CN116139336A - 一种多通道生物支架及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多通道生物支架及其制备方法与应用。所述多通道生物支架包括复数个核壳结构纤维，所述核壳结构纤维具有核壳结构，所述核壳结构纤维包括核结构纤维及壳结构纤维；所述核结构纤维与壳结构纤维的表面均具有拓扑结构，所述拓扑结构包括纵向凹槽微结构、多孔微结构、光滑结构中的任意一种，所述核壳结构纤维中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构。本发明制备的多通道生物支架提供与脊髓组织环境相似的基质环境，从而引导神经细胞定向迁移和促进神经元轴突定向再生延伸，而负载的药物分子和/或活性因子在脊髓损伤区域缓释，有助于受损的神经功能进行恢复。

Description

一种多通道生物支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多通道生物支架及其制备方法与应用。

背景技术

用神经组织工程技术修复脊髓损伤成为目前研究的热点和难点，其核心是构建理想的神经支架材料。脊髓横断后两段端的对接不良和空隙，易产生胶质细胞“瘢痕”，阻隔脊髓神经纤维的再生。填充生物支架材料可以防止胶质瘢痕的形成，有研究表明：在体内脊髓损伤模型中，具有高度排列的纤维支架比具有随机取向的纤维支架能实现更强健的定向轴突再生，引导神经元轴突延伸，使新形成的组织接近于原有的组织结构，有利于功能性连接的建立，这是功能恢复的基础。单纯的细胞悬液或者单纯的诱导因子、生长因子无法保证其到达预定部位从而起到预定作用，而理想的支架材料则可以成为细胞和因子的载体，为其构建良好的微环境。姜黄素作为传统中药材，具有抗炎，抗氧化的功效，并且显示出对神经保护作用，包括抑制神经炎症反应；通过下调胶质纤维酸性蛋白的过量表达，减少胶质瘢痕的形成；降低局部神经组织自由基释放和脂质过氧化，从而保护脊髓组织免受氧化应激；减少神经细胞凋亡来改善脊髓微环境。但是目前使用姜黄素治疗脊髓损伤模型方法绝大部分是通过构建脊髓夹伤模型后每天腹腔注射方式，而对于脊髓全横断模型及姜黄素特定损伤组织部位控释的治疗方法还很少见。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种多通道生物支架及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种多通道生物支架，其包括复数个核壳结构纤维，所述核壳结构纤维具有核壳结构，所述核壳结构纤维包括核结构纤维及壳结构纤维；所述核结构纤维与壳结构纤维的表面均具有拓扑结构，所述拓扑结构包括纵向凹槽微结构、多孔微结构、光滑结构中的任意一种，所述核壳结构纤维中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构，所述核结构纤维与壳结构纤维的表面独立地负载有药物分子和/或活性因子；

其中，所述核结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～30μm，凹槽高度为50～100μm；所述壳结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～50μm，凹槽高度为20～30μm。

本发明实施例还提供了前述的多通道生物支架的制备方法，其包括：利用湿法纺丝制备技术，采用至少2通道的同轴点胶针头将天然高分子材料-药物分子和/或活性因子凝胶挤出成型，再经交联固化、旋转收集、冷冻干燥处理，制得多通道生物支架。本发明实施例还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包括前述的多通道生物支架。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明制备的多通道生物支架提供明确定义的空间指导和高度有序微结构形貌，提供与脊髓组织环境相似的基质环境，从而引导神经细胞定向迁移和促进神经元轴突定向再生延伸，而负载姜黄素在脊髓损伤区域缓释，有利于神经干细胞向神经元分化，减少胶质瘢痕产生，在一定程度上有助于受损的神经功能进行恢复。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一典型实施方案中多通道生物支架的构建示意图；

图2A是本发明一实施例中同轴点胶针头图片，从左到右内点胶针/外点胶针规格分别为22G/14G，26G/26G/16G，25G/18G；

图2B-图2C是本发明一实施例中利用特殊旋转收集工艺装置将湿态纤维收集在树脂支撑架上的图片；

图3A是本发明一实施例中通过树脂支撑架收集湿态核结构纤维图片；

图3B是本发明一实施例中通过树脂支撑架收集负载姜黄素的湿态核结构纤维图片；

图3C是本发明一实施例中通过树脂支撑架收集干燥的核结构纤维图片；

图3D是本发明一实施例中不同浓度(4％和6％)核结构纤维SEM图片，包括纵向微观结构和横向微观结构；

图4A是本发明一实施例中多通道生物支架，其核壳结构纤维分别负载不同荧光染料图；

图4B是本发明一实施例中多通道生物支架表面形貌的扫描电子显微镜图片；

图4C是本发明一实施例中多通道生物支架，其核壳结构纤维分别负载不同荧光染料的激光共聚焦扫描荧光显微镜图片；

图4D-图4F是本发明一实施例中多通道生物支架横截面SEM图片；

图5A是本发明一实施例中绘制姜黄素的标准曲线图；

图5B是本发明一实施例中核结构纤维和壳结构纤维分别负载姜黄素于缓释介质中累计释药率曲线图；

图6A是本发明一实施例中SD大鼠来源神经干细胞在多通道生物支架上培养5d的免疫荧光染色图片；

图6B是本发明一实施例中核结构纤维负载姜黄素且表面具有有序纵向凹槽微结构的多通道生物支架移植到大鼠全横断脊髓损伤处14d的免疫荧光染色图片；

图6C是本发明一实施例中人源神经前体细胞及星形胶质细胞在多通道生物支架上培养8d免疫荧光染色图片；

图6D是本发明一实施例中人源神经前体细胞及星形胶质细胞在多通道生物支架上培养8d的SEM图片；

图7是本发明对比例1中核结构纤维未负载姜黄素且表面无有序纵向凹槽微结构的多通道生物支架移植到大鼠全横断脊髓损伤处14d的免疫荧光染色图片。

具体实施方式

鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要利用湿法纺丝制备技术和特殊旋转收集工艺及冷冻干燥方法，获得具有纵向凹槽微结构的多通道生物支架，所述的多通道生物支架包括核壳结构纤维中核纤维和壳纤维，且分别负载不同效应的药物和/或生物活性因子以及多通道生物支架担载细胞。本发明将需要具有控释周期长短的药物和/或因子按需分别负载于核纤维和壳纤维以达到不同缓释速率从而实现相应治疗效果，更重要的是多通道生物支架不仅可以能够促进神经细胞的线性生长和细胞骨架的伸长，还具有有序性和连通性，能为细胞生长提供限定的空间，有利于细胞间营养物质交换，促进支架移植细胞，因此同时构建对齐生长的细胞、药物和/或因子的多通道生物支架是一种具有巨大应用潜力的生物医用材料。

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种多通道生物支架包括复数个核壳结构纤维，所述核壳结构纤维具有核壳结构，所述核壳结构纤维包括核结构纤维及壳结构纤维；所述核结构纤维与壳结构纤维的表面均具有拓扑结构，所述拓扑结构为纵向凹槽微结构(有序纵向凹槽微结构)，所述核壳结构纤维中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构，所述核结构纤维与壳结构纤维的表面独立地负载有药物分子和/或活性因子；

其中，所述核结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～30μm，凹槽高度为50～100μm；所述壳结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～50μm，凹槽高度为20～30μm。

在一些优选实施方案中，所述拓扑结构的尺寸为1～100μm。

在一些优选实施方案中，所述多通道生物支架中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构，且孔隙的横截面直径为30～100μm。

在一些优选实施方案中，所述多通道生物支架中的单个纤维(核壳结构纤维)横截面直径为300～800μm。

在一些优选实施方案中，所述核结构纤维与壳结构纤维之间至少设置有一层中间壳结构纤维。

在一些优选实施方案中，所述核结构纤维、壳结构纤维、中间壳结构纤维的来源均为天然高分子材料，所述天然高分子材料包括胶原蛋白、丝素蛋白、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、硫酸软骨素、羧甲基淀粉、聚赖氨酸、聚谷氨酸、羧甲基葡萄糖、弹性蛋白、肝素中的一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步地，所述天然高分子材料包括胶原蛋白。

在一些优选实施方案中，所述药物分子包括姜黄素、紫杉醇、黄芩素、神经节苷酯、甲基强的松龙、米诺环素、东莨菪碱中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步地，所述药物分子包括姜黄素。

在一些优选实施方案中，所述活性因子包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素III(NT-3)、神经营养素IV/V(NT-4/5)中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

在一些优选实施方案中，所述多通道生物支架的表面担载有细胞。

在一些优选实施方案中，所述多通道生物支架为胶原蛋白纤维多通道生物支架，所述胶原蛋白纤维多通道生物支架具有核壳结构，通过核结构负载姜黄素促进神经干细胞向神经元分化，构建成有利于脊髓损伤神经再生及功能修复的多通道生物支架。

进一步地，所述胶原蛋白纤维多通道生物支架中的核结构纤维与壳结构纤维的表面均具有有序纵向凹槽微结构，其中，壳结构纤维表面的凹槽宽度为10～50μm，凹槽高度为20～30μm，核结构纤维表面的凹槽宽度为10～30μm，凹槽高度为50～100μm。

进一步地，所述核壳结构纤维中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构，且孔隙的横截面直径为30～100μm。

进一步地，所述胶原蛋白纤维多通道生物支架中的单个纤维横截面直径为300～800μm。

进一步地，所述胶原蛋白纤维多通道生物支架包含一种及以上的药物和/或活性因子通过物理共混方式(物理吸附)均匀分布于所述胶原纤维支架的内部和表面。

本发明中的多通道生物支架通过自身多通道表面凹槽形成二级结构提高了纤维与支架整体的比表面积，使得细胞与生物支架相互作用更加紧密。具体为凹槽微结构可以通过促进细胞黏附从而间接促进细胞增殖；同时，凹槽微结构所增大的比表面积为细胞增殖提供了更多的可利用表面；此外，特定尺寸的凹槽具有毛细作用，能够显著提升支架的流体输送性能，提高多通道支架内部营养物质与氧气的递送效率，从而达到促进细胞增殖效果。通过调整多通道中核壳结构的工艺参数(如原料浓度，纤维直径及凹槽尺寸)，达到不同的分工作用，具体为壳结构的支撑包裹作用，既提供力学支撑作用，维持通道贯穿连续性，又为核结构担载的细胞提供保护作用，避免受到组织液冲刷而流失。核结构用于负载需要缓释的药物及因子，其缓释效果优于壳结构；维持通道的贯穿连续性能可以更高效地实现氧气，营养物质的输送与代谢废物的清除，使得细胞能够快速向支架内部迁移。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的多通道生物支架的制备方法，其包括：利用湿法纺丝制备技术，采用至少2通道的同轴点胶针头将天然高分子材料-药物分子和/或活性因子凝胶挤出成型，再经交联固化、旋转收集、冷冻干燥处理，制得多通道生物支架。

进一步地，在挤出成型中推泵速率为0.001～90mL/h，同轴点胶针头为至少2通道，点胶针头规格为34G～14G。

更进一步地，在挤出成型中推泵速率为0.1～90mL/h。

在一些优选实施方案中，所述多通道生物支架的构建示意图如图1所示，其中药物A和药物B可以是相同或者不同的药物分子或活性因子。

在一些优选实施方案中，所述同轴点胶针头包括至少一个内点胶针头和一个外点胶针头的组合、两个相同的内点胶针头和一个外点胶针头的组合、两个不同的内点胶针头和一个外点胶针头的组合、至少一个内点胶针头和能包裹全部内点胶针头的外点胶针头组合中的任意一种。

在一些优选实施方案中，所述交联固化的方式包括化学交联和/或物理交联。

在一些优选实施方案中，所述交联固化的温度为10～30℃，时间为10～24h。

在一些优选实施方案中，所述交联固化采用的交联固化溶液包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺。

进一步地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为2∶1～5∶1。

进一步地，所述交联固化溶液的pH值为7.5～9。

在一些优选实施方案中，所述旋转收集采用的旋转收集装置的旋转速率为0.1～10mm/s，旋转方向为正向和/或逆向。

在一些更为具体地实施方案中，所述多通道生物支架的制备方法包括：

提供两种不同的胶原蛋白溶液，分别记为第一胶原蛋白溶液、第二胶原蛋白溶液；再分别向第一胶原蛋白溶液、第二胶原蛋白溶液中加入姜黄素，并经搅拌、离心处理，制得第一胶原蛋白-姜黄素凝胶、第二胶原蛋白-姜黄素凝胶；

分别将第一胶原蛋白-姜黄素凝胶、第二胶原蛋白-姜黄素凝胶转移到2支注射器中，注射器针头位置安装上同轴点胶针头，装有第一胶原蛋白-姜黄素凝胶的注射器对应安装上内点胶针头，装有第二胶原蛋白-姜黄素凝胶的注射器对应安装上外点胶针头，然后将注射器分别固定在挤出推泵上；

将碳酸氢钠溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺混合形成交联固化溶液；并将其放置在前述的注射器同轴点胶针头下方，并调整推泵高度，使同轴点胶针头顶端刚刚浸入交联固化溶液即可。

以及，打开前述推泵挤出开关，开始挤出多通道生物支架，使核结构和壳结构同时从针头处出来，室温下静置反应，再经洗涤、旋转收集、真空冷冻干燥处理，制得通道生物支架。

进一步地，所述胶原蛋白溶液的浓度为20mg/mL～70mg/mL。

进一步地，所述姜黄素与胶原蛋白的质量比为0.1％～5％。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包括前述的多通道生物支架。

本发明构建的核壳结构纤维表面图案化的多通道生物支架，通过控制制备工艺及收集参数制备出具有不同间距和深度的纵向凹槽，不仅可以调整神经细胞形态和排列，还能保持管状空间有序性，具有促进细胞定向迁移能力和营养扩散渗透性。此外将内部核结构负载姜黄素，外部壳结构提高其交联密度，壳结构较核结构具有更强的机械支撑力，既避免核结构受组织液的冲刷，确保其负载药物在损伤部位缓释，又避免损坏微环境对内部迁移细胞的不利作用。

本发明中的多通道生物支架的(有序)纵向凹槽微结构可以被应用于神经细胞感知，并能调控其有序迁移：纵向凹槽结构所给予细胞的各向异性力学刺激，内在机制是细胞的机械转导，即通过黏附部位感知各向异性力学刺激，并从基因层面调整自身形态特征，沿着凹槽方向延伸以适应生物支架结构或形貌。通过设计具有特殊表面拓扑结构的多通道生物支架，从而达到应用于修复脊髓损伤的目的。要获得特殊工艺即纵向凹槽微结构，首先工艺中离心步骤(速率及时间，温度)至关重要，保证其有效地去除气泡，其次，选择合适原料参数和合适挤出成型速率确保其具有剪切应力作用下的“流动取向”和受拉伸作用下“拉伸取向”，从而得以实现。

下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。

实施例1：多通道生物支架的构建

1.原料溶解

将1g胶原蛋白材料溶解于1％乙酸溶液中，分别配制成溶液浓度为40mg/mL和60mg/mL的两种，并于室温静置4h，分别向其中加入胶原蛋白质量0.5％的姜黄素(姜黄素用二甲基亚砜溶解)，搅拌均匀，室温下2000rpm离心10min去除气泡，得到胶原蛋白-姜黄素凝胶。

2.挤出成型

分别将其转移到2支10mL注射器中，注射器针头位置安装上同轴点胶针头(参阅图2A)，装有40mg/mL(4％)的胶原蛋白溶液-姜黄素凝胶的注射器对应安装上内点胶针头，装有60mg/mL(6％)的胶原蛋白溶液-姜黄素凝胶的注射器对应安装上外点胶针头，然后将注射器分别固定在挤出推泵上。设置推泵规格10cc，体积为10mL，内外点胶针头对应的推泵速率分别为2mL/h和15mL/h。图2A显示出不同规格组合的内点胶针头和外点胶针头，根据支架预期用途，通过调整不同规格组合可以控制核结构和壳结构的直径及孔隙大小，进一步的，可以增加核壳层数以增加多层通道作为药物及细胞载体。

3.交联固化

(1)配制1L 0.1M的碳酸氢钠溶液。按照质量比＝3∶1，加入1.5g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和500mg N-羟基丁二酰亚胺，搅拌溶解，配制成溶液。

(2)将配制好的溶液倒入敞口容器中，并将其放置在步骤2中的注射器同轴点胶针头下方，并调整推泵高度，使同轴点胶针头顶端刚刚浸入溶液即可。

(3)打开步骤2中推泵挤出开关，开始挤出多通道生物支架，使核结构和壳结构同时从针头处出来。

(4)接收完成后，室温下静置反应24h。

4.洗涤处理

24h后，轻轻收集多通道生物支架(可以用镊子或漏勺)，将其转移至新的器皿中，加入纯水，轻搅洗涤5次，每次10min。

5.旋转收集

利用可调节自动旋转收集纤维装置(参阅图2B-图2C)，将步骤4中多通道生物支架收集在树脂支撑架上(参阅图3A和3B)，设置旋转收集装置旋转速率为1mm/s。图3A和3B显示出纤维载药与否均具有较好的力学性能，且纤维直径均一。

6.真空冷冻干燥

(1)预先打开冻干所需要用的-80℃医用低温保存箱，使温度降至所需温度。

(2)将步骤5中材料放入-80℃医用低温保存箱中进行预冻1h。

(3)打开真空冷冻干燥机，将真空冷冻干燥机进行预冻(根据具体仪器要求，预热时间一般为20min)真空度设置为0.1mbar。

(4)预冻结束后，将上述材料从-80℃医用低温保存箱取出，逐一放入真空冷冻干燥机板层内，开启启动开关，升华干燥12h，即制备获得多通道生物支架(参阅图3C和4A)。图4A显示出多通道生物支架的核壳结构具有一体性，并且药物姜黄素连续性分布在核结构纤维，确保药物的均匀分布。

实施例2：多通道生物支架的表征

1.SEM观察多通道生物支架形貌及孔隙大小

将多通道生物支架在干燥状态下喷金，在扫描电镜下观察，拍照。观察表面形貌(参阅图3D和4B)和横截面(参阅图3D，4D，4E和4F)，分别取3个视野，统计支架直径范围和横截面孔隙大小与范围。图4B结果显示从支架表面形貌可以看出总直径在450μm～500μm，且支架核壳结构表面均具有有序的凹槽结构；从横截面图4D和4E可以看出核结构纤维直径在200μm～350μm，核壳结构之间的孔隙大小在100μm～200μm。核结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为20±5μm，凹槽高度为70±10μm；壳结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为30±5μm，凹槽高度为25±2μm。

注：图3D是本发明一实施例中不同浓度(4％，40mg/mL的胶原蛋白溶液-姜黄素凝胶制备核结构和6％：60mg/mL的胶原蛋白溶液-姜黄素凝胶制备壳结构)核结构纤维SEM图片，包括纵向微观结构和横向微观结构。

2.荧光染料标记多通道支架验证其连通性

制备用蓝色和绿色荧光分别标记的核结构及壳结构的多通道生物支架，经交联固化，洗涤处理，冷冻干燥，重新浸泡在PBS缓冲溶液中，通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察核结构和壳结构之间的孔隙连通性，并层扫拍照(参阅图4C)。图4C结果显示湿润状态下核壳结构之间的孔隙仍然存在，孔隙大小在50～150μm，且具有连通性。

3.核壳结构负载姜黄素体外缓释实验

精密称取2.5mg姜黄素于25mL容量瓶中，并用乙醇定容配置成贮存液。然后分别吸取不同体积的贮存液于5mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，精确配制成浓度为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的系列标准溶液，经光谱扫描确定吸收峰的波长423nm，用此波长测定标准溶液吸光度，以吸光度(A)对姜黄素浓度(C)进行线性回归，获得回归方程，绘制标准曲线(参阅图5A)。

将核壳结构分别负载姜黄素的支架置于缓释介质中：含吐温80(0.5％)的PBS(pH7.4)溶液，分别于1、2、4、8、24、32、48、72、96h取样2mL，同时补充同温等量缓释介质，样品以0.5％吐温80的PBS溶液为空白对照，423nm处测定吸光度，按照回归方程计算测定的浓度，从而计算累计释药率(参阅图5B)。图5B结果显示短期内核结构纤维对于负载的姜黄素释放量显著低于壳结构纤维。

实施例3：多通道生物支架对神经干细胞的体外培养

1.原代神经干细胞(NSCs)的分离培养及接种到支架上

取出生24h内的SD乳鼠分离出脑端，剪碎，加胰酶替代物37℃培养箱多次消化吹打，时间分别为3min、5min、5min，加入等量培养基终止消化，400目尼龙膜滤去组织结块，将滤液离心：350g，5min，弃去上清液，将细胞转移到培养瓶中成球培养，第4d换液，第7d将神经球用胰酶替代物消化15min，消散成单细胞。将细胞悬液接种于灭菌的支架上，每2d换液一次。

2.免疫荧光染色观察支架表面凹槽微结构对NSCs粘附分布的影响作用

担载NSCs的多通道生物支架用4％多聚甲醛室温下固定30min，PBS浸洗3次；0.5％TritonX-100室温透膜5min，PBS浸洗3次；5％BSA溶液室温封闭1h；加入抗Nestin，GFAP一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次；加入对应种属的二抗和DAPI室温孵育2h，PBS洗3次；通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察拍照。结果显示多通道生物支架有利于神经干细胞的粘附且明显表现出随着壳结构纤维凹槽长度延伸进行线性分布(参阅图6A和6C)，说明我们的多通道生物支架可以通过高度有序的表面凹槽结构给予附着细胞的各向异性力学刺激，从而使细胞感知各向异性力学刺激调整自身形态特征，沿凹槽方向延伸以适应基质形貌。绿色荧光代表神经干细胞的标志物Nestin，红色荧光代表星形胶质细胞的标志物GFAP，蓝色代表DAPI染的细胞核。

3.担载NSCs的多通道生物支架形貌

担载NSCs的多通道生物支架用4％多聚甲醛室温下固定30min，PBS浸洗3次，使用梯度乙醇(浓度为25％、50％、75％、85％、95％、100％)进行脱水，每个浓度脱水时间为10min，然后将样品进行冷冻干燥，喷金制样后进行SEM表征(参阅图6D)。图6D显示出NSCs主要粘附于壳结构纤维凹槽粗糙处，且呈现出与凹槽延伸方向一致的定向伸展状态，这一现象与免疫荧光染色结果相一致(参阅图6A和6C)，表明制备的生物多通道支架表面分布的有序性凹槽结构(参阅图3D和4B)有利于神经细胞定向迁移。

实施例4：多通道生物支架对大鼠脊髓全横断损伤的修复

1.大鼠脊髓全横断损伤模型的构建

SPF级雌性SD大鼠，体重在200g～220g，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，取俯卧位，大鼠腰背部脱毛，消毒，在T8-T10位置切开皮肤和筋膜，沿棘突切开双侧肌肉，用持针器撬开并剔除T9位置的椎板，暴露出脊髓。显微持针器夹住脊髓，用显微剪立即在前后端各剪一刀，去除一段约4mm的脊髓组织，立即将明胶海绵压紧止血。待血止后，将支架材料植入损伤部位。

2.免疫荧光染色检测神经元及星形胶质细胞的表达

术后14d，麻醉后的大鼠用4％多聚甲醛心脏灌注，取出包含损伤部位的脊髓，4％多聚甲醛4℃过夜固定，然后分别更换20％和30％蔗糖溶液4℃过夜脱水，最后用OCT包埋，冰冻切片。切片用PBS浸洗3次，每次5min；待PBS干燥后，用免疫组化笔将待染组织区域圈住；室温下用即用型山羊血清封闭处理1h，去除血清；加入抗Tuj-1，GFAP一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次；加入对应种属的二抗室温避光孵育2h，PBS洗3次；晾干，用含DAPI的封片剂封片15min，通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察拍照(参阅图6B)。图6B显示核结构负载姜黄素的多通道生物支架有利于神经干细胞向神经元分化，这一现象并未出现在壳结构上，相反地，壳结构纤维上显示出零星分布的星形胶质细胞，观察整体，核壳结构均显示出较多数量的细胞募集，而核结构纤维上显示出符合其外观轮廓的一圈细胞量，表明多通道生物支架核壳结构之间具有连通性且允许内源性神经细胞向其中孔隙处迁移，红色荧光代表神经元的标志物Tuj-1，绿色荧光代表星形胶质细胞的标志物GFAP，蓝色代表DAPI染的细胞核。

对比例1

多通道生物支架的制备方法同实施例1，不同之处在于制备的多通道生物支架的核结构纤维与壳结构纤维的表面不具备纵向凹槽微结构；

将该对比例的多通道生物支架用于对大鼠脊髓全横断损伤的修复方法同实施例4，通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察拍照表征，图7显示单纯的核结构即未负载姜黄素的多通道生物支架上并未观察到较多数量神经干细胞向神经元分化现象，观察整体，核壳结构均显示出较少数量的细胞募集，而缺失的纵向凹槽微结构也导致核壳结构纤维外观轮廓的一圈细胞无序混乱，表明多通道生物支架中核壳结构表面纵向凹槽微结构是促进神经细胞有序取向迁移的必要条件，红色荧光代表神经元的标志物Tuj-1，绿色荧光代表星形胶质细胞的标志物GFAP，蓝色代表DAPI染的细胞核。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多通道生物支架，其特征在于包括复数个核壳结构纤维，所述核壳结构纤维具有核壳结构，所述核壳结构纤维包括核结构纤维及壳结构纤维；所述核结构纤维与壳结构纤维的表面均具有拓扑结构，所述拓扑结构为纵向凹槽微结构，所述核壳结构纤维中的核结构纤维与壳结构纤维之间具有连通的孔隙结构，所述核结构纤维与壳结构纤维的表面独立地负载有药物分子和/或活性因子；

其中，所述核结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～30μm，凹槽高度为50～100μm；所述壳结构纤维表面的纵向凹槽微结构的凹槽宽度为1～50μm，凹槽高度为20～30μm。

2.根据权利要求1所述的多通道生物支架，其特征在于：所述拓扑结构的尺寸为1～100μm；

和/或，所述多通道生物支架中的核结构纤维与壳结构纤维之间的孔隙的横截面直径为30～100μm；

和/或，所述多通道生物支架中的核壳结构纤维的横截面直径为300～800μm。

3.根据权利要求1所述的多通道生物支架，其特征在于：所述核结构纤维与壳结构纤维之间至少设置有一层中间壳结构纤维。

4.根据权利要求3所述的多通道生物支架，其特征在于：所述核结构纤维、壳结构纤维、中间壳结构纤维的来源均为天然高分子材料，所述天然高分子材料包括胶原蛋白、丝素蛋白、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、硫酸软骨素、羧甲基淀粉、聚赖氨酸、聚谷氨酸、羧甲基葡萄糖、弹性蛋白、肝素中的一种或两种以上的组合；优选的，所述天然高分子材料包括胶原蛋白。

5.根据权利要求1所述的多通道生物支架，其特征在于：所述药物分子包括姜黄素、紫杉醇、黄芩素、神经节苷酯、甲基强的松龙、米诺环素、东莨菪碱中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述药物分子包括姜黄素；

和/或，所述活性因子包括脑源性神经营养因子、神经营养素III、神经营养素IV/V中的任意一种或两种以上的组合；

和/或，所述多通道生物支架的表面担载有细胞。

6.权利要求1-5中任一项所述的多通道生物支架的制备方法，其特征在于包括：利用湿法纺丝制备技术，采用至少2通道的同轴点胶针头将天然高分子材料-药物分子和/或活性因子凝胶挤出成型，再经交联固化、旋转收集、冷冻干燥处理，制得多通道生物支架。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述同轴点胶针头包括至少一个内点胶针头和一个外点胶针头的组合、两个相同的内点胶针头和一个外点胶针头的组合、两个不同的内点胶针头和一个外点胶针头的组合、至少一个内点胶针头和能包裹全部内点胶针头的外点胶针头组合中的任意一种；

和/或，在挤出成型中推泵速率为0.001～90mL/h；优选为0.1～90mL/h。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述交联固化的方式包括化学交联和/或物理交联；和/或，所述交联固化的温度为10～30℃，时间为10～24h；

和/或，所述交联固化采用的交联固化溶液包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液、1～2.5wt％的戊二醛溶液、1～10mmol/L的京尼中的任意一种；优选的，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为2∶1～5∶1；优选的，所述交联固化溶液的pH值为7.5～9。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述旋转收集采用的旋转收集装置的旋转速率为0.1～10mm/s，旋转方向为正向和/或逆向。

10.一种修复脊髓损伤的功能产品，其特征在于包括权利要求1-5中任一项所述的多通道生物支架。

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