CN116157130A

CN116157130A - 作为trpa1抑制剂的四唑衍生物

Info

Publication number: CN116157130A
Application number: CN202180045923.7A
Authority: CN
Inventors: M·T·佛雷克; F·P·C·班德; J·威尔沃谢尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: HRP20241730T1; FI4171571T3; JP7539500B2; US20240352033A1; US20210403482A1; SA522441973B1; PL4171571T3; JP2023533189A; HUE069955T2; MX2022016272A; RS66140B1; TW202216729A; ES3005209T3; DOP2022000270A; LT4171571T; CN116157130B9; PH12022553493A1; MA60099B1; CL2022003325A1; IL299172A

Abstract

本发明提供某些四唑衍生物，其为短暂性受体电位锚蛋白1(TRPA1)的抑制剂，且因此适用于治疗可通过抑制TRPA1来治疗的疾病。还提供含有所述化合物的药物组合物以及制备所述化合物的方法。

Description

作为TRPA1抑制剂的四唑衍生物

技术领域

本发明提供某些四唑衍生物，其为短暂性受体电位锚蛋白1(TRPA1)的抑制剂，且因此适用于治疗可通过抑制TRPA1来治疗的疾病。本发明还提供含有所述化合物的药物组合物以及制备所述化合物的方法。

背景技术

短暂性受体电位信道(TRP信道)为一组主要位于众多哺乳动物细胞类型的质膜上的电压闸控离子信道。存在大约30个结构相关的TRP信道，其被分成以下类别：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP和TRPV。短暂性受体电位阳离子通道子族A成员1(TRPA1)，也称为短暂性受体电位锚蛋白1，为TRPA基因子族的唯一成员。在结构上，TRPA信道的特征是有多个N端锚蛋白重复序列(人类TRPA1的N端处有约14个)，其产生针对锚蛋白的“A”的命名(Montell,2005)。

TRPA1高度表达于为皮肤和肺服务的背根神经节和结节神经节的感觉神经元的质膜中，以及小肠、结肠、胰脏、骨胳肌、心脏、脑部、膀胱和淋巴细胞中(https://www.proteinatlas.org/)，以及人类肺纤维母细胞中。

TRPA1最广为人知的为作为产生诸如疼痛、寒冷和搔痒的体觉模态的环境刺激物的传感器。TRPA1为由多个反应性、亲电性刺激(例如异硫氰酸烯丙酯、反应性含氧物)，以及非反应性化合物(例如伊西林(icilin))激活，其涉及与哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)相关的咳嗽或病毒感染后咳嗽(post-viral cough)，或者慢性特发性咳嗽以和敏感患者的咳嗽(Song和Chang,2015；Grace和Belvisi,2011)。基于显示咳嗽诱发TGF-β升高的研究(Xie等人,2009；Froese等人,2016；Tschumperlin等人,2003；Yamamoto等人,2002；Ahamed等人,2008)，TRPA1抑制剂适用于治疗其中咳嗽为由于咳嗽与肺脏损伤之间有联系而非常普遍的IPF。TRPA1拮抗剂抑制由咳嗽诱因(诸如香烟烟雾提取物(CSE)氧化应激、发炎介体释放和抗氧化基因表达下调)触发的钙信号(Lin等人,2015；Wang等人,2019)。TRPA1拮抗剂在异位性皮肤炎(Oh等人,2013；Wilson等人,2013)、接触性皮炎(Liu等人,2013)、牛皮癣相关的搔痒(Wilson等人,2013)和IL-31相关的搔痒(Cevikbas等人,2014)的研究中有效。人类TRPA1的功能获得与家族性阵发性疼痛综合征相关(Kremeyer等人,2010)。TRPA1拮抗剂在偏头痛相关的异常疼痛的行为模型中亦有效(Edelmayer等人,2012)。当与神经支配健康牙齿的三叉神经节中的TRPA1表达相比时，TRPA1在神经支配受损牙齿的三叉神经节中选择性增加(Haas等人,2011)。已知若干麻醉剂为TRPA1激动剂，包括异氟醚(Matta等人,2008)，其为TRPA1抑制剂提供了缓解术后疼痛的基本原理。TRPA1基因剔除小鼠和野生型小鼠经TRPA1拮抗剂治疗后显示出抗焦虑和抗抑郁样表型(de Moura等人,2014)。基于显示AMPK和TRPA1之间存在反向调节的机理联系的研究，预期TRPA1抑制剂将有益于治疗糖尿病神经病变(Hiyama等人,2018；Koivisto和Pertovaara,2013；Wang等人,2018)。与野生型小鼠相比，所展现的TRPA1基因剔除小鼠的心肌梗塞面积较小(Conklin等人,2019)。TRPA1基因剔除和药理学干预抑制小鼠中TNBS诱发的结肠炎(Engel等人,2011)。在小鼠脑局部缺血模型中，TRPA1基因剔除和TRPA1拮抗剂减少髓鞘损伤(Hamilton等人,2016)。在痛风的单钠尿酸盐小鼠模型中，TRPA1基因剔除小鼠中的尿酸盐晶体和关节炎症减少(Moilanen等人,2015)。大鼠中TRPA1缺失改善大鼠急性痛风发作模型中的关节炎症和痛觉过敏(Trevisan等人,2014)。TRPA1的激活引起骨关节炎软骨细胞的发炎反应(Nummenmaaet等人,2016)。TRPA1抑制和基因缺失减少骨关节炎小鼠软骨细胞和鼠类软骨中的发炎介体(Nummenmaa等人,2016)。最后，TRPA1基因剔除小鼠在MIA诱发的膝关节肿胀模型中显现出对骨关节炎肢体负重的改善(Horvath等人,2016)。TRPA1在大鼠(Du等人,2007)和膀胱出口阻塞患者(Du等人,2008)的膀胱上皮中表达不同。TRPA1受体调节减轻脊髓损伤大鼠模型中的膀胱过动症(Andrade等人,2011)且鞘内施用TRPA1拮抗剂减轻排尿反射过度大鼠中的环磷酰胺诱发的膀胱炎(Chen等人,2016)。

因此，需要提供有效的TRPA1抑制剂。

各种结构类别的TRPA1抑制剂为综述于S.Skerratt,Progress in MedicinalChemistry,2017,第56卷,81-115和D.Preti,G.Saponaro,A.Szallasi,Pharm.Pat.Anal.(2015)4(2),75-94中。

WO2017/060488公开了作为TRPA1拮抗剂的化合物，其具有以下结构通式

但未公开其中带有四唑基环的实施例28和29的TRPA1活性。

L.Schenkel等人,J.Med.Chem.2016,59,2794-2809公开了基于喹唑啉酮的TRPA1拮抗剂，其包括以下结构通式的化合物

其中R为OH的化合物31被公开为在FLIPR测定中具有IC₅₀为58nM的拮抗TRPA1活性且在人类肝脏微粒体中具有<14μL/min/kg的固有清除率。

具体实施方式

本发明公开新颖四唑衍生物，其为短暂性受体电位锚蛋白1(TRPA1)的抑制剂，具有适当药理学和药物动力学特性，使得其能够用作治疗可通过抑制TRPA1来治疗的病状和/或疾病的药剂。

本发明化合物可提供若干优点，诸如增强的效能；高代谢和/或化学稳定性；高选择性、安全性和耐受性；增强的溶解性；增强的渗透性；所需的血浆蛋白结合；增强的生物可用性；适合的药物动力学概况；和形成稳定盐的可能性。

本发明化合物

本发明提供新颖四唑衍生物，其为TRPA1(测定A)的出人意料的强效抑制剂，其特征进一步在于

-人类肝脏微粒体(测定B)中的稳定性得到改良

-人类肝细胞(测定C)中的稳定性得到改良。

本发明化合物与WO2017/060488中的实施例28和29在结构上的不同之处在于本发明化合物的经取代的双环核(嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮、嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-4,6-二酮或吡啶并[3,2-d][1,4]嘧啶酮-4,6-二酮)以及邻近于仲脂族醇的取代基。本发明化合物与L.Schenkel等人,J.Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例31在结构上的不同之处在于本发明化合物带有四唑基环。这些结构差异意想不到地引起以下的有利组合：(i)TRPA1的抑制、(ii)人类肝脏微粒体中的稳定性和(iii)人类肝细胞中的稳定性。

因此，本发明的化合物在以下参数的组合方面优于背景技术中所公开的那些化合物：

-作为TRPA1抑制剂的效能

-人类肝脏微粒体中的稳定性

-人类肝细胞中的稳定性。

人类肝脏微粒体中的稳定性是指在选择和/或设计具有有利药物动力学特性的药物作为第一筛选步骤的情形中，化合物对生物转化的易感性。肝脏为许多药物的主要代谢部位。人类肝脏微粒体含有细胞色素P450(CYP)，且因此代表了用于研究体外I期药物代谢的模型系统。人类肝脏微粒体中的增强的稳定性与若干优势(包括增加的生物可用性和适当的半衰期)相关，其可实现患者的给药量减少且频率较低。因此，人类肝脏微粒体中的增强的稳定性为待用于药物的化合物的有利特征。因此，除能够抑制TRPA1以外，本发明的化合物亦预期具有有利的体内清除率且因此在人类中具有所需的作用持续时间。

人类肝细胞中的稳定性是指在选择和/或设计具有有利药物动力学特性的药物的情形中，化合物对生物转化的易感性。肝脏为许多药物的主要代谢部位。人类肝细胞含有细胞色素P450(CYP)和其他药物代谢酶，且因此代表了用于研究体外药物代谢的模型系统。(重要地，与肝脏微粒体测定相比，肝细胞测定亦涵盖II期生物转化以及肝脏特异性转运体介导的过程，且因此代表了用于药物代谢研究的更完整系统)。人类肝细胞中的增强的稳定性与若干优势(包括增加的生物可用性和适当的半衰期)相关，其可实现患者的给药量减少且频率较低。因此，人类肝细胞中的增强的稳定性为待用于药物的化合物的有利特征。

本发明提供根据式(I)的新颖化合物

其中

A选自苯基、噻吩基、苯并噻吩基或苯并呋喃基，其未经取代或经由卤素、CN、C_1-4烷基、O-C_1-4烷基、C_1-4氟烷基、O-C_1-4氟烷基、C_3-4环烷基、O-C_3-4环烷基、C_3-4环氟烷基和O-C_3-4环氟烷基组成的基团R³中的一个、两个或三个成员取代；

或

A选自：

E选自O、S、SO、SO₂和CH₂；

以及

R¹和R²独立地选自H、C_1-4烷基、C_1-4氟烷基和卤素，

或R¹和R²与其所连接的碳一起形成环丙基或环丁基环。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中

A选自苯基、噻吩基、苯并噻吩基或苯并呋喃基，其未经取代或经由卤素、C_1-4烷基、-CN和-O-C_1-4烷基组成的基团R³中之一或两个成员取代；

或

A为

E选自O、S和CH₂；

以及

R¹和R²独立地选自H、C_1-4烷基和卤素。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物

其中

A选自苯基、噻吩基、苯并噻吩基或苯并呋喃基，其未经取代或经由选自F、Cl、Br、C_1-4烷基、CN和OCH₃的基团R³中之一或两个成员取代；

或

A为

且取代基E、R¹和R²如前述实施方案中所定义。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中

A选自苯基、噻吩基、苯并噻吩基或苯并呋喃基，其未经取代或经选自F、Cl、Br、CH₃、CN和OCH₃的基团R³中之一或两个成员取代，

或

A为

且取代基E、R¹和R²如前述实施方案中的任一者中所定义。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中

A选自：

未经取代或经基团R³中之一或两个成员取代，

或

A为

且取代基E、R¹、R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中R³选自F、Cl、Br、CH₃、CN和OCH₃；

且取代基A、E、R¹和R²如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中A选自：

且取代基E、R¹和R²如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中E选自O和S；

且取代基A、R¹、R²和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中E选自O和CH₂：

且取代基A、R¹、R²和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中E为O；

且取代基A、R¹、R²和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中E为S；

且取代基A、R¹、R²和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中E为CH₂；

且取代基A、R¹、R²和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中R¹和R²独立地选自H、CH₃和卤素；

且取代基A、E和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中

R¹和R²独立地选自H、CH₃和F；

且取代基A、E和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中R¹和R²为H；

且取代基A、E和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。

本发明的另一实施方案涉及一种式(I)化合物，其中

R¹和R²中之一者为H且R¹和R²中的另一者选自CH₃和F；

且取代基A、E和R³如前述实施方案中的任一者中所定义。

选自以下的式(I)化合物是优选的：

及

且取代基A如前述实施方案中的任一者中所定义。选自以下的式(I)化合物是尤其优选的：

所用术语和定义

未在本文中具体定义的术语应赋予本领域技术人员鉴于公开内容和上下文所赋予其的含义。然而，除非相反规定，否则如本说明书中所使用，以下术语具有指定的含义且将遵守以下约定。

在下文定义的基团(group)、基(radical)或部分中，通常在基团之前指定碳原子数目，例如C_1-6烷基是指具有1至6个碳原子的烷基(alkyl group/alkyl radical)。一般而言，在如HO、H₂N、(O)S、(O)₂S、NC(氰基)、HOOC、F₃C或其类似者的基团中，本领域技术人员可看到自基团自身的游离价至分子的基团连接点。对于包含两个或更多个亚基的组合基团，最后命名的亚基为基团连接点，例如取代基“芳基-C_1-3烷基”是指与C_1-3烷基键合的芳基，该C_1-3烷基与核或与取代基所连接的基团键合。

倘若以化学名称和化学式形式描绘本发明的化合物，在有任何分歧的情况下，将以化学式为准。可在子式中使用星号来指示如所定义的连接至核分子的键。

取代基原子的记数始于最接近核或最接近取代基所连接的基团的原子。

例如，术语“3-羧丙基”表示以下取代基：

其中羧基连接至丙基的第三个碳原子。术语“1-甲基丙基-”、“2,2-二甲基丙基-”或“环丙基甲基-”表示以下基团：

星号可用于子式中以指示如所定义的连接至核分子的键。

术语“C_1-n烷基”(其中n为选自2、3、4或5的整数)单独或与另一基团组合表示具有1至n个C原子的非环状饱和分支链或直链烃基。例如，术语“C_1-5烷基”涵盖基团H₃C-、H₃C-CH₂-、H₃C-CH₂-CH₂-、H₃C-CH(CH₃)-、H₃C-CH₂-CH₂-CH₂-、H₃C-CH₂-CH(CH₃)-、H₃C-CH(CH₃)-CH₂-、H₃C-C(CH₃)₂-、H₃C-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、H₃C-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-、H₃C-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-、H₃C-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-、H₃C-CH₂-C(CH₃)₂-、H₃C-C(CH₃)₂-CH₂-、H₃C-CH(CH₃)-CH(CH₃)-和H₃C-CH₂-CH(CH₂CH₃)-。

添加至“烷基”、“亚烷基”或“环烷基”(饱和或不饱和)的术语“氟”是指其中一个或多个氢原子被氟原子替换的烷基或环烷基。实施例包括(但不限于)：H₂FC-、HF₂C-和F₃C-。

术语苯基是指以下环的基团

术语噻吩基是指以下环的基团

术语苯并噻吩基是指以下环的基团

术语苯并呋喃基是指以下环的基团

术语四唑基是指以下环的基团

术语嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮是指以下双环核的基团

术语嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-4,6-二酮是指以下双环核的基团

术语吡啶并[3,2-d][1,4]嘧啶酮-4,6-二酮是指以下双环核的基团

如本文所用，术语“经取代”是指指定原子上的任何一个或多个氢为经自指定基团的选择替换，其限制条件为不超过指定原子正常价，且取代产生稳定化合物。

除非特别指示，否则在整个说明书和随附权利要求书中，给定化学式或名称应涵盖互变异构体和所有立体异构体、光学异构体和几何异构体(例如对映异构体、非对映异构体、E/Z异构体等)和其外消旋体以及呈不同比例的独立对映异构体的混合物、非对映异构体的混合物或存在此类异构体和对映异构体之前述形式中的任一者的混合物，以及盐，包括其药学上可接受的盐和其溶剂合物(诸如包括游离化合物的溶剂合物或化合物的盐的溶剂合物的水合物)。

一般而言，实质上纯立体异构体可根据本领域技术人员已知的合成原理获得，例如通过分离相应混合物、通过使用立体化学纯起始物质和/或通过立体选择性合成。本领域已知如何制备光活性形式，诸如通过外消旋形式的拆分或通过合成，例如以光活性起始物质开始和/或通过使用手性试剂。

本发明的对映异构体纯的化合物或中间体可经由不对称合成来制备，例如通过制备和后续分离可通过已知方法(例如通过色谱分离或晶体)分离的适当非对映异构体化合物或中间体和/或通过使用手性试剂(诸如手性起始物质、手性催化剂或手性助剂)。

此外，本领域技术人员已知如何由相应之外消旋混合物制备对映异构体纯的化合物，诸如通过在手性固定相上色谱分离相应之外消旋混合物；或通过使用适当拆分剂拆分外消旋混合物，例如借助外消旋化合物与光活性酸或碱形成非对映异构体盐，之后拆分盐且自盐中释放所需化合物；或通过使用光活性手性辅助试剂衍生相应外消旋化合物，之后分离非对映异构体且移除手性辅助基团；或通过动力学拆分外消旋体(例如通过酶促拆分)；通过在适当条件下由同形异向晶体的聚结物进行对映选择性结晶；或通过在光活性手性助剂的存在下由适合溶剂进行(分级)晶体。

词组“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范畴内适合使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症且与合理效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指其中母体化合物与酸或碱形成盐或复合物的所公开的化合物的衍生物。与含有碱性部分的母体化合物形成药学上可接受的盐的酸的实施例包括无机酸或有机酸，诸如苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、反丁烯二酸、龙胆酸(gentisic acid)、氢溴酸、氢氯酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、杏仁酸、甲磺酸、4-甲基-苯磺酸、磷酸、水杨酸、丁二酸、硫酸和酒石酸。

与含有酸性部分的母体化合物形成药学上可接受的盐的阳离子和碱的实施例包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、NH₄ ⁺、L-精氨酸、2,2'-亚氨基双乙醇、L-赖氨酸、N-甲基-D-还原葡糖胺或三(羟甲基)-氨基甲烷。本发明的药学上可接受的盐可由含碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。一般而言，可通过使这些化合物的游离酸或游离碱形式与足量适当碱或酸的水溶液或有机稀释剂溶液(如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈)或其混合物反应来制备此类盐。

除上文所提及的那些盐外，例如适用于纯化或分离本发明化合物的其他酸的盐(例如三氟乙酸盐)亦构成本发明的一部分。

生物测定

TRPA1活性的评估

测定A：TRPA1测定

可使用以下体外TRPA1细胞测定来证明本发明化合物的活性：

方法：

将过度表达人类TRPA1离子通道的人类HEK293细胞株(Perkin Elmer，产品编号AX-004-PCL)用作为化合物功效和效能的测试系统。通过在FLIPRtetra系统(MolecularDevices)中量测化合物对由异硫氰酸烯丙酯(AITC)促效作用诱导的细胞内钙浓度的影响来测定化合物活性。

细胞培养：

细胞系以存在冷冻小瓶中呈冷冻细胞形式获得且在使用前储存在-150℃下。

使细胞在培养基(具有10％FCS和0.4mg/ML Geneticin的MEM/EBSS培养基)中生长。重要的为密度不超过90％汇合度。对于继代培养，通过Versene将细胞自烧瓶中脱离出来。在测定前一天，将细胞脱离出来，用培养基(具有10％FCS的MEM/EBSS培养基)洗涤两次，且将20000个细胞以20μl/孔接种至来自Corning的聚-D-赖氨酸(Poly D-Lysin)生物涂布的384孔盘(黑色透明底，Cat.356697)。将培养盘在37℃/5％CO₂下培育24小时，随后用于测定中。

化合物制备

将测试化合物以浓度为10 mM溶解于100％DMSO中且第一步于DMSO中稀释至浓度为5mM，接着于100％DMSO中进行连续稀释步骤。稀释因子和稀释步骤的数目可根据需要而变化。通常通过1:5稀释来制备8种不同浓度，用HBSS/HEPES缓冲液(1×HEPES，Cat.14065，来自Gibco；20mM HEPES，Cat.83264，来自SIGMA；0.1％BSA Cat.11926，来自Invitrogen，pH7.4)对物质进行进一步中间稀释(1:20)。

FLIPR测定：

在测定当日，将细胞用测定缓冲液洗涤3次，在洗涤后孔中剩余20μL缓冲液。将于HBSS/HEPES中的10μL Ca6试剂盒(Cat.R8191，MolecularDevices)上样缓冲液添加至细胞中且将各盘在37℃/5％CO₂下加盖培育120分钟。将于HBSS/HEPES缓冲液/5％DMSO中的10μL化合物或对照自中间稀释盘中谨慎地添加至各孔中。在FLIPRtetra装置上读取发光(指示钙流入或释放)持续10分钟以监测化合物诱导的作用(例如促效作用)。最后，将10μL溶解于HBSS/HEPES缓冲液/0.05％DMSO中的激动剂AITC 50μM(最终浓度10μM)添加至各孔中，随后在FLIPRtetra装置上再读取10分钟。添加AITC后的信号曲线下面积(AUC)用于IC50/抑制％计算。

数据评估和计算：

各测定微量滴定盘含有具有媒剂(1％DMSO)对照代替化合物的孔，作为AITC诱导的发光的对照(100％CTL；高对照)，和具有无AITC的媒剂对照的孔，作为发光的非特异性变化的对照(0％CTL；低对照)。

通过计算个别孔的信号曲线下面积来进行数据分析。基于此值，使用MegaLab软件(内部研发)计算各物质浓度的量测值的％(AUC(样本)-AUC(低))*100/(AUC(高)-AUC(低))。使用MegaLab软件由对照值％计算IC50值。计算：[y＝(a-d)/(1+(x/c)^b)+d]，a＝低值，d＝高值；x＝浓度M；c＝IC50 M；b＝希尔斜率(hill)；y＝对照％

表1：在测定A中获得的本发明化合物的生物资料

表2：在测定A中获得的背景技术化合物(WO2017/060488中的实施例28和29)的生物资料.

WO2017/060488中的实施例	hTRPA1 IC₅₀[nM]
		28	366
29	1120

表3：在测定A中获得的背景技术化合物(L.Schenkel等人,J.Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例31)的生物数据.

Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例	hTRPA1 IC₅₀[nM]
		31	52

微粒体清除率的评估

测定B：微粒体清除率：

在37℃下使用所合并的肝脏微粒体来测定测试化合物的代谢降解。每个时间点的100μl的最终培育体积含有在RT下pH 7.6(0.1M)的TRIS缓冲液、氯化镁(5mM)、微粒体蛋白(1mg/ml)和最终浓度为1μM的测试化合物。

在37℃下的短暂预培育期之后，通过添加呈还原形式(NADPH，1mM)的β-烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸启动反应且通过在不同时间点(0、5、15、30、60min)之后将等分试样转移至溶剂中来终止反应。另外，在不含NADPH的培育物中监测NADPH非依赖性降解，在最后一个时间点终止。NADPH非依赖性培育之后的剩余测试化合物[％]为由参数c(对照)(代谢稳定性)反映。通过离心(10000g，5min)使经淬灭的培育物进行造粒。

通过LC-MS/MS测定上清液的等分试样中的母体化合物量。通过浓度-时间特征曲线的半对数图的斜率来测定半衰期(t1/2INVITRO)。

通过考虑培育物中蛋白质的量来计算内在清除率(CL_INTRINSIC)：

CL_INTRINSIC[μl/min/mg蛋白质]＝(Ln 2/(半衰期[min]*蛋白质含量[mg/ml]))*1000

CL_INTRINSIC_INVIVO[ml/min/kg]＝(CL_INTRINSIC[μl/min/mg蛋白质]×MPPGL[mg蛋白质/g肝脏]×肝因子[g/kg体重])/1000

Qh[％]＝CL[ml/min/kg]/肝血流量[ml/min/kg])

肝细胞数，人类：120×10e6个细胞/公克肝脏

肝因子，人类：25.7g/kg体重

血流量，人类：21ml/(min×kg)

表4：测定B中获得的本发明化合物的生物资料

表5：在测定B中获得的背景技术化合物(WO2017/060488中的实施例28和29)的生物资料.

WO2017/060488中的实施例	人类LM[％Qh]
		28	62
29	<23

表6：在测定B中获得的背景技术化合物(L.Schenkel等人,J.Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例31)的生物数据.

Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例	人类LM[％Qh]
		31	<23

肝细胞清除率的评估

测定C：肝细胞清除率

在肝细胞悬浮液中测定测试化合物的代谢降解。在含有5％或50％物种血清的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium)(补充有3.5μg升糖素/500mL、2.5mg胰岛素/500mL和3.75mg/500mL氢皮质酮)中培育肝细胞(冷冻保存)。

在培育箱(37℃，10％CO₂)中预培育30min之后，将5μl的测试化合物溶液(80μM；由2mM DMSO储备溶液用培养基按1:25稀释而成)添加至395μl肝细胞悬浮液中(细胞密度在0.25-5百万个细胞/mL范围内，其视物种而定，通常1百万个细胞/mL；测试化合物的最终浓度为1μM，最终DMSO浓度为0.05％)。

将细胞培育六小时(培育箱，回转式震荡器)且在0、0.5、1、2、4和6小时获取样本(25μl)。将样本转移至乙腈中且通过离心(5min)进行造粒。将上清液转移至新的96深孔盘，在氮气下蒸发且再悬浮。

通过HPLC-MS/MS来分析母体化合物的减少

CLint如下计算：CL_INTRINSIC＝剂量/AUC＝(C0/CD)/(AUD+clast/k)×1000/60。C0：培育物中的初始浓度[μM]、CD：活细胞的细胞密度[10e6个细胞/mL]、AUD：资料下面积[μM×h]、clast：最后一个数据点的浓度[μM]、k：母体减少的回归线的斜率[h-1]。

所计算的体外肝内在清除率可按比例扩大为体内肝内在清除率，且用于通过使用肝脏模型(搅拌良好的模型)来预测体内肝血液清除率(CL)。

CL_INTRINSIC_INVIVO[ml/min/kg]＝(CL_INTRINSIC[μL/min/10e6个细胞]×肝细胞数[10e6个细胞/公克肝脏]×肝因子[g/kg体重])/1000

CL[ml/min/kg]＝CL_INTRINSIC_INVIVO[ml/min/kg]×肝血流量[ml/min/kg]/(CL_INTRINSIC_INVIVO[ml/min/kg]+肝血流量[ml/min/kg])

Qh[％]＝CL[ml/min/kg]/肝血流量[ml/min/kg])

肝细胞数，人类：120×10e6个细胞/公克肝脏

肝因子，人类：25.7g/kg体重

血流量，人类：21ml/(min×kg)

表7：在测定C中获得的本发明化合物的生物资料

实施例	人类肝细胞[％Qh]
		1	7
2	16
		3	18
4	31
		5	29
6	13
		7	21
8	11
		9	5
10	<4
		11	29
12	8
		13	10
14	5
		15	29
16	<4
		17	13
18	8
		19	19
20	<4
		21	6
22	12
		23	36
24	16

表8：在测定C中获得的背景技术化合物(WO2017/060488中的实施例28和29)的生物资料.

WO2017/060488中的实施例	人类肝细胞[％Qh]
		28	49
29	22

表9：在测定C中获得的背景技术化合物(L.Schenkel等人,J.Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例31)的生物数据.

Med.Chem.2016,59,2794-2809中的实施例	人类肝细胞[％Qh]
		31	73

渗透率的评估

将Caco-2细胞(1-2×105个细胞/1cm²区域)接种在过滤器插件(Costartranswell聚碳酸酯或PET过滤器，0.4μm孔径)上且培养(DMEM)持续10至25天。

将化合物溶解于适当溶剂(如DMSO，1-20mM储备溶液)中。用HTP-4缓冲液(128.13mM NaCl、5.36mM KCl、1mM MgSO₄、1.8mM CaCl₂、4.17mM NaHCO₃、1.19mM Na₂HPO₄×7H₂O、0.41mM NaH₂PO₄×H₂O、15mM HEPES、20mM葡萄糖、0.25％BSA，pH 7.2)稀释储备溶液以制备转运溶液(0.1-300μM化合物，最终DMSO<＝0.5％)。将转运溶液(TL)施用至顶部或基侧的供体侧以用于分别量测A-B或B-A渗透率(重复过滤3次)。在实验开始以及最后自供体收集样本且在各个时间间隔处亦自受体侧收集样本，时间持续2小时，以通过HPLC-MS/MS或闪烁计数来进行浓度量测。用新制受体溶液替换取样后的受体容积。

血浆蛋白质结合的评估

此平衡透析(ED)技术为用于测定测试化合物与血浆蛋白质的近似体外分级结合。使用Dianorm Teflon透析单元(0.2ml)。各单元为由供体室和受体室组成，由具有5kDa分子量截断的超薄半透膜分隔。在DMSO中以1mM制备用于各测试化合物的储备溶液且稀释至1.0μM的最终浓度。后续透析溶液为在来自雄性和磁性供体的合并的人类或大鼠血浆(含NaEDTA)制备。将200μL透析缓冲液(100mM磷酸钾，pH 7.4)的等分试样分配至缓冲液腔室中。将200μL测试化合物透析溶液的等分试样分配至血浆腔室中。在37℃下在旋转下培育2小时。

在透析期结束时，将透折液转移至反应管中。用于缓冲液部分的管含有0.2mLACN/水(80/20)。将25μL血浆透折液的等分试样转移至深孔盘中且与25μL ACN/水(80/20)、25μL缓冲液、25μL校准溶液和25μL内标物溶液混合。通过添加200μL ACN进行蛋白质沉淀。将50μL缓冲液透折液的等分试样转移至深孔盘中且与25μL空白血浆、25μL内标物溶液和200μL ACN混合。在HPLC-MS/MS-系统上量测样本且借助于Analyst-Software加以评估。用下式计算结合百分比：结合％＝(血浆浓度-缓冲液浓度/血浆30浓度)×100。

溶解度的评估

通过将适当体积的所选液体介质(通常在0.25-1.5ml范围内)添加至含有已知量的固体原料药(通常在0.5-5.0mg范围内)的各孔中来在孔盘(格式视机器人而定)中制备饱和溶液。将各孔震荡或搅拌预定时间段(通常在2-24h范围内)且接着使用适当的过滤薄膜(通常为具有0.45μm孔径的PTFE-滤膜)过滤。通过丢弃前几滴滤液来避免滤膜吸收。通过UV光谱分析测定经溶解的原料药的量。另外，使用玻璃电极pH计来量测饱和水溶液的pH。

啮齿动物中的药物动力学特征的评估

测试化合物为经静脉内施用进食大鼠或经口施用禁食大鼠。在施加测试化合物后的若干时间点获取血液样本，进行抗凝处理且离心。

对血浆样本中作为分析物的所施用的化合物和/或代谢物的浓度进行定量。PK参数使用非室体方法加以计算。将AUC和Cmax标准化至1μmol/kg的剂量。

体外人类肝细胞代谢的评估

使用呈悬浮液形式的初级人类肝细胞来研究测试化合物的代谢路径。在自冷冻保存复原之后，将人类肝细胞在含有5％人类血清且补充有3.5μg升糖素/500ml、2.5mg胰岛素/500ml和3.75mg/500ml氢皮质酮的杜氏改良伊格尔培养基中培育。

在细胞培养培育箱(37℃，10％CO₂)中预培育30min之后，将测试化合物溶液掺入肝细胞悬浮液中以获得1.0*10⁶至4.0*10⁶个细胞/毫升的最终细胞密度(视伴随初级人类肝细胞所观测到的化合物的代谢转换率而定)、10μM的最终测试化合物浓度和0.05％的最终DMSO浓度。

将细胞在水平震荡器上的细胞培养培育箱中培育六小时，且视代谢转换率而定在0、0.5、1、2、4或6小时之后自培育移除样本。样本用乙腈淬灭且通过离心进行造粒。将上清液转移至96深孔盘，在氮气下蒸发且再悬浮，之后通过液相色谱-高分辨率质谱分析进行生物分析，以用于鉴别推定的代谢物。

基于Fourier-Transform-MSⁿ数据暂时指配结构。以人类肝细胞培育中母体的百分比报导代谢物，临界值≥4％。

治疗方法

本发明涉及通式1化合物，其适用于预防和/或治疗与TRPA1活性相关或由TRPA1活性调节的疾病和/或病状，包括(但不限于)治疗和/或预防纤维变性疾病、发炎性和免疫调节病症、呼吸道或胃肠道疾病或不适、眼科疾病、关节的发炎性疾病和鼻咽部、眼部和皮肤的发炎性疾病以及疼痛和神经病症。所述病症、疾病和不适包括咳嗽、特发性肺纤维化、其他肺间质性疾病和其他纤维变性、哮喘或过敏性疾病、嗜酸性疾病、慢性阻塞性肺病以及发炎性和免疫调节病症(诸如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化)以及疼痛和神经病症(诸如急性疼痛、手术疼痛、慢性疼痛和抑郁症以及膀胱病症)。

通式1化合物适用于预防和/或治疗：

(1)咳嗽，诸如慢性特发性咳嗽或慢性难治性咳嗽、与哮喘、COPD、肺癌、病毒感染后和特发性肺纤维化以及其他肺间质性疾病相关的咳嗽。

(2)肺纤维变性疾病(诸如与胶原病相关的肺炎或间质性肺炎)，例如红斑性狼疮、全身性硬皮病类风湿性关节炎、多发性肌炎和皮肌炎、特发性间质性肺炎(诸如特发性肺纤维化(IPF))、非特异性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎相关之间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、隐原性机化性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴球性间质性肺炎、淋巴管肌瘤病、肺泡蛋白沉积症、兰格汉氏细胞组织细胞增生症(Langerhan's cell histiocytosis)、胸膜实质性纤维弹性组织增生症、已知病因之间质性肺病，诸如因职业性接触(诸如石绵沉着病、硅粉沉着病、矿工肺(煤粉)、农民肺(干草和霉菌)、养鸽人肺(Pidgeon fanciers lung)(鸟类)或其他职业性空气传播诱因(诸如金属粉尘或分枝杆菌)或因治疗(诸如辐射、甲胺蝶呤、胺碘酮、呋喃妥因(nitrofurantoin)或化学治疗剂)而引起之间质性肺炎或肉芽肿性疾病，诸如肉芽肿性多发性血管炎、彻奇-斯全司综合征(Churg-Strauss syndrome)、类肉瘤病、过敏性肺炎或由不同病因(例如吸入有毒气体、蒸气、支气管炎或肺炎)引起之间质性肺炎或由心衰竭、X射线、辐射、化疗、伯克病(M.boeck)或类肉瘤病、肉芽肿病、囊肿性纤维化或黏稠性黏液病或α-1抗胰蛋白酶缺乏症引起之间质性肺炎。

(3)其他纤维变性疾病，诸如肝桥接纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪变性肝炎(NASH)、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、旧心肌梗塞、神经胶质疤、动脉硬度、关节纤维化、杜普宜特朗氏挛缩(Dupuytren's contracture)、瘢痕瘤、硬皮病/全身性硬化症、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病(Peyronie's disease)、肾源性全身性纤维化、腹膜后纤维化、黏连性囊炎。

(4)发炎性、自体免疫性或过敏性疾病和病状，诸如过敏性或非过敏性鼻炎或鼻窦炎、慢性鼻窦炎或鼻炎、鼻息肉、慢性鼻窦炎、急性鼻窦炎、哮喘、儿童哮喘、过敏性支气管炎、肺泡炎、高反应性气管、过敏性结膜炎、支气管扩张症、成人呼吸窘迫综合征、支气管和肺水肿、支气管炎或局部肺炎、嗜酸性蜂窝织炎(例如，韦尔斯综合征(Well'ssyndrome))、嗜酸性肺炎(例如吕佛勒氏综合征(Loeffler's syndrome)、慢性嗜酸性肺炎、嗜酸性筋膜炎(例如，舒尔曼氏综合征(Shulman's syndrome))、迟发型过敏、非过敏性哮喘；运动诱发性支气管收缩；慢性阻塞性肺病(COPD)、急性支气管炎、慢性支气管炎、咳嗽、肺气肿；全身性过敏反应或超敏反应、药物过敏(例如，对青霉素、头孢菌素)、因摄入经污染的色氨酸而引起的嗜伊红血球肌痛综合征、昆虫螯针过敏；自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、格雷夫氏病(Graves'disease)、休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、全身性红斑性狼疮症、重症肌无力、免疫性血小板减少症(成人ITP/新生血儿小板减少症、小儿ITP)、免疫性溶血性贫血(自体免疫和药物引起)、伊凡氏综合征(Evanssyndrome)(血小板和红血球免疫性血细胞减少症)、新生儿Rh病、古巴斯德氏综合征(Goodpasture's syndrome)(抗GBM病)、乳糜泻、自身免疫性心肌病幼发型糖尿病；丝球体肾炎、自体免疫性甲状腺炎、白塞氏病(Behcet's disease)；移植排斥(例如，在移植中)，包括同种异体移植排斥反应或移植物抗宿主病；发炎性肠病，诸如克罗恩氏病(Crohn'sdisease)和溃疡性结肠炎；脊椎关节病；牛皮癣(包括T细胞介导的牛皮癣)和发炎性皮肤病(诸如皮炎、湿疹、异位性皮炎、过敏性接触性皮炎、风疹)；脉管炎(例如坏死性、皮肤性和超敏性脉管炎)；结节性红斑；嗜酸性肌炎、嗜酸性筋膜炎、皮肤或器官有白细胞浸润的癌症；眼科疾病，诸如年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病黄斑水肿、角膜炎、嗜酸性角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、瘢痕、前节瘢痕(anterior segment scarring)、睑炎、睑结膜炎、大疱性病症、瘢痕性类天疱疮、结膜黑素瘤、乳头状结膜炎、干眼症、上巩膜炎、青光眼、神经胶瘤病、环状肉芽肿瘤、格雷夫氏眼病(Graves'ophthalmopathy)、眼内黑素瘤、结膜黄斑、增生性玻璃体视网膜病变、翼状胬肉、巩膜炎、急性痛风发作、痛风或骨关节炎。

(5)疼痛，诸如慢性特发性疼痛综合征、神经痛、感觉迟钝、触摸痛、偏头痛、牙痛和术后疼痛。

(6)抑郁、焦虑、糖尿病神经病变和膀胱病症，诸如膀胱出口阻塞、膀胱过动症、膀胱炎；心肌再灌注损伤或脑局部缺血损伤。

因此，本发明涉及一种通式1化合物，其用作药剂。

此外，本发明涉及一种通式1化合物的用途，其用于治疗和/或预防与TRPA1活性相关或由TRPA1活性调节的疾病和/或病状。

此外，本发明涉及通式1化合物的用途，其为用于治疗和/或预防纤维变性疾病、发炎性和免疫调节病症、呼吸道或胃肠道疾病或不适、眼科疾病、关节的发炎性疾病和鼻咽部、眼部和皮肤的发炎性疾病、疼痛和神经病症。所述病症、疾病和不适包括咳嗽、特发性肺纤维化、其他肺间质性疾病和其他纤维变性、哮喘或过敏性疾病、嗜酸性疾病、慢性阻塞性肺病以及发炎性和免疫调节病症(诸如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化)以及疼痛和神经病症(诸如急性疼痛、手术疼痛、慢性疼痛和抑郁症以及膀胱病症)。

此外，本发明涉及一种通式1化合物的用途，其用于治疗和/或预防：

(1)咳嗽，诸如慢性特发性咳嗽或慢性难治性咳嗽的、与哮喘、COPD、肺癌、病毒感染后和特发性肺纤维化以及其他肺间质性疾病相关的咳嗽。

(2)肺纤维变性疾病(诸如与胶原病相关的肺炎或间质性肺炎)，例如红斑性狼疮、全身性硬皮病类风湿性关节炎、多发性肌炎和皮肌炎、特发性间质性肺炎(诸如特发性肺纤维化(IPF))、非特异性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎相关之间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、隐原性机化性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴球性间质性肺炎、淋巴管肌瘤病、肺泡蛋白沉积症、兰格汉氏细胞组织细胞增生症、胸膜实质性纤维弹性组织增生症、已知病因之间质性肺病，诸如因职业性接触(诸如石绵沉着病、硅粉沉着病、矿工肺(煤粉)、农民肺(干草和霉菌)、养鸽人肺(鸟类)或其他职业性空气传播诱因，诸如金属粉尘或分枝杆菌)或因治疗(诸如辐射、甲胺蝶呤、胺碘酮、呋喃妥因或化学治疗剂)而引起之间质性肺炎或肉芽肿性疾病，诸如肉芽肿性多发性血管炎、彻奇-斯全司综合征、类肉瘤病、过敏性肺炎或由不同病因(例如吸入有毒气体、蒸气、支气管炎或肺炎)引起之间质性肺炎，或由心衰竭、X射线、辐射、化疗、伯克病或类肉瘤病、肉芽肿病、囊肿性纤维化或黏稠性黏液病或α-1抗胰蛋白酶缺乏症引起之间质性肺炎。

(3)其他纤维变性疾病，诸如肝桥接纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪变性肝炎(NASH)、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、旧心肌梗塞、神经胶质疤、动脉硬度、关节纤维化、杜普宜特朗氏挛缩、瘢痕瘤、硬皮病/全身性硬化症、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾源性全身性纤维化、腹膜后纤维化、黏连性囊炎。

(4)发炎性、自体免疫性或过敏性疾病和病状，诸如过敏性或非过敏性鼻炎或鼻窦炎、慢性鼻窦炎或鼻炎、鼻息肉、慢性鼻窦炎、急性鼻窦炎、哮喘、儿童哮喘、过敏性支气管炎、肺泡炎、高反应性气管、过敏性结膜炎、支气管扩张症、成人呼吸窘迫综合征、支气管和肺水肿、支气管炎或局部肺炎、嗜酸性蜂窝织炎(例如，韦尔斯综合征)、嗜酸性肺炎(例如吕佛勒氏综合征、慢性嗜酸性肺炎)、嗜酸性筋膜炎(例如，舒尔曼氏综合征)、迟发型过敏、非过敏性哮喘；运动诱发性支气管收缩；慢性阻塞性肺病(COPD)、急性支气管炎、慢性支气管炎、咳嗽、肺气肿；全身性过敏反应或超敏反应、药物过敏(例如，对青霉素、头孢菌素)、因摄入经污染的色氨酸而引起的嗜伊红血球肌痛综合征、昆虫螯针过敏；自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、格雷夫氏病、休格连氏综合征、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、全身性红斑性狼疮症、重症肌无力、免疫性血小板减少症(成人ITP/新生血儿小板减少症、小儿ITP)、免疫性溶血性贫血(自体免疫和药物引起)、伊凡氏综合征(血小板和红血球免疫性血细胞减少症)、新生儿Rh病、古巴斯德氏综合征(抗GBM病)、乳糜泻、自身免疫性心肌病幼发型糖尿病；丝球体肾炎、自体免疫性甲状腺炎、白塞氏病；移植排斥(例如，在移植中)，包括同种异体移植排斥反应或移植物抗宿主病；发炎性肠病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；脊椎关节病；牛皮癣(包括T细胞介导的牛皮癣)和发炎性皮肤病(诸如皮炎、湿疹、异位性皮炎、过敏性接触性皮炎、风疹)；脉管炎(例如坏死性、皮肤性和超敏性脉管炎)；结节性红斑；嗜酸性肌炎、嗜酸性筋膜炎、皮肤或器官有白细胞浸润的癌症；眼科疾病，诸如年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病黄斑水肿、角膜炎、嗜酸性角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、瘢痕、前节瘢痕、睑炎、睑结膜炎、大疱性病症、瘢痕性类天疱疮、结膜黑素瘤、乳头状结膜炎、干眼症、上巩膜炎、青光眼、神经胶瘤病、环状肉芽肿瘤、格雷夫氏眼病、眼内黑素瘤、结膜黄斑、增生性玻璃体视网膜病变、翼状胬肉、巩膜炎、急性痛风发作、痛风或骨关节炎。

在另一方面中，本发明涉及一种通式1化合物，其用于治疗和/或预防上文所提及的疾病和病状。

在另一方面中，本发明涉及一种通式1化合物的用途，其用于制备用于治疗和/或预防上文所提及的疾病和病状的药剂。

在本发明的另一方面中，本发明涉及用于治疗或预防上文所提及的疾病和病状的方法，该方法包含向人类施用有效量的通式1化合物。

组合疗法

本发明化合物可进一步与一种或多种，优选一种额外治疗剂组合。根据一个实施方案，额外治疗剂选自：适用于治疗上文所描述，尤其与纤维变性疾病、发炎性和免疫调节病症、呼吸道或胃肠道疾病或不适、关节或鼻咽部、眼部和皮肤的发炎性疾病或病状(诸如咳嗽)、特发性肺纤维化、其他肺间质性疾病、哮喘或过敏性疾病、嗜酸性疾病、慢性阻塞性肺病、异位性皮炎以及自体免疫性病变(诸如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化)相关的疾病或病状的治疗剂；或适用于治疗眼科疾病、疼痛和抑郁的治疗剂。

适用于此类组合的额外治疗剂尤其包括例如增强一种或多种活性物质对所提及的适应症中之一者的治疗作用和/或使一种或多种活性物质的剂量减少的那些治疗剂。

因此，本发明的化合物可与一种或多种选自以下的额外治疗剂组合：抗纤维变性剂、抗咳嗽剂、抗炎剂、抗异位性皮炎剂、镇痛剂、抗惊厥剂、抗焦虑剂、镇静剂、骨骼肌松弛剂或抗抑郁剂。

抗纤维变性剂为例如尼达尼布(nintedanib)、吡非尼酮(pirfenidone)、磷酸双酯酶4型抑制剂(PDE4)(诸如罗氟司特(roflumilast))、自分泌运动因子抑制剂，诸如GLPG-1690或BBT-877；结缔组织生长因子(CTGF)阻断抗体，诸如潘瑞鲁单抗(Pamrevlumab)；B细胞活化因子受体(BAFF-R)阻断抗体，诸如拉那鲁单抗(Lanalumab)；α-v/β-6阻断抑制剂(诸如BG-00011/STX-100)、重组正五聚素蛋白-2(PTX-2)(诸如PRM-151)；c-Jun N端激酶(JNK)抑制剂，诸如CC-90001；半乳凝集素-3抑制剂，诸如TD-139；G-蛋白偶合受体84(GPR84)抑制剂，诸如GLPG-1205；G-蛋白偶合受体84/G-蛋白偶合受体40双重抑制剂，诸如PBI-4050；Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)，诸如KD-025；热休克蛋白47(HSP47)小干扰RNA/ND-L02-s0201，诸如BMS-986263；Wnt路径抑制剂，诸如SM-04646；LD4/PDE3/4抑制剂，诸如泰鲁司特(Tipelukast)；组氨酰基tRNA合成酶(HARS)的重组免疫调节域，诸如ATYR-1923；前列腺素合成酶抑制剂，诸如ZL-2102/SAR-191801；15-羟基-二十碳五烯酸(15-HEPE例如DS-102)；赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)抑制剂，诸如PAT-1251，PXS-5382/PXS-5338；磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)双重抑制剂，诸如HEC-68498；钙蛋白酶抑制剂，诸如BLD-2660；促分裂原活化蛋白激酶(MAP3K19)抑制剂，诸如MG-S-2525；壳质酶抑制剂，诸如OATD-01；促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MAPKAPK2)抑制剂，诸如MMI-0100；转型生长因子β1(TGF-β1)小干扰RNA，诸如TRK250/BNC-1021；或溶血磷脂酸受体拮抗剂，诸如BMS-986278。

例如，止咳剂为嘌呤受体3(P2X3)受体拮抗剂，诸如吉法匹生(gefapixant)、S-600918、BAY-1817080或BLU-5937；神经激肽1(NK-1)受体拮抗剂，诸如奥维匹坦(Orvepitant)、阿瑞匹坦(Aprepitant)；烟碱型乙酰胆碱受体α7次单位刺激剂，诸如ATA-101/布达克兰(bradanicline)、可待因(codeine)、加巴喷丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregablin)或阿奇霉素(azithromycin)。例如，抗炎剂为皮质类固醇，诸如普赖苏秾(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone)；环氧化酶-2(COX2)抑制剂，诸如塞来昔布(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、地拉考昔(deracoxib)、依托考昔(etoricoxib)或罗米昔布(lumiracoxib)；前列腺素E2拮抗剂；白三烯(leukotriene)B4拮抗剂；白三烯D4拮抗剂，诸如孟鲁司特(monteleukast)；5-脂肪加氧酶抑制剂；或其他非类固醇抗炎剂(NSAIDs)，诸如阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、布洛芬(ibuprofen)或吲哚美辛(indomethacin)。

例如，抗异位性皮肤炎剂为环孢素(cyclosporin)、甲胺蝶呤(methotrexate)、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤、磷酸二酯酶抑制剂(例如，阿普斯特(apremilast)、克立硼罗(crisaborole))、詹纳斯(Janus)相关激酶(JAK)抑制剂(例如托法替尼(tofacitinib))、抗IL-4/IL-13的中和抗体(例如度匹单抗(dupilamab))、IL-13(例如雷布瑞奇单抗(lebrikizumab)、曲罗芦单抗(tralokinumab))和IL-31(尼立珠单抗(nemolizumab))。

例如，镇痛剂为类鸦片型，诸如吗啡碱、羟吗啡(oxymorphine)、左旋丙醇(levopanol)、羟考酮、丙氧芬、纳美芬(nalmefene)、芬太尼(fentanyl)、氢可酮(hydrocondon)、氢吗啡酮(hydromorphone)、美利皮定(meripidine)、美沙酮(methadone)、纳洛芬(nalorphine)、纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)、戊唑新(pentazocine)；或诸如乙酰烯胺的非类鸦片型。

例如，抗抑郁剂为三环抗抑郁剂，诸如阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、地斯帕明(despramine)、多虑平(doxepin)、地昔帕明(desipramine)、丙咪嗪(imipramine)、去甲替林(nortriptyline)；选择性血清素再吸收抑制剂抗抑郁剂(SSRI)，诸如氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、西它普兰(citalopram)、依地普兰(escitalopram)；去甲肾上腺素再吸收抑制剂抗抑郁剂(SNRI)，诸如马普替林(maprotiline)、洛夫帕明(lofepramine)、米氮平(mirtazapine)、羟丙替林(oxaprotiline)、非唑拉明(fezolamine)、托莫西汀(tomoxetine)、米安色林(mianserin)、丁胺苯丙酮、羟基丁胺苯丙酮(hydroxybuproprion)、诺米芬辛(nomifensine)、维洛沙嗪(viloxazine)；双重血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂抗抑郁剂(SNRI)，诸如度洛西汀(duloxetine)、文拉法辛(venlafaxine)、去甲文拉法辛(desvenlafaxine)、左旋体米那普仑(levomilnacipran)；非典型抗抑郁剂，诸如曲唑酮(trazodone)、米氮平(mirtazapine)、沃替西汀(vortioxetine)、维拉唑酮(vilazodone)、安非他酮；单胺氧化酶抑制剂抗抑郁剂(MAOI)，诸如反苯环丙胺(tranylcypromine)、苯乙肼(phenelzine)或异卡波肼(isocarboxazid)。

例如，抗焦虑剂为苯并二氮杂卓，诸如阿普唑仑(alprazolam)、溴西泮(bromazepam)、氯二氮环氧化物(chlordiazepoxide)、氯硝西泮(clonazepam)、氯氮平酸盐、安定(diazepam)、氟西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)、三唑仑(triazolam)或托非索泮(tofisopam)；或其为非苯并二氮杂卓催眠药，诸如右唑匹可隆(eszopiclone)、扎来普隆(zaleplon)、唑吡坦(zolpidem)或唑匹可隆(zopiclone)；或其为胺甲酸酯，例如美普巴(meprobamate)、肌安宁(carisoprodol)、泰巴氨酯(tybamate)或洛巴甲酸酯(lorbamate)；或其为抗组织胺，诸如羟嗪、氯芬尼拉明(chlorpheniramine)或苯海拉明(diphenhydramine)。

例如，镇定剂为巴比妥酸盐(barbiturate)镇静剂，诸如异戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、布塔巴比妥(butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯巴比妥(mephobarbital)、甲巴比妥(metharbital)、美索比妥(methohexital)、戊巴比妥(pentobarbital)、司可巴比妥(secobarbital)、他布比妥(talbutal)、塞米乐(theamylal)或硫喷妥(thiopental)；或其为非巴比妥酸盐镇静剂，诸如格鲁米特(glutethimide)、美普巴、甲喹酮(methaqualone)或氯醛比林(dichloalphenazone)。

例如，骨骼肌松弛剂为氯苯胺丁酸(baclofen)、美普巴、肌安宁、环苯扎平(cyclobenzaprine)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)、替扎尼定(tizanidine)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)或奥菲那特林(orphenadrine)。

其他适合的组合搭配物为乙酰胆碱酯酶抑制剂，诸如多奈哌齐(donepezil)；5-HT-3拮抗剂，诸如昂丹司琼(ondansetron)；代谢型谷氨酸受体拮抗剂；抗心律不整剂，诸如美西律(mexiletine)或苯妥英(phenytoin)；或NMDA受体拮抗剂。

其他适合的组合搭配物为失禁药物，例如抗胆碱激导性剂，诸如奥昔布宁(oxybutynin)、托特罗定(tolterodine)、达非那新(darifenacin)、弗斯特罗定(fesoterodine)、索非那新(solifenacin)或曲司铵(trospium)；或其为膀胱肌松弛剂，诸如米拉贝隆(mirabegron)；或其为α阻断剂，诸如他苏洛辛(tamsulosin)、阿夫唑嗪(alfuzosin)、西洛多辛(silodosin)、多沙唑嗪(doxazosin)或特拉唑嗪(terazosin)。

上述组合搭配物的剂量通常为正常建议最低剂量的1/5至正常建议剂量的1/1。

因此，在另一方面中，本发明涉及与一种或多种上下文中所描述的额外治疗剂组合的根据本发明的化合物的用途，其用于治疗可受TRPA1影响或介导的疾病或病状，尤其如上下文中所描述的疾病或病状。

在另一方面中，本发明涉及一种用于治疗患者的可受TRPA1抑制影响的疾病或病状的方法，其包括以下步骤：向需要此类治疗的患者施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐与治疗有效量的一种或多种额外治疗剂的组合。

在另一方面中，本发明涉及与一种或多种额外治疗剂组合的式(I)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于治疗有需要的患者的可受TRPA1抑制影响的疾病或病状。

在又一方面中，本发明涉及一种用于治疗患者的经TRPA1活性介导的疾病或病状的方法，其包括以下步骤：向需要此类治疗的患者(优选人类)施用治疗有效量的本发明的化合物与治疗有效量的一种或多种上下文中所描述的额外治疗剂的组合。

与其他治疗剂组合的根据本发明的化合物的使用可同时进行或以错开的时间进行。

根据本发明的化合物和一种或多种额外治疗剂二者可一起存在于一种调配物(例如片剂或胶囊)中，或分开存在于两种相同或不同的调配物中(例如呈所谓的分装部分的试剂盒(kit-of-part))。

因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的化合物和一种或多种上下文中所描述的额外治疗剂，任选连同一种或多种惰性载剂和/或稀释剂。

在又一方面中，本发明涉及一种根据本发明的化合物的用途，其用于咳嗽量测装置中。

本发明的其他特征和优点将自以下更详细的实施例而变得显而易见，所述实施例以举例方式说明本发明的原理。

制备

可使用本领域技术人员已知且描述于有机合成的文献中的合成方法来获得本发明的化合物和其中间体。优选地，以与下文更充分解释，尤其如实验部分中所描述的制备方法类似的方式来获得化合物。在一些情况下，进行反应步骤的次序可变化。亦可使用本领域技术人员已知但未在本文中详细描述的反应方法的变型。

制备根据本发明的化合物的通用制程对于研究以下流程的本领域技术人员将变得显而易见。可使用常规保护基来保护起始物质或中间体中的任何官能基。这些保护基可使用本领域技术人员熟悉的方法在反应序次内的适合阶段再次裂解。

根据本发明的化合物为通过下文所描述的合成方法制备，其中通式的取代基具有上文所给出的含义。这些方法意欲作为本发明的说明，但不限制其主题和这些实施例所主张的化合物的范畴。在未描述起始化合物的制备的情况下，其可商购或可以本文中所述的已知化合物或方法类似的方式制备。文献中所述的物质为根据所公布的合成方法制备。缩写如实施例部分中所定义。

由(Ia)表示的具有E＝O的式(I)化合物可如以下方案1中所示制备。

方案1：

在方案1中，在碱(例如K₂CO₃)的存在下，用携载邻近羰基的离去基“LG”(例如Cl或Br)的适当乙酮衍生物使氯甲基四唑N-烷基化，得到两种区位异构体的混合物。可通过使用适当梯度的色谱移除非所需区位异构体(未图示)。可通过使用适当的催化系统，使用过渡金属错合物(例如Ru或Ir)与手性配位体(例如([(1S,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](4-甲苯磺酰基)酰胺基)和氢源(诸如甲酸三乙胺复合物)组合以对映选择性方式还原所得酮(A)。在碱存在下，所得醇(B)可用于直接烷基化(C)，得到通式(Ia)化合物，或烷基化(D)以产生中间体(E)，该中间体在碱存在下与甲基化试剂(例如碘代甲烷)甲基化后亦得到通式(Ia)化合物。

由(Ia)表示的具有E＝O的式(I)化合物可如以下方案2中所示制备。

方案2：

在方案2中，化合物(G)可通过以下制备：在诸如DIPEA的弱碱存在下，用携载离去基“LG”(例如Cl或Br)的乙腈衍生物使(D)烷基化，接着在碱(例如K₂CO₃)存在下用甲基化试剂(例如MeI)使中间体(F)甲基化。可通过用于形成四唑的典型反应条件(例如在TEA/TEA盐酸盐的DMF溶液的存在下使用NaN₃)来实现四唑(H)的形成。在诸如K₂CO₃的碱的存在下，用携载邻近羰基的离去基“LG”(例如Cl或Br)的适当乙酮衍生物操作四唑(H)的烷基化，得到两种区位异构体的混合物。可通过使用适当梯度的色谱移除非所需区位异构体(未图示)。最后，可通过使用适当的催化系统，使用过渡金属错合物(例如Ru或Ir)与手性配位体(例如([(1S,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](4-甲苯磺酰基)酰胺基)和氢源(诸如甲酸三乙胺复合物)组合以对映选择性方式还原(J)的酮基，得到最终化合物(Ia)。替代地，可通过在诸如DIPEA的碱的存在下，用携载邻近羟基的离去基“LG”(例如Cl或Br)的适当的乙醇衍生物(K)使中间体(H)烷基化，且随后分离出所需区位异构体来制备最终化合物(Ia)。

方案1和2的中间体(C)和(D)可如方案3中所示制备。

方案3

在方案3中，中间体(C)和(D)可以5-氨基嘧啶-4,6-二醇为起始物质合成。用在α位处具有离去基(LG)(例如氯乙酰氯)的活化羧酸使5-氨基嘧啶-4,6-二醇酰胺化，得到(L)，其可进一步在碱(例如DIPEA)存在下进展成中间体(D)。或者，中间体(D)可由5-氨基嘧啶-4,6-二醇经由在纯净条件下与在α位处携载离去基(LG)的羧酸或羧酸衍生物反应来合成。具有诸如对甲氧基苯甲基的保护基的嘧啶酮(D)的N-烷基化可通过在碱(例如，K₂CO₃)存在下，用携载离去基(例如，对甲氧基苯甲基氯，PMB-Cl)的适当试剂来达成。此使得后续可在碱(例如K₂CO₃)存在下使(M)甲基化(例如用MeI)以得到(N)。最后，(N)的保护基在适合条件下(例如对于PMB：三氟乙酸，100℃)裂解得到中间体(C)。

由(Ib)表示的具有E＝CH₂的式(I)化合物可如以下方案4中所示制备。

方案4

在方案4中，肌氨酸乙酯盐酸盐与乙基丁二酰基氯在碱存在下进行酰胺偶合，得到中间体(XVI)，该中间体可在克莱森缩合(Claisen condensation)中在碱(例如NaOEt)存在下进一步反应成中间体(XVII)。后续与甲脒鎓盐(例如，乙酸甲脒鎓)缩合，得到中间体(XVIII)，其可在碱(例如K₂CO₃)存在下用醇(B)烷基化，得到(Ib)。

可如下文方案5中所示制备通过(Ic)例示的具有E＝S、SO和SO₂的式(I)化合物。

方案5：

在方案5中，中间体(XIX)可通过在碱(例如NaH)存在下用甲基化试剂(例如MeI)使4-氯-5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-6-酮甲基化而合成。之后在酸(例如甲酸)存在下水解(XIX)得到中间体(XX)，该中间体可在碱(例如K₂CO₃)存在下用醇(B)N-烷基化，得到(Ic)。

实施例

制备

根据本发明的化合物和其中间体可使用本领域技术人员已知且描述于有机合成的文献中的合成方法，例如使用描述于“Comprehensive Organic Transformations”,第2版,RichardC.Larock,John Wiley&Sons,2010和“March's Advanced OrganicChemistry”,第7版,Michael B.Smith,John Wiley&Sons,2013中的方法获得。优选地，以类似于下文更充分阐述的制备方法，尤其如实验部分中所述来获得化合物。在某些状况下，实施反应方案所采用的顺序可变化。亦可使用本领域技术人员已知但未在本文中详细描述的这些反应的变型。基于研究以下方案，用于制备根据本发明的化合物的一般制程对于本领域技术人员将变得显而易见。起始化合物为可商购的或可通过描述于文献或本文中的方法来制备，或可以类似或相似方式制备。在进行反应之前，起始化合物中的任何对应官能基可使用常规保护基加以保护。这些保护基可在反应序次内的适合阶段使用本领域技术人员熟悉且例如“Protecting Groups”,第3版,Philip J.Kocienski,Thieme,2005和“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”,第4版,Peter G.M.Wuts,TheodoraW.Greene,John Wiley&Sons,2006的文献中所描述的方法再次裂解。术语“环境温度”和“室温”可互换使用且表示约20℃，例如介于19至24℃之间的温度。

缩写：

中间体的制备中间体I

中间体I.1(通用程序)

2-[5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑-2-基]-1-(4-氯苯基)乙-1-酮

在RT下，将1.63g(11.8mmol)K₂CO₃在搅拌下添加至1.00g(8.44mmol)5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑和2.17g(9.28mmol)4-氯苯甲酰甲基溴的15mL DMA溶液中。将反应混合物在RT下搅拌30min且随后过滤。将滤液用水和饱和NaCl水溶液稀释且用EtOAc萃取三次。经合并的有机相用水洗涤，经Na₂SO₄干燥，经活性炭过滤，且在减压下移除溶剂。通过柱色谱(硅胶；CH/EtOAc，80/20至50/50梯度)纯化残余物，得到产物。

C₁₀H₈Cl₂N₄O(M＝271.1g/mol)

ESI-MS：271[M+H]⁺

R_t(HPLC)：1.01min(方法B)

使用类似于中间体I.1所描述的程序，使用适当起始物质制备以下化合物。如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可涉及一般反应条件的变化形式。

*在18℃下将对甲氧基苯甲酰甲基溴(1.04eq.)缓慢添加至氯甲基四唑和K₂CO₃(1.4eq)于DMA中的搅拌溶液中；在RT下搅拌混合物1.5h；经由反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化。

中间体II

中间体II.1(通用程序)

(1R)-2-[5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑-2-基-]-1-(4-氯苯基)乙-1-醇

在惰性氛围下将1.30g(4.80mmol)1-(4-氯苯基)-2-[5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑-2-基]乙-1-酮(I.1)溶解于20mL ACN中。添加12mg(0.02mmol)氯化([(1S,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](4-甲苯磺酰基)酰胺基)(均三甲苯)钌(II)(CAS 174813-81-1)，接着逐滴添加0.72mL(1.73mmol)甲酸三乙胺复合物(5:2)。在RT下搅拌3h之后，在减压下移除溶剂。向剩余粗混合物中添加水且用EtOAc萃取此混合物。合并有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤，用活性炭处理，过滤且在减压下移除溶剂，得到中间体II.1。

C₁₀H₁₀Cl₂N₄O(M＝273.1g/mol)

ESI-MS：273[M+H]⁺

R_t(HPLC)：0.96min(方法B)

使用类似于中间体II.1所描述的程序，使用适当起始物质制备以下化合物。如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可涉及一般反应条件的变化形式。

中间体III

中间体III.1(通用程序)

1-(5,6-二氟-1-苯并呋喃-2-基)乙-1-酮

在0℃下在氩气下用6.99g(50.6mmol)碳酸钾处理5.00g(31.6mmol)4,5-二氟-2-羟基苯甲醛的50mL丙酮溶液。在0℃下再搅拌10min之后，逐滴添加3.78mL(47.4mmol)氯丙酮且在70℃下搅拌反应混合物3h。将反应混合物冷却至RT且浓缩。粗产物用EtOAc/水萃取且在减压下浓缩有机相，得到中间体III.1。

C₁₀H₆F₂O₂(M＝196.2g/mol)

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm:2.56(s,3H),7.89(m,1H),7.92(m,1H),8.01(m,1H)

使用类似于中间体III.1所述的程序，使用适当起始物质制备以下化合物。如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可能涉及一般反应条件的变化形式。

中间体IV

中间体IV.1(通用程序)

2-溴-1-(5,6-二氟-1-苯并呋喃-2-基)乙-1-酮

用1.23g(2.55mmol)三溴化四丁基铵于300μL MeOH和3mL THF中的溶液逐滴处理500mg(2.55mmol)1-(5,6-二氟-1-苯并呋喃-2-基)乙-1-酮(III.1)的6mL THF溶液。在RT下搅拌反应混合物2小时。在减压下浓缩反应混合物且用EtOAc/水萃取残余物。在减压下浓缩有机相且通过柱色谱(硅胶；己烷/EtOAc，9/1至7/3梯度)纯化粗物质。

C₁₀H₅BrF₂O₂(M＝275.0g/mol)

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm:4.83(s,2H),7.98-8.12(m,3H)

使用类似于中间体IV.1所描述的程序，使用适当起始物质制备以下化合物。如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可涉及一般反应条件的变化形式。

**：使反应在RT下用溴(13.6eq)在二噁烷/乙醚中进行2h，且用硫代硫酸钠溶液淬灭。

中间体V

3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

在65℃下，将7.5mL(94.41mmol)氯乙酰氯在搅拌下缓慢添加至10.0g(127.10mmol)5-氨基嘧啶-4,6-二醇的300mL DMF溶液。在65℃下搅拌1.5h之后，将36.1mL(129.94mmol)DIPEA缓慢添加至反应混合物中且在65℃下继续搅拌45min。在减压下浓缩反应混合物，用水处理，且过滤沉淀产物，用少量EtOH洗涤且干燥。

C₆H₅N₃O₃ (M＝167.1g/mol)

ESI-MS： 168[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.20min(方法M)

中间体VI

3-[(4-甲氧基苯基)甲基]-5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

用843mg(6.10mmol)碳酸钾处理680mg(4.07mmol)3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮(中间体V)的15mL DMF溶液且在RT下搅拌15min。添加0.58mL(4.27mmol)1-(氯甲基)-4-甲氧基苯，且搅拌反应混合物20h。添加843mg(6.10mmol)碳酸钾和0.30ml(4.88mmol)碘代甲烷，且在RT下搅拌反应混合物20h。添加0.26ml(4.07mmol)碘代甲烷且在RT下搅拌反应混合物20h，过滤，在减压下浓缩，且通过反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化。

C₁₅H₁₅N₃O₄ (M＝301.3g/mol)

ESI-MS： 302[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.95min(方法B)

中间体VII

5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

用16ml TFA处理5.30g(14.07mmol)3-[(4-甲氧基苯基)甲基]-5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮(中间体VI)且在100℃下搅拌1.5h。随后，在微波中在120℃下搅拌反应混合物15min，倒入冰水上且过滤。冻干滤液且未经进一步纯化即直接使用。

C₇H₇N₃O₃ (M＝181.2g/mol)

ESI-MS： 182[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.37min(方法B)

中间体VIII

7-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

在100℃下在纯条件下搅拌200mg(1.57mmol)5-氨基嘧啶-4,6-二醇和1.44g(9.44mmol)2-溴丙酸的混合物22.5h。反应混合物用DCM稀释，过滤且浓缩滤液通过柱色谱(硅胶；DCM/MeOH，1/0至7/3梯度)纯化。

C₇H₇N₃O₃ (M＝181.2g/mol)

ESI-MS： 182[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.23min(方法E)

中间体IX

中间体IX.1(通用程序)

3-({2-[(2R)-2-(4-氯苯基)-2-羟乙基]-2H-1,2,3,4-四唑-5-基}甲基)-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

向61mg(0.37mmol)3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮(V)的3mL DMF溶液添加76mg(0.55mmol)碳酸钾和100mg(0.37mmol)(1R)-2-[5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑-2-基]-1-(4-氯苯基)乙-1-醇(II.1)且混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用水/ACN/TFA淬灭，过滤且通过反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化，产生所需产物。

C₁₆H₁₄ClN₇O₄(M＝403.8g/mol)

ESI-MS： 404[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.77min(方法H)

使用类似于中间体IX.1所述的程序，使用适当起始物质制备以下化合物。如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可能涉及一般反应条件的变化形式。

中间体X

2-溴-2,2-二氟-N-(4-羟基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-基)乙酰胺

将200mg(1.57mmol)5-氨基嘧啶-4,6-二醇用456mg(2.36mmol)溴二氟乙酰氯处理且在纯条件下在90℃下搅拌3.5h。用二乙醚湿磨反应混合物且过滤，得到中间体X。

C₆H₄BrF₂N₃O₃ (M＝284.0g/mol)

ESI-MS： 284/286[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.10min(方法E)

中间体XI

7,7-二氟-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

用16mg(0.37mmol)氢化钠处理30mg(0.11mmol)2-溴-2,2-二氟-N-(4-羟基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-基)乙酰胺(X)的2.5ml DMF溶液且在50℃下搅拌18h。反应混合物通过反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化，产生所需产物。

C₆H₃F₂N₃O₃ (M＝203.1g/mol)

ESI-MS： 204[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.23min(方法A)

中间体XII

6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酸乙酯

向1.00g(3.72mmol)6-溴-1-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(III.4)的12.5mL DMF溶液中添加616mg(4.46mmol)碳酸钾。用氩气吹扫混合物，且添加92mg(0.22mmol)1,3-双(二苯膦基)丙烷、250mg(0.11mmol)乙酸钯(II)和670mg(9.29mmol)乙基乙烯基醚。反应混合物在80℃下搅拌18h，接着冷却至RT且通过添加1M HCl水溶液将pH调节至pH＝1。粗产物用EtOAc萃取，在减压下浓缩且通过柱色谱(硅胶；己烷/EtOAc 7/3)纯化。

C₁₃H₁₂O₄ (M＝232.2g/mol)

ESI-MS： 233[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 1.38min(方法Q)

中间体XIII

6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酸

向6.60g(28.4mmol)6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(XII)于66mL THF和33mL中的溶液中添加3.3mL乙醇和1.43g(34.1mmol)LiOH单水合物。在室温下搅拌反应混合物1小时且在减压下浓缩至干燥，得到中间体。

C₁₁H₈O₄(M＝204.2g/mol)

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm:2.67(s,3H),7.73(m,1H),7.99-7.85(m,2H),8.32(m,1H),13.30-14.50(br s,1H)

中间体XIV

6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酰胺

在0℃下，向1.00g(4.90mmol)6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酸(XIII)的10mL DCM溶液中添加932mg(7.34mmol)乙二酰氯和1滴DMF。在RT下搅拌反应混合物2h且浓缩至干燥。将残余物溶解于10mL THF中，冷却至0℃且添加15mL 25％氨水。反应混合物在RT下搅拌16小时且在减压下浓缩至干燥，得到中间体。

C₁₁H₉NO₃ (M＝203.2g/mol)

ESI-MS： 204[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.96min(方法Q)

中间体XV

6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲腈

在搅拌下在0℃下向0.90g(4.43mmol)6-乙酰基-1-苯并呋喃-2-甲酰胺(XIV)和1.4mL(9.88mmol)TEA的12mL THF溶液中逐滴添加1.1mL(7.77mmol)TFAA。反应混合物在0℃下搅拌1小时，用水淬灭且用EtOAc萃取三次。合并的有机层用饱和NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤且在减压下浓缩，得到中间体。

C₁₁H₇NO₂(M＝185.2g/mol)

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm:2.68(s,3H),7.92-8.05(m,2H),8.21(m,1H),8.37(m,1H).

中间体XVI

3-[(2-乙氧基-2-氧代乙基)(甲基)胺甲酰基]丙酸乙酯

在0℃下在搅拌下，向1.50g肌氨酸乙酯盐酸盐(9.77mmol，CAS：5260-49-9)的30mLDCM溶液中添加TEA(3.40mL，24.4mmol)，接着添加乙基丁二酰基氯(1.53mL，10.74mmol，CAS：14794-31-3)。使混合物缓慢升温至室温，在RT下搅拌3小时，且随后用水洗涤三次。在减压下浓缩有机层且通过柱色谱(硅胶；CyH/EtOAc，梯度)纯化。

C₁₁H₁₉NO₅ (M＝245.27g/mol)

ESI-MS： 246[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 1.05min(方法M)

中间体XVII

1-甲基-3,6-二氧代哌啶-2-甲酸乙酯

在搅拌下在RT下，向0.40g(1.63mmol)3-[(2-乙氧基-2-氧代乙基)(甲基)胺甲酰基]丙酸乙酯(XVI)的4.0mL无水二噁烷溶液中缓慢添加56mg(2.45mmol)钠，接着缓慢添加0.2mL无水EtOH。在80℃下搅拌反应混合物12小时，冷却至RT且通过添加HCl水溶液(4N)将pH调节至pH＝7。反应混合物用水稀释且用EtOAc萃取三次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤且在减压下浓缩，得到中间体。

C₉H₁₃NO₄ (M＝199.20g/mol)

ESI-MS： 200[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.75min(方法H)

中间体XVIII

1-甲基-1,2,3,4,7,8-六氢-1,7-萘啶-2,8-二酮

在0℃下向0.13g(0.52mmol)1-甲基-3,6-二氧代哌啶-2-甲酸乙酯(XVII)和0.27g乙酸甲脒(2.61mmol)于5.0mL无水MeOH中的搅拌混合物中缓慢添加0.60mL甲醇钠的MeOH溶液(25wt％)随后，使反应混合物回流4小时，冷却至0℃，用乙酸中和且在减压下浓缩。通过反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化产生所需产物。

C₈H₉N₃O₂ (M＝179.18g/mol)

ESI-MS： 180[M+H]⁺

R_t(HPLC)：0.08min(方法J)

中间体XIX

4-氯-5-甲基-5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-6-酮

在氩气下，向0.50g(2.48mmol)4-氯-5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-6-酮(CAS：20015-70-7)的3.0mL DMF溶液中添加0.12g(2.73mmol)氢化钠且在室温下搅拌20分钟。添加碘代甲烷(0.17mL，2.73mmol)且在室温下搅拌反应混合物过夜。反应混合物用盐水稀释且用EtOAc萃取。有机层经Na₂SO₄干燥，过滤且在减压下浓缩，得到中间体。

C₇H₆ClN₃OS (M＝215.66g/mol)

ESI-MS： 215[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.80min(方法B)

中间体XX

5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-6-酮

在4.0mL甲酸中在90℃下搅拌0.34g(1.58mmol)4-氯-5-甲基-5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噻嗪-6-酮(XIX)持续3h且在室温下搅拌过夜。随后在减压下浓缩反应混合物且在搅拌下在EtOH中回流30分钟。在缓慢冷却至室温之后，滤出产物，用EtOH洗涤且在减压下干燥。

C₇H₇N₃O₂S (M＝197.22g/mol)

ESI-MS： 198[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.53min(方法B)

最终化合物的制备

实施例1(通用程序A)

3-({2-[(2R)-2-(4-氯苯基)-2-羟乙基]-2H-1,2,3,4-四唑-5-基}甲基)-5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮

向210mg(0.77mmol)(1R)-2-[5-(氯甲基)-2H-1,2,3,4-四唑-2-基]-1-(4-氯苯基)乙-1-醇(II.1)的7mL DMF溶液中添加159mg(1.15mmol)K₂CO₃和185mg(0.77mmol)5-甲基-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮(VII)且混合物在室温下搅拌过夜。通过反相HPLC(ACN/H₂O梯度，0.1％TFA)纯化混合物，产生所需产物。

C₁₇H₁₆ClN₇O₄(M＝417.8g/mol)

ESI-MS： 418[M+H]⁺

R_t(HPLC)： 0.81min(方法H)

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm:3.33(s,3H),4.74-4.84(m,4H),5.10-5.16(m,1H),5.45(s,2H),5.92(d,J＝4.8Hz,1H),7.36-7.43(m,4H),8.46(s,1H)

使用类似于实施例1所描述的程序，通用程序A，使用适当起始物质制备以下化合物。

如本领域技术人员所了解，这些类似实施例可能涉及一般反应条件的变化形式。

化合物的分析数据描述于上表中：

实施例1(通用程序B)

向0.74g(1.83mmol)3-({2-[(2R)-2-(4-氯苯基)-2-羟乙基]-2H-1,2,3,4-四唑-5-基}甲基)-3H,4H,5H,6H,7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-4,6-二酮(IX.1)的15ml DMF溶液中添加0.43g(3.12mmol)碳酸钾和0.17mL(2.75mmol)碘代甲烷。在室温下搅拌反应混合物过夜，过滤且在减压下浓缩滤液。残余物用水稀释且用EtOAc萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥且在减压下浓缩，得到实施例1。

使用类似于实施例1所描述的程序，通用程序B，使用适当起始物质制备以下化合物。

*实施例23的立体中心的绝对构型为经由X射线指配。

化合物的分析数据描述于上表中：

分析型HPLC方法

方法A

分析柱：XBridge BEH C18_2.1×30mm，1.7μm；柱温：60℃

方法B

分析柱：Stable Bond(Agilent)1.8μm；3.0×30mm；柱温：60℃

方法C

分析柱：Sunfire C18(Waters)2.5μm；3.0×30mm；柱温：60℃

方法D

分析柱：XBridge C18_3.0×30mm_2.5μm(Waters)；柱温：60℃

方法E

分析柱：XSelect HSS PFP(Waters)_2.1×30mm_1.8μm；柱温：60℃

方法F

分析柱：Sunfire(Waters)C18_3.0×30mm_2.5μm；柱温：60℃

方法G

分析柱：Zorbax StableBond C18(Agilent)1.8μm；2.1×30mm；柱温：60℃

方法H

分析柱：Sunfire(Waters)2.5μm；3.0×30mm；柱温：60℃

方法I

分析柱：Sunfire(Waters)；C18_3.0×30mm_2.5μm；柱温：60℃

方法J

分析柱：Xbridge(Waters)；C18_3.0×30mm_2.5μm；柱温：60℃

方法K

分析柱：Sunfire(Waters)；C18_3.0×30mm_2.5μm；柱温：60℃

方法L

分析柱：Chiral Art Cellulose(YMC)；SJ_4.6×250mm_5μm；柱温：40℃；背压：2175.0psi

方法M

分析柱：Zorbax StableBond(Agilent)C18_3.0×30mm_1.8μm；柱温：60℃

方法N

分析柱：Kinetex XB；C18_4.6×50mm_2.6μm；柱温：25℃

方法O

分析柱：Acquity UPLC BEH；C8_2.1×150mm_1.7μm；柱温：55℃

方法P

分析柱：Xbridge(Waters)；C18_3.0×30mm_2.5μm；柱温：60℃

方法Q

时间(min)	水体积％	ACN体积％	流速[mL/min]
				0.0	80	20	0.5
0.1	80	20	0.5
				1.1	0	100	0.5
2.5	80	20	0.5
				3.0	80	20	0.5

分析柱：Acquity UPLC BEH；C18_2.1×100mm_1.7μm；柱温：40℃