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CN116162608A - 热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因及应用 - Google Patents

热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因及应用 Download PDF

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CN116162608A
CN116162608A CN202211004695.1A CN202211004695A CN116162608A CN 116162608 A CN116162608 A CN 116162608A CN 202211004695 A CN202211004695 A CN 202211004695A CN 116162608 A CN116162608 A CN 116162608A
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CN
China
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mutant
mutated
enzyme
nicotinamide
ribokinase
Prior art date
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Application number
CN202211004695.1A
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薛亚平
程峰
吴晓虎
李欢
沈其
郑裕国
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Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
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Abstract

本发明涉及一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌及应用，所述突变体由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位、第134位、第136位、第137位进行单突变或多点联合突变获得。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，热稳定性得到显著的提高，45℃加热20分钟后残留酶活由野生型的14.05％增加到突变体的76.24％；同时，突变体的单位酶活相对于野生型提高了2.77倍，从而可以显著提升酶的反应温度，加快反应速率，降低反应时间和生产成本，提高NMN收率，能够满足采用生物酶法制备NMN的大规模工业化生产的需求，具有广泛的应用前景。(2)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体的稳定性增加，可以有效延长酶的保存时间，降低酶的使用成本。

Description

热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌及应用。
(二)背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是一种自然存在的生物活性核苷酸，NMN有2种不规则存在形式，α异构体和β异构体。其中，β异构体是NMN的活性形式，分子量为334.221g/mol。NMN是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide，NAD+，又称辅酶I)合成途径的重要中间体。近年来在Science、Nature、Cell等国际权威学术杂志上的相关研究报道表明，补充NMN可有效地增加和恢复体内辅酶I水平，大幅延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病，并由此从根本上调理和改善衰老的各种症状。因此以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LABNMN3000胶囊等。
NMN目前的生产方法主要有三种：固态酵母发酵工艺、体外酶催化工艺和化学法合成工艺。其中：(1)固态酵母发酵工艺复杂，产量较低，因此产品价格高昂。(2)化学法合成工艺以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。虽然技术容易控制，但产品中杂质过多，分离纯化困难且总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，对环境污染不可忽视。(3)酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。目前主流的NMN生产工艺都是采用安全绿色的体外酶催化工艺。
主流的NMN的生物酶法制备是以烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN。对于酶催化反应来说，在酶的最适反应温度范围内，反应速率隨著温度的升高而急剧增加，从而缩短反应时间。然而，目前已报道的合成NMN的酶均为常温反应的酶，热稳定性不高，最适反应温度低于37℃，反应速率低，反应时间较长；同时也不利于酶液的长期保存。
然而目前关于烟酰胺核糖激酶的研究仍然较少，限制了生物酶催化一步反应法制备NMN工业化生产中的应用。通过定向突变方法提高烟酰胺核糖激酶的热稳定性及酶活性，将十分有助于实现工业上减少酶量，降低生产成本。
(三)发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌及应用，以解决现有NRK热稳定性不高、反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题。
本发明采用的技术方案是：
一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体，由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位、第134位、第136位、第137位进行单突变或多点联合突变获得。
来源于人的烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体的，所述突变为下列之一(单点突变)或其中两种以上(多点突变)的组合：(1)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸；(2)第134位精氨酸突变为组氨酸；(3)第136位酪氨酸突变为谷氨酸；(4)第137位苏氨酸突变为缬氨酸。
优选的，所述突变为下列之一：
(1)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸(突变体D140S)；
(2)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸(突变体D140S-R134H)；
(3)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸，第136位酪氨酸突变为谷氨酸(突变体D140S-R134H-Y136E)；
(4)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸，第136位酪氨酸突变为谷氨酸，第137位苏氨酸突变为缬氨酸(突变体D140S-R134H-Y136E-T137V)。
本发明还涉及编码所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因。
优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8之一所示，分别编码突变体D140S、突变体D140S-R134H、突变体D140S-R134H-Y136E和突变体D140S-R134H-Y136E-T137V。
本发明还涉及含有编码所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因的重组载体，以及含有编码所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因的基因工程菌。具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。所述基因工程菌的宿主细胞可以为任一种合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母。
本发明还涉及所述烟酰胺核糖激酶突变体在微生物催化制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
具体原理为：采用一锅法的酶催化体系，以烟酰胺核糖为底物，利用烟酰胺核糖激酶将磷酸供体上的磷酸基团转移到烟酰胺核糖上催化为烟酰胺单核苷酸，同时，可加入乙酸激酶将副产物二磷酸腺苷(ADP)转化为三磷酸腺苷(ATP)，因为过量ADP的积累会对Nrk具有一定的抑制作用，而转化的ATP将会重新加入反应，以此循环降低反应成本。
所述乙酸激酶可以采用本领域常规的序列。优选的，所述乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示(编码基因如SEQ ID No.3所示)。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，热稳定性得到显著的提高，45℃加热20分钟后残留酶活由野生型的14.05％增加到突变体的76.24％；同时，突变体的单位酶活相对于野生型提高了2.77倍，从而可以显著提升酶的反应温度，加快反应速率，降低反应时间和生产成本，提高NMN收率，能够满足采用生物酶法制备NMN的大规模工业化生产的需求，具有广泛的应用前景。
(2)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体的稳定性增加，可以有效延长酶的保存时间，降低酶的使用成本。
(四)附图说明
图1为本发明方法采用的酶法生产烟酰胺单核苷酸的反应式；
图2为烟酰胺核糖核磁氢谱图；
图3为烟酰胺单核苷酸核磁氢谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-24a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对产物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/40℃；流速/1mL/min；检测波长/254nm；流动相：20mM K2HPO4，用KH2PO4调pH至7.0。
实施例1：
一、原核表达体系的构建
NrK基因片段由杭州擎科生物有限公司合成(SEQ ID NO.1)，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自自杭州皓丰生物技术有限公司)。随后与同样经过双酶切的表达载体pET28a(+)(Novage公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下置于低温连接仪里连接过夜。连接液转化BL21(DE3)感受态细胞，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NrK-pET28a(+)。含Nrk基因的阳性转化子记为工程菌Nrk001，保存于-80℃保存。
二、烟酰胺核糖激酶突变体库的构建
第一轮，以上述全基因合成所得密码子优化后的烟酰胺核糖激酶基因为模板，分别以表1中用于突变D140S的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有D140S突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为烟酰胺核糖激酶突变体Nrk001-D140S。
第二轮以突变体Nrk001-D140S为模板，分别以表1中用于突变R134H、的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌为带有D140S和R134H双突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为烟酰胺核糖激酶突变体Nrk001-D140S-R134H。
第三轮以突变体Nrk001-D140S-R134H为模板，分别以表1中用于突变Y136E的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有D140S、R134H和Y136E三突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为烟酰胺核糖激酶突变体Nrk001-D140S-R134H-Y136E。
第四轮以突变体Nrk001-D140S-R134H-Y136E为模板，分别以表1中用于突变T137V的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有D140S、R134H和Y136E和T137V四突变，将该优势突变体的质粒命名为烟酰胺核糖激酶突变体Nrk001-D140S-R134H-Y136E-T137V。
其中，PCR反应体系如下：
2×Phanta Max缓冲液：25μL；
dNTPs：1μL；
上游引物：1μL；
下游引物：1μL；
模板：1μL；
Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：0.5μL；
ddH2O：20.5μL。
PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃15s，退火56℃30s，延伸72℃6min，共循环30次；后延伸72℃10min；4℃保存。
PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1300bp左右。将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
表1
Figure BDA0003808200920000061
实施例2：表达乙酸激酶的基因工程菌的构建
一、目的基因转氨酶的扩增
从假单胞杆菌基因组中克隆乙酸激酶基因，根据相应基因组DNA序列(SEQ IDNO.3)设计相应的PCR上游引物和下游引物。
上游引物：ATGCATATGGCGAAGGTTCTGGCGGTTAA
下游引物：CTCGAGCAGGTTCGCCAGACGCATAACAT
PCR扩增体系：
2×Phanta Max缓冲液：25μL；
dNTPs：1μL；
上游引物：1μL；
下游引物：1μL；
模板：1μL；
Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：0.5μL；
ddH2O：20.5μL。
PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃6min，共循环30次；后延伸72℃10min；4℃保存。
PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1200bp左右。将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
二、表达载体和工程菌的构建
表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4 DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)，构建表达载体pET-28a(+)-gabT，将构建的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50mg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8～12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选含有表达重组质粒pET-28a(+)-gabT的重组大肠杆菌BL21(DE)/pET-28a(+)-gabT。
实施例3：微生物的培养
一、菌体的培养
将含有烟酰胺核糖激酶和乙酸激酶基因的工程菌分别经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
二、粗酶液的制备
将培养结束后收集的菌体用pH 8的磷酸盐缓冲液(50mM)洗涤两次，之后，将菌体加入pH＝8的PBS(50mM)重悬细胞，在超声破碎30次，破碎条件：功率为400W，破碎2s，间歇5s。将此细胞破碎液于4℃8000rpm离心10min，去除沉淀，得到的上清即为粗酶液。
三、酶的纯化
将粗酶液与经上样缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含500mM NaCl、20mM咪唑)平衡过的Ni亲和层析树脂结合后，再用冲洗缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含50mM咪唑、500mM NaCl)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含200mM咪唑、500mM NaCl)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液)透析24h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.7mg/mL，将酶液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃，即获得重组纯酶。
乙酸激酶重组纯酶也按上述方法制备。
实施例4：烟酰胺核糖激酶活力的测定
酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(30℃)下，在1分钟内转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中的1微摩尔的有关基团的酶量。
底物NR浓度25g/L，100mM ATP，20mM无水氯化镁，加入适量制备粗酶上清液，用50mM pH7.0磷酸钾缓冲液补充体积至1mL，置于40℃恒温金属浴反应器下振荡反应。反应10min后取样进行HPLC检测计算酶活。
表2：酶活测定结果
编号 突变类型 相对酶活
对照1 未突变 1
E1 D140S 1.98
E2 D140S-R134H 2.06
E3 D140S-R134H-Y136E 2.44
E4 D140S-R134H-Y136E-T137V 3.74
实施例5：菌体的大规模制备
因生产烟酰胺单核苷酸的过程中，需要大量的生物催化剂，因此需要菌体大规模制备。所用培养基为LB培养基。
将保藏有重组烟酰胺核糖激酶工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1L同样含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例6：选取乙酸激酶制备烟酰胺单核苷酸
按照实施例4的方法培养能够表达乙酸激酶基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取烟酰胺核糖到50mM pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得烟酰胺核糖的终浓度为100mM，初始烟酰胺核糖激酶菌体浓度为10g/L，乙酸激酶菌体浓度为10g/L，10mM的三磷酸腺苷和10mM Mg2+。通过水浴控制反应温度为40℃，定时取样用液相色谱检测NMN的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测NR的减少量。
反应3小时结束，转化率为75％，产率67％。
实施例7：
酶活测定：在50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液中依次加入终浓度分别为25g/L的NR、15g/L的ATP、10mM的无水氯化镁，于40℃水浴锅中磁力搅拌温育5min后加入待测的酶液(或酶冻干粉)，反应20min后取样进行HPLC检测。
热稳定性测定：将野生型烟酰胺核糖激酶酶粉和烟酰胺核糖激酶突变体酶粉溶于50mM pH7.0的磷酸钠缓冲后，置于50℃水浴锅中温育15min，离心取上清进行残留的酶活测定。实验结果如下表所示，突变体热稳定性得到了显著提升，残留酶活从野生型的14.05％提高到突变体的76.24％；单位酶活也得到意外提升，比野生型酶提高了2.77倍。
实施例8：选取烟酰胺核糖激酶突变体D140S-R134H-Y136E-T137V制备烟酰胺单核苷酸
按照实施例4的方法培养能够表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取烟酰胺核糖到50mM pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得烟酰胺核糖的终浓度为100mM，突变体烟酰胺核糖激酶菌体浓度为10g/L，乙酸激酶菌体浓度为10g/L，10mM的三磷酸腺苷和10mM Mg2+。通过水浴控制反应温度为40℃，定时取样用液相色谱检测NMN的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测NR的减少量。
反应3小时结束，转化率为99％，产率约为90％。
实施例9：选取烟酰胺核糖激酶突变体D140S-R134H-Y136E-T137V制备烟酰胺单核苷酸
按照实施例4的方法培养能够表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取烟酰胺核糖到50mM pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得烟酰胺核糖的终浓度为200mM，突变体烟酰胺核糖激酶菌体浓度为10g/L，乙酸激酶菌体浓度为10g/L，10mM的三磷酸腺苷和10mM Mg2+。通过水浴控制反应温度为40℃，定时取样用液相色谱检测NMN的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测NR的减少量。
反应3小时结束，转化率99％，产率约为90％。
实施例10：选取烟酰胺核糖激酶突变体D140S-R134H-Y136E-T137V(制备烟酰胺单核苷酸
按照实施例4的方法培养能够表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取烟酰胺核糖到50mM pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得烟酰胺核糖的终浓度为400mM，突变体烟酰胺核糖激酶菌体浓度为10g/L，乙酸激酶菌体浓度为10g/L，10mM的三磷酸腺苷和10mM Mg2+。通过水浴控制反应温度为40℃，定时取样用液相色谱检测NMN的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测NR的减少量。
反应5小时结束，因初始底物浓度大幅度增加，存在底物抑制，所以转化率降低为95％，产率约为90％。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体，由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位、第134位、第136位、第137位进行单突变或多点联合突变获得。
2.如权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸；(2)第134位精氨酸突变为组氨酸；(3)第136位酪氨酸突变为谷氨酸；(4)第137位苏氨酸突变为缬氨酸。
3.如权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于所述突变为下列之一：
(1)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸；
(2)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸；
(3)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸，第136位酪氨酸突变为谷氨酸；
(4)第140位天冬氨酸突变为丝氨酸，第134位精氨酸突变为组氨酸，第136位酪氨酸突变为谷氨酸，第137位苏氨酸突变为缬氨酸。
4.编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8之一所示。
6.含有编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因的重组载体。
7.含有编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因的基因工程菌。
8.权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体在微生物催化制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
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