CN116178536B - 小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 - Google Patents
小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116178536B CN116178536B CN202211465121.4A CN202211465121A CN116178536B CN 116178536 B CN116178536 B CN 116178536B CN 202211465121 A CN202211465121 A CN 202211465121A CN 116178536 B CN116178536 B CN 116178536B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- chain
- collagen
- segment
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title abstract description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title abstract description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title abstract description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 24
- 208000003215 hereditary nephritis Diseases 0.000 claims description 22
- 208000024985 Alport syndrome Diseases 0.000 claims description 18
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 101150114528 COL4A5 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000002429 X-linked Alport syndrome Diseases 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 210000000585 glomerular basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 101150057990 COL4A4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100033780 Collagen alpha-3(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100033775 Collagen alpha-5(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 206010011891 Deafness neurosensory Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000022461 Glomerular disease Diseases 0.000 description 1
- 101000710873 Homo sapiens Collagen alpha-3(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000710886 Homo sapiens Collagen alpha-5(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000009966 Sensorineural Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000852 glomerular disease Toxicity 0.000 description 1
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 208000023573 sensorineural hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/34—Genitourinary disorders
- G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于抗体领域，具体提供一种小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用，所述小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。本发明在国内首先开发、成功制备了小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体，该单抗是IV型胶原α5链免疫荧光或组化检测得以开展的关键，而这对AS诊断具重要意义，并有助于遗传方式的确定。预初临床验证实验显示，本发明制备的单抗与市面抗体的免疫荧光检测结果完全一致，而且更易于结果解读。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体涉及小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
IV型胶原(type IV collagen)是构成基底膜的重要框架蛋白，α链是构成IV型胶原分子的亚单位，一个IV型胶原分子由3条α链组成。迄今为止，人类IV型胶原α链发现6种，分别称为α1～α6链，其编码基因分别为COL4A1-6。根据氨基酸序列和功能不同α5链可分为三个结构域：1.氨基端7S区；2.胶原区，包含“Gly-X-Y”重复序列；3.羧基端非胶原区(NC1)。NC1区控制了IV型胶原单体的缔结，在不同种族之间其氨基酸序列是高度保守的，但不同α链NC1区氨基酸序列明显不同，这是制备单克隆抗体的分子基础。
Alport综合征(Alport syndrome，AS)，又称遗传性肾炎、眼-耳-肾综合征，是一最为常见的遗传性肾小球疾病，临床主要表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能衰竭伴感音神经性耳聋、眼部病变。1988年Atkin首先将AS相关基因定位于X染色体，1990年Barker等成功克隆到COL4A5基因即编码Ⅳ型胶原α5链的基因，并在X伴性遗传AS(XLAS)患者中发现了第一个COL4A5基因突变，随后越来越多的COL4A5基因突变被发现，而COL4A3和COL4A4基因与常染色体遗传AS相关。
采用针对IV型胶原α5链NC1段的单克隆抗体行免疫荧光检测，对XLAS和常染色体隐性遗传AS(ARAS)具重要诊断价值。正常情况下，α5(Ⅳ)链存在于肾小球基底膜、远端肾小管基底膜和包氏囊壁内，免疫荧光呈阳性、连续线样，而在XLAS男性患者，α5链免疫荧光绝大多数呈阴性，XLAS女性患者免疫荧光则多呈不连续阳性。此外，IV型胶原α5链亦见于皮肤的表皮基底膜，同肾脏，正常情况下，α5链免疫荧光亦呈阳性、连续线样，而XLAS男性免疫荧光绝大多数为阴性，XLAS女性免疫荧光多为不连续阳性，因此对于部分发现疾病时肾功能已出现严重损害而丧失肾穿刺机会的患者，皮肤活检行IV型胶原α5链检测可替代肾组织起到疾病诊断的作用。对于部分ARAS患者，研究者发现抗α5链单抗在远端肾小管基底膜和包氏囊呈连续沉积，但在肾小球基底膜上无沉积，这一特异免疫荧光检测结果仅见于ARAS。因此α5链免疫荧光检测不仅对XLAS具重要诊断价值，对部分ARAS患者亦具诊断价值，更有助于AS遗传方式的确定。
专利文献CN110531088A公开了一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包含混有包被鼠抗人IV型胶原蛋白单克隆抗体胶乳颗粒的试剂；专利文献CN102010470B公开了一种抗IV型胶原单克隆抗体。而目前未见如本文所述小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人IV型胶原α5链NC1段，由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。
本专利还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：H链可变区和L链可变区，其中(a)所述H链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:17表示的CDR1序列、由SEQ IDNO:19表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:21表示的CDR3序列，以及(b)所述L链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:37表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:39表示的CDR2序列和由SEQID NO:41表示的CDR3序列。
优选地，所述单克隆抗体识别包含由SEQ ID NO:1表示的第251-475位氨基酸序列的表位。
优选地，所述单克隆抗体是人源化的。
本专利还提供了单克隆抗体在制备检测人IV型胶原的试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒用于人IV型胶原α5链的免疫荧光检测。
优选地，所述试剂盒用于诊断Alport综合征。
本专利还提供了一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2022240。
本发明的有益效果在于：在国内首先开发、成功制备了小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体，该单抗是IV型胶原α5链免疫荧光或组化检测得以开展的关键，而这对AS诊断具重要意义，并有助于遗传方式的确定。目前国际仅日本具有这一单抗产品，价格昂贵。预初临床验证实验显示，我们制备的单抗与日本公司的抗体免疫荧光检测结果完全一致，且更易解读结果。
附图说明
图1：CO4A5-Ecoli的SDS-PAGE和Western Blot分析。
图2：肾组织细胞上清克隆免疫荧光检测。上清4,11,19免疫荧光阳性，阳性部位上清4和19同对照抗体，但19上清荧光强度明显弱；11#上清荧光明显阳性部位与对照抗体类似，但除远端肾小管基底膜外其他肾小管基底膜亦有非特异弱阳性。A：Cosmobio抗体；B：上清2；C：上清3；D：上清4；E：上清5；F:上清6；G：上清8；H：上清9；I：上清10；J：上清11；K：上清12；L：上清13；M：上清14；N：上清15；O：上清17；P：上清18；Q：上清19；R：上清21。(400x)
图3：皮肤组织细胞上清克隆免疫荧光检测。a：Cosmobio抗体(200x)；b：4#上清(200x)；c：11L#上清(200x)；d：19#上清(200x)。
图4：肾组织抗α5(IV)单克隆抗体免疫荧光检测。A,B：Cosmobio抗体(A:100x；B:400x)；C,D：4#单抗(C:100x；D:400x)；E,F：5#单抗(E:100x；F:400)；G,H：11#单抗(G:100x；H:400x)。
图5：皮肤组织抗α5(IV)单克隆抗体免疫荧光检测。a：Cosmobio抗体(200x)；b：4#单抗(200x)；c：5#单抗(200x)；d：11#单抗(200x)。
图6：4#单抗肾组织免疫荧光检测。A,B：Cosmobio抗体在对照非Alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(A:100x；B:400x)；C,D：4#单抗在对照非Alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(C:100x；D:400x)；E,F：Cosmobio抗体在X伴性遗传Alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(E；100x；F:400x)；G,H：4#单抗在X伴性遗传Alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(G:100x；H:400x)。
图7：皮肤组织4#单抗免疫荧光检测。a：Cosmobio抗体在对照非Alport综合征患者皮肤组织免疫荧光检测结果(200x)；b：4#单抗在对照非Alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(200x)；c：Cosmobio抗体在X伴性遗传Alport综合征男性患者皮肤组织免疫荧光检测结果示阴性(200x)；d：4#单抗在X伴性遗传Alport综合征男性患者皮肤组织免疫荧光检测结果示阴性(200x)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
一、抗原制备：基因克隆、蛋白表达纯化
订购基因human CO4A5，亚克隆到同时带His标签和GST标签的pGS-21a质粒载体上，转化E.coli做表达鉴定，实验结果表明蛋白表达在包涵体中，包涵体用8M尿素PBS溶解，后续用镍柱亲和纯化human CO4A5，蛋白溶解在8M尿素PBS，浓度1.05mg/ml，6ml，纯度90％。
克隆策略：ATG--His tag--GST tag--KpnI--TEV protease site--CO4A5-Ecoli--Stop codon-HindIII，其aa序列如SEQ ID NO:1所示，其中，第5-10位为His tag，第14-233位为GST tag，第244-250位为TEV protease site，第251-475位为CO4A5-Ecoli，即CO4A5 NC1段。CO4A5 NC1段的编码序列如SEQ ID NO:2的第28-702bp所示。
原核表达，亲和纯化蛋白检测。结果见图1。
二、小鼠免疫
定期配佐剂(完全和不完全佐剂)各免疫5只balb/c小鼠(皮下多点注射5次)(实际免疫11只小鼠，存活9只小鼠)，免疫三次后收集小样血清做Elisa测试，如下表所示。
(一)Elisa数据分析
1.CO4A5蛋白带有GST和HIS标签，蛋白免疫11鼠，存活9只小鼠，编号C-1#～C-9#；
2.分别用CO4A5蛋白，GST蛋白和His蛋白包被，9鼠四免血1∶100开始，GST和His单抗正对照1ug/ml开始，1∶3梯度稀释；
3.CO4A5蛋白：三鼠(1#，4#，6#)无效价，其他6鼠效价：9#＞3#＝5#＞2#＝7#＞8#；
4.GST蛋白检测，三鼠：3#，7#，9#与GST蛋白反应，7#特异性差；
5.His蛋白检测，确认2#，3#鼠与His蛋白不反应。
(二)结论
1.小鼠血清与GST和His有微弱交叉反应，主要还是跟CO4A5蛋白反应；
2.选取6鼠按照效价优先循序9#＞3#＝5#＞2#＝7#＞8#做细胞融合。
三、细胞融合筛选及亚克隆
| 时间 | 内容 | 备注 |
| 第1天 | 小鼠终加强 | 80μg鼠，无佐剂，腹腔注射 |
| 第3天 | 细胞融合 | PEG法 |
| 第7-10天 | 融合初筛 | 包被偶联物ELISA |
| 第9天 | 融合复检 | 包被偶联物ELISA，竞争反应，ELISA仿照法 |
| 第19天 | 第一次亚克隆 | 初步筛选的杂交瘤单克隆化 |
| 第29天 | 第二次亚克隆 | |
| 第39天 | 第三次亚克隆 |
6只小鼠做细胞融合，Elisa筛选细胞上清共得到21个阳性克隆，Elisa数值：
21个克隆做免疫荧光(IF)检测，实验步骤如下：
1.取冰冻肾组织切片(0.2-0.3um)，在空气中风干；
2.丙酮固定10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；
3.滴加变性剂(0.1M甘氨酸，6M尿索，pH3.5)，空气中孵育10分钟；
4.双蒸水冲洗3次，每次3分钟；
5.滴加稀释好的I抗(获得的21个细胞上清，原液，空白对照滴加等体积PBS)抗α2/α5抗体(Cosmobio，日本)为阳性对照，原液，37℃，孵育30分钟；
6.PBS冲洗3次，每次3分钟；
7.滴加稀释好的FITC标记的羊抗小鼠F(ab)2IgG二抗(Sigma)，37℃，孵育30分钟；
8.PBS冲洗3次，每次3分钟；PBS-甘油封片，镜检。
9.结果：共得到3个克隆可检测到免疫荧光阳性：4#，11#，19#，其中4#和19#上清荧光阳性部位同对照抗体，但19#荧光强度非常弱，11#上清荧光明显，阳性的部位与对照抗体相似，但除远端肾小管基底膜外其他肾小管基底膜均有免疫荧光弱阳性，存在非特异信号。(见图2)
检测到的阳性克隆进一步在皮肤组织进行免疫荧光检测，实验步骤同上，结果同肾组织。(见图3)
四、细胞建株冻存及抗体小量生产
对免疫荧光筛选出的细胞克隆进行建株、冻存，并生产小量抗体。
| 时间 | 内容 | 备注 |
| 第1天 | 96孔细胞转24孔 | 细胞扩大培养、鉴定 |
| 第14天 | 24孔细胞转T25瓶 | |
| 第28天 | T25瓶细胞转T75瓶 | |
| 第38天 | 细胞冻存 | 细胞冻存 |
| 第42天 | 细胞注射小鼠 | 生产腹水 |
| 第56天 | 采集腹水 | |
| 第58天 | 腹水Protein A纯化 | 腹水纯化 |
最后获得三个单克隆抗体，分别是4#，5#，11#抗体，4#和11#对应原来4#和11#细胞克隆，5#抗体对应19#细胞克隆，分别生产了5mg抗体。4#细胞克隆已于2022年09月06日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏编号为CCTCC NO：C2022240，培养物名称为杂交瘤细胞株NC1#4。其序列信息如下：
五、3个抗体免疫荧光检测，进一步验证
1.取冰冻肾及皮肤组织切片(厚度0.2-0.3um)，在空气中风干；
2.丙酮固定10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；
3.滴加变性剂(0.1M甘氨酸，6M尿素，pH3.5)，空气中孵育10分钟；
4.双蒸水冲洗3次，每次3分钟；
5.滴加稀释好的I抗(获得的不同克隆的单克隆抗体，稀释度均为1:100，抗α2/α5抗体为阳性对照(Cosmobio，日本，原液)，空白对照滴加等体积PBS，37℃，孵育30分钟；
6.PBS冲洗3次，每次3分钟；
7.滴加稀释好的FITC标记的羊抗小鼠F(ab)2IgG二抗(Sigma)，37℃，孵育30分钟；
8.PBS冲洗3次，每次3分钟；PBS-甘油封片，镜检。
9.结果：
皮肤组织：共检测12个皮肤标本，其中1个为COL4A5突变和2个COL4A4突变患者，余为非IV型胶原α链突变的肾病患者；
肾组织：共检测15个标本，其中1个为COL4A5基因突变和1个COL4A4基因突变患者，其他为非Alport综合征肾病患者或手术切除肾组织；
荧光结果：4#抗体效果最好，与Cosmobio抗体检测结果一致，无论是Alport综合征和非Alport综合征患者，稀释100倍的情况下荧光强度与Cosmobio抗体匹配，5#抗体虽然检测结果与Cosmobio抗体一致，但即使原浓度，荧光强度亦非常弱，而11#抗体有非特异信号，因此最后筛选出4#单抗符合最终要求。(见图4,5,6,7)
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
Claims (8)
1.一种结合人IV型胶原α5链NC1段的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性结合人IV型胶原α5链NC1段，由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。
2.一种结合人IV型胶原α5链NC1段的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：H链可变区和L链可变区，其中(a)所述H链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:17表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:19表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:21表示的CDR3序列，以及(b)所述L链可变区包括三个互补决定区，为SEQ IDNO:37表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:39表示的CDR2序列和由SEQ IDNO:41表示的CDR3序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别包含由SEQID NO:1表示的第251-475位氨基酸序列的表位。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是人源化的。
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测人IV型胶原的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于人IV型胶原α5链的免疫荧光检测。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断Alport综合征。
8.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2022240。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211465121.4A CN116178536B (zh) | 2022-11-22 | 2022-11-22 | 小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211465121.4A CN116178536B (zh) | 2022-11-22 | 2022-11-22 | 小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116178536A CN116178536A (zh) | 2023-05-30 |
| CN116178536B true CN116178536B (zh) | 2024-07-16 |
Family
ID=86446891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211465121.4A Active CN116178536B (zh) | 2022-11-22 | 2022-11-22 | 小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116178536B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006200868A1 (en) * | 1995-04-27 | 2006-03-23 | Amgen Fremont Inc. | Human Antibodies Derived From Immunized Xenomice |
| CN102010470A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201415714D0 (en) * | 2014-09-05 | 2014-10-22 | Medical Res Council | Antibodies and antigen binding fragments thereof |
| CN105924522A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-09-07 | 四川耀康生物科技有限公司 | 一种vi型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用 |
| CN106906220B (zh) * | 2017-03-10 | 2019-08-13 | 中国人民解放军南京军区南京总医院 | 一种突变的col4a5基因及其应用 |
| CN107058242B (zh) * | 2017-04-10 | 2020-10-13 | 河南中医药大学 | 鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂 |
| CN108409859A (zh) * | 2018-03-08 | 2018-08-17 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法 |
-
2022
- 2022-11-22 CN CN202211465121.4A patent/CN116178536B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006200868A1 (en) * | 1995-04-27 | 2006-03-23 | Amgen Fremont Inc. | Human Antibodies Derived From Immunized Xenomice |
| CN102010470A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116178536A (zh) | 2023-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111269313B (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒的单克隆抗体及其制备试剂盒的用途 | |
| CN106749667B (zh) | 一种抗癌胚抗原的纳米抗体及其应用 | |
| CN115724958B (zh) | 抗诺如病毒gⅱ基因组衣壳蛋白vp1的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114075279A (zh) | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 | |
| CN115304674A (zh) | 一种抗d-二聚体纳米抗体的制备及其应用方法 | |
| CN115772225A (zh) | 靶向TNF-α和IL-23的双特异性纳米抗体及其用途 | |
| CN110885374B (zh) | 一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用 | |
| CN111732659A (zh) | 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| CN116178536B (zh) | 小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用 | |
| CN115286712B (zh) | 新型冠状病毒Delta突变株特异性抗体及其应用 | |
| CN106399294B (zh) | 一种抗人降钙素原蛋白n末端抗原表位的单克隆抗体7h8的制备 | |
| CN112646037B (zh) | 一种抗cd105特异性单克隆抗体及其应用 | |
| CN109776679B (zh) | 一种丝氨酸蛋白酶抑制因子spink1的抗体、其制备方法和应用 | |
| CN118184786A (zh) | 一种靶向gpc3的鲨鱼单域抗体vnar-f10及其应用 | |
| CN115851611B (zh) | 一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 | |
| JP2002272457A (ja) | アセチルリジン認識モノクローナル抗体及びその製造方法 | |
| CN112710835B (zh) | 一种生殖系统疾病检测试剂盒 | |
| CN116903745A (zh) | 一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用 | |
| KR20070103548A (ko) | 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도 | |
| CN111705039B (zh) | 一种分泌抗sox17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN113512119A (zh) | 一种抗ca125的纳米抗体5d2及其应用 | |
| CN120081931B (zh) | 一种抗水痘-带状疱疹病毒的单克隆中和抗体及其应用 | |
| CN118791620B (zh) | 抗糖原磷酸化酶gpbb单克隆抗体及其应用 | |
| CN118255883B (zh) | 针对人视锥蛋白样蛋白1的单克隆抗体、抗体对和试剂盒及其应用 | |
| CN119899269B (zh) | 一种单克隆抗体及其检测应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |