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CN116157515A - Sarm1的双等位基因敲除 - Google Patents

Sarm1的双等位基因敲除 Download PDF

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CN116157515A
CN116157515A CN202180046677.7A CN202180046677A CN116157515A CN 116157515 A CN116157515 A CN 116157515A CN 202180046677 A CN202180046677 A CN 202180046677A CN 116157515 A CN116157515 A CN 116157515A
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CN
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exon
sequence
nucleotides
seq
sarm1
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CN202180046677.7A
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R·伊曼纽尔
M·戈兰·马什亚赫
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Emmendo Biology
Original Assignee
Emmendo Biology
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Abstract

包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分的RNA分子及其组合物、方法和用途，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1‑12105中任一个所示序列中的核苷酸。

Description

SARM1的双等位基因敲除
贯穿本申请，引用了各种出版物，包含括号中的参考文献。本申请中提及的所有出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以提供本发明所属领域的附加描述和可用于本发明的本领域的特征。
对序列表的引用
本申请通过引用并入了存在于名为“210527_91408-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt”的文件中的核苷酸序列，其大小为2,585千字节，并且其在2021年5月25日以IBM-PC机器格式创建，具有与MS窗口的操作系统兼容性，其含在2021年5月27日提交的文本文件中作为本申请的一部分。
背景技术
含有不育α和TIR基序的1(SARM1)基因是NAD+水解酶，其通过促进沃勒变性(一种损伤诱导形式的程序性亚细胞死亡，涉及损伤位点远端轴突的变性)作为MYD88和TRIF依赖性toll样受体信号传导途径的负调节因子。SARM1还可以响应于应激而激活神经元细胞死亡并且在视网膜结构和功能中发挥作用(莫尔德伊(Molday)等人，2013)。
发明内容
公开了敲除SARM1基因以抑制光感受器变性，从而使眼睛中的光感受器保持不变的方法。因此，如本文所述的感光细胞中SARM1基因的双等位基因敲除可用于治疗、抑制、预防和/或改善色素性视网膜炎、光感受器(视杆和视锥)变性和年龄相关性黄斑变性中的任一种。
本公开还提供了一种用于使细胞中含有不育α和TIR基序的1(SARM1)基因的等位基因失活的方法，该方法包括
向细胞中引入组合物，该组合物包括：
CRISPR核酸酶或编码该CRISPR核酸酶的序列；以及
包括具有17至50个核苷酸的引导序列部分或编码其的核苷酸序列的RNA分子，
其中CRISPR核酸酶和RNA分子的复合物影响SARM1基因的等位基因中的双链断裂。
根据本发明的实施例，提供了一种RNA分子，其包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID No:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了一种包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于使细胞中的SARM1等位基因失活的方法，该方法包括向细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。在一些实施例中，细胞是视杆细胞。在一些实施例中，细胞是视锥细胞。在一些实施例中，细胞是感光细胞。在一些实施例中，向细胞的递送在体内、离体或体外进行。在一些实施例中，该方法离体进行，并且从个体患者提供/取出细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括将具有修饰/敲除的SARM1等位基因的所得细胞引入至个体患者的步骤。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗和/或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的方法，该方法包括向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物的用于使细胞中的SARM1等位基因失活的用途，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，该用途包括向细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的实施例，提供了一种用于使细胞中的SARM1等位基因失活的包括RNA分子和CRISPR核酸酶的药物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，其中该药物通过向细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物来加以施用，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物的用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的用途，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，该用途包括向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
在一些实施例中，该方法在体内进行，并且该细胞是受试者眼睛视网膜中的感光细胞。
根据本发明的一些实施例，提供了一种包括组合物的药物，该组合物包括RNA分子和CRISPR核酸酶，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个中所示序列中的核苷酸，其用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性，其中该药物通过向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物来加以施用，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于使细胞中的SARM1等位基因失活的试剂盒，其包括RNA分子、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸；以及用于将RNA分子；CRISPR核酸酶和/或tracrRNA递送至细胞的说明书。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗受试者中的光感受器变性的试剂盒，其包括RNA分子、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸；和用于将RNA分子；CRISPR核酸酶和/或tracrRNA递送至患有光感受器变性或具有经历光感受器变性的风险的受试者的细胞的说明书。
附图说明
图1A至1B：在HeLa细胞中筛选靶向SARM1的RNA引导分子的活性。DNA转染后72小时收获细胞。提取基因组DNA并在使用靶上引物扩增内源基因组区域后用于毛细管电泳。该图表示三(3)个独立实验的编辑％±标准偏差(STDV)的平均值。图1A：将SpCas9编码质粒与表达指定RNA引导分子的质粒共转染。图1B：将OMNI-50或OMNI-79 CRISPR核酸酶与指定的RNA引导分子共转染。
图2：将与特定RNA引导分子复合的SpCas9核酸酶的RNP电穿孔到Neuro-2a细胞中以测定RNP活性。DNA电穿孔72小时后收获细胞，提取基因组DNA，然后通过下一代序列(NGS)进行分析。该图表示两(2)次独立电穿孔的编辑百分比±STDV。
图3：编辑后SARM1 RNA的相对量。电穿孔后七(7)天收获Neuro-2a细胞，提取RNA并逆转录。使用AriaMx系统定量SARM1 RNA的相对量。相对于未编辑的未处理细胞定量mRNA水平。
图4：OMNI-103 CRISPR核酸酶与靶向SARM1的RNA引导分子在HeLa细胞中的编辑活性。将特定RNA引导分子与OMNI-103 CRISPR核酸酶共转染以测定它们的靶上活性。DNA转染后72小时收获细胞，提取基因组DNA，扩增突变区域并通过NGS分析。通过mCherry荧光测量转染效率。该图表示三(3)次独立转染的编辑百分比±STDV。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施例的实践或测试中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以本专利说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在必然是限制性的。
应当理解，如上文和本文其它地方使用的术语“一(a)”和“一个(an)”是指列举的成分中的“一或多个”。本领域普通技术人员将清楚的是，单数的使用包含复数，除非另有具体说明。因此，术语“一”、“一个”和“至少一个”在本申请中可互换使用。
出于更好地理解本教导的目的并且绝不以任何方式限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字和其它数值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可取决于寻求获得的所需特性而变化。至少，每个数值参数应当至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的四舍五入技术来解释。
除非另有说明，否则修饰本发明实施例的一或多个特征的条件或关系特征的形容词(诸如“基本上”和“约”)应理解为意指该条件或特征被限定在对于其预期应用的实施例的操作可接受的公差范围内。除非另有指明，否则说明书和权利要求书中的词语“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的或，并且指示其结合的项目中的至少一个或任何组合。
在本申请的说明书和权利要求书中，每个动词“包括”、“包含”和“具有”及其词性变化用于表示动词的一或多个宾语不一定是动词的一或多个主语的成分、元素或部分的完整列表。本文所用的其它术语意在通过其在本领域中众所周知的含义来定义。
在本发明的一些实施例中，DNA核酸酶用于影响靶位点处的DNA断裂以诱导细胞修复机制，例如但不限于非同源末端连接(NHEJ)。在经典的NHEJ过程中，双链断裂(DSB)位点的两个末端以快速但也不准确的方式连接在一起(即，经常导致在切割位点处的DNA以小插入或缺失的形式突变)。
如本文所用，术语“修饰的细胞”是指其中双链断裂由于与靶序列杂交(即靶上杂交)而受RNA分子和CRISPR核酸酶的复合物影响的细胞。
如本文所用，术语“靶向序列”或“靶向分子”是指包括能够与特定靶序列杂交的核苷酸序列的核苷酸序列或分子，例如，靶向序列具有沿着靶向序列的长度与被靶向的序列至少部分互补的核苷酸序列。靶向序列或靶向分子可以是可以单独或与其它RNA分子组合与CRISPR核酸酶形成复合物的RNA分子的一部分，其中靶向序列充当CRISPR复合物的靶向部分。当具有靶向序列的分子与CRISPR分子同时存在时，单独或与另外的一或多种RNA分子(例如tracrRNA分子)组合的RNA分子能够将CRISPR核酸酶靶向至特定靶序列。作为非限制性实例，CRISPR RNA分子或单引导RNA分子的引导序列部分可以充当靶向分子。每种可能性代表单独的实施例。可以定制设计靶向序列以靶向任何所需序列。
本文所用的术语“靶”是指靶向分子的靶向序列优先与具有靶向核苷酸序列的核酸杂交。应当理解，术语“靶”涵盖可变的杂交效率，使得具有靶向核苷酸序列的核酸优先靶向，但除了靶上杂交外，也可能发生无意的脱靶杂交。应当理解，当RNA分子靶向序列时，RNA分子和CRISPR核酸酶分子的复合物靶向该序列以获得核酸酶活性。
RNA分子的“引导序列部分”是指能够与特定靶DNA序列杂交的核苷酸序列，例如，引导序列部分具有与沿着引导序列部分的长度被靶向的DNA序列部分或完全互补的核苷酸序列。在一些实施例中，引导序列部分的长度为17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，或大约17至50、17至49、17至48、17至47、17至46、17至45、17至44、17至43、17至42、17至41、17至40、17至39、17至38、17至37、17至36、17至35、17至34、17至33、17至31、17至30、17至29、17至28、17至27、17至26、17至25、17至24、17至22、17至21、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至22、18至20、20至21、21至22或17至20个核苷酸。引导序列部分的全长与沿着引导序列部分的长度被靶向的DNA序列完全互补。引导序列部分可以是能够与CRISPR核酸酶形成复合物的RNA分子的一部分，其中引导序列部分充当CRISPR复合物的DNA靶向部分。当具有引导序列部分的RNA分子与CRISPR分子同时存在时，单独或与另外的一或多种RNA分子(例如tracrRNA分子)组合，RNA分子能够将CRISPR核酸酶靶向特定的靶DNA序列。因此，CRISPR复合物可以通过具有引导序列部分的RNA分子与CRISPR核酸酶的直接结合或通过具有引导序列部分的RNA分子和另外的一或多种RNA分子与CRISPR核酸酶的结合来形成。每种可能性代表单独的实施例。可以定制设计引导序列部分以靶向任何所需序列。因此，包括“引导序列部分”的分子是一种类型的靶向分子。在一些实施例中，引导序列部分包括与本文所述的引导序列部分(例如，SEQ ID NO:1-12105中任一个所示的引导序列)相同或相差不超过1、2、3、4或5个核苷酸的序列。每种可能性代表单独的实施例。在这些实施例的一些中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列相同的序列。在本申请中，术语“引导分子”、“RNA引导分子”、“引导RNA分子”和“gRNA分子”与包括引导序列部分的分子同义。
本文所用的术语“非识别性”是指靶向基因的所有等位基因共有的特定DNA序列的RNA分子的引导序列部分。
在本发明的实施例中，RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
RNA分子和/或RNA分子的引导序列部分可以含有修饰的核苷酸。对核苷酸/多核苷酸的示例性修饰可以是合成的，并且涵盖含有包括除天然存在的腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤碱基以外的碱基的核苷酸的多核苷酸。对多核苷酸的修饰包含含有合成的、非天然存在的核苷的多核苷酸，例如锁定的核酸。对多核苷酸的修饰可用于增加或降低RNA的稳定性。修饰的多核苷酸的实例是含有1-甲基假尿苷的mRNA。关于修饰的多核苷酸及其用途的实例，参见美国专利8,278,036、PCT国际公开号WO/2015/006747，以及魏斯曼(Weissman)和卡里科(Kariko)(2015)，其各自以引用的方式并入本文。
如本文所用，SEQ ID NO中所示的“连续核苷酸”是指SEQ ID NO中所示顺序的核苷酸序列中的核苷酸，没有任何插入核苷酸。
在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是50个核苷酸，并且在SEQ IDNO:1-12105中任一个所示的序列中含有20至22个连续的核苷酸。在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以小于22个核苷酸。例如，在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是17、18、19、20或21个核苷酸。在此类实施例中，引导序列部分可以分别由SEQ ID NO:1-12105中任一个所示的17至22个连续核苷酸的序列中的17、18、19、20或21个核苷酸组成。例如，在SEQ ID NO:12106所示的17个连续核苷酸的序列中具有17个核苷酸的引导序列部分可以由以下核苷酸序列中的任一种组成(从连续序列中排除的核苷酸用删除线标出)：
AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:12106)
17个核苷酸引导序列1：
Figure BDA0004026229840000071
17个核苷酸引导序列2：
Figure BDA0004026229840000072
17个核苷酸引导序列3：
Figure BDA0004026229840000073
17个核苷酸引导序列4：
Figure BDA0004026229840000074
在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以大于20个核苷酸。例如，在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是21、22、23、24或25个核苷酸。在此类实施例中，引导序列部分包括17至50个核苷酸，其含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示的20、21或22个连续核苷酸的序列以及与邻近靶序列的3'端、靶序列的5'端或两者的核苷酸或核苷酸序列完全互补的另外的核苷酸。
在本发明的实施例中，CRISPR核酸酶和包括引导序列部分的RNA分子形成CRISPR复合物，其结合靶DNA序列以实现靶DNA序列的切割。CRISPR核酸酶(例如Cpf1)可以形成包括CRISPR核酸酶和RNA分子而没有另外的tracrRNA分子的CRISPR复合物。替代地，CRISPR核酸酶(例如Cas9)可以在CRISPR核酸酶、RNA分子和tracrRNA分子之间形成CRISPR复合物。包括能够与特定靶DNA序列杂交的核苷酸序列的引导序列部分和参与CRIPSR核酸酶结合的序列部分(例如tracrRNA序列部分)可以位于同一RNA分子上。替代地，引导序列部分可以位于一个RNA分子上，而参与CRIPSR核酸酶结合的序列部分(例如tracrRNA部分)可以位于单独的RNA分子上。包括引导序列部分(例如DNA靶向RNA序列)和至少一个CRISPR蛋白结合RNA序列部分(例如tracrRNA序列部分)的单个RNA分子可以与CRISPR核酸酶形成复合物并且充当DNA靶向分子。在一些实施例中，包括包含引导序列部分的DNA靶向RNA部分的第一RNA分子和包括CRISPR蛋白结合RNA序列的第二RNA分子通过碱基配对相互作用以形成将CRISPR核酸酶靶向DNA靶位点的RNA复合物，或替代地融合在一起以形成与CRISPR核酸酶复合并将CRISPR核酸酶靶向DNA靶位点的RNA分子。
在本发明的实施例中，包括引导序列部分的RNA分子可以进一步包括tracrRNA分子的序列。此类实施例可以设计为RNA分子的引导部分和反式激活crRNA(tracrRNA)的合成融合体。(参见季聂克(Jinek)等人，2012)。在此类实施例中，RNA分子是单引导RNA(sgRNA)分子。本发明的实施例还可以利用单独的tracrRNA分子和包括引导序列部分的单独的RNA分子形成CRISPR复合物。在此类实施例中，tracrRNA分子可以通过碱基配对与RNA分子杂交，并且在本文所述的本发明的某些应用中可能是有利的。
术语“tracr配对序列”是指与tracrRNA分子充分互补以便通过碱基配对与tracrRNA杂交并促进CRISPR复合物形成的序列。(参见美国专利第8,906,616号)。在本发明的实施例中，RNA分子可以进一步包括具有tracr配对序列的部分。
出于本公开的目的，“基因”包含编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包含但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
“真核”细胞包含但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。
本文所用的术语“核酸酶”是指能够切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。核酸酶可以分离自或衍生自天然来源。天然来源可以是任何活生物体。替代地，核酸酶可以是保留磷酸二酯键切割活性的经修饰或合成的蛋白质。使用核酸酶(例如CRISPR核酸酶)可以实现基因修饰。
根据本发明的实施例，提供了一种包括引导序列部分(例如靶向序列)的RNA分子，该引导序列部分包括与包括位于SARM1基因的等位基因中或附近的SNP位置(REF/SNP序列)的靶序列完全或部分互补的核苷酸序列。在一些实施例中，RNA分子的引导序列部分由16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或多于26个核苷酸组成。在一些实施例中，引导序列部分被配置以将CRISPR核酸酶靶向靶序列并通过与其复合的CRISPR核酸酶提供选自SARM1靶位点的500、400、300、200、100、50、25或10个核苷酸内的双链断裂和单链断裂的切割事件。在一些实施例中，切割事件使得SARM1基因能够无义介导的衰变。在一些实施例中，RNA分子是引导RNA分子，诸如crRNA分子或单引导RNA分子。
在一些实施例中，SARM1基因的等位基因的靶序列被改变(例如，通过引入NHEJ介导的indel(例如，插入或缺失))，并导致由SARM1基因的等位基因编码的基因产物的表达减少或消除。在一些实施例中，表达的减少或消除是由于无义介导的mRNA衰变，诸如由于不成熟的终止密码子。在一些实施例中，表达的减少或消除是由于SARM1基因产物的截短形式的表达。在一些实施例中，引导序列部分与包括SNP位置的靶序列互补。在一些实施例中，SNP位置是rs782593684。在一些实施例中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-103中任一个所示的序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的序列。在一些实施例中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:3、19-21、26、30、32、34、37、104-131、40、54、60-61、65-67、132-155、69、72、76、88、94、98、100-102或156-181中任一个所示的序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的序列。每种可能性代表单独的实施例。在一些实施例中，SNP位置17:28372349_C_CT。在一些实施例中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:182-313中任一个所示的序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的序列。在一些实施例中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:196、203、209、211、217、219-221、226、228-229、314-352、246-247、253-254、259-262、264、266-267、353-389、271、281、287-288、302-305、310、312-313或390-432中任一个所示的序列相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的序列。每种可能性代表单独的实施例。
根据本发明的实施例，提供了一种包括引导序列部分(例如靶向序列)的RNA分子，该引导序列部分包括与位于SARM1基因中或附近的靶序列完全或部分互补的核苷酸序列。在一些实施例中，引导序列部分与位于SARM1基因的外显子I、外显子II、外显子III、外显子IV、外显子V、外显子VI、外显子VII、外显子VIII或外显子IX上游30个碱基对处至下游30个碱基对处的靶序列互补。在一些实施例中，引导序列部分与位于SARM1基因的外显子I、外显子II、外显子III、外显子IV、外显子V、外显子VI、外显子VII、外显子VIII或外显子IX上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。每种可能性代表单独的实施例。在一些实施例中，SARM1基因的靶序列被改变(例如，通过引入NHEJ介导的indel(例如，插入或缺失))，并导致SARM1基因编码的基因产物的表达减少或消除。在一些实施例中，表达的减少或消除是由于无义介导的mRNA衰变。在一些实施例中，RNA分子的引导序列部分由16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或多于26个核苷酸组成。在一些实施例中，引导序列部分被配置以将CRISPR核酸酶靶向靶序列并通过与其复合的CRISPR核酸酶提供选自SARM1靶位点的500、400、300、200、100、50、25或10个核苷酸内的双链断裂和单链断裂的切割事件。在一些实施例中，切割事件使得SARM1基因能够无义介导的衰变。在一些实施例中，RNA分子是引导RNA分子，诸如crRNA分子或单引导RNA分子。
在一些实施例中，引导序列部分与位于SARM1基因的外显子上游30个碱基对处至下游30个碱基对处的靶序列互补。在一些实施例中，引导序列部分与位于SARM1基因的外显子上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。在一些实施例中，引导序列部分与位于SARM1基因的外显子上游7个碱基对处至下游7个碱基对处的靶序列互补。在一些实施例中，外显子是外显子I，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-30、32、34、36-37、182-229、1099-1838、38-67、230-238、240-251、253-257、259-267、1839-2531、69-102、268-293、295-300、302-313或2532-3227中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子II，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:3228-6803中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子III，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:6804-8007中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子IV，并且引导序列部分包括与SEQID NO:8008-8487中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子V，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:8488-9831中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子VI，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:9832-10377中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子VII，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:10378-11445中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子VIII，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:11446-12105中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。在一些实施例中，外显子是外显子IX，并且引导序列部分包括与SEQ ID NO:433-1098中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。
根据本发明的实施例，提供了一种用于使细胞中含有不育α和TIR基序的1(SARM1)基因的等位基因失活的方法，该方法包括
向细胞中引入组合物，该组合物包括：
至少一种CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的序列；以及
包括引导序列的RNA分子，
其中CRISPR核酸酶和RNA分子的复合物影响SARM1基因的等位基因中的双链断裂，
其中RNA分子的引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，这些连续核苷酸含有SEQID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
在一些实施例中，将组合物引入至受试者的细胞或培养物中的细胞。
在一些实施例中，细胞是感光细胞，优选地视杆细胞或视锥细胞。
在一些实施例中，CRISPR核酸酶和RNA分子在基本上相同的时间或在不同的时间引入至细胞。
在一些实施例中，细胞中SARM1基因的等位基因进行插入或缺失突变。
在一些实施例中，插入或缺失突变产生早期终止密码子。
在一些实施例中，失活导致由突变等位基因编码的截短蛋白。
根据本发明的实施例，提供了本文所述的任一种组合物用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的用途，其包括将组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者。
根据本发明的实施例，提供了一种包括本文所述的任一种组合物的药物，用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性，使得该药物通过将组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者来加以施用。
根据本发明的实施例，提供了一种用于使细胞中的SARM1等位基因失活的试剂盒，其包括本文所述的任一种组合物和将该组合物递送至细胞的说明书。
根据本发明的实施例，提供了一种用于治疗或预防受试者的色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的试剂盒，其包括本文所述的任一种组合物和用于将该组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的说明书。
根据本发明的实施例，提供了一种包括RNA分子的组合物，该RNA分子包括17至50个连续核苷酸，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
在一些实施例中，组合物进一步包括CRISPR核酸酶。
在一些实施例中，组合物进一步包括tracrRNA分子。
根据本发明的实施例，提供了一种包括RNA分子的基因编辑组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。在一些实施例中，RNA分子进一步包括具有结合CRISPR核酸酶的序列的部分。在一些实施例中，结合CRISPR核酸酶的序列是tracrRNA序列。
在一些实施例中，RNA分子进一步包括具有tracr配对序列的部分。
在一些实施例中，RNA分子可以进一步包括一或多个接头部分。
根据本发明的实施例，RNA分子的长度可以高达1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110或100个核苷酸。每种可能性代表单独的实施例。在本发明的实施例中，RNA分子的长度可以是17至300个核苷酸、100至300个核苷酸、150至300个核苷酸、100至500个核苷酸、100至400个核苷酸、200至300个核苷酸、100至200个核苷酸或150至250个核苷酸。每种可能性代表单独的实施例。
根据本发明的一些实施例，组合物进一步包括tracrRNA分子。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于使细胞中SARM1表达失活的方法，该方法包括向细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的一些实施例，提供了一种用于预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的方法，该方法包括向受试者的细胞递送包括RNA分子和CRISPR核酸酶的组合物，该RNA分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
根据本发明的实施例，将至少一种CRISPR核酸酶和一或多种RNA分子基本上同时或在不同的时间递送至受试者和/或细胞。
在一些实施例中，将tracrRNA分子与CRISPR核酸酶和一或多种RNA分子基本上同时或在不同的时间递送至受试者和/或细胞。
本公开的组合物和方法可用于治疗、预防、改善或减缓色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的进展。
上述用于使SARM1表达失活的策略中的任一种或其组合可用于本发明的上下文中。
在本发明的实施例中，RNA分子用于将CRISPR核酸酶导向SARM1等位基因的外显子或剪接位点以产生双链断裂(DSB)，通过诱导易错的非同源末端连接(NHEJ)机制和在SARM1等位基因中形成移码突变而导致核苷酸的插入或缺失。移码突变可通过在SARM1等位基因中生成早期终止密码子而导致例如SARM1等位基因的失活或敲除，并导致截短蛋白的生成或等位基因转录物的无义介导的mRNA衰变。在其它实施例中，一种RNA分子用于将CRISPR核酸酶导向SARM1等位基因的启动子。
在一些实施例中，该方法用于治疗具有视网膜色素变性、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性风险的受试者，这些疾病是由SARM1基因的表达引起的疾病表型。在此类实施例中，该方法导致疾病表型的改善、缓解或预防。
本文所述的组合物的实施例包含至少一种CRISPR核酸酶、RNA分子和tracrRNA分子，其在受试者或细胞中同时有效。至少一种CRISPR核酸酶、RNA分子和tracrRNA可以基本上同时递送或可以在不同的时间递送，但同时起作用。例如，这包含在RNA分子和/或tracrRNA基本上存在于受试者或细胞中之前将CRISPR核酸酶递送至受试者或细胞。
在一些实施例中，细胞是视杆细胞。在一些实施例中，细胞是视锥细胞。在一些实施例中，细胞是感光细胞。
SARM1编辑策略
许多健康个体在其基因组中具有SARM1的双等位基因敲除。因此，本发明提供了敲除受试者细胞(优选地感光细胞)中的SARM1等位基因的方法，从而抑制光感受器变性而不会对受试者造成伤害。所提供的敲除细胞中的SARM1等位基因的方法可用于治疗、预防或改善色素性视网膜炎、光感受器变性和年龄相关性黄斑变性中的任一种。
SARM1编辑策略包含但不限于：(1)通过靶向外显子2-9中的任何一个或组合进行双等位基因敲除，包含在外显子上游和下游的七个核苷酸内以侧接剪接供体和受体位点，因为这些外显子中的移码导致非功能性截短的SARM1蛋白或突变的SARM1转录物的无义介导的衰变；和(2)通过介导外显子1中位于外显子中第二个甲硫氨酸密码子上游或与其重叠的indels来消除SARM1蛋白进行SARM1蛋白的截短，从而防止翻译的重新起始，或通过靶向外显子1-内含子1连接来破坏剪接供体。
CRISPR核酸酶和PAM识别
在一些实施例中，序列特异性核酸酶选自CRISPR核酸酶，或是其功能变体。在一些实施例中，序列特异性核酸酶是RNA引导的DNA核酸酶。在此类实施例中，引导RNA引导的DNA核酸酶(例如，Cpf1)的RNA序列结合细胞中的所有SARM1等位基因和/或将RNA引导的DNA核酸酶导向细胞中的所有SARM1等位基因。在一些实施例中，CRISPR复合物不进一步包括tracrRNA。在一个非限制性实例中，其中RNA引导的DNA核酸酶是CRISPR蛋白，在显性SARM1等位基因和功能性等位基因之间不同的至少一个核苷酸可以在RNA分子设计杂交的区域内的PAM位点内和/或接近PAM位点。本领域技术人员将理解，可以通过本领域通常已知的方法将RNA分子工程化以结合基因组中选择的靶。
本文所用的术语“PAM”是指位于靶DNA序列附近并被CRISPR核酸酶复合物识别的靶DNA的核苷酸序列。PAM序列可以根据核酸酶的特性而不同。另外，存在可靶向几乎所有PAM的CRISPR核酸酶。在本发明的一些实施例中，CRISPR系统利用一或多种具有引导序列部分的RNA分子，以通过引导序列部分和靶DNA位点上的原型间隔区之间的沃森-克里克碱基配对将CRISPR核酸酶导向靶DNA位点，靶DNA位点紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)，这是靶识别的额外要求。CRISPR核酸酶然后介导靶DNA位点的切割以在原型间隔区内产生双链断裂。在一个非限制性实例中，一种II型CRISPR系统利用成熟的crRNA:tracrRNA复合物，其通过crRNA的引导序列部分与靶DNA上紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)的原型间隔区之间的沃森-克里克碱基配对将CRISPR核酸酶(例如Cas9)导向靶DNA。本领域技术人员将理解，本发明的工程化RNA分子中的每一个被进一步设计成与紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)的感兴趣的靶基因组DNA序列缔合，例如与所用CRISPR核酸酶的类型相关的序列匹配的PAM，诸如作为非限制性实例，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9 WT(SpCAS9)的NGG或NAG，其中“N”是任何核碱基；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)的NNGRRT；空肠弯曲杆菌(Jejuni)Cas9 WT的NNNVRYM；SpCas9-VQR变体的NGAN或NGNG；SpCas9-VRER变体的NGCG；SpCas9-EQR变体的NGAG；SpCas9-NRRH变体的NRRH，其中N是任何核碱基，R是A或G且H是A、C或T；SpCas9-NRTH变体的NRTH，其中N是任何核碱基，R是A或G且H是A、C或T；SpCas9-NRCH变体的NRCH，其中N是任何核碱基，R是A或G且H是A、C或T；SpCas9的SpG变体的NG，其中N是任何核碱基；SpCas9的SpCas9-NG变体的NG或NA，其中N是任何核碱基；SpCas9的SpRY变体的NR或NRN或NYN，其中N是任何核碱基，R是A或G且Y是C或T；狗链球菌(Streptococcuscanis)Cas9变体(ScCas9)的NNG，其中N是任何核碱基；金黄色葡萄球菌的SaKKH-Cas9变体(SaCas9)的NNNRRT，其中N是任何核碱基，且R是A或G；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)(NmCas9)的NNNNGATT，其中N是任何核碱基；嗜热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)Cas12b(AacCas12b)的TTN，其中N是任何核碱基；或Cpfl的TTTV，其中V是A、C或G。本发明的RNA分子各自被设计成与一或多种不同的CRISPR核酸酶形成复合物，并且被设计成利用对应于所利用的CRISPR核酸酶的一或多种不同的PAM序列来靶向感兴趣的多核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA引导的DNA核酸酶(例如，CRISPR核酸酶)可用于在细胞基因组中的所需位置处引起天然双链或单链的DNA断裂。最常用的RNA引导的DNA核酸酶衍生自CRISPR系统，然而，其它RNA引导的DNA核酸酶也预期用于本文所述的基因组编辑组合物和方法中。例如，参见美国公开号2015/0211023，其通过引用并入本文。
可用于实施本发明的CRISPR系统变化很大。CRISPR系统可以是I型、II型或III型系统。合适的CRISPR蛋白的非限制性实例包含Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Casl0、Casl Od、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csxl0、Csxl6、CsaX、Csx3、Cszl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966。
在一些实施例中，RNA引导的DNA核酸酶是衍生自II型CRISPR系统(例如，Cas9)的CRISPR核酸酶。CRISPR核酸酶可以衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝杆藻(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德氏制氨菌(Ammonifex degensii)、贝氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、暂定脱硫细杆菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difjicile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热厌氧钠杆菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沐节球藻(Nodularia spumigena)、球形念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、海洋蓝藻菌(Acaryochloris marina)，或编码具有已知PAM序列的CRISPR核酸酶的任何物种。由未培养的细菌编码的CRISPR核酸酶也可用于本发明的上下文中。(参见伯斯坦(Burstein)等人《自然(Nature)》，2017)。具有已知PAM序列的CRIPSR蛋白的变体(例如，SpCas9 D1135E变体，SpCas9 VQR变体，SpCas9 EQR变体或SpCas9 VRER变体)也可用于本发明的上下文中。
因此，CRISPR系统的RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas9蛋白或修饰的Cas9或Cas9的同源物或直向同源物)，或属于其它类型的CRISPR系统的其它RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cpf1及其同源物和直向同源物)可以用于本发明的组合物中。也可以使用另外的CRISPR核酸酶，例如，在PCT国际申请公开号WO2020/223514和WO2020/223553中描述的核酸酶，其各自通过引用并入本文。
在某些实施例中，CRIPSR核酸酶可以是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽相同的定性生物学性质的化合物。“功能衍生物”包含但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽相同的生物活性。本文考虑的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合体。Cas多肽或其片段的合适衍生物包含但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰体。Cas蛋白，其包含Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段的衍生物，可以从细胞获得或通过化学方法或通过这两种方法的组合合成。细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞，或天然产生Cas蛋白并且经遗传工程改造以产生较高表达水平的内源性Cas蛋白或从外源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞，核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，细胞不天然产生Cas蛋白，并且经基因工程改造以产生Cas蛋白。
在一些实施例中，CRISPR核酸酶是Cpf1。Cpf1是利用富含T的原型间隔区相邻基序的单一RNA引导的核酸内切酶。Cpf1通过交错的DNA双链断裂切割DNA。来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)的两种Cpf1酶已显示在人类细胞中实现有效的基因组编辑活性。(参见蔡澈(Zetsche)等人，2015)。
因此，II型CRISPR系统的RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas9蛋白或修饰的Cas9或Cas9的同源物、直向同源物或变体)，或属于其它类型的CRISPR系统的其它RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cpf1及其同源物、直向同源物或变体)可以用于本发明中。
在一些实施例中，引导分子包括一或多种化学修饰，其赋予新的或改善的性质(例如，改善的降解稳定性、改善的杂交能量学或改善的与RNA引导的DNA核酸酶的结合性质)。合适的化学修饰包含但不限于：修饰的碱基、修饰的糖部分或修饰的核苷间键。合适的化学修饰的非限制性实例包含：4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、“β,D-半乳糖基辫苷”、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、“2,2-二甲基鸟苷”、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、“β,D-甘露糖基辫苷”、5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、怀丁氧苷(wybutoxosine)、辫苷(queuosine)、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷(wybutosine)、“3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3)u”、2'-O-甲基(M)、3'-硫代磷酸酯(MS)、3'-硫代PACE(MSP)、假尿苷(pseudouridine)，或1-甲基假尿苷。每种可能性代表本发明的单独实施例。
除了通过RNA引导的CRISPR核酸酶靶向SARM1等位基因之外，抑制SARM1在靶细胞(优选地感光细胞)中表达的其它方法包含但不限于使用gapmer、shRNA、siRNA、定制的TALEN、大范围核酸酶或锌指核酸酶、小分子抑制剂，以及本领域已知的用于减少或消除基因在靶细胞中的表达的任何其它方法。参见，例如，美国专利第6,506,559号；第7,560,438号；第8,420,391号；第8,552,171号；第7,056,704号；第7,078,196号；第8,362,231号；第8,372,968号；第9,045,754号；和PCT国际公布号WO/2004/067736；WO/2006/097853；WO/2003/087341；WO/2000/041566l；WO/2003/080809；WO/2010/079430；WO/2010/079430；WO/2011/072246；WO/2018/057989；以及WO/2017/164230，其各自的全部内容通过引用并入本文。
有利地，当与细胞中的CRISPR核酸酶复合时，相对于其它引导RNA分子，包括本文提供的至少一个引导序列部分的引导RNA分子提供了改善的SARM1敲除效率。这些特别设计的序列也可用于为其它基于核苷酸靶向的基因编辑或基因沉默方法(例如，siRNA、TALEN、大范围核酸酶或锌指核酸酶)鉴定SARM1靶位点。
递送至细胞
本文所述的任一种组合物可以通过任何合适的方式递送至靶细胞。本发明的RNA分子组合物可以靶向含有和/或表达SARM1等位基因的任何细胞，诸如哺乳动物感光细胞(例如视杆细胞或视锥细胞)。例如，在一个实施例中，RNA分子特异性靶向靶细胞中的SARM1等位基因，并且靶细胞是感光细胞。在一些实施例中，靶细胞是视杆细胞。在一些实施例中，靶细胞是视锥细胞。向细胞的递送可以在体内、离体或体外进行。此外，本文所述的核酸组合物可以作为DNA分子、RNA分子、核糖核蛋白(RNP)、核酸载体或其任何组合中的一或多种递送至细胞。
在一些实施例中，RNA分子包括化学修饰。合适的化学修饰的非限制性实例包含2'-0-甲基(M)、2'-0-甲基、3'硫代磷酸酯(MS)或2'-0-甲基、3'硫代PACE(MSP)、假尿苷和1-甲基假尿苷。每种可能性代表本发明的单独实施例。
任何合适的病毒载体系统可用于递送核酸组合物，例如本发明的RNA分子组合物。常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于导入核酸和靶组织。在某些实施例中，施用核酸用于体内或离体基因治疗用途。非病毒载体递送系统包含裸核酸和与递送载体(诸如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer))复合的核酸。关于基因治疗方法的综述，参见安德森(Anderson)(1992)；纳贝尔(Nabel)和费尔格纳(Felgner)(1993)；三谷(Mitani)和卡斯基(Caskey)(1993)；狄龙(Dillon)(1993)；米勒(Miller)(1992)；范·戴恩(Van Brunt)(1988)；瓦因(Vigne)(1995)；克雷默(Kremer)和佩里科代(Perricaudet)(1995)；哈达德(Haddada)等人(1995)；和于(Yu)等人(1994)。
核酸和/或蛋白质的非病毒递送方法包含电穿孔、脂质转染、显微注射、生物弹射、基因枪加速、病毒体、脂质体、免疫脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、人工病毒体和试剂增强的核酸摄取或可通过细菌或病毒(例如，土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboiummeliloti)、中慢生型百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)和木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus))递送至植物细胞。(参见，例如，钟(Chung)等人，2006)。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可用于递送核酸。阳离子脂质介导的蛋白质和/或核酸的递送也被认为是体内、离体或体外递送方法。(参见祖易斯(Zuris)等人(2015)；另见科埃略(Coelho)等人(2013)；贾奇(Judge)等人(2006)；和巴沙(Basha)等人(2011))。
非病毒载体，诸如基于转座子的系统，例如重组睡美人转座子系统或重组PiggyBac转座子系统，也可被递送至靶细胞并用于在靶细胞中转座组合物分子的多核苷酸序列或编码组合物分子的多核苷酸序列。
另外的示例性核酸递送系统包含由Amaxa.RTM.生物系统(德国科隆)、Maxcyte公司(马里兰州罗克维尔市)、BTX分子递送系统(马萨诸塞州霍利斯顿)和CopernicusTherapeutics公司(参见，例如，美国专利第6,008,336号)提供的那些。脂质转染描述于例如美国专利第5,049,386号、美国专利第4,946,787号；和美国专利第4,897,355号，和脂质转染试剂是商业上销售的(例如，Transfectam.TM.、Lipofectin.TM.和Lipofectamine.TM.RNAiMAX)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包含PCT国际公开号WO/1991/017424和WO/1991/016024中公开的那些。可以递送至细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。
脂质：核酸复合物(包含靶向脂质体(诸如免疫脂复合物))的制备是本领域技术人员熟知的(参见，例如，克里斯特尔(Crystal)，《科学(Science)》(1995)；布莱泽(Blaese)等人，(1995)；贝尔(Behr)等人，(1994)；雷米(Remy)等人(1994)；高(Gao)和黄(Huang)(1995)；阿哈默德(Ahmad)和艾伦(Allen)(1992)；美国专利第4,186,183号；第4,217,344号；第4,235,871号；第4,261,975号；第4,485,054号；第4,501,728号；第4,774,085号；第4,837,028号；和第4,946,787号)。
其它递送方法包含将待递送的核酸包装到EnGeneIC递送载体(EDV)中。使用双特异性抗体将这些EDV特异性递送至靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一个臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV带入细胞。一旦进入细胞，释放内容物(参见麦克迪尔米德(MacDiarmid)等人，2009)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统进行病毒介导的核酸递送，利用了高度进化的过程将病毒靶向体内的特定细胞，并将病毒有效载荷运输至细胞核。病毒载体可直接施用于患者(体内)或它们可用于体外治疗细胞并将修饰的细胞施用于患者(离体)。用于递送核酸的常规基于病毒的系统包含但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒载体。
通过掺入外源包膜蛋白，扩大靶细胞的潜在靶群体，可以改变逆转录病毒的向性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由包装容量高达6至10kb的外源序列的顺式作用长末端重复序列组成。最小的顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后将其用于将治疗性基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包含基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见，例如，布赫沙赫(Buchschacher)等人(1992)；约翰(Johann)等人(1992)；索默费尔特(Sommerfelt)等人(1990)；威尔逊(Wilson)等人(1989)；米勒(Miller)等人(1991)；PCT国际公开号WO/1994/026877A1)。
目前至少有六种病毒载体方法可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系的基因互补缺陷载体以生成转导剂的方法。
pLASN和MFG-S是已经用于临床试验的逆转录病毒载体的实例(参见邓巴(Dunbar)等人，1995；科恩(Kohn)等人，1995；马莱奇(Malech)等人，1997)。PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一种治疗载体(布莱泽(Blaese)等人，1995)。已经观察到MFG-S包装的载体的转导效率为50％或更高。(埃勒姆(Ellem)等人，(1997)；德拉诺夫(Dranoff)等人，1997)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这些细胞包含包装腺病毒、AAV的293细胞和包装逆转录病毒的Psi-2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常由将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系生成。载体通常含有包装和随后整合入宿主(如果适用)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待表达蛋白质的表达盒取代。缺失的病毒功能由包装细胞系反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，其对于包装和整合到宿主基因组中是必需的。病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其它AAV基因(即rep和cap)但缺乏ITR序列的辅助质粒。该细胞系也用作为辅助病毒的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因从辅助质粒的表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒没有以显著量包装。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒对热处理比AAV更敏感。另外，可以使用杆状病毒系统以临床规模生产AAV(参见美国专利第7,479,554号)。
在许多基因治疗应用中，希望基因治疗载体对特定组织类型具有高度特异性。因此，通过将配体表达为病毒外表面上具有病毒外壳蛋白的融合蛋白，可以修饰病毒载体，使其对给定的细胞类型具有特异性。选择对已知存在于感兴趣的细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，韩(Han)等人(1995)报道了莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murineleukemia virus)可以被修饰以表达与gp70融合的人调节蛋白(heregulin)，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这一原理可扩展到其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，病毒表达包括细胞表面受体配体的融合蛋白。例如，可以工程化丝状噬菌体以展示对几乎任何选择的细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管上述描述主要应用于病毒载体，但相同的原理可应用于非病毒载体。此类载体可以被工程化以含有有利于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
基因治疗载体可以通过施用于个体患者体内递送，例如通过全身施用(例如，玻璃体内、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用，如下所述。优选地，本文公开的任一种组合物的递送在体内递送至受试者眼睛内的感光细胞，以敲除视网膜感光细胞中的SARM1表达。可以通过几种已知的方式将组合物递送至感光细胞，包含通过使用病毒载体(例如慢病毒、腺伴随病毒(AAV)等)、纳米颗粒或递送裸RNA组合物。组合物可以通过视网膜下注射、玻璃体内注射或脉络膜内注射在体内递送至眼睛的感光细胞。
替代地，可将载体离体递送至细胞，例如从个体患者中取出的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检)或通用供体造血干细胞，随后将细胞再植入患者体内，任选地在选择整合了载体的细胞后进行。非限制性示例性离体方法可涉及从患者体内取出组织(例如，外周血、骨髓和脾)用于培养，将核酸转移至培养的细胞(例如，造血干细胞)，然后将细胞移植至患者的靶组织(例如，骨髓和脾)。在一些实施例中，干细胞或造血干细胞可以进一步用生存力增强剂处理。
用于诊断、研究或用于基因治疗的离体细胞转染(例如，通过将转染的细胞再输注到宿主生物体中)是本领域技术人员熟知的。在优选的实施例中，细胞从受试者生物体分离，用核酸组合物转染，并再输注回受试者生物体(例如，患者)。适合于离体转染的各种细胞类型是本领域技术人员熟知的(参见，例如，弗雷谢尼(Freshney)，《动物细胞的培养，基本技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique andSpecialized Applications)》(第6版，2010)和其中引用的关于如何从患者中分离和培养细胞的讨论的参考文献)。
含有治疗性核酸组合物的载体(例如，逆转录病毒、脂质体等)也可直接施用于生物体用于体内转导细胞。施用是通过通常用于将分子引入最终与血液或组织细胞接触的任何途径，包含但不限于注射、输注、局部施用(例如，滴眼剂和乳膏)和电穿孔。施用此类核酸的合适方法是可获得的并且是本领域技术人员熟知的，并且，尽管可以使用多于一种途径来施用特定的组合物，但是特定的途径通常可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。根据一些实施例，组合物通过IV注射递送。
适于将转基因导入免疫细胞(例如，T细胞)的载体包含非整合性慢病毒载体。参见，例如，美国公开号2009/0117617。
药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在多种可用的药物组合物的合适制剂，如下所述(参见，例如，《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第17版，1989)。
所公开的组合物和方法还可用于制备治疗患者显性遗传疾病的药物。
特异性靶向SARM1基因等位基因的RNA引导序列部分的实例
包含可与SARM1序列以某种形式相互作用的序列的公开内容包含PCT国际申请公开号WO2016/011080、WO2007/096854、WO2008/021290、WO2011/029914和美国公开号2018/0245164，其各自通过引用并入本文。尽管可以设计大量引导序列以靶向SARM1基因，但描述于表1中并由SEQ ID NO:1-12105标识的核苷酸序列被特别选择以有效地实施本文所述的方法。
表1示出了设计用于如上述实施例中所述与SARM1等位基因缔合的引导序列。每个工程化的引导分子被进一步设计成与紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)的感兴趣的靶基因组DNA序列缔合，例如与序列NGG或NAG匹配的PAM缔合，其中“N”是任何核碱基。设计引导序列以与一或多种不同的CRISPR核酸酶联合起作用，包含但不限于例如SpCas9WT(PAM SEQ:NGG)、SpCas9.VQR.1(PAM SEQ:NGAN)、SpCas9.VQR.2(PAM SEQ:NGNG)、SpCas9.EQR(PAMSEQ:NGAG)、SpCas9.VRER(PAM SEQ:NGCG)、SaCas9WT(PAM SEQ:NNGRRT)、SpRY(PAM SEQ:NRN或NYN)、NmCas9WT(PAM SEQ:NNNNGATT)、Cpf1(PAM SEQ:TTTV)或JeCas9WT(PAM SEQ:NNNVRYM)。本发明的RNA分子各自被设计成与一或多种不同的CRISPR核酸酶结合形成复合物，并且被设计成利用对应于所利用的CRISPR核酸酶的一或多种不同的PAM序列来靶向感兴趣的多核苷酸序列。
表1：设计用于与特定SARM1基因靶缔合的引导序列部分
Figure BDA0004026229840000221
Figure BDA0004026229840000231
表1第1列中列出的指定位置基于gnomAD v3数据库和UCSC基因组浏览器装配ID:hg38，测序/装配供应商ID:人类基因组参考联盟GRCh38.p12(GCA_000001405.27)。装配日期：2013年12月首次发布；2017年12月12日补丁版本发布。
下面提供实例以便于更完整地理解本发明。以下实例说明了制备和实施本发明的示例性方式。然而，本发明的范围不限于这些实例中公开的具体实施例，这些实例仅用于说明的目的。
实验细节
实例1：SARM1校正分析
在HeLa细胞中使用SpCas9筛选包括17至50个连续核苷酸的引导序列部分的高靶上活性，这些连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。通过DNA毛细管电泳分析测定靶上活性。
实例2：另外的SARM1编辑分析
含有不育α和Toll/白介素-1受体基序的1(SARM1)是NAD+水解酶，其活性与轴突变性有关。为了选择SARM1双等位基因敲除的最佳RNA引导分子，在HeLa细胞中筛选了23种靶向SARM1外显子的RNA引导分子(表2)。简言之，使用
Figure BDA0004026229840000241
试剂(Polyplus公司)以96孔板形式将SpCas9编码质粒(64ng)与表达RNA引导分子的DNA质粒(20ng)共转染。DNA转染后72小时收获细胞，提取基因组DNA并使用扩增内源基因组区域的引物用于毛细管电泳。图1A中的图表示三(3)个独立实验的编辑％±标准偏差(STDV)的平均值。所有RNA引导分子的毛细管电泳数据分析显示活性范围为10％至90％。
另外，用OMNI-50(SEQ ID NO:12119)和OMNI-79(SEQ ID NO:12120)CRISPR核酸酶在HeLa细胞中进行筛选。转染条件与针对SpCas9转染描述的条件相同。通过下一代测序(NGS)分析测量编辑效率。对于OMNI-50，g13编辑效率为43％(STDV＝3.94)。对于OMNI-79，g33编辑效率为35％(STDV＝4.2)。参见图1B。RNA引导分子的引导序列部分列于表4中。
为了验证通过无义介导的衰变(NMD)赋予Sarm1敲除的RNA引导分子，使用表达SARM1的小鼠Neuro-2a细胞。为了测试来自HeLa筛选的靶向人SARM1的十(10)个最具活性的引导RNA分子的作用，我们鉴定了靶向小鼠SARM1 DNA的十(10)个小鼠特异性引导RNA分子，其对应于人引导RNA分子。在小鼠细胞中测试小鼠RNA引导分子的活性。简言之，将150x103个Neuro-2a细胞与由105皮摩尔SpCas9蛋白和120皮摩尔sgRNA组成的预装配RNP(参见表3)混合，与100皮摩尔电穿孔增强剂(IDT-1075916)混合，并通过应用DS-134程序使用SF细胞4D-核转染器X试剂盒S(PBC2-00675，龙沙公司(Lonza))进行电穿孔。电穿孔72小时后收获细胞部分，提取基因组DNA以通过NGS测量靶上活性。根据NGS分析，所有引导RNA分子描绘了高插入或缺失(indel)活性(图2)。
为了评估编辑对SARM1转录物水平的影响，在电穿孔后七(7)天从Neuro-2a细胞中提取总RNA，并通过qRT-PCR测量Sarm1的mRNA水平。结果表明，由于无义介导的衰变(NMD)，Sarm1 mRNA水平降低超过80％(图3)。
接下来，测试了显示独特PAM要求的新型CRISPR核酸酶OMNI-103(SEQ ID NO:12121)对SARM1的编辑。如上所述，在HeLa细胞中测试了这种核酸酶。为此，使用相应的OMNI-P2A-mCherry表达载体(pmOMNI，表7)以及设计用于靶向人基因组中特定位置的sgRNA分子(表5A中所列的引导序列部分(gRNA)序列)将OMNI-103转染到HeLa细胞中。在72小时，收获细胞，使用mCherry荧光作为标记，通过FACS将一半细胞用于定量转染效率。将剩余的细胞裂解，并将它们的基因组DNA含量用于PCR反应，该PCR反应扩增相应的推定基因组靶。将扩增子进行NGS，然后使用所得序列计算每个靶位点中编辑事件的百分比。切割位点周围的短插入或缺失(indels)是核酸酶诱导的DNA切割后DNA末端修复的典型结果。因此，编辑％的计算从每个扩增子中含有indels的序列的比例推导出来。参见表5B和图4。
表2：靶向人SARM1编码序列的20-核苷酸引导序列部分序列
引导序列部分(gRNA) gRNA的序列 PAM
g1 GGCCCAUGGUGGGCUGCGGG(SEQ ID NO:28) UGG
g2 GCGCCUGCUGGAGCAGAUCC(SEQ ID NO:1584) UGG
g3 CUCCACCAGUUGGAAGACCU(SEQ ID NO:1426) CGG
g4 AGAGACCGCGUGGCGCGCAU(SEQ ID NO:3315) UGG
g5 CGUGAUCCUGAACCUGGCGA(SEQ ID NO:3735) AGG
g6 GGCAACUGCGCGCUGCACGG(SEQ ID NO:4112) GGG
g7 GGCGAGCGGGAAGAGCCACU(SEQ ID NO:4139) CGG
g8 CAUCCAGAGCCUGAAACGCC(SEQ ID NO:6900) UGG
g9 UGCUGGGCGAGGAGGUGCCA(SEQ ID NO:7179) CGG
g10 AGCAACCUGGCGGACUGGCU(SEQ ID NO:8522) GGG
g11 GGCGGACUGGCUGGGCAGCC(SEQ ID NO:8816) UGG
g12 ACACGCGGUGCAGCAGGGAG(SEQ ID NO:8496) CGG
g13 CUCAGACACGCGGUGCAGCA(SEQ ID NO:8677) GGG
g14 CACUCCCCGCUGCCCUGUAC(SEQ ID NO:9875) UGG
g15 UCCCCGCUGCCCUGUACUGG(SEQ ID NO:9990) UGG
g16 UGCCACCAGUACAGGGCAGC(SEQ ID NO:9998) GGG
g17 AAGGUGCACCUGCAGCUGCA(SEQ ID NO:10389) UGG
g18 CAUGCAAGACCAUGACUGCA(SEQ ID NO:10498) AGG
g19 GCAGCUGCAGGUGCACCUUC(SEQ ID NO:10591) AGG
g20 GCACCCAAUCCUUGCAGUCA(SEQ ID NO:10586) UGG
g21 AUUGUGACUGCUUUAAGCUG(SEQ ID NO:11491) CGG
g22 AACAUUGUGCCCAUCAUUGA(SEQ ID NO:11447) UGG
g23 CACUCGAAGCCAUCAAUGAU(SEQ ID NO:11498) GGG
表3：靶向小鼠Sarm1编码序列的20-核苷酸引导序列部分序列
Figure BDA0004026229840000251
Figure BDA0004026229840000261
表4：靶向人SARM1编码序列的22-核苷酸引导序列部分序列
Figure BDA0004026229840000262
表5A：位于SARM1区域中的靶向SNP的22-核苷酸引导序列部分序列
引导序列部分(gRNA) 引导序列部分的序列
g42 CGCGCGGCCUGCACACGCGUCU(SEQ ID NO:2788)
g43 CGCCACUGCGCGCUGGCGCUGG(SEQ ID NO:6022)
g44 GUGUCUGAGCAGCAGCUGCUGG(SEQ ID NO:9753)
g45 GAUGUCUUCAUCAGCUACCGCC(SEQ ID NO:10302)
表5B：定量结果如图4所示
Figure BDA0004026229840000263
表6：新型OMNI CRISPR核酸酶、PAM需求和sgRNA支架序列
Figure BDA0004026229840000264
Figure BDA0004026229840000271
表7：OMNI CRISPR核酸酶哺乳动物表达质粒和元件
Figure BDA0004026229840000272
表7附录
元件 氨基酸序列的SEQ ID NO DNA序列的SEQ ID NO
HA标签 SEQ ID NO:12128 SEQ ID NO:12132
NLS SEQ ID NO:12129 SEQ ID NO:12133
P2A SEQ ID NO:12130 SEQ ID NO:12134
mCherry SEQ ID NO:12131 SEQ ID NO:12135
参考文献
1.阿哈默德(Ahmad)和艾伦(Allen)(1992)《体外抗体介导的脂质体包裹的阿霉素对肺癌细胞的特异性结合和细胞毒性(Antibody-mediated Specific Binging andCytotoxicity of Lipsome-entrapped Doxorubicin to Lung Cancer Cells inVitro)》，《癌症研究(Cancer Research)》52:4817-20。
2.安德森(Anderson)(1992)《人类基因治疗(Human gene therapy)》，《科学(Science)》256:808-13。
3.巴沙(Basha)等人(2011)《阳离子脂质组成对siRNA脂质纳米颗粒制剂在抗原呈递细胞中基因沉默特性的影响(Influence of Cationic Lipid Composition on GeneSilencing Properties of Lipid Nanoparticle Formulations of siRNA in Antigen-Presenting Cells)》，《分子治疗(Mol.Ther.)》19(12):2186-200。
4.贝尔(Behr)(1994)《用合成阳离子两亲物进行基因转移：基因治疗的前景(Genetransfer with synthetic cationic amphiphiles:Prospects for gene therapy)》，《生物共轭化学(Bioconjuage Chem)》5:382-89。
5.布莱泽(Blaese)(1995)《癌症治疗中的载体：它们将如何递送(Vectors incancer therapy:how will they deliver)》，《癌症基因治疗(Cancer Gene Ther.)》2:291-97。
6.布莱泽等人(1995)《用于ADA-SCID的T淋巴细胞定向基因治疗：4年后的初步试验结果(T lympocyte-directed gene therapy for ADA-SCID:initial trial resultsafter 4 years)》，《科学》270(5235):475-80。
7.布赫沙赫(Buchschacher)和潘加尼班(Panganiban)(1992)《用于诱导表达外源基因的人类免疫缺陷病毒载体(Human immunodeficiency virus vectors for inducibleexpression of foreign genes)》，《病毒学杂志(J.Virol.)》66:2731-39。
8.伯斯坦(Burstein)等人(2017)《来自未培养微生物的新型CRISPR-Cas系统(NewCRISPR-Cas systems from uncultivated microbes)》，《自然(Nature)》542:237-41。
9.张(Chang)和威尔逊(Wilson)(1987)《相对于哺乳动物细胞中的同源重组，DNA末端的修饰可以减少末端连接(Modification of DNA ends can decrease end-joiningrelative to homologous recombination in mammalian cells)》，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》84:4959-4963。
10.钟(Chung)等人(2006)《土壤杆菌属不单用：基因通过病毒和其它细菌转移到植物(Agrobacterium is not alone:gene transfer to plants by viruses and otherbacteria)》，《植物科学发展趋势(Trends Plant Sci.)》11(1):1-4。
11.科埃略(Coelho)等人(2013)《RNAi治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的安全性和功效(Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis)》，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》369，819-829。
12.科利亚斯(Collias)和拜塞尔(Beisel)(2021)《CRISPR技术和无PAM核酸酶的研究(CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease)》，《自然通讯(Nature Communications)》12，555。
13.克里斯特尔(Crystal)(1995)《向人类转移基因：早期的教训和成功的障碍(Transfer of genes to humans:early lessons and obstacles to success)》，《科学》270(5235):404-10。
14.狄龙(Dillon)(1993)《基因治疗中基因表达的调控(Regulation geneexpression in gene therapy)》，《生物技术趋势(Trends in Biotechnology)》11(5):167-173。
15.德拉诺夫(Dranoff)等人(1997)《用经工程改造以分泌人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的自体辐射黑素瘤细胞进行疫苗接种的I期研究(A phase I study ofvaccination with autologous,irradiated melanoma cells engineered to secretehuman granulocyte macrophage colony stimulating factor)》，《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》8(1):111-23。
16.邓巴(Dunbar)等人(1995)《逆转录病毒标记的富含CD34的外周血和骨髓细胞有助于自体移植后的长期植入(Retrovirally marked CD34-enriched peripheral bloodand bone marrow cells contribute to long-term engraftment after autologoustransplantation)》，《血液(Blood)》85:3048-57。
17.埃勒姆(Ellem)等人(1997)《病例报告：人类首次使用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子诱导的自体黑素瘤细胞进行免疫疗法的免疫应答和临床过程(A case report:immune responses and clinical course of the first human use of ganulocyte/macrophage-colony-stimulating-factor-tranduced autologous melanoma cells forimmunotherapy)》，《癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol Immunother)》44:10-20。
18.高(Gao)和黄(Huang)(1995)《阳离子脂质体介导的基因转移(Cationicliposome-mediated gene transfer)》，《基因治疗(Gene Ther.)》2(10):710-22。
19.哈达德(Haddada)等人(1995)《用腺病毒载体进行基因治疗(Gene TherapyUsing Adenovirus Vectors)》，载于：《腺病毒的分子库III：生物学和发病机理(TheMolecular Repertoire of Adenoviruses III:Biology and Pathogenesis)》，德夫勒(Doerfler)和博姆
Figure BDA0004026229840000291
编辑，第297至306页。
20.韩(Han)等人(1995)《人乳腺癌细胞的配体定向的逆转录病毒靶向(Ligand-directed retro-viral targeting of human breast cancer cells)》，《美国国家科学院院刊》92(21):9747-51。
21.胡(Hu)等人(2018)《进化的Cas9变异体具有广泛的PAM相容性和高DNA特异性(Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNAspecificity)》，《自然》556(7699):57-63。
22.季聂克(Jinek)等人(2012)《适应性细菌免疫中的可编程双RNA引导的DNA核酸内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity)》，《科学》337(6096):816-21。
23.约翰(Johan)等人(1992)《GLVR1，长臂猿白血病病毒的受体，与粗糙脉孢菌的磷酸盐通透酶同源并在脑和胸腺中以高水平表达(GLVR1,a receptor for gibbon apeleukemia virus,is homologous to a phosphate permease of Neurospora crassa andis expressed at high levels in the brain and thymus)》，《病毒学杂志》66(3):1635-40。
24.贾奇(Judge)等人(2006)《体内介导有效基因沉默的非炎性合成siRNA的设计(Design of noninflammatory synthetic siRNAmediating potent gene silencing invivo)》，《分子治疗》13(3):494-505。
25.科恩(Kohn)等人(1995)《基因修饰脐带血细胞在新生儿腺苷脱氨酶缺乏症中的移植(Engraftment of gene-modified umbilical cord blood cells in neonateswith adnosine deaminase deficiency)》，《自然医学(Nature Medicine)》1:1017-23。
26.克雷默(Kremer)和佩里科代(Perricaudet)(1995)《腺病毒和腺伴随病毒介导的基因转移(Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer)》，《英国医学公报(Br.Med.Bull.)》51(1):31-44。
27.麦克迪尔米德(Macdiarmid)等人(2009)《用含有siRNA或细胞毒性药物的靶向微细胞序贯治疗耐药性肿瘤(Sequential treatment of drug-resistant tumors withtargeted minicells containing siRNA or a cytotoxic drug)》，《自然·生物技术(NatBiotehcnol.)》27(7):643-51。
28.马莱奇(Malech)等人(1997)《慢性肉芽肿性疾病基因治疗后NADPH氧化酶校正颗粒细胞的延长产生(Prolonged production of NADPH oxidase-correctedgranulocyes after gene therapy of chronic granulomatous disease)》，《美国国家科学院院刊(PNAS)94(22):12133-38。
29.米勒(Miller)等人(1991)《基于长臂猿白血病病毒的逆转录病毒包装细胞的构建及其特性(Construction and properties of retrovirus packaging cells basedon gibbon ape leukemia virus)》，《病毒学杂志》65(5):2220-24。
30.米勒(1992)《人类基因治疗的时代到来(Human gene therapy comes ofage)》，《自然》357:455-60。
31.三谷(Mitani)和卡斯基(Caskey)(1993)《递送治疗性基因——匹配方法和应用(Delivering therapeutic genes–matching approach and application)》，《生物技术趋势》11(5):162-66。
32.莫尔德伊(Molday)等人(2013)《X连锁青少年视网膜劈裂症：临床诊断、遗传分析和分子机制(X-linked juvenile retinoschisis:Clinical diagnosis,geneticanalysis,and molecular mechansims)》，《视网膜与眼科研究进展(Prog Retin EyeRes.)》31(3):195-212。
33.纳贝尔(Nabel)和费尔格纳(Felgner)(1993)《用于免疫疗法和免疫的直接基因转移(Direct gene transfer for immunotherapy and immunization)》，《生物技术趋势》11(5):211-15。
34.Nishimasu等人(2018)《具有扩大靶向空间的工程化CRISPR-Cas9核酸酶(Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space)》，《科学》361(6408):1259-1262。
35.雷米(Remy)等人(1994)《用一系列亲脂性DNA结合分子进行基因转移(GeneTransfer with a Series of Lipphilic DNA-Binding Molecules)》，《生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)》5(6):647-54。
36.森特马纳特(Sentmanat)等人(2018)《CRISPR-Cas9编辑验证策略综述(ASurvey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing)》，《科学报告(Scientific Reports)》8:888，doi:10.1038/s41598-018-19441-8。
37.索默费尔特(Sommerfelt)等人(1990)《D型猿猴逆转录病毒受体基因在人类19号染色体上的定位(Localization of the receptor gene for type D simianretroviruses on human chromosome 19)》，《病毒学杂志》64(12):6214-20。
38.范·戴恩(Van Brunt)(1988)《分子框架：作为生物因子的转基因动物(Molecular framing:transgenic animals as bioactors)》，《生物技术(Biotechnology)》6:1149-54。
39.瓦因(Vigne)等人(1995)《用于基因治疗的第三代腺病毒载体(Third-generation adenovectors for gene therapy)》，《恢复神经学和神经科学(RestorativeNeurology and Neuroscience)》8(1,2):35-36。
40.沃尔顿(Walton)等人(2020)《用近无PAM工程CRISPR-Cas9变体进行无约束基因组打靶(Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9variants)》，《科学》368(6488):290-296。
41.魏斯曼(Weissman)和卡里科(Kariko)(2015)《mRNA：实现基因治疗的承诺(mRNA:Fulfilling the promise of gene therapy)》，《分子治疗》(9):1416-7。
42.威尔逊(Wilson)等人(1989)《与长臂猿白血病病毒和人T细胞白血病病毒逆转录病毒包膜糖蛋白以及莫洛尼氏鼠白血病病毒的gag和pol蛋白形成感染性杂合病毒体(Formation of infectious hybrid virion with gibbon ape leukemia virus andhuman T-cell leukemia virus retroviral envelope glycoproteins and the gag andpol proteins of Moloney murine leukemia virus)》，《病毒学杂志》63:2374-78。
43.于(Yu)等人(1994)《HIV感染基因治疗的进展(Progress towards genetherapy for HIV infection)》，《基因治疗》1(1):13-26。
44.蔡澈(Zetsche)等人(2015)《Cpf1是一种2类CRIPSR-Cas系统的单一RNA引导的核酸内切酶(Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRIPSR-Cassystem)》，《细胞(Cell)》163(3):759-71。
45.祖易斯(Zuris)等人(2015)《阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内进行有效的基于蛋白质的基因组编辑(Cationic lipid-mediated delivery of proteinsenables efficient protein based genome editing in vitro and in vivo)》，《自然·生物技术》33(1):73-80。

Claims (21)

1.一种用于使细胞中含有不育α和toll/白介素-1受体基序的1(SARM1)基因的等位基因失活的方法，所述方法包括
向所述细胞中引入组合物，所述组合物包括：
至少一种CRISPR核酸酶，或编码CRISPR核酸酶的序列；以及
包括引导序列部分的RNA分子，
其中所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子的复合物影响所述SARM1基因的等位基因中的双链断裂，
其中所述RNA分子的所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述组合物引入至受试者体内的细胞或培养物中的细胞。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞是感光细胞，优选地视杆细胞或视锥细胞。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中将所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子在基本上相同的时间或在不同的时间引入至所述细胞。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞中所述SARM1基因的等位基因经历插入或缺失突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述插入或缺失突变产生早期终止密码子。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述失活导致由所述失活的等位基因编码的截短蛋白。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中引导序列部分与位于所述SARM1基因的外显子I、外显子II、外显子III、外显子IV、外显子V、外显子VI、外显子VII、外显子VIII或外显子IX上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述引导序列部分与位于所述SARM1基因的外显子上游7个碱基对处至下游7个碱基对处的靶序列互补，且
a)所述外显子是外显子I，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-30、32、34、36-37、182-229、1099-1838、38-67、230-238、240-251、253-257、259-267、1839-2531、69-102、268-293、295-300、302-313或2532-3227中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
b)所述外显子是外显子II，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:3228-6803中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
c)所述外显子是外显子III，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:6804-8007中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
d)所述外显子是外显子IV，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:8008-8487中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
e)所述外显子是外显子V，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:8488-9831中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
f)所述外显子是外显子VI，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:9832-10377中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
g)所述外显子是外显子VII，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:10378-11445中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
h)所述外显子是外显子VIII，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:11446-12105中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；或
i)所述外显子是外显子IX，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:433-1098中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。
10.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
11.一种包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括引导序列部分，所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，其中所述引导序列部分与位于所述SARM1基因的外显子I、外显子II、外显子III、外显子IV、外显子V、外显子VI、外显子VII、外显子VIII或外显子IX上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述引导序列部分与位于所述SARM1基因的外显子上游7个碱基对处至下游7个碱基对处的靶序列互补，且
a)所述外显子是外显子I，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-30、32、34、36-37、182-229、1099-1838、38-67、230-238、240-251、253-257、259-267、1839-2531、69-102、268-293、295-300、302-313或2532-3227中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
b)所述外显子是外显子II，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:3228-6803中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
c)所述外显子是外显子III，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:6804-8007中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
d)所述外显子是外显子IV，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:8008-8487中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
e)所述外显子是外显子V，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:8488-9831中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
f)所述外显子是外显子VI，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:9832-10377中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
g)所述外显子是外显子VII，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:10378-11445中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；
h)所述外显子是外显子VIII，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:11446-12105中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列；或
i)所述外显子是外显子IX，并且所述引导序列部分包括与SEQ ID NO:433-1098中任一个所示的序列相同或相差不超过3个核苷酸的序列。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。
14.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括CRISPR核酸酶。
15.根据权利要求11至14中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)分子。
16.根据权利要求11至15中任一权利要求所述的组合物，其中所述CRISPR核酸酶和RNA分子或CRISPR核酸酶、RNA分子和tracrRNA分子形成复合物。
17.一种包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物的药物，其用于使细胞中的SARM1等位基因失活，其中所述药物通过向所述细胞递送根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物来加以施用。
18.一种根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的用途，其包括将根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者。
19.一种包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物的药物，其用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性，其中所述药物通过将根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者来加以施用。
20.一种用于使细胞中的SARM1等位基因失活的试剂盒，其包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物和将所述组合物递送至所述细胞的说明书。
21.一种用于治疗或预防受试者的色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的试剂盒，其包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物和用于将所述组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的说明书。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230056630A (ko) * 2020-06-04 2023-04-27 에멘도바이오 인코포레이티드 신규의 omni-59, 61, 67, 76, 79, 80, 81 및 82 crispr 뉴클레아제
EP4288085A4 (en) * 2021-02-08 2025-01-29 Emendobio Inc. OMNI103-CRISPR-NUCLEASE
CN116887854A (zh) * 2021-02-08 2023-10-13 埃门多生物公司 Omni-103 crispr核酸酶
JP2024542882A (ja) * 2021-12-01 2024-11-18 エメンドバイオ・インコーポレイテッド 細胞治療において使用するｓａｒｍ１の発現の減少

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017164230A1 (ja) * 2016-03-23 2017-09-28 国立大学法人 岡山大学 リン酸化ｓａｒｍ１、抗体、ｓａｒｍ１リン酸化阻害剤、神経変性疾患の予防又は治療薬、スクリーニング方法、ｓａｒｍ１改変体及び使用
CA3037884A1 (en) * 2016-09-24 2018-03-29 Washington University Inhibitors of sarm1 nadase activity and uses thereof
WO2019236879A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Disarm Therapeutics, Inc. Inhibitors of sarm1

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050244851A1 (en) * 2004-01-13 2005-11-03 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in human
WO2015148863A2 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2020176862A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Neuroprotection of neuronal soma and axon by modulating er stress/upr molecules

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017164230A1 (ja) * 2016-03-23 2017-09-28 国立大学法人 岡山大学 リン酸化ｓａｒｍ１、抗体、ｓａｒｍ１リン酸化阻害剤、神経変性疾患の予防又は治療薬、スクリーニング方法、ｓａｒｍ１改変体及び使用
CA3037884A1 (en) * 2016-09-24 2018-03-29 Washington University Inhibitors of sarm1 nadase activity and uses thereof
CN110545804A (zh) * 2016-09-24 2019-12-06 华盛顿大学 Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途
WO2019236879A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Disarm Therapeutics, Inc. Inhibitors of sarm1

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMA OZAKI 等: "SARM1 deficiency promotes rod and cone photoreceptor cell survival in a model of retinal degeneration", 《LIFE SCIENCE ALLIANCE》, vol. 3, no. 5, 20 April 2020 (2020-04-20) *
MELISSA B. UCCELLINI 等: "Passenger Mutations Confound Phenotypes of SARM1-Deficient Mice", 《CELL REP.》, vol. 31, no. 1, 7 April 2020 (2020-04-07), pages 13, XP093045621, DOI: 10.1016/j.celrep.2020.03.062 *

Also Published As

Publication number Publication date
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