液在室温下搅拌2小时。然后通过加入100mL饱和碳酸氢钠来淬灭反应。将所得溶液用4×150mL二氯甲烷/乙腈(10:1)萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩。将粗产物通过快速制备型HPLC((IntelFlash-1):Kinetex EVO C18柱，21.2*150,5um；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：30分钟内5B到50B；254/220nm)，分离后得到46.9mg呈黄色固体的化合物2A(ES,m/z):[M+H]+＝412.2.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 13.21(s,1H),8.90(s,1H),8.86(s,1H),8.47(s,1H),7.65(s,1H),4.97-4.80(m,1H),4.76-4.63(m,1H),3.71(s,3H),3.64-3.56(m,2H),3.18(s,3H),2.33-2.25(m,1H),1.81-1.60(m,5H)。
按照上述工序，但从INT 8B开始，得到21.1mg(16.95％)化合物2B，为黄色固体(ES，m/z):[M+H]+＝412.2.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 13.23(s,1H),8.91(s,1H),8.86(s,1H),8.47(s,1H),7.65(s,1H),4.99-4.82(m,1H),4.78-4.61(m,1H),3.71(s,3H),3.64-3.55(m,2H),3.18(s,3H),2.31-2.25(m,1H),1.81-1.58(m,5H)。
实施例3:制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮(化合物3A和3B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和正丁醇(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯。
向1000mL三颈圆底烧瓶中加入4-溴-5-氟-2-硝基苯甲酸甲酯(60.00g,215.8mmol)、甲醇(600mL)和叔丁醇钾(29.06g,258.974mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。然后浓缩混合物，用水(300mL)洗涤，用二氯甲烷(2×200mL)萃取，合并有机层，然后浓缩，分离后得到59g(94.25％)呈固体的4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯。
步骤5：制备2-氨基-4-溴-5-甲氧基苯甲酸甲酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的1000mL三颈圆底烧瓶中加入4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯(59.00g,203.4mmol)、乙醇、水、乙酸和锌金属粉末(26.61g,406.8mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在60℃下搅拌3小时，然后移开热源，使其冷却。将所得溶液在60℃下搅拌3小时。将混合物从热源移开，冷却，过滤。浓缩所得滤液，用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)洗涤，然后用二氯甲烷(3×300mL)萃取。合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成固体，分离后得到呈固体的40g(75.61％)2-氨基-4-溴-5-甲氧基苯甲酸甲酯，直接用于下一步反应。
步骤6：制备7-溴-6-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的1000mL三颈圆底烧瓶中加入2-氨基-4-溴-5-甲氧基苯甲酸甲酯(34.00g,130.725mmol)、乙醇(340.00mL)、乙酸；和甲脒(13.61g,130.728mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在80℃下搅拌3小时，然后移开热源，使其冷却。然后用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)小心地淬灭反应。将所得混合物浓缩，然后用二氯甲烷(3×200mL)萃取。合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，分离后得到32g(95.97％)呈固体的7-溴-6-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮，直接用于下一步反应。
步骤7：制备7-溴-6-甲氧基-3-甲基喹唑啉-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的250mL三颈圆底烧瓶中加入二甲基甲酰胺(50mL)和氢化钠(0.56g,23.523mmol)。将混合物冷却至0℃，随后在℃加入7-溴-6-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(5g,19.602mmol)。将混合物搅拌30分钟，随后加入碘甲烷(2.78g,19.586mmol)。移开冷却浴，将混合物在室温下再搅拌2小时。用冰/水(30mL)小心地淬灭反应。将混合物用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。用饱和盐水(3×50mL)洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，分离后得到4g(75.83％)呈固体的7-溴-6-甲氧基-3-甲基喹唑啉-4-酮，直接用于下一步反应。
步骤8：制备6-甲氧基-3-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)喹唑啉-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的40mL小瓶中，加入7-溴-6-甲氧基-3-甲基喹唑啉-4-酮(1.20g,4.459mmol)、4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(1.36g,5.351mmol)、1,1-双(二苯基膦基)二茂铁-钯(II)二氯二氯甲烷络合物(0.16g,0.219mmol)、乙酸钾(0.88g,8.919mmol)和二噁烷(10mL)将所得混合物置于预热的油浴中，并在100℃下搅拌12小时。将反应从热源移开，冷却，并在真空下浓缩。粗将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/石油醚(1:3))纯化，分离后得到400mg(28.37％)呈固体的6-甲氧基-3-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)喹唑啉-4-酮。
步骤9：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基-3-甲基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基-3-甲基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的8mL小瓶中加入异构体1(120mg,0.313mmol)、3-甲基水杨酸铜(167.95mg,0.782mmol)、6-甲氧基-3-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)喹唑啉-4-酮(197.86mg,0.626mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(18.08mg,0.016mmol)和四氢呋喃(1.20mL)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在氮气下在60℃下搅拌2小时。浓缩所得混合物，将粗产物通过快速制备型HPLC((IntelFlash-1)纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN/5MMNH4CO3＝0.2，在15分钟内增加到ACN/5MMNH4CO3＝1；检测器，254nm)，分离后得到120mg(72.96％)呈固体的INT 9A。
按照上述工序，但从异构体2(120mg,0.313mmol)开始，分离后得到86mg(52.29％)的INT 9B，为黄色固体。
步骤10：制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-3-甲基喹唑啉-4(3H)-酮(化合物3A和3B)。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的25mL圆底烧瓶中加入INT 9A(110.00mg,0.209mmol)、二氯甲烷(2.00mL)，并滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(2.00mL)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。然后通过添加2mL NaHCO3水溶液来淬灭反应。将混合物用二氯甲烷(3×10mL)萃取，合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过快速制备型HPLC((IntelFlash-1)纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN/5MMNH4CO3＝0.1，在20分钟内增加到ACN/5MMNH4CO3＝0.5；检测器，254nm)，分离后得到31.9mg(37.05％)呈固体的化合物3A(ES,m/z):[M+H]+＝412。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),8.87(s,1H),8.44(s,1H),8.24(s,1H),7.57(s,1H),4.91(d,J＝30.9Hz,1H),4.69(d,J＝52.3Hz,1H),3.54(s,2H),3.50(s,3H),3.17(d,J＝1.7Hz,3H),2.28(t,J＝11.3Hz,1H),1.85-1.51(m,6H)。
按照上述工序，但从INT 9B开始，得到29.3mg(43.52％)化合物3B，为黄色固体(ES,m/z)[M+H]+＝412。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),8.87(s,1H),8.44(s,1H),8.24(s,1H),7.57(s,1H),4.91(d,J＝30.9Hz,1H),4.69(d,J＝52.3Hz,1H),3.54(s,2H),3.50(s,3H),3.17(d,J＝1.7Hz,3H),2.28(t,J＝11.3Hz,1H),1.91-1.50(m,6H)。
实施例4:制备6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮和6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮(化合物4A和4B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和正丁醇(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备4-溴-3-甲氧基-N-(新戊酰氧基)苯甲酰胺。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入4-溴-3-甲氧基苯甲酸(20.00g,86.563mmol)、二甲基甲酰胺(100.02mL)、二异丙基乙胺(89.50g,692.506mmol)、丙膦酸酐(41.31g,129.8mmol)和邻新戊酰基羟胺(15.21g,129.845mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。然后用水淬灭反应。将所得混合物用乙酸乙酯(5×300mL)萃取。合并有机物，经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩至干。粗产物用制备型HPLC纯化，分离后得到9.7g(33.94％)4-溴-3-甲氧基-N-(新戊酰氧基)苯甲酰胺，为棕色油状物(ES,m/z)：[M+H]+＝330.1.
步骤5：制备6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的250mL三颈圆底烧瓶中，加入4-溴-3-甲氧基-N-(新戊酰氧基)苯甲酰胺(9.00g,27.258mmol)、甲醇(100.00mL)、五甲基环戊二烯基二氯化铑(0.17g,0.273mmol)、乙酸乙烯酯(3.52g,40.887mmol)和乙酸铯(1.57g,8.177mmol)。将所得混合物置于45C的预热的油浴中，搅拌16小时，然后移开热源，使其冷却。真空浓缩所得混合物，得到固体。通过从MTBE重结晶来纯化粗产物。过滤收集固体，真空干燥，得到5.3g(76.53％)6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮，为灰白色固体(ES,m/z):[M+H]+＝254.0.
步骤6：制备6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的100mL三颈圆底烧瓶中加入四氢呋喃(30.00mL,370.290mmol)和6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(2.60g,10.233mmol)。将混合物在冰/水浴中冷却，然后加入氢化钠(0.61g,25.419mmol)。然后加入碘甲烷(2.18g,15.350mmol)，并将所得溶液在0℃下再搅拌1小时。然后通过加入50mL水/冰来淬灭反应。用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物，合并有机物，经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩至干。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/石油醚)纯化，分离后得到2.2g(80.19％)6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮，为白色固体。
步骤7：制备7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基硼酸。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的100mL三颈圆底烧瓶中加入双(频哪醇根合)二硼(2.73g,10.742mmol)、6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮(2.40g,8.952mmol)、1,1-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(0.33g,0.448mmol,0.05)、二噁烷(30mL)和乙酸钾(1.76g,17.903mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在100℃下搅拌2小时，然后移开热源，使其冷却。将混合物浓缩，通过制备型HPLC纯化，分离后得到950mg(45.54％)7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基硼酸，为灰白色固体。
步骤8：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(7-甲氧基-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(7-甲氧基-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的8mL小瓶中加入异构体1(120mg,0.313mmol)、7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基硼酸(145.84mg,0.626mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(147.79mg,0.689mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(18.08mg,0.016mmol)、四氢呋喃(2mL)。将所得混合物置于70℃的预热的油浴中，并搅拌2小时，然后移开热源，使其冷却。将混合物通过制备型HPLC纯化，分离后得到111mg(67.62％)INT 8A，为黄色固体(ES，m/z):[M+H]+＝525.3.
按照上述工序，但从异构体2(120mg,0.313mmol)开始，分离后得到112mg(68.23％)的INT 8B，为黄色固体。
步骤9：制备6-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮和6-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的8mL小瓶中加入INT 8A(111.00mg,0.212mmol)、二氯甲烷(1mL)和三溴化硼(1.00mL,10.578mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时。然后通过添加水/冰来淬灭反应。用饱和碳酸氢钠水溶液将溶液的pH调节至8。用二氯甲烷(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机物，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩至干，得到残余物。粗产物通过制备型HPLC纯化，分离后得到51.3mg化合物4A(ES,m/z):[M+H]+＝411.2.1HNMR(300MHz,氯仿-d)δ12.34(s,1H),8.49(s,1H),8.40(d,J＝0.9Hz,1H),8.06(s,1H),6.98-6.90(m,1H),6.53(d,J＝7.3Hz,1H),5.44-5.18(m,1H),4.74(d,J＝51.9Hz,1H),3.77(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,3H),3.27-3.15(m,3H),2.36-2.21(m,1H),2.15-1.97(m,2H),1.92-1.81(m,2H)。
按照上述工序，但从INT 8B(112.00mg,0.213mmol)开始，得到29.3mg化合物4B，为黄色固体(ES，m/z):[M+H]+＝411.2。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ12.34(s,1H),8.50(s,1H),8.40(s,1H),8.06(s,1H),6.94(d,J＝7.3Hz,1H),6.53(d,J＝7.4Hz,1H),5.32(d,J＝37.0Hz,1H),4.74(d,J＝51.6Hz,1H),3.77(s,2H),3.62(s,3H),3.22(d,J＝1.6Hz,3H),2.36-2.21(m,1H),2.06(d,J＝6.8Hz,2H),1.91-1.80(m,2H)。
实施例5:制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇(化合物5A和5B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和正丁醇(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备1-(3-溴-4-甲氧基苯基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)甲亚胺。
向500mL三颈圆底烧瓶中加入3-溴-4-甲氧基苯甲醛(25g,116.000mmol)、甲苯(250mL)和2,2-二甲氧基乙-1-胺(19mL,174.1mmol,1.50)。在反应烧瓶上安装Dean-Stark分水器，将混合物置于120℃的预热的油浴中，搅拌6小时，移开热源，使其冷却。然后将所得混合物在真空下浓缩至恒重，分离后得到37g 1-(3-溴-4-甲氧基苯基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)甲亚胺，其直接用于下一步m/z:302(M+H+)。
步骤5：制备7-溴-6-甲氧基异喹啉。
向1000mL的1颈圆底烧瓶中加入1-(3-溴-4-甲氧基苯基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)甲亚胺(37g,122.45mmol)、四氢呋喃(370mL)。然后将混合物冷却至0℃，滴加氯甲酸异丙酯(15.01g,122.45mmol)。搅拌5分钟后，加入亚磷酸三乙酯(24.42g,146.970mmol)并将混合物搅拌20分钟，然后移开冷却浴。然后将所得混合物在室温下搅拌18小时。然后除去溶剂，将剩余的残余物与100mL甲苯共沸。向所得混合物中加入四氯化钛(94.16g)和氯仿(375mL)，将混合物加热回流48小时。将混合物从热源移开，然后倒在冰/水上。然后用氢氧化铵将pH调节至9。用乙酸乙酯(4×200mL)萃取反应混合物。合并有机物，减压浓缩至干，用硅胶柱(乙酸乙酯:石油醚3:7)纯化，分离后得到6.1g 7-溴-6-甲氧基异喹啉固体。m/z:238(M+H+)。
步骤6：制备6-甲氧基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的40mL小瓶中加入7-溴-6-甲氧基异喹啉(1.50g,6.3mmol)、双(频哪醇根合)二硼(1.92g,7.561mmol)、1,1-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(0.51g,0.625mmol)、乙酸钾(1.24g,12.635mmol)和二噁烷(30mL,354.123mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在100℃下搅拌4小时，然后移开热源，使其冷却。将所得混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释，通过硅藻土垫过滤，减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 9:1)纯化，得到红棕色固体，其通过制备型HPLC进一步纯化(C18；流动相：NH4HCO3(水溶液)/MeCN；梯度：30分钟内10％ B到50％ B；检测器：254nm)，分离后得到1.4g呈固体的6-甲氧基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉，m/z:286(M+H+)。
步骤7：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基异喹啉-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基异喹啉-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的40mL小瓶中加入异构体1(300mg,0.782mmol)、6-甲氧基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉(670mg,2.35mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(135mg,0.117mmol,0.15)、3-甲基水杨酸铜(I)(504mg,2.348mmol)和四氢呋喃(7.50mL)。将所得混合物置于70℃的预热的油浴中，并搅拌12小时，然后移开热源，使其冷却。用CH2Cl2稀释所得混合物(100mL)。将所得混合物用3×25mL氢氧化铵(10％)和50mL盐水洗涤。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:100％)纯化，分离后得到278mgINT 7A，为淡黄色固体。m/z:495(M+H+)。
按照上述工序，但从异构体2(350mg,0.913mmol)开始，分离后得到350mgINT 7B，为黄色固体，m/z:495(M+H+)。
步骤8：制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)异喹啉-6-醇(化合物5A和5B)。
将INT 7A(150mg,0.303mmol)、二氯甲烷(5mL,78.65mmol)和三溴化硼(759.82mg,3.033mmol)放入100mL圆底烧瓶中。将所得溶液在室温下搅拌4小时，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭至最终pH为9。将混合物用二氯甲烷(3×50mL)萃取，合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。将粗产物通过快速制备型HPLC(IntelFlash-1)纯化：柱：C18；流动相：NH4HCO3(水溶液)/MeCN；梯度：30分钟内10％ B到50％ B；检测器254nm，分离后得到30mg化合物5A，为黄色固体(ES，m/z):[M+1]+＝381.2.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm12.96(s,1H),9.31(d,J＝1.1Hz,1H),8.99(s,1H),8.87(s,1H),8.39(d,J＝5.8Hz,1H),7.66(d,J＝5.9Hz,1H),7.38(s,1H),4.94(d,J＝24.8Hz,1H),4.70(d,J＝52.0Hz,1H),3.55(s,2H),3.18(d,J＝1.7Hz,3H),2.35-2.19(m,1H),1.87-1.52(m,5H)。
按照上述工序，但从INT 7B(150mg,0.303mmol)开始，得到25mg化合物5B，为黄色固体(ES，m/z):[M+1]+＝381.2.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm12.96(s,1H),9.31(d,J＝1.1Hz,1H),8.99(s,1H),8.87(s,1H),8.39(d,J＝5.8Hz,1H),7.66(d,J＝5.9Hz,1H),7.38(s,1H),4.94(d,J＝24.8Hz,1H),4.70(d,J＝52.0Hz,1H),3.55(s,2H),3.18(d,J＝1.7Hz,3H),2.35-2.19(m,1H),1.87-1.52(m,5H)。
实施例6:制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮(化合物6A和6B)。
步骤1：制备外消旋(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入6-溴-3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪(24.00g,116.5mmol)、(1S,2R,3R,5R)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-3-氨基-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物(43.0g,176mmol)、DIEA(60mL,344.5mmol)和正丁醇(360mL)。将所得溶液置于预热的油浴中，在氮气下在120℃下搅拌2小时。将反应混合物从热源移开，冷却至室温，用水(700mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将有机层合并，用盐水(250mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。过滤混合物，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(4:1)纯化，得到(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，为黄色固体(24g,55.8％)[M+H]+＝370。
步骤2：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯、(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物。
在氮气下，向1000mL三颈圆底烧瓶中加入(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g,56.84mmol)和二甲基甲酰胺(420mL)。将所得混合物冷却至0℃，随后在氮气下分批加入氢化钠(4.54g,113.51mmol,60％)，将内部温度保持在0℃。移开冷却浴，将混合物再搅拌0.5小时，并在氮气下使其达到室温。在室温下搅拌下滴加碘甲烷(7.20mL,115.66mmol)。将所得混合物在室温下再搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用水(1L)淬灭。用乙酸乙酯(3×250mL)萃取所得混合物。用水(2×250mL)和饱和盐水(250mL)洗涤合并的有机层，然后经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压浓缩滤液，通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2/EtOAc(19:1))纯化，得到17g(78％)(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为外消旋黄色固体，[M+H]+＝384。
步骤3：(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的手性分离。
将(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-(甲基(3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(11.00g,28.684mmol)的外消旋混合物通过Prep-SFC纯化为单独的异构体。使用以下条件(柱：CHIRALPAK IG，2*25cm，5um流动相A：CO2，流动相B：EtOH-HPLC；流速：40mL/min；梯度：50％ B；250nm；RT1:3.99分钟；RT2:6.19分钟；进样量：4ml；运行次数:80；)得到呈黄色固体的异构体1(5.0g)和呈黄色固体的异构体2(5.2g)。
步骤4：制备1-(4-溴-2,5-二甲氧基苯基)乙-1-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的1000mL三颈圆底烧瓶中加入2-溴-1,4-二甲氧基苯(60g,276.419mmol)、二氯甲烷(500mL,7865.023mmol)和无水氯化铝(55.29g,414.628mmol)。将反应混合物冷却至0℃，然后在10分钟内滴加乙酰氯(29.59mL,414.637mmol)。然后移开冷却浴，将所得溶液在室温下搅拌2小时。然后通过缓慢加入200mL水/冰小心地淬灭反应混合物。用二氯甲烷(3×300mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，分离后得到45g粗制1-(4-溴-2,5-二甲氧基苯基)乙-1-酮，为黄色固体(m/z:259(M+H+))，其直接用于下一步。
步骤5：制备1-(4-溴-2,5-二羟基苯基)乙-1-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的1000mL三颈圆底烧瓶中放入1-(4-溴-2,5-二甲氧基苯基)乙酮(45g,173.679mmol)和二氯甲烷(300mL)，然后将其冷却至0℃，接着在搅拌下滴加三溴化硼(1M，在二氯甲烷中，694mL,694mmol)，同时保持内部温度为0℃。然后移开冷却浴，将所得溶液在室温下搅拌过夜。然后将混合物冷却至0℃，然后通过缓慢加入200mL水/冰小心淬灭。用二氯甲烷(3×300mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到16g 1-(4-溴-2,5-二羟基苯基)乙-1-酮，为黄色固体(m/z:231(M+H+))，其直接用于下一步。
步骤6：制备1-(4-溴-2-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯基)乙-1-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入1-(4-溴-2,5-二羟基苯基)乙-1-酮(16g,69.251mmol)、碳酸钾(19.14g,138.489mmol)和丙酮(150mL)。然后将混合物冷却至0℃，随后滴加溴(甲氧基)甲烷(8.65g,69.251mmol)。移开冷却浴，将所得混合物在室温下搅拌2小时。过滤混合物并真空浓缩，分离后得到15g 1-(4-溴-2-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯基)乙-1-酮，为黄色固体，m/z:275(M+H+)，其直接用于下一步。
步骤7：制备7-溴-2-羟基-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基色满-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入1-(4-溴-2-羟基-5-(甲氧基甲氧基)苯基)乙-1-酮(15g,54.526mmol)、四氢呋喃(200mL,2468.598mmol)和氢化钠(5.23g,218.1mmol,4.00)。将混合物冷却至0℃，然后滴加无水乙酸乙酯(9.61g,109.074mmol)。移开冷却浴，将混合物在室温下搅拌2小时。然后用50mL水/冰小心地淬灭混合物。然后将混合物用乙酸乙酯(2×200mL)萃取，合并有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到12g 7-溴-2-羟基-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基苯并色满-4-酮，为黄色固体，m/z:317(M+H+)，其直接用于下一步。
步骤8：制备7-溴-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入7-溴-2-羟基-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基苯并色满-4-酮(12g)、丙-2-醇(100mL)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在65℃下搅拌，随后滴加Amberlyst-15(15g)。将所得混合物在65C下再搅拌2小时，然后移开热源，使其冷却。过滤混合物，将所得滤液在真空下浓缩至干，分离后得到9g 7-溴-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体，m/z:255(M+H+)，其直接用于下一步。
步骤9：制备7-溴-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-4H-色烯-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的500mL三颈圆底烧瓶中加入7-溴-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮(9.00g,35.285mmol)、四氢呋喃(100mL)。将混合物冷却至0℃,随后在0℃下分批加入氢化钠(1.69g,70.423mmol)。向混合物中滴加甲氧基甲基溴(8.82g,70.57mmol)，之后移除冷却浴，并将所得混合物在室温下搅拌2小时。然后通过添加50mL水/冰来淬灭反应。用乙酸乙酯(3×200mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到7g 7-溴-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体，m/z:299(M+H+)，其直接用于下一步。
步骤10：制备6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-4H-色烯-4-酮。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的250mL三颈圆底烧瓶中加入7-溴-6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-4H-色烯-4-酮(5.00g,16.716mmol)、双(频哪醇根合)二硼(8.49g,33.433mmol)、1,1-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(1.22g,1.667mmol)、二噁烷(100mL)和乙酸钾(3.28g,33.421mmol)。将所得混合物置于预热的油浴中，并在100℃下搅拌2小时，然后移开热源，使其冷却。将所得溶液用乙酸乙酯(500mL)稀释并用水(3×50)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，然后真空浓缩至干。将残余物在硅胶[(乙酸乙酯/己烷：1:1)上通过快速制备型HPLC(IntelFlash-1)上进行色谱分离:柱：C18；流动相：ACN(50％)，H2O；检测器：254nm]，分离后得到2g 6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-4H-色烯-4-酮，为黄色固体。m/z:265(M+H+)。
步骤11：制备(1S,2R,3R,5R)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基-2-甲基-4-氧代-4H-色烯-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-((3-(6-甲氧基-2-甲基-4-氧代-4H-色烯-7-基)-1,2,4-三嗪-6-基)(甲基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的40mL圆底烧瓶中放入异构体1(150mg,0.391mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(250.74mg,1.173mmol)、6-(甲氧基甲氧基)-2-甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-4H-色烯-4-酮(309.83mg,1.173mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(45.20mg,0.039mmol)和四氢呋喃(10mL)。将所得混合物置于70℃的预热的油浴中，并搅拌2小时，然后移开热源，使其冷却。将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用水(3×30)洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，用制备型HPLC纯化，分离后得到60mgINT 11A，为黄色固体，m/z:556(M+H+)。
按照上述工序，但从异构体2(150mg,0.391mmol)开始，分离后得到61mgINT 11B，为黄色固体，m/z:556(M+H+)。
步骤12：制备7-(6-(((1S,2S,3R,5R)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮和7-(6-(((1R,2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)(甲基)氨基)-1,2,4-三嗪-3-基)-6-羟基-2-甲基-4H-色烯-4-酮(化合物6A和6B)。
向用干燥氮气吹扫并保持的100mL三颈圆底烧瓶中加入INT 11A(100mg,0.180mmol)、二氯甲烷(5mL)和HCl(4M，在1,4-二噁烷中，5mL)。将混合物在室温下搅拌2小时。然后用碳酸氢钠水溶液(1M)将混合物的pH调节至9。用二氯甲烷(3×30mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。将粗产物通过快速制备型HPLC(IntelFlash-1)纯化：柱：C18柱；流动相：NH4HCO3(水溶液)/MeCN；梯度：30分钟内10％ B到50％ B；检测器254nm，分离后得到10.6mg化合物6A，为黄色固体(ES，m/z):[M+1]+＝412.2 1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 12.46(s,1H),8.86(s,1H),8.28(s,1H),7.43(s,1H),6.23(s,1H),5.03-4.80(m,1H),4.68(d,J＝52.1Hz,1H),3.54(s,2H),3.17(d,J＝1.7Hz,3H),2.41(d,J＝0.7Hz,3H),2.28(d,J＝25.2Hz,1H),1.87-1.50(m,5H)。
按照上述工序，但从INT 11B(100mg,0.180mmol)开始，得到29.3mg化合物6B，为黄色固体(ES，m/z):[M+H]+＝412.2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm 12.46(s,1H),8.86(s,1H),8.28(s,1H),7.43(s,1H),6.23(s,1H),5.03-4.80(m,1H),4.68(d,J＝52.1Hz,1H),3.54(s,2H),3.17(d,J＝1.7Hz,3H),2.41(d,J＝0.7Hz,3H),2.28(d,J＝25.2Hz,1H),1.87-1.50(m,5H)。
实施例7.制备4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1-酮(化合物66)。
步骤1：制备2,2-二甲基丙酸(叔丁氧基羰基)氨基酯。
向10L四颈圆底烧瓶中加入N-羟基氨基甲酸叔丁酯(250.00g,1877.6mmol)和ACN(5L)。然后滴加新戊酸酐(384.68g,2065.4mmol)，并将所得混合物加热回流过夜。使反应冷却至环境温度，然后在真空下浓缩。将残余物在EtOAc(7L)和饱和碳酸氢钠水溶液(5L)之间分配。分离有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×2l)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到350g(85.8％)2,2-二甲基丙酸(叔丁氧基羰基)氨基酯，为灰白色固体。
步骤2：制备三氟甲磺酸[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]氮鎓。
在10L四颈圆底烧瓶中，在0℃下，向乙醚(7.0L)中的2,2-二甲基丙酸(叔丁氧基羰基)氨基酯(350.00g,1610.9mmol)中加入2,2,2-三氟乙烷磺酸(241.75g,1610.9mmol)(注意到气体的剧烈放出)。将反应混合物在0℃下搅拌5分钟，然后将其温热至室温。1小时后，加入己烷(3L)，将混合物搅拌10分钟。过滤所得固体，用己烷(3×1L)洗涤，并在真空烘箱中干燥，得到300g(69.69％)三氟甲磺酸[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]氮鎓，为灰白色固体。
步骤3:4-溴-3-甲氧基苯甲酰氯的制备。
在5L四颈圆底烧瓶中，在环境温度和氮气气氛下，向搅拌的4-溴-3-甲氧基苯甲酸(300g,1298.4mmol)在DCM(3L)和DMF(30.15mL,389.5mmol)的悬浮液中滴加草酰氯(197.77g,1558.1mmol)。将所得溶液在室温下搅拌3小时。将所得混合物减压浓缩。这产生4-溴-3-甲氧基苯甲酰氯(380g,粗)，为灰白色固体，其直接用于下一步。[M+H]+＝248.9。
步骤4：制备2,2-二甲基丙酸溴-3-甲氧基苯基)甲酰胺基酯。
在3L四颈圆底烧瓶中，在0℃下向在EA(500mL)中的三氟甲磺酸[(2,2-二甲基丙酰基)-氧基]氮鎓(152.00g,568.8mmol)中滴加碳酸氢钠(88.00g,1047.5mmol)在水(500mL)中的溶液。搅拌30分钟后，在0℃下滴加4-溴-3-甲氧基苯甲酰氯(120.00g,481mmol)在EA(1.20L)中的溶液。然后将所得混合物在室温下搅拌2小时。分离有机相，将水相用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×500mL)洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EA(5/1)作为洗脱剂)纯化，得到126g(79.6％)2,2-二甲基丙酸(4-溴-3-甲氧基苯基)甲酰胺基酯，为白色固体。[M+H]+＝331.02。
步骤5：制备6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮。
向3L四颈圆底烧瓶中加入2,2-二甲基丙酸(4-溴-3-甲氧基苯基)甲酰胺基酯(250.00g,757.2mmol)、乙酸乙烯酯(99.73g,1158.5mmol)、乙酸铯(45.05g,234.7mmol)、双[(五甲基环戊二烯基)二氯铑](4.68g,7.6mmol)和MeOH(2.5L)。在氮气气氛下，将所得混合物在40℃下搅拌16小时。使混合物冷却至室温。过滤收集沉淀的固体，用冷乙醚(3×1000mL)洗涤。这产生6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(120g,62.38％)，为灰白色固体。[M+H]+＝254.97。
步骤6：制备6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮。
在1L三颈圆底烧瓶中，在0℃和氮气气氛下，向搅拌的6-溴-7-甲氧基-2H-1-酮(120g,472.3mmol)在THF(1.2L)和DMF(0.5L)中的悬浮液中分批加入氢化钠在矿物油(28.71g,717.9mmol)中的60％悬浮液。将所得溶液在0℃下搅拌30分钟。在0℃和氮气气氛下滴加碘甲烷(81.76g,524.2mmol)。将所得溶液温热至室温。1小时后，将反应混合物倒入冷水(2L)中并搅拌15分钟。通过过滤收集沉淀的固体，并用冷水(3×1L)洗涤。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EA(3:1))洗脱进行纯化，得到6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮(102g,85.55％)，为灰白色固体。[M+H]+＝268.
步骤7：制备6-溴-4-氟-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮。
在三颈圆底烧瓶中，在室温下向乙腈(2L)中的6-溴-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮(102g,380.4mmol)中加入selectfluor(134.77g,380.4mmol)。在氮气气氛下，将所得混合物在80℃下搅拌1小时。使混合物冷却至室温。用水(1000ml)淬灭反应。用二氯甲烷(3×1000mL)萃取所得混合物。用盐水(1x1000 mL)洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液减压浓缩至残余物，通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:01)洗脱，得到6-溴-4-氟-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮(30g,27.56％)，为白色固体。[M+H]+＝285.9。
步骤8：制备4-氟-7-甲氧基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮。
将6-溴-4-氟-7-甲氧基-2-甲基异喹啉-1-酮(30g,104.9mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-(四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(53.26g,209.7mmol)、Pd(dppf)Cl2(3.84g,5.243mmol)和乙酸钾(15.44g,157.3mmol)在二噁烷(300mL)中的混合物在100℃下搅拌2小时。冷却至室温后，将所得混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化,用二氯甲烷/甲醇(20:01)洗脱,得到4-氟-7-甲氧基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮(19g,54.39％)，为白色固体。[M+H]+＝334.2.
步骤9：制备(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的40mL三颈圆底烧瓶中加入(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-[甲基[3-(甲基硫烷基)-1,2,4-三嗪-6-基]氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.00g,2.6mmol)、4-氟-7-甲氧基-2-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮(1.74g,5.2mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(1.40g,6.5mmol)、Pd(PPh3)4(0.30g,0.3mmol)和THF(10.00mL)。将所得溶液70℃下搅拌2小时。通过加入30mL的10％重量的氨水来淬灭反应，并过滤固体。将所得溶液用3×50mL二氯甲烷萃取。用50mL盐水洗涤合并的有机相，经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法纯化，条件如下：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.5％ NH4HCO3)，30分钟内25％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这产生(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(800mg，56.54％)，为淡黄色固体。
平行重复该工序13次，得到(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12g)，为黄色固体。在室温下，将在THF(240mL)中的合并的(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12)与巯基官能化的二氧化硅PSB-20(1.2g)混合。在氮气气氛下，将所得混合物在50℃下搅拌0.5小时，冷却至室温过滤，用THF(3×100mL)洗涤，浓缩得到产物。重复该工序8次，将滤液减压浓缩，得到(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12g)，为黄色固体。[M+H]+＝543.1。
步骤10：制备(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-羟基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
在三颈圆底烧瓶中，向在DMF(120mL)中的(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-甲氧基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12g,22.1mmol)中加入甲硫醇钠(7.75g,110.6mmol)。在氮气气氛下，将所得混合物在100℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。使混合物冷却至室温，用水(100mL)淬灭。用乙酸乙酯(3×200mL)萃取水层。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法纯化，条件如下：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN水溶液，30分钟内25％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这产生(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-羟基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(8g,68.44％)，为淡黄色固体。[M+H]+＝529.4。
步骤11：制备4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1-酮(化合物66)。
在室温和氮气气氛下，向搅拌的(2S,3S,5S)-2-氟-3-{[3-(4-氟-7-羟基-2-甲基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(8g)的乙酸乙酯(100mL)溶液中滴加饱和HCl的乙酸乙酯(80mL)溶液。将所得混合物在氮气气氛下在室温下搅拌1.5小时。将所得混合物减压浓缩。用饱和碳酸氢钠水溶液将混合物碱化至pH 8～9。将水层用乙酸乙酯(3×300mL)萃取，减压浓缩。这产生4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基-2-甲基异喹啉-1-酮(化合物66)(5.3g,80.18％)，为淡黄色固体。LC[M+H]+＝429.2。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ12.57(s,1H),8.68(s,1H),8.40(s,1H),8.03(d,J＝2.2Hz,1H),6.90(d,J＝6.1Hz,1H),5.29(dddd,J＝34.3,12.8,5.8,2.8Hz,1H),4.74(dt,J＝51.8,3.4Hz,1H),3.77(s,2H),3.58(s,3H),3.22(d,J＝1.7Hz,3H),2.29(td,J＝12.7,3.2Hz,1H),2.12-1.99(m,2H),1.92-1.79(m,2H),1.77-1.67(m,1H)。
实施例8.制备2-乙基-4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基异喹啉-1-酮(化合物163)。
步骤1：制备6-溴-7-甲氧基-2-乙基异喹啉-1-酮。
在氮气下，在0°℃下，向1L三颈圆底烧瓶中搅拌的6-溴-7-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(245.00g,964.6mmol)在THF(2.5L)和DMF(1L)的悬浮液中分批加入氢化钠(60％，在矿物油中)(57.87g,1446.9mmol)。在0℃下30分钟后，在0℃下滴加碘乙烷(180.57g,1157.5mmol)。将所得溶液温热至环境温度并搅拌1小时将反应混合物倒入冷水(2L)中并搅拌15分钟。通过过滤收集沉淀的固体，并用冷水(3×1L)洗涤。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EA(3:01)洗脱)纯化，得到6-溴-7-甲氧基-2-乙基异喹啉-1-酮(230g,84.56％)，为灰白色固体。
步骤2：制备6-溴-2-乙基-4-氟-7-甲氧基异喹啉-1-酮。
在室温下，向乙腈(4560mL)中的6-溴-2-乙基-7-甲氧基异喹啉-1-酮(230g,815.2mmol)中加入selectfluor(288.80g,815.2mmol)。在氮气下，将所得混合物在80℃下搅拌1小时。冷却至室温后，用水(800mL)淬灭反应。用二氯甲烷(3×1000mL)萃取所得混合物。用盐水(1×1000mL)洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥。过滤并浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:01)洗脱，得到6-溴-2-乙基-4-氟-7-甲氧基异喹啉-1-酮(120g,粗)。将粗产物通过反相快速色谱法纯化，条件如下：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％NH4HCO3)，30分钟内25％至85％梯度；检测器，UV 254nm，得到6-溴-2-乙基-4-氟-7-甲氧基异喹啉-1-酮(75g,30.65％)，为白色固体。[M+H]+＝300.
步骤3：制备得到2-乙基-4-氟-7-甲氧基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮。
将6-溴-2-乙基-4-氟-7-甲氧基异喹啉-1-酮(75g,249.9mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-(四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(126.92g,499.8mmol)、Pd(dppf)Cl2(9.14g,12.5mmol)、乙酸钾(36.79g,374.8mmol)在二噁烷(750mL)中的混合物在100℃下搅拌2小时。冷却后，将所得混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用二氯甲烷/甲醇(20:1)洗脱)纯化，得到2-乙基-4-氟-7-甲氧基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮(65g,74.92％)，为黄色固体。[M+H]+＝348.
步骤4：制备(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
将(1R,2S,3S,5S)-2-氟-3-[甲基[3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-基]氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.00g,2.6mmol)、2-乙基-4-氟-7-甲氧基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异喹啉-1-酮(1.81g,5.2mmol)、3-甲基水杨酸铜(I)(1.40g,6.5mmol)、Pd(PPh3)4(0.30g,0.26mmol)在THF(10mL)中的混合物在70℃和氮气(N)下搅拌2小时.通过加入30mL 10％氨/水淬灭反应，并滤出固体。用3×50mL二氯甲烷萃取所得溶液。将合并的有机相用50mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法纯化，条件如下：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.5％ NH4HCO3)，30分钟内25％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这产生0.80g(55.12％)(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯，为淡黄色固体。
平行重复该工序20次，得到(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(22g)，为黄色固体。在室温下，将在THF(240mL)中的合并的(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(22g,39.55mmol)与巯基官能化的二氧化硅PSB-20(2.2g)混合。将所得混合物在50℃下在氮气下搅拌0.5小时，冷却至室温并过滤，用THF(3×10mL)洗涤滤饼。重复该工序8次，滤液减压浓缩，得到(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21g)，为黄色固体。
[M+H]+＝556.26.
步骤5：制备(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-羟基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。
向在DMF(182mL)中的(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-甲氧基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(20g,35.931mmol)中加入甲硫醇钠(12.59g,179.7mmol)。将所得混合物在100℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。使混合物冷却至室温，用水(200mL)淬灭。用乙酸乙酯(3×200mL)萃取水层。蒸发得到残余物，将残余物通过反相快速色谱法纯化，条件如下：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN水溶液，30分钟内25％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这产生(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-羟基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(15g,76.94％)，为淡黄色固体。[M+H]+＝542.2。
步骤6：制备2-乙基-4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基异喹啉-1-酮(化合物163)。
在室温和氮气下，向搅拌的(2S,3S,5S)-3-{[3-(2-乙基-4-氟-7-羟基-1-氧代异喹啉-6-基)-1,2,4-三嗪-6-基](甲基)氨基}-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(15g)的乙酸乙酯(150mL)溶液中滴加在EA(150mL)中的HCl(气体)。将所得混合物在室温下搅拌1.5小时。将所得混合物减压浓缩。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液碱化至pH 8～9。水层用乙酸乙酯(3×300mL)萃取，减压浓缩。这产生2-乙基-4-氟-6-(6-{[(2R,3S,5S)-2-氟-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基](甲基)氨基}-1,2,4-三嗪-3-基)-7-羟基异喹啉-1-酮(化合物171)(11.6g)，为淡黄色固体。M+H]+＝443.25.1H-NMR(300MHz,氯仿-d)δ12.56(s,1H),8.71(s,1H),8.42(s,1H),8.06(d,J＝2.2Hz,1H),6.91(d,J＝6.2Hz,1H),5.31(dddd,J＝34.3,12.8,5.8,2.8Hz,1H),4.86-4.61(m,1H),4.03(q,J＝7.2Hz,2H),3.78(s,2H),3.22(d,J＝1.6Hz,3H),2.30(td,J＝12.7,3.2Hz,1H),2.06(s,3H),1.93-1.79(m,2H),1.71(dd,J＝12.2,5.3Hz,1H),1.40(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例9.SMN定量剪接测定。
将脊髓性肌萎缩症(SMA)患者成纤维细胞(GM03813,Coriell)以50,000个细胞/孔接种于96孔板中。铺板后立即向细胞给予浓度范围为2.5μM至0.6nM(0.1％ DMSO)的化合物并持续24小时。根据制造商的说明，使用Fast Advanced Cell-to-Ct试剂盒(ThermomkierA35378)对处理过的细胞进行裂解并进行cDNA合成。在qPCR反应中使用2μL的每种cDNA。使用TaqManTM Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher；4444965)与表4所示的引物和探针在384孔板中以10μL体积制备qPCR反应物。反应在具有默认设置的Quant Studio 6qPCR仪器中运行。
表4
实施例10.SMN蛋白测定。
将脊髓性肌萎缩症(SMA)患者成纤维细胞以7,000个细胞/孔接种于96孔板中。加入浓度范围为0.6nM至2.5μM的化合物，孵育48小时，用100μL裂解缓冲液裂解细胞。通过PharmOptima(Michigan)开发的Mesoscale Discovery(MSD)测定，将20μL裂解物用于SMN蛋白测量。在每个MSD板中使用用SMN蛋白制备的1μg/ml至19.5pg/ml的标准曲线，以计算每个样品中的绝对SMN蛋白量。
SMN定量剪接测定和蛋白质测定的结果如下表5所示。
表5-*EC50/IC50范围(nM):0.01≤A≤15；16≤B≤50；51≤C≤100；101≤D≤500；501≤E≤10,000；N/T-未测试。

Claims (54)

1.一种式(I)的化合物：
式(I)
其中所述化合物是：
(a) 式(Ia)的化合物；
式(Ia)；
(b) 式(Ib)的化合物；
式(Ib)；
(c) 式(Ic)的化合物；
式(Ic)；
(d) 式(Id)的化合物；
式(Id)；
(e) 式(Ie)的化合物；
式(Ie)；
(f) 式(If)的化合物；
式(If)；
(g) 式(Ig)的化合物；
式(Ig)；
(h) 式(Ih)的化合物；
式(Ih)；
(i) 式(Ii)的化合物；
式(Ii)；
(j) 式(Ij)的化合物；
式(Ij)；
(k) 式(Ik)的化合物；
式(Ik)；
(l) 式(Il)的化合物；
式(Il)；
(m) 式(Im)的化合物；
式(Im)；或
(n) 式(In)的化合物；
式(In)；
其中
Q是取代或未取代的C1-C7亚烷基；或
Q是-CH2OCH2-、-OCH2CH2O-、-OCH2CH2OCH2CH2O-或-OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-；
X是氢、CH3、或取代或未取代的C3-C6环烷基；
每个R1和R2独立地是氢、卤素或CH3；
每个R3和R4独立地是氢或卤素；
每个A1、A2、A3和A4独立地是N、-NRY1-、-O-、-S-或CRA1；
每个独立地是单键或双键；
每个RA1独立地是氢、卤素、=O或取代或未取代的C1-C6烷基；并且
每个RY1独立地是氢或取代或未取代的C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ia)的结构：
式(Ia)。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ib)的结构：
式(Ib)。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ic)的结构：
式(Ic)。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Id)的结构：
式(Id)。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ie)的结构：
式(Ie)。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(If)的结构：
式(If)。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ig)的结构：
式(Ig)。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ih)的结构：
式(Ih)。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ii)的结构：
式(Ii)。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ij)的结构：
式(Ij)。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Ik)的结构：
式(Ik)。
13.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Il)的结构：
式(Il)。
14.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Im)的结构：
式(Im)。
15.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(In)的结构：
式(In)。
16.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(Iaa)的结构：
式(Iaa)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R3或R4中的至少一者是氟。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R3是氟，并且R4是氢。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R3是氢，并且R4是氟。
20.根据权利要求1、2、5、6或9中任一项所述的化合物，其中A1是CH、CF、C(CH3)、N、O或C(=O)。
21.根据权利要求1至5、8或11至13中任一项所述的化合物，其中A2是CH、C(CH3)或N。
22.根据权利要求1至4、6、7、10、12或14中任一项所述的化合物，其中A3是CH、C(CH3)或N。
23.根据权利要求1、3、10、11或15中任一项所述的化合物，其中A4是CH、C(CH3)、N、O或C(=O)。
24.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物包含至少20个碳原子、5个氮原子和1个氟原子。
25.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R1是氢或CH3。
26.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R2是氢或CH3。
27.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中Q是取代或未取代的C1-C7亚烷基。
28.根据权利要求17所述的化合物，其中Q是取代或未取代的C2-C4亚烷基。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中Q是-CH2CH2-。
30.根据权利要求28所述的化合物，其中Q是-CH2CH2CH2-。
31. 根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中 选自、、、、、、、、、、、、、、和。
32.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中Q是-CH2OCH2-。
33.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中X是氢。
34.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中X为-CH3。
35.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中X是取代或未取代的C3-C6环烷基。
36. 根据权利要求35所述的化合物，其中X是环丙基。
37.一种化合物，其选自
38.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
39.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
40.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
41.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
42.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
43.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
44.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
45.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
46.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
47.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
48.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
49.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
50.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
51.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是。
52.根据权利要求1所述的化合物的药学上可接受的盐。
53.根据权利要求37所述的化合物的药学上可接受的盐。
54.一种药物组合物，其包含权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
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