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CN116179667A - 基于斑马鱼模型中trpv1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用 - Google Patents

基于斑马鱼模型中trpv1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用 Download PDF

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CN116179667A CN202211157031.9A CN202211157031A CN116179667A CN 116179667 A CN116179667 A CN 116179667A CN 202211157031 A CN202211157031 A CN 202211157031A CN 116179667 A CN116179667 A CN 116179667A
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张阳
夏博伟
陆槿
韩新彬
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Fujian Zhongzhuang Technology Research Co ltd
East China University of Science and Technology
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Fujian Zhongzhuang Technology Research Co ltd
East China University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，所述试剂盒包括了RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP基因、NGF基因和TNF‑α基因中的至少一种。本发明还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选出皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。这极大减少了实验周期，对舒缓皮肤疼痛和瘙痒的化妆品功效成分的开发，具有重要意义。

Description

基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的 试剂盒及应用
技术领域
本发明属于化妆品原料筛选技术领域，具体涉及一种基于斑马鱼模型中TRPV1 信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用。
背景技术
瞬时感受器电位香草酸亚型1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1) 是初级感受神经上对物理和化学刺激产生疼痛作用的靶点，在人表皮角质形成细胞、人表皮永生化角质形成细胞系等广泛分布的皮肤细胞和伤害性感受器中均有表达，与局部皮肤瘙痒、疼痛的发生密切相关。当表达在皮肤感觉传入纤维末端的TRPV1通道激活后，促进轴突内囊泡胞吐释放大量神经肽，如P物质(Substance P，SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene Related Peptide,CGRP)等神经源性炎症因子。这些神经肽可激活多种皮肤细胞(如角质细胞、抗原呈递细胞、皮脂腺细胞、成纤维细胞等)，最终导致皮肤神经源性炎症。因此，筛选出高效、温和的TRPV1抑制剂用于皮肤舒缓具有重要意义。
TRPV1可被辣椒素和其他香草酸类化合物、炎性介质(如花生四烯酸代谢物)、热(＞43℃)、酸(pH＜5.3)、细胞外渗透压的改变等多种理化因素直接激活，通过介导Ca2+内流，参与细胞新陈代谢和信号传递等生理活动。缓激肽、前列腺素E2、神经生长因子等内源性介质可以通过介导蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、磷酯酶C(PLC)等胞内级联信号使TRPV1特定结构磷酸化，敏化TRPV1从而降低其激活阈值。神经生长因子(Nerve GrowthFactor，NGF)在皮肤、免疫细胞和其它组织中广泛存在。在炎症反应中，NGF与酪氨酸激酶受体(TrkA) 结合激活PKA、PKC、ERK/MAPK、PI3K通路使TRPV1通道敏化,导致热痛觉过敏；此外NGF还能通过激活并磷酸化p38MAPK信号通路增强TRPV1蛋白的表达水平。肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是一种重要的炎性介质。当皮肤感觉传入纤维的TRPV1通道激活时，释放的SP和CGRP等神经肽可以诱导单核巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞产生TNF-α，它可以激活丝裂原活化蛋白激酶 (p38-MAPK)信号通路，改变细胞膜通透性，使Na+内流，降低兴奋阈值,加剧疼痛反应。
与其它常用的鼠、兔等动物模型相比，斑马鱼模型具有以下独特优势：(1)斑马鱼基因组已被完全测序，与人类基因组有70％–80％的同源性；(2)斑马鱼物种稳定，个体差异小；(3)体积小，繁殖能力强，易于培养，可获得较大样本量，实验周期短。斑马鱼可以模拟皮肤细胞、神经细胞和免疫细胞共同参与的神经源性炎症，是理想的实验模型。
现有技术中，对于化妆品舒缓功效评价常用HaCaT细胞和3D皮肤模型等皮肤细胞，此类方式难以检测皮肤感受器感知的疼痛刺激，对化妆品舒缓功效的评价不够全面。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的第一个目的是设计一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，以检测TRPV1、SP、NGF和TNF-α等相关基因mRNA表达；第二个目的是使用上述试剂盒实现TRPV1信号通路抑制剂的化妆品原料快速筛选，筛选出皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和 qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP 基因、NGF基因和TNF-α基因中的至少一种。
进一步地，用于检测TRPV1基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：1-2所示：
Forward：5’-ATGCAGGGTTTACATGAGTATCTC-3’；
Reverse：5’-GTCGGTGTAAGCAGCATTGATA-3’。
进一步地，用于检测SP基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：3-4所示：
Forward：5’-CAAGAAGAGCCAGAGTCGTATG-3’；
Reverse：5’-CTTTTGGGAGCGAATGTGAA-3’。
进一步地，用于检测NGF基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：5-6所示：
Forward：5’-CGCTGACTTCATTCAAGAACC-3’；
Reverse：5’-GGAAAACATCCACCATCACATAC-3’。
进一步地，用于检测TNF-α基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：7-8所示：
Forward：5’-ATCTTCAAAGTCGGGTGTATGG-3’；
Reverse：5’-GATTGCCCTGGGTCTTATGG-3’。
本发明还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
进一步地，通过建立斑马鱼模型筛选出TRPV1信号通路的抑制剂，以筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
进一步地，所述斑马鱼模型是使用斑马鱼AB品系，通过LPS诱导建立相关模型。
进一步地，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料的方法，包括如下步骤：
(1)培养斑马鱼，并分别设置模型组、对照组和样品处理组，其中，模型组和样品处理组是将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有LPS胚胎培养液中进行诱导，对照组是将24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含LPS的胚胎培养液中培养。
(2)向样品处理组的培养液中分别加入待筛选的化妆品原料，化妆品原料浓度为安全浓度，继续培养；
(3)使用所述试剂盒，对模型组、对照组和样品处理组的斑马鱼胚胎进行RNA 的提取和纯化、逆转录、PCR扩增后，通过检测并分析化妆品原料对相关基因mRNA 表达的影响，以筛选化妆品原料。
本发明实现的有益效果为：(1)基于斑马鱼模型，对通过抑制TRPV1信号通路舒缓皮肤炎症化妆品原料的快速筛选，极大减少了实验周期；(2)定量检测TRPV1 及其相关的疼痛、瘙痒介质的基因表达，灵敏、方便地检测出待筛选化妆品原料的效果；(3)使用本发明设计的试剂盒能够快速筛选出抑制TRPV1信号通路的化妆品原料，对舒缓皮肤疼痛和瘙痒的化妆品功效成分的开发，具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中提取RNA纯度和完整性检测的示意图。
图2为实施例1处理后TRPV1mRNA检测结果的示意图。
图3为实施例1处理后SP mRNA检测结果的示意图。
图4为实施例1处理后NGF mRNA检测结果的示意图。
图5为实施例1处理后TNF-αmRNA检测结果的示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
本发明提供一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP基因、NGF基因和 TNF-α基因中的至少一种；其中：
用于检测TRPV1基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：1-2所示：
Forward：5’-ATGCAGGGTTTACATGAGTATCTC-3’；
Reverse：5’-GTCGGTGTAAGCAGCATTGATA-3’。
用于检测SP基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：3-4所示：
Forward：5’-CAAGAAGAGCCAGAGTCGTATG-3’；
Reverse：5’-CTTTTGGGAGCGAATGTGAA-3’。
用于检测NGF基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：5-6所示：
Forward：5’-CGCTGACTTCATTCAAGAACC-3’；
Reverse：5’-GGAAAACATCCACCATCACATAC-3’。
用于检测TNF-α基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：7-8所示：
Forward：5’-ATCTTCAAAGTCGGGTGTATGG-3’；
Reverse：5’-GATTGCCCTGGGTCTTATGG-3’。
本发明还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料，其具体操作步骤包括：
(1)实验用鱼培养：以购自中国斑马鱼资源库的AB品系斑马鱼作为实验鱼，将斑马鱼受精卵胚在温度为28.5℃，pH为7.2-7.6，光照/黑夜＝14h:10h的环境中培养24h。
(2)斑马鱼分组：将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有20μg/ml LPS的胚胎培养液中诱导，设置模型组；同时，另取30枚受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含 LPS的胚胎培养液，设置对照组；将其余样品处理组同模型组相同方式进行处理。
(3)4h后，在含有LPS的斑马鱼培养液的样品处理组中加入待筛选的原料，原料浓度在安全浓度以内(死亡率≤95％)，各组处理实验的实验鱼数量为30条，每组实验重复三次。继续培养24h。
(4)RNA的提取和纯化：分别取各组30条斑马鱼胚胎匀浆，加入Trizol 1ml，静置3min；加入300μL氯仿涡旋混匀，静置3min；调整离心机转速12000rpm，温度4℃离心15min，完成后吸取含有RNA的上清液到新的无酶1.5mL离心管中。加入与上清液等量的异丙醇沉淀RNA，-20℃冰箱下静置20min；检验RNA纯度和完整性后将提取分离的RNA立即逆转录。
(5)逆转录：将分离纯化的RNA进行逆转录。
(6)引物设计及序列。
(7)PCR扩增：对合成的cDNA进行PCR扩增，使用SYBR GREENI染料法进行荧光分析。
(8)结果判定：根据获得的CT值，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCT法进行计算表达量。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
通过建立斑马鱼模型，使用上述基于TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒筛选出皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。本发明的实施例中所选的化妆品原料为苦参碱、黄连素和黄芩苷，通过下述步骤对这三种化妆品原料进行皮肤疼痛舒缓检验。
具体操作步骤如下：
一、RNA提取
(1)实验用鱼培养：以购自中国斑马鱼资源库的AB品系斑马鱼作为实验鱼，将斑马鱼受精卵胚在温度为28.5℃，pH为7.2-7.6，光照/黑夜＝14h:10h的环境中培养24h。
(2)斑马鱼分组：将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有20μg/ml LPS的胚胎培养液中诱导，设置模型组。同时，另取30枚受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含LPS的胚胎培养液，设置对照组。将苦参碱、黄连素和黄芩苷三个样品处理组同模型组相同方式进行处理。
(3)4h后，在含有LPS的样品处理组的斑马鱼培养液中加入待筛选的原料，设置样品浓度为5mg/mL，各组处理实验的实验鱼数量为30条，每组实验重复三次。继续培养24h。三组样品处理组分别为模型+苦参碱、模型+黄连素、模型+黄芩苷。
(4)RNA的提取和纯化：取各组30条斑马鱼胚胎匀浆，加入Trizol 1ml，静置3min；加入300μL氯仿涡旋混匀，静置3min；调整离心机转速12000rpm，温度 4℃离心15min，完成后吸取含有RNA的上清液到新的无酶1.5mL离心管中。加入与上清液等量的异丙醇沉淀RNA，颠倒混匀，后放入-20℃冰箱静置20min后，再设置转速12000rpm，温度4℃，离心15min，完成后弃上清。加入1mL 75％乙醇(DEPC 配制)，洗涤沉淀后离心，设置转速12000rpm，温度4℃，离心5min，移除液体。最后通风橱晾干沉淀RNA，待RNA略干之后，加入适量体积的DEPC水溶解RNA。
(5)RNA纯度和完整性检测：取总RNA 8μL，使用TGem微量分光光度检测，每次上样1.5μL，检测5次，记录总RNA浓度和OD260nm/OD280nm，求平均值。若 OD260nm/OD280nm比值在1.8-2.1，则说明提取的RNA纯度较高。取总RNA样品3μL，质量分数1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，150V恒压15min，利用凝胶成像系统观察 RNA条带并拍照。上述模型组、对照组和样品处理组的检测结果如表1和图1所示。
表1RNA纯度检测
Figure BDA0003857229300000061
如表1中RNA的纯度检测结果所示，上述各组所提取的RNA OD260nm/OD280nm比值均在1.8-2.1之间，这表明所提取的RNA纯度较高。如图1所示，从左到右组别分别为对照组、模型组、模型+苦参碱、模型+黄连素、模型+黄芩苷，其中18S和28S 条带清晰完整，表明提取的RNA完整性好。
二、qPCR检测
将上述提取好的并通过纯度和完整性检测的RNA进行逆转录合成cDNA，具体操作步骤如下：
(1)逆转录：将分离纯化的RNA按照下述表2所示的反应体系和表3所示的反应条件进行。本实施例中，反应体系中的逆转录酶为MMLV逆转录酶，逆转录缓冲液为MMLV逆转录缓冲液。
表2逆转录反应体系
Figure BDA0003857229300000071
表3逆转录反应条件
Figure BDA0003857229300000072
(2)设计用于qPCR的引物序列如表4所示。
表4特异性引物表
Figure BDA0003857229300000073
Figure BDA0003857229300000081
(3)逆转录完成后，进行qPCR定量分析
将合成的cDNA按照以下表5所示的反应体系和表6所示的反应条件进行PCR 扩增，使用SYBR GREENI染料法进行荧光分析。
表5 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003857229300000082
表6 PCR扩增反应条件
Figure BDA0003857229300000083
(4)结果判定：根据获得的CT值，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCT法进行计算。
各组最终的结果如图2-图5所示，使用LPS诱导的模型组中，斑马鱼TRPV1 mRNA的表达水平显著上升，并介导SP、NGF和TNF-α等疼痛相关基因mRNA表达均明显上升。如图2所示，加入适宜浓度的苦参碱、黄连素和黄芩苷三个样品后， TRPV1的mRNA表达虽高于对照组，但较模型组均出现了显著的下降；如图3所示，加入适宜浓度的苦参碱、黄连素和黄芩苷三个样品后，SP的mRNA表达虽高于对照组，但较模型组均出现了显著的下降；如图4所示，加入适宜浓度的苦参碱、黄连素和黄芩苷三个样品后，NGF的mRNA表达虽高于对照组，但较模型组均出现了显著的下降；如图5所示，加入适宜浓度的苦参碱、黄连素和黄芩苷三个样品后，TNF-α的mRNA表达虽高于对照组，但较模型组均出现了显著的下降。上述结果也表明，本发明实施例中所选择的化妆品原料苦参碱、黄连素和黄芩苷可以作为皮肤疼痛舒缓原料。
综上所述，本发明使用所述的基于斑马鱼模型TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，可以对TRPV1基因及其相关的疼痛介质SP、NGF和TNF-α的基因进行精准、快速的检测，适用于对皮肤疼痛舒缓化妆品功效成分进行有效、高效的筛选。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，其特征在于，包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP基因、NGF基因和TNF-α基因中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测TRPV1基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：1-2所示：
Forward：5’-ATGCAGGGTTTACATGAGTATCTC-3’；
Reverse：5’-GTCGGTGTAAGCAGCATTGATA-3’。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测SP基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：3-4所示：
Forward：5’-CAAGAAGAGCCAGAGTCGTATG-3’；
Reverse：5’-CTTTTGGGAGCGAATGTGAA-3’。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测NGF基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：5-6所示：
Forward：5’-CGCTGACTTCATTCAAGAACC-3’；
Reverse：5’-GGAAAACATCCACCATCACATAC-3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测TNF-α基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：7-8所示：
Forward：5’-ATCTTCAAAGTCGGGTGTATGG-3’；
Reverse：5’-GATTGCCCTGGGTCTTATGG-3’。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过建立斑马鱼模型筛选TRPV1信号通路的抑制剂，以筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述斑马鱼模型是使用斑马鱼AB品系，通过LPS诱导建立相关模型。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料的方法，包括如下步骤：
(1)培养斑马鱼，并设置模型组、对照组和样品处理组，其中，模型组和样品处理组是将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有LPS胚胎培养液中进行诱导，对照组是将24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含LPS的胚胎培养液中培养；
(2)向样品处理组的培养液中分别加入待筛选的化妆品原料，化妆品原料浓度为安全浓度，继续培养；
(3)使用所述试剂盒，对模型组、对照组和样品处理组的斑马鱼胚胎进行RNA的提取和纯化、逆转录、PCR扩增，通过检测并分析化妆品原料对相关基因mRNA表达的影响，以筛选化妆品原料。
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