CN116139275A

CN116139275A - Cd300ld抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途

Info

Publication number: CN116139275A
Application number: CN202111392144.2A
Authority: CN
Inventors: 罗敏; 赵允; 卢智刚
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS; Fudan University
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS; Fudan University
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2023-05-23

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途，CD300LD抑制剂通过调节其下游信号通路中的S100A8/A9来调节PMN‑MDSC细胞的迁移和功能，在肿瘤微环境的建立中发挥重要作用；CD300LD抑制剂可以有效抑制多种实体瘤小鼠模型的发展，并与PD1抗体有显著的抗肿瘤协同作用；在肿瘤已建成的阶段，施用CD300LD抑制剂能够显著抑制肿瘤发展。本发明为肿瘤免疫治疗提供新的靶点和思路。

Description

CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途。

背景技术

PD1、CTLA4等免疫检查点阻断疗法仅在部分病人中具有较好治疗效果，因此寻找新的免疫检查点以进一步促进肿瘤免疫治疗是领域内的重大挑战。多型核髓源抑制细胞(PMN-MDSC)是一类病理诱导产生的、广泛存在于各种肿瘤中的中性粒细胞，能够抑制T细胞和NK等效应细胞功能，促进肿瘤发展、浸润和转移，在肿瘤免疫调节上发挥关键作用。针对PMN-MDSC的特异性靶向药物可进一步推进肿瘤的免疫治疗，但目前其特异性的免疫检查点分子仍有待发现。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明首先提供CD300LD基因作为靶标在制备肿瘤预防、诊断或治疗药物中的用途。

本发明还提供CD300LD基因和PD1共同作为靶标在制备肿瘤预防、诊断或治疗药物中的用途。

本发明还提供CD300LD抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

1)预防、诊断、治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包括CD300LD抑制剂，所述组合物用于以下任一种或多种用途：

1)预防、诊断、治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

如上所述，本发明的CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途，具有以下有益效果：提供了一种PMN-MDSC特异性的新免疫检查点分子——CD300LD，从而特异、高效地靶向调控PMN-MDSC，为解决靶向调控PMN-MDSC进行肿瘤免疫治疗提供新靶点和思路。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中通过CD300LD基因的发现及其在免疫细胞中的基因表达图谱。A，PMN-MDSC与中性粒细胞的差异表达基因。B和C，利用Crispr-Cas9和B16-F10肿瘤模型对髓系细胞表面受体进行体内筛选的筛选流程示意图(B)；筛选富集基因(C)，与荷瘤小鼠的骨髓相比，CD300LD gRNA在肿瘤中特异缺失。D，流式分析显示在正常小鼠免疫细胞中，CD300LD特异表达在白细胞中的髓系细胞里，尤其是在中性粒细胞(CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺)中特异性高表达(n＝3)。E，流式分析CD300LD在瘤内髓系细胞中的表达：巨噬细胞

(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺)，单核髓来源抑制细胞M-MDSC(CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺ly6G^-)，多型核髓来源抑制细胞PMN-MDSC(CD45⁺CD11b⁺Ly6c^lowly6G⁺)，结果显示CD300LD在PMN-MDSC中特异性高表达。F，qRT-PCR显示CD300LD在荷瘤小鼠PMN-MDSC与正常小鼠中性粒细胞中的mRNA水平。G，Human Protein Atlas数据库分析显示CD300LD基因主要表达在血液/免疫组织，在细胞亚型上主要表达在中性粒细胞上。H，qRT-PCR对健康人与结肠癌病人外周血粒细胞的CD300LD基因定量。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图2显示为本发明实施例2中CD300LD敲除抑制多种肿瘤的发生发展。A&B，CD300LDKO小鼠的构建示意图(A)及genotyping结果(B)。C，流式分析CD300LD WT和KO小鼠中性粒细胞中CD300LD的表达。D-F，CD300LD WT和KO小鼠黑色素瘤(B16-F10)肿瘤模型的肿瘤生长曲线(D)、20天肿瘤大小(E)、以及小鼠生存曲线(F)(n＝11)。G，CD300LD WT和KO小鼠中TC-1宫颈癌模型的肿瘤生长曲线(n＝6)。H，CD300LD WT和KO小鼠中MC-38结肠癌模型的肿瘤生长曲线(n＝6)。I，CD300LD WT和KO小鼠中LLC肺癌模型的肿瘤生长曲线(n＝6)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图3显示为本发明实施例3中CD300LD敲除通过PMN-MDSC抑制肿瘤的发展。A，通过LyzCre条件敲除髓系细胞内的CD300LD，可以明显抑制B16-F10肿瘤的发展(n＝6)。B，通过S100A8Cre条件敲除髓系细胞内PMN-MDSC的CD300LD，可以明显B16-F10抑制肿瘤的发展(n＝9)。C，通过Ly6g抗体清除小鼠体内的PMN-MDSC，在野生型小鼠中显著抑制B16-F10肿瘤的发展，但在CD300LD敲除小鼠的B16-F10肿瘤模型中没有明显效果。D-F，分离野生型小鼠或CD300LD KO小鼠B16-F10肿瘤中的巨噬细胞(D)﹑单核髓源抑制型细胞(E)﹑以及PMN-MDSC(F)等细胞，以1：1的比例与B16-F10细胞混合后分别接种于野生小鼠皮下，图中显示的是小鼠的生长曲线，只有多核型髓源抑制细胞的CD300LD存在与否导致肿瘤生长差别。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图4显示为本发明实施例4中CD300LD敲除改善肿瘤免疫微环境(流式分析结果)。A，流式分析B16-F10肿瘤中白细胞(CD45⁺)及各主要髓系细胞亚群比例。B,流式分析B16-F10肿瘤中淋巴细胞各亚群的比例变化。C&D，免疫荧光分析B16-F10肿瘤瘤内PMN-MDSC(Ly6g⁺)和CD8⁺T细胞，其中C为免疫荧光结果(Bar＝200um)，D为免疫荧光分析的数据统计。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图5显示为本发明实施例4中CD300LD敲除改善肿瘤免疫微环境(单细胞测序结果)。A&B，利用单细胞测序对B16-F10肿瘤免疫微环境中的免疫细胞进行分群，其中A为tSNE图，B&C，CD300LD WT与KO小鼠B16-F10肿瘤微环境中免疫细胞的分布，其中KO组PMN-MDSC在明显减少，CD8⁺T细胞明显增加；B为tSNE图，C为WT和KO相应细胞的比例图。D，PMN-MDSC功能相关基因、以及T细胞招募和功能相关基因在WT和KO组免疫细胞中的表达水平，结果显示在KO组中PMN-MDSC功能相关基因明显下调，T细胞浸润和功能相关基因表达明显升高。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图6显示为本发明实施例5中CD300LD-KO显著降低PMN-MDSC的迁移和功能。A，RNAseq分析CD300LD WT和KO PMN-MDSC的基因表达谱，GO分析发现粒细胞迁移信号通路有显著差异。B，GSEA分析发现粒细胞迁移相关基因显著富集在WT PMN-MDSC中。C，从荷瘤的CD300LD WT和KO小鼠中分离PMN-MDSC进行体外迁移实验，其中左侧为示意图，右侧为实验统计结果(n＝3)。D-F，从荷瘤的CD300LD WT和KO小鼠分离PMN-MDSC进行体内迁移实验：D为过程示意图。E&F，注射前、以及注射后骨髓和肿瘤中WT和KO PMN-MDSC的流式分析图(E)及统计结果(F)。G&H，CD300LD WT和KO PMN-MDSC抑制T细胞增殖的能力分析，其中G为流式图，H为统计分析(n＝3)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图7显示为本发明实施例6中CD300LD通过S100A8/A9调控PMN-MDSC的迁移和功能。A，RNAseq分析CD300LD WT和KO PMN-MDSC的差异基因，其中PMN-MDSC相关基因S100A8/A9的表达有在KO组中显著下调。B，ELISA分析WT和KO荷瘤小鼠血清中S100A8/A9的水平。C，qRT-PCR分析CD300LD WT和KO PMN-MDSC中S100A8/A9的表达(n＝3)。D，S100A8/A9蛋白对PMN-MDSC的体外迁移能力的影响(n＝3)。E,S100A8/A9抑制剂Tasquinimod对WT和KO PMN-MDSC抑制T细胞增殖的影响(n＝3)。F&G，小鼠荷瘤过程中腹腔注射S100A8/A9的抑制剂Tasquinimod，分析其对肿瘤生长曲线的影响(F)，以及瘤内PMN-MDSC的比例(G)(n＝4-5)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图8显示为本发明实例7中CD300LD敲除与PD抗体具有抗肿瘤协同效应。A，CD300LDWT和KO小鼠肿瘤中PD1⁺CD8⁺细胞、PD-L1⁺PMN-MDSC细胞、以及PD-L1⁺肿瘤细胞的比例。B，CD300LD WT和KO小鼠接种B16-F10肿瘤细胞后，第7天开始进行PD1抗体处理，200μg/小鼠，2天一次共3次；肿瘤生长曲线(B)和小鼠生存曲线(C)(n＝11-15)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图9显示为本发明实施例8中CD300LD敲除对免疫和造血系统发育无明显影响的结果。A，CD300LD WT和KO小鼠骨髓(BM)、外周血(PB)、和脾脏中的T(CD3⁺)、B(B220⁺)、髓系(Mac1⁺)和中性粒细胞(Mac1⁺Gr1⁺)等免疫细胞比例的流式分析统计(n＝3)。B&C，CD300LDWT和KO小鼠骨髓中HSC及各前体细胞的流式分析图(B)及统计(C)(n＝3)。D，CD300LD WT和KO小鼠HSC的克隆形成能力(n＝3)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图10显示为本发明实施例9中诱导敲除CD300LD能够抑制已建成肿瘤的发展，可以作为一个有效的肿瘤治疗靶点。A，在CD300LD^(f/f)/Mx1-Cre和CD300LD^(f/f)小鼠中建立B16-F10肿瘤模型，肿瘤发展第7天注射PolyI:C来诱导敲除CD300LD。肿瘤生长曲线显示CD300LD^(f/f)/Mx1-Cre小鼠中的肿瘤发展被显著抑制(n＝6)。B，A组的对照，小鼠同A组，如果不注射PolyI:C，两组小鼠的肿瘤生长无显著差别(n＝6)。双尾t检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具体实施方式

本发明聚焦寻找调控PMN-MDSC的关键检查点分子。因为PMN-MDSC与中性粒细胞在分子分型上类似但功能相反，本发明首先对二者进行转录组测序，分析膜蛋白表达差异；同时也构建了针对PMN-MDSC膜蛋白的sgRNA文库，结合小鼠肿瘤模型进行CRISPR-Cas9体内筛选。两种策略同时指向一个全新的膜蛋白CD300LD。人和鼠CD300LD均特异表达在中性粒细胞/PMN-MDSC上，荷瘤后在后者表达明显上调。敲除CD300LD在包括黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肺癌等多种模型中显著抑制肿瘤的发展。利用CD300LD条件敲除或Ly6G抗体清除体内PMN-MDSC以及分离不同髓系细胞亚群进行混合成瘤实验等，证明PMN-MDSC特异性通过CD300LD调控肿瘤免疫。因此，CD300LD是一个全新的PMN-MDSC特异性肿瘤免疫抑制受体，一个有效的免疫检查点分子。

机制研究发现，CD300LD敲除导致肿瘤免疫抑制微环境发生明显改善：PMN-MDSC急剧减少，CD8⁺T细胞浸润显著增加；PMN-MDSC迁移及功能相关信号通路显著下调；T细胞迁移和杀伤相关信号通路明显上调。进一步研究发现，CD300LD通过下游S100A8/A9调控PMN-MDSC的肿瘤迁移及抑制T细胞的功能。综上，CD300LD敲除通过S100A8/A9调控PMN-MDSC的募集与功能，从而显著改善肿瘤免疫抑制微环境，产生广谱抗肿瘤作用。

在安全性方面，与目前广受关注的、髓系细胞广泛表达的CSF1R敲除机体致死、以及CD47存在较强的副作用不同，CD300LD敲除不影响机体及免疫系统的正常发育。而有效性方面，CD300LD抑制多种肿瘤模型的发展，与PD1抗体呈现显著抗肿瘤协同效应；更为重要的是在肿瘤已建成的阶段，诱导敲除CD300LD也能够显著抑制肿瘤发展。综上，CD300LD作为全新靶点具有很好的安全性和抗肿瘤有效性。

基于以上研究，本发明首先提供CD300LD基因作为靶标在制备肿瘤预防、诊断或治疗药物中的用途。

本发明中，“预防”一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的预防性处置。该效果较佳是指医疗上可阻滞、延迟疾病的发生和/或降低疾病发展或恶化的风险。

本发明中，“诊断”一词可以为根据CD300LD的表达量判断是否存在某种疾病。

本发明中，“治疗”一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的治愈性或缓和性处置。该效果较佳是指医疗上可减少疾病的一种或多种症状或者完全消除疾病。

如无特殊解释，本发明所述的肿瘤为CD300LD过表达的肿瘤。所述CD300LD过表达通常指CD300LD的表达水平高于一定的标准，这一表达可以是分子水平的，也可以是蛋白水平的。例如，CD300LD阳性可以是肿瘤组织中可检测出CD300LD的mRNA的过表达。再例如，CD300LD阳性可以是肿瘤组织中可检测出CD300LD的蛋白的过表达。再例如，CD300LD阳性可以是肿瘤组织的CD300LD的mRNA表达水平高于其周围健康组织。再例如，CD300LD阳性可以是肿瘤组织的CD300LD蛋白的表达水平高于其周围健康组织。所述肿瘤可以是实体瘤(例如消化道肿瘤、呼吸道肿瘤)或血液肿瘤，更具体可以是肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、头颈癌、皮肤癌、肾癌、白血病、宫颈癌、coad(结肠癌)，lihc(肝细胞肝癌)，ov(卵巢浆液性囊腺癌)，ucec(子宫内膜癌)，thca(甲状腺癌)，skcm(皮肤黑色素瘤)，luad(肺腺癌)，hnsc(头颈鳞状细胞癌)，gbm(多形成性胶质细胞瘤)，prad(前列腺癌)，thym(胸腺癌)，lgg(脑低级别胶质瘤)，read(直肠腺癌)，pcpg(嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)，esca(食管癌)，kirc(肾透明细胞癌)，blca(膀胱尿路上皮癌)，kirp(肾乳头状细胞癌)，paad(胰腺癌)，stad(胃癌)，kich(肾嫌色细胞癌)，brca(乳腺浸润癌)，lusc(肺鳞癌)，sarc(肉瘤)，LAML(急性髓细胞样白血病)等。

所述CD300LD基因作为靶标在制备预防、诊断或肿瘤治疗药物具体是指：将CD300LD基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制CD300LD基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如小分子干扰RNA(siRNA)即是以人CD300LD基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将CD300LD基因作为作用对象。

所述将人CD300LD基因作为靶标用于制备肿瘤诊断药物具体是指：将CD300LD基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

在一种实施方式中，所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制CD300LD基因的转录或翻译，或能够特异性抑制CD300LD蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中CD300LD基因的表达水平，或能够竞争性抑制CD300LD，达到肿瘤免疫抑制微环境发生明显改善的目的，肿瘤免疫抑制微环境发生明显改善具体表现为PMN-MDSC急剧减少，CD8⁺T细胞浸润显著增加；PMN-MDSC迁移及功能相关信号通路显著下调；T细胞迁移和杀伤相关信号通路明显上调。发明人通过机制研究发现，肿瘤治疗药物中的CD300LD通过下游S100A8/A9调控PMN-MDSC的肿瘤迁移及抑制T细胞的功能，产生广谱抗肿瘤作用。

所述通过CD300LD基因制备获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

在一种实施方式中，所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人CD300LD基因的转录或翻译，或者足够降低CD300LD蛋白的表达或活性的剂量。以使人CD300LD基因的表达或活性至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

在另一种实施方式中，所述足够降低CD300LD蛋白的活性的剂量为足够与CD300LD蛋白或其受体竞争性结合，从而使CD300LD蛋白不能发挥作用的剂量。

采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人CD300LD基因的表达或活性水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人CD300LD基因表达或活性水平的物质给药于患者。

在一种实施方式中，所述CD300LD基因的靶标为Exon2。

1)预防、诊断、治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

本发明的发明人发现，CD300LD抑制剂可以调节髓系细胞的活性。所述调节髓系细胞的活性例如可以是使髓系细胞的细胞数量减少，或使髓系细胞上抑制免疫相关的基因表达下降。

所述调节髓系细胞的迁移可以是通过髓系细胞迁移相关信号通路显著下调实现的。

所述髓系细胞选自巨噬细胞、M-MDSC或PMN-MDSC。

调节T细胞活性例如可以是肿瘤微环境中浸润免疫细胞显著增加，CD4⁺和CD8⁺T细胞数量显著增加，Treg细胞显著减少，T细胞杀伤功能相关的基因表达显著上升，或T细胞募集相关基因显著升高。CD300LD抑制剂能够通过抑制髓系细胞的T细胞抑制功能，达到调节T细胞增殖的目的。

所述调节CD300LD的下游信号通路可以是通过正调节下游信号通路中的某个基因，也可以是通过负调节下游信号通路的某个基因调节。所述下游信号通路的基因例如是S100A8、S100A9、Trim10、Ms4a6d、Apol11b。

本发明所提供的产品中，CD300LD抑制剂通常是作为免疫治疗药物。用于治疗肿瘤的免疫治疗药物通常是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而改变肿瘤微环境，以达到控制与清除肿瘤的效果。

所述产品必然包括CD300LD抑制剂，并以CD300LD抑制剂作为前述功效的有效成分。

所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为CD300LD抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。

亦即，CD300LD抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。

所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述产品包括但不限于药物、保健品、食品、试剂盒等。

所述CD300LD抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述CD300LD抑制剂可以为降低肿瘤细胞中CD300LD基因表达的核酸分子。

本发明中，CD300LD抑制剂通常指可以抑制CD300LD的表达和/或功能的物质。例如，CD300LD抑制剂可以部分抑制，即降低CD300LD的表达和/或功能，例如降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的CD300LD的表达和/或功能；也可为完全抑制，即基本上完全消除CD300LD的表达和/或其功能。合适的能够作为CD300LD抑制剂的物质的种类对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，CD300LD抑制剂可以是拮抗剂、阻断剂等。再例如，CD300LD抑制剂的抑制功能可以是在CD300LD基因核酸分子水平(例如，mRNA水平、DNA水平)和/或蛋白分子水平上表达水平的抑制。再例如，CD300LD抑制剂也可以是与CD300LD竞争性结合其配体的物质，亦或是与CD300LD的配体竞争性结合CD300LD的物质。更具体的，CD300LD抑制剂可以是核酸分子、蛋白分子或化合物等。例如，核酸分子可以选自针对CD300LD的干扰RNA、针对CD300LD的反义寡核苷酸、用于敲除或敲减CD300LD表达的物质，更具体可以是siRNA、miRNA、shRNA、基因敲除载体、基因表达载体(例如，能够表达siRNA、shRNA、干扰RNA)等。在本发明一具体实施例中，核酸分子的靶序列可以是CD300LD的2号外显子。例如，蛋白分子可以选自抗CD300LD抗体，这些抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体等。再例如，CD300LD抑制剂可以是CD300LD-ECD(CD300LD胞外区)，CD300LD-ECD的氨基酸序列可以来源于大鼠、小鼠、人等。

1)治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

所述CD300LD抑制剂可以是如上所述的各种CD300LD抑制剂。

本发明中，上述产品或组合物等，可以以诊断或治疗目的进行使用，也可以是以非诊断或治疗目的进行使用。

本发明还提供一种药物体外筛选方法，所述药物体外筛选方法包括以下步骤：将过表达CD300LD的细胞与待筛选的药物混合后，检测细胞的变化情况。

在一种实施方式中，所述待筛选的药物为抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物例如为CD300LD抑制剂。

在一种实施方式中，过表达CD300LD的细胞为髓系免疫细胞。更具体的，所述髓系免疫细胞选自巨噬细胞、M-MDSC和PMN-MDSC。

所述细胞的变化情况包括细胞的活性变化、迁移变化、CD300LD的表达变化、CD300LD的下游信号通路的变化等。

本发明还提供一种调控方法，所述调控方法包括向个体施用有效量的CD300LD抑制剂、或前述提供的组合物来调节髓系细胞的活性、或调节T细胞活性、或调节CD300LD的下游信号通路。

本发明还提供一种治疗方法包括：向个体施用治疗有效量的CD300LD抑制剂、或本发明前述所提供的组合物。

本发明所提供的治疗方法可以用于治疗包括但不限于肿瘤等的适应症。

本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用上述的药物、组合物、制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。具体的，所述CD300LD抑制剂、或组合物在向受试者施用时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。

在一些实施方式中，本文所述的CD300LD抑制剂、或组合物的给药量为约0.001mg/Kg至约500mg/Kg(例如，约0.001mg/Kg至约200mg/Kg；约0.01mg/Kg至约200mg/Kg；约0.01mg/Kg至约150mg/Kg；约0.01mg/Kg至约100mg/Kg；约0.01mg/Kg至约50mg/Kg；约0.01mg/Kg至约10mg/Kg；约0.01mg/Kg至约5mg/Kg；约0.01mg/Kg至约1mg/Kg；约0.01mg/Kg至约0.5mg/Kg；约0.01mg/Kg至约0.1mg/Kg；约0.1mg/Kg至约200mg/Kg；约0.1mg/Kg至约150mg/Kg；约0.1mg/Kg至约100mg/Kg；约0.1mg/Kg至约50mg/Kg；约0.1mg/Kg至约10mg/Kg；约0.1mg/Kg至约5mg/Kg；约0.1mg/Kg至约1mg/Kg；约0.1mg/Kg至约0.5mg/Kg)。给药时可以将每日总给药量分开，并在一整天内或通过提供连续递送的方式分次给药。可以每天(例如，作为单剂量或作为两个或更多个分剂量)或非每天(例如，每隔一天，每两天，每三天，每周一次，每周两次，每两周一次，每月一次)给药。在一些实施方式中，本文所述CD300LD抑制剂、或组合物的给药时间为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。在另一个实施方式中，给药停止时间为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。在一个实施方式中，给予个体治疗CD300LD抑制剂、或组合物一段时间，然后是分开的时间段。在另一个实施方式中，在第一段时间给予治疗CD300LD抑制剂、或组合物，在第一段时间之后的第二段年时间停止给药，然后在第三段时间重新开始给予CD300LD抑制剂、或组合物，再然后在第三段时间之后的第四段时间停止给药。在一个实施方式中，给药时间为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。在另一个实施方式中，停止给药的时间为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。

在一些实施方式中，本文描述的方法可以进一步包括与本文描述的化合物联合给予一种或多种另外的疗法(例如，一种或多种另外的治疗剂和/或一种或多种治疗方案)。

在一些实施方式中，本文所述的方法可以进一步包括给予一种或多种另外的癌症疗法。一种或多种另外的癌症疗法可以包括但不限于：手术，放射疗法，化学疗法，毒素疗法，免疫疗法，冷冻疗法，癌症疫苗(例如，HPV疫苗，乙型肝炎疫苗，Oncophage，Provenge)和基因疗法，以及它们的组合。免疫疗法，包括但不限于过继细胞疗法，干细胞和/或树突状细胞的衍生，输血，灌洗和/或其它疗法，包括但不限于冷冻肿瘤。

在一些实施方式中，所述一种或多种另外的癌症疗法是化学疗法，其可以包括给予一种或多种另外的化学疗法药剂。

在一些实施方式中，其它化学治疗剂是免疫调节分子，例如免疫检查点抑制剂。在这些实施方式的一些中，免疫检查点抑制剂靶向选自以下的免疫检查点受体：CTLA-4，PD-1，PD-L1，PD-1–PD-L1，PD-1–PD-L2。

在这些实施方案的一些中，免疫检查点抑制剂选自：派姆单抗(Pembrolizumab)(PD1)，纳武单抗(Nivolumab)(PD1)，阿特朱单抗(Atezolizumab)(过去称为MPDL3280A)(PDL1)，MEDI4736(PD-L1)，阿维鲁单抗(Avelumab)(PD-L1)，PDR001(PD1)，BMS-986016，MGA271，利鲁单抗(Lirilumab)，IPH2201，尹玛克妥珠单抗(Emactuzumab)，INCB024360，高鲁尼替(Galunisertib)，乌克普鲁单抗(Ulocuplumab)，BKT140，巴维昔单抗(Bavituximab)，CC-90002，贝伐单抗(Bevacizumab)，MNRP1685A，和MGA271。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 PMN-MDSC的关键功能受体筛选

肿瘤的免疫抑制微环境是肿瘤免疫逃逸的重要因素。在肿瘤微环境中，多型核髓源抑制细胞(PMN-MDSC)是导致免疫抑制的重要细胞群体。因为PMN-MDSC与中性粒细胞在分子分型上类似但功能相反，本实施例首先对二者进行转录组测序，分析膜蛋白表达差异；同时构建针对PMN-MDSC膜蛋白的sgRNA文库，结合小鼠肿瘤模型进行CRISPR-Cas9体内筛选。利用这两种策略对PMN-MDSC的关键功能受体进行筛选，并对所获得的候选分子进行表达谱分析。

材料与方法：

1-1)PMN-MDSC与中性粒细胞的转录组分析：利用AutoMACS磁分选分离正常C57小鼠骨髓中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)、以及B16-F10荷瘤小鼠脾脏中的PMN-MDSC(CD11b⁺Ly6G⁺)，按照本领域熟知的方法提取细胞总RNA进行RNAseq测序分析。

1-2)靶向髓系细胞特异性表面受体的sgRNA文库的构建与包装：利用免疫细胞的RNAseq数据，针对其中的膜蛋白基因，计算其在髓系细胞/淋系细胞的表达比，按比值>2挑选出300个在髓系细胞中特异表达的受体基因。针对每个基因，按照本领域熟知的方法设计合成10条sgRNA oligo，构建到Syn003-modified慢病毒表达质粒中，获得针对髓系细胞表面受体的sgRNA慢病毒表达文库。将文库质粒与慢病毒包装质粒利用Lipofectin共转293T细胞，48hrs后收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤，用于靶细胞的感染。

1-3)肿瘤微环境中髓系细胞相关的关键受体筛选：利用磁分选分离Cas9小鼠胎肝中的造血前体细胞(Lineage阴性细胞)，继而利用前述sgRNA文库病毒上清感染这些前体细胞后，移植到辐照小鼠(9G)中重建小鼠的免疫系统；这些小鼠的免疫细胞中将表达不同sgRNA。移植4周后在小鼠皮下接种1.5×10⁵B16细胞进行成瘤，2周后分离小鼠骨髓和肿瘤中的髓系细胞，按照本领域熟知的方法扩增其中的gRNA进行深度测序和比较分析。

1-4)CD300LD在小鼠各类型免疫细胞中的表达分析：分离正常小鼠骨髓或B16荷瘤小鼠的骨髓和肿瘤，制备单细胞悬液，利用CD300LD抗体及各免疫细胞的抗体进行标记后进行流式检测，分析CD300LD在各类型免疫细胞表面的蛋白表达水平，其中各免疫细胞的表面标记分别为：巨噬细胞(CD45⁺/CD11b⁺//F4/80⁺)，单核细胞/M-MDSC(CD45⁺/CD11b⁺/Ly6c⁺)，中性粒细胞/PMN-MDSC(CD45⁺/CD11b⁺/Ly6G⁺)，DC(CD45⁺/CD11b^-/CD11c⁺)，T细胞(CD45⁺/CD3⁺)，CD4⁺T(CD45⁺/CD3⁺/CD4⁺)，CD8⁺T(CD45⁺/CD3⁺/CD8⁺)，B细胞(CD45⁺/B220⁺)，NK细胞(CD45⁺/NKG2D⁺)。为分析CD300LD的RNA表达水平，本发明利用以上分子标记，流式分选出正常或荷瘤小鼠骨髓或肿瘤中的免疫细胞，提取mRNA后利用oligo d(T)16(Invitrogen,Cat#N8080128)反转录，再按照如下所述引物和条件进行qRT-PCR检测。

mLD-For：5‘ACATTGACCAAGCCCCAAAAA3’(SEQ ID NO.1)

mLD-Rev：5‘AGCAGGGGTAACTCCACAAAG 3’(SEQ ID NO.2)

mGAPDH-For：5‘GTCTACATGTTCCAGTATGACTCC 3’(SEQ ID NO.3)

mGDPDH-Rev：5‘AGTGAGTTGTCATATTTCTCGTGGT 3’(SEQ ID NO.4)

qPCR条件：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycles)，72℃10min，4℃

10min

1-5)CD300LD在人各类型免疫细胞中的表达分析：利用Human Protein Atlas数据库，分析CD300LD在不同类型的人免疫细胞中的mRNA表达水平。为分析临床肿瘤病人中CD300LD表达水平，本发明收集正常人和肠癌病人的外周血，提取白细胞mRNA后按照如下引物和条件进行qRT-PCR检测：

huLD-For：5‘TCCCAGGTTACTCCATTGCC 3’(SEQ ID NO.5)

huLD-Rev：5‘GCCTGAGCCATAAGCACACT 3’(SEQ ID NO.6)

huGAPDH-For：5‘TGTGGGCATCAATGGATTTGG 3’(SEQ ID NO.7)

huGDPDH-Rev：5‘ACACCATGTATTCCGGGTCAAT 3’(SEQ ID NO.8)

qPCR条件：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycles)，72℃10min，4℃10min)

结果：

转录组分析结果显示，与正常中性粒细胞相比，PMN-MDSC中CD300LD显著上调(图1A)。同时利用Crispr-Cas9对髓系细胞特异表达的膜蛋白进行体内筛选(图1B)，结果显示，在荷瘤小鼠的肿瘤微环境的髓系细胞中，CD300LD-gRNA丰度显著低于骨髓的髓系细胞(图1C)，表明肿瘤微环境排斥CD300LD敲除。以上两种筛选均提示CD300LD可能是PMN-MDSC的关键受体。

对CD300LD的表达细胞进行分析。CD300LD特异高表达在正常中性粒细胞、以及肿瘤PMN-MDSC中(图1D和E)。与正常中性粒细胞相比，PMN-MDSC的CD300LD表达水平显著升高(图1F)。在人的免疫细胞群体中，CD300LD也是在中性粒细胞上特异高表达(图1G)；并且肿瘤病人来源的PMN-MDSC中，CD300LD的表达水平显著高于正常中性粒细胞(图1H)。

以上结果表明，CD300LD在中性粒细胞/PMN-MDSC上特异高表达，并且在肿瘤发生过程中在PMN-MDSC细胞上表达显著升高；结合Crispr-Cas9筛选结果，即肿瘤微环境排斥CD300LD敲除，提示CD300LD很有可能是PMN-MDSC在肿瘤中募集、分化和行使功能时所需要的关键受体。

实施例2 CD300LD敲除显著抑制各种类型肿瘤的发展

为评估CD300LD在肿瘤发展中的功能，构建CD300LD敲除小鼠，并利用各种不同的肿瘤模型，分析CD300LD敲除后对肿瘤发展的影响。

材料与方法：

2-1)CD300LD敲除小鼠的构建(委托第三方公司集萃药康公司构建)：利用Cas9/sgRNA(gRNA1序列如SEQ ID NO.9所示；gRNA2序列如SEQ ID NO.10所示)，构建敲除CD300LDExon2(核苷酸序列如SEQ ID NO.11)的小鼠；

2-2)B16-F10黑色素肿瘤小鼠模型：将B16细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积在1000cm³判定为死亡，绘制小鼠的生存曲线；

2-3)TC-1宫颈癌小鼠模型：将TC1细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积在1000cm³判定为死亡，绘制小鼠的生存曲线；

2-4)MC-38结肠癌小鼠模型：将MC38细胞(按1.0×10⁶细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积在1000cm³判定为死亡，绘制小鼠的生存曲线；

2-5)LLC肺癌小鼠模型：将LLC细胞(按5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积在1000cm³判定为死亡，绘制小鼠的生存曲线

结果：

构建CD300LD敲除小鼠，基因组水平和蛋白水平检测CD300LD被敲除(图2A-C)。利用B16-F10黑色素瘤模型，发现CD300LD敲除小鼠中，肿瘤生长显著低于野生型小鼠(图2D和E)，小鼠生存时间也显著延长(图2F)。在TC-1宫颈癌、MC-38结肠癌、LLC肺癌等其他3种肿瘤模型中，CD300LD敲除小鼠的肿瘤生长均显著低于野生型小鼠(图2G-I)。以上结果表明敲除宿主CD300LD能够显著抑制多种类型肿瘤的发展。

实施例3 CD300LD敲除通过PMN-MDSC抑制肿瘤的发展

CD300LD敲除小鼠能够显著抑制各种类型肿瘤的发展，因此，确定哪一个类群细胞的CD300LD在其中发挥作用极为关键。CD300LD的主要表达细胞群体为髓系免疫细胞，包括巨噬细胞、M-MDSC和PMN-MDSC；其中PMN-MDSC上CD300LD的表达远高于其他类型细胞(图1D和E)。因此，本实施例分析哪一类髓系细胞的CD300LD被敲除抑制肿瘤的发展。

材料与方法：

3-1)不同细胞群体中条件性敲除CD300LD对肿瘤发展的影响：构建CD300LD fl/fl条件性敲除小鼠(委托第三方公司集萃药康公司构建；gRNA1序列如SEQ ID NO.12所示，gRNA2序列如SEQ ID NO.13所示)，将该小鼠与不同Cre小鼠配繁，其中包括LyzCre(巨噬细胞、中性粒细胞/PMN-MDSC等髓系细胞特异表达Cre)和S100A8Cre(中性粒细胞/PMN-MDSC特异表达Cre)，从而获得在不同类型髓系细胞中条件性敲除CD300LD的小鼠。利用以上小鼠进行B16-F10肿瘤实验，检测肿瘤的生长(步骤见实施例2中2-2)。

3-2)利用Ly6G抗体清除PMN-MDSC后对肿瘤发展的影响：在小鼠皮下接种B16-F10肿瘤细胞，在接种后第7、9、11、13天注射Ly6G抗体或Isotype对照抗体(200μg/小鼠/次)，检测肿瘤的生长。

3-3)检测不同髓系细胞与肿瘤细胞共同移植对肿瘤生长的影响：从WT或CD300LD-KO荷瘤小鼠中分离巨噬细胞、M-MDSC和PMN-MDSC细胞，按1：1的比例与B16-F10细胞混合后接种到野生型小鼠皮下进行成瘤实验，检测肿瘤的生长。

结果：

结果显示，利用LyzCre在多种髓系细胞(包括巨噬细胞/中性粒细胞/PMN-MDSC)中条件性敲除CD300LD显著抑制B16肿瘤的发展(图3A)；利用更为特异的S100A8Cre在PMN-MDSC中条件性敲除CD300LD同样也显著抑制肿瘤的发展(图3B)；表明PMN-MDSC表达的CD300LD在肿瘤发展过程中具有重要作用。

为进一步证明CD300LD通过PMN-MDSC在肿瘤中发挥作用，本实施例在野生型和CD300LD-KO的肿瘤小鼠中，利用Ly6G抗体清除中性粒细胞/PMN-MDSC，结果显示野生型小鼠中肿瘤的发展显著减缓，而在CD300LD-KO小鼠中，Ly6G抗体没有效果(图3C)，表明CD300LD敲除导致的抗肿瘤作用主要通过中性粒细胞/PMN-MDSC来完成。

为进一步证明CD300LD通过PMN-MDSC调控肿瘤的发展，从CD300LD WT和KO荷瘤小鼠中分离巨噬细胞、M-MDSC和PMN-MDSC细胞，继而利用共注射的方式分析不同细胞群体对肿瘤发展的影响。结果显示只有CD300LD-KO PMN-MDSC显著抑制肿瘤的发展(图3D-F)。

综合以上结果，CD300LD主要是通过PMN-MDSC细胞在肿瘤发展中发挥重要作用。

实施例4 CD300LD敲除逆转肿瘤免疫抑制微环境

为研究CD300LD敲除如何抑制肿瘤的发展，本实施例利用流式分析和免疫组化分析了WT和CD300LD敲除小鼠肿瘤微环境中各免疫细胞群体的变化，同时对肿瘤微环境中的免疫细胞进行进一步的单细胞测序分析。

材料与方法：

4-1)B16-F10黑色素肿瘤小鼠模型：将B16-F10细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，每2-3天测量肿瘤的大小。

4-2)肿瘤微环境分析：取小鼠肿瘤制备单细胞悬液，利用以下两组抗体进行标记：抗体组1(Anti-Ly6C FITC,Anti-MHCII PE,Anti-F4/80PE-Cy7,Anti-Cd11b PB,Anti-CD45BV510,Anti-Cd11c APC,Anti-Ly6G APC-Cy7)和抗体组2(Anti-CD3 FITC，Anti-CD8 PE,Anti-B220 PE-Cy7,Anti-CD45 BV510,Anti-CD49b APC,Anti-CD4 APC-Cy7)，流式分析各免疫细胞群体的比例。

4-3)免疫荧光：分离小鼠肿瘤进行冰冻切片，利用CD8-FITC抗体或Ly6G-PE抗体在4度染色过夜后，洗涤3次，用含DAPI的封片液封片后在荧光显微镜下观察。

4-4)肿瘤免疫微环境的单细胞测序：取B16肿瘤小鼠的肿瘤组织制备单细胞悬液，流式分选CD45+免疫细胞，进行10×单细胞测序，利用Sereut进行降维、分群等分析

结果：

结果见图4，和WT小鼠的肿瘤微环境相比，CD300LD敲除导致肿瘤微环境中浸润免疫细胞显著增加，PMN-MDSC细胞显著减少，同时伴随CD4⁺和CD8⁺T细胞的显著增加，以及Treg细胞显著减少(图4A和B)。免疫荧光结果也同样显示，在CD300LD敲除小鼠的肿瘤中，PMN-MDSC显著减少，CD8⁺T细胞显著增加(图4C和D)。

本实施例进一步从单细胞转录组层面分析CD300LD敲除后对肿瘤免疫微环境的影响。结果同样显示，CD300LD敲除导致肿瘤微环境中PMN-MDSC的显著减少以及CD8⁺T细胞的浸润显著增加(图5A-C)。同时，PMN-MDSC抑制免疫相关的多个重要基因表达显著下降，如S100a8,S100a9,Cxcr2,Cxcl2,Cxcl3等；而T细胞杀伤功能相关的多个重要基因表达显著上升，如Gzma,Gzmb,Ifng,Prf1和Klrk1等；T细胞募集相关基因也显著升高，如Cxcl10,Cxcl9,Ccl5和H2-Ab1等(图5D)。

以上结果证明，CD300LD敲除导致肿瘤微环境中免疫抑制细胞群体PMN-MDSC显著降低，而免疫效应T细胞则显著升高，表明CD300LD敲除显著改善了肿瘤中的免疫抑制微环境。

实施例5 CD300LD敲除抑制PMN-MDSC的迁移与功能

由于CD300LD敲除通过调控PMN-MDSC来抑制肿瘤的发展，而敲除后的肿瘤微环境中PMN-MDSC急剧减少，因此，本实施例进一步验证CD300LD敲除是否影响PMN-MDSC的迁移过程。同时，PMN-MDSC作为免疫抑制细胞，其显著作用是能够抑制T细胞的活性，因此本实施例也将分析CD300LD敲除是否影响PMN-MDSC的免疫抑制功能。

材料与方法：

5-1)RNAseq：分离WT和CD300LD-KO B16荷瘤小鼠脾脏中脾脏，制备单细胞悬液并进行抗体标记，流式分选PMN-MDSC细胞(CD45+/CD11b+/Ly6G+)，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后进行转录组测序和分析。

5-2)PMN-MDSC体外细胞迁移实验(Transwell)：分离荷瘤小鼠脾脏制备单细胞悬液并进行抗体标记，流式分选PMN-MDSC细胞(CD45+/CD11b+/Ly6G+)。利用Transwell孔，在上层加入10⁵PMN-MDSC细胞后置于37℃培养箱中培养2hr，流式分析下层PMN-MDSC细胞的数量，计算细胞的迁移比例。

5-3)PMN-MDSC体内细胞迁移实验：分离B16荷瘤小鼠脾脏制备单细胞悬液并进行抗体标记，流式分选PMN-MDSC细胞(CD45+/CD11b+/Ly6G+)。利用CTV染色，将WT PMN-MDSC和CD300LD-KO PMN-MDSC分别染为高CTV和低CTV标记。按1：1的比例混合WT/KO PMN-MDSC，静脉注射到荷瘤的WT小鼠中，24hr后分离小鼠骨髓、脾脏和肿瘤，流式分析其中WT和CD300LD-KO PMN-MDSC的比例。

5-4)T细胞增殖实验：分离OT-1小鼠脾脏，制备单细胞悬液悬于PBS中(5×10⁷细胞/ml)，加入终浓度5μM的CTV染料，37℃水浴锅孵育20分钟，加入5倍体积冰预冷的RPMI培养基(RPMI-1640+10％FBS)，颠倒混匀后室温放置5分钟，400g离心5分钟，将细胞重悬于RPMI培养基中(1×10⁶细胞/ml)。取80μl CTV标记细胞，加入40μl浓度为100ng/ml的OVA肽段，再补充80ul RPMI培养基，加入96孔U底板孔中，37℃二氧化碳培养箱中培养，48-72hr后进行抗体标记和流式分析

5-5)PMN-MDSC抑制T细胞增殖的实验：分离B16荷瘤小鼠脾脏制备单细胞悬液并进行抗体标记，流式分选获得PMN-MDSC细胞(CD45^+/CD11b⁺/Lying6G⁺)，重悬于RPMI培养基中(1×10⁶细胞/ml)。取8-1)中80μl CTV标记细胞，加入40ul浓度为100ng/ml的OVA肽段，以及PMN-MDSC细胞，培养基，加入96孔U底板孔中，37℃二氧化碳培养箱中培养，48-72hr后进行抗体标记和流式分析。在以上T细胞增殖实验过程中，加入不同比例的PMN-MDSC细胞，48-72hr后进行抗体标记和流式分析

结果：

本实施例对CD300LD WT和KO的PMN-MDSC进行RNAseq分析，结果显示，CD300LD敲除后，中性粒细胞迁移相关信号通路发生显著下调(图6A和B)。体外细胞迁移实验证明，CD300LD-KO PMN-MDSC的迁移能力显著低于WT PMN-MDSC(图6C)。将CD300LD WT和KO PMN-MDSC按1：1混合后注射到荷瘤小鼠中进行迁移竞争实验，结果显示肿瘤中募集的WT PMN-MDSC显著高于CD300LD-KO PMN-MDSC(图6D-F)。以上结果表明，CD300LD敲除抑制了PMN-MDSC的迁移能力，导致肿瘤募集PMN-MDSC的显著减少。

进一步分析CD300LD对PMN-MDSC功能的影响。T细胞增殖实验结果显示，WT PMN-MDSC能够高效抑制T细胞增殖，这个能力在CD300LD-KO PMN-MDSC中发生显著下降(图6G和H)，表明PMN-MDSC的T细胞抑制功能受到CD300LD的正向调控。以上结果表明CD300LD敲除也同时抑制了PMN-MDSC的T细胞抑制功能。

实施例6 CD300LD通过S100A8/A9调控PMN-MDSC的迁移和功能

为研究CD300LD如何调控PMN-MDSC的分子机制，本实施例对WT和KO PMN-MDSC进行转录组测序，并分析其中显著差异基因，以研究CD300LD通过哪个下游基因调控PMN-MDSC的细胞迁移和功能。

材料与方法：

6-1)PMN-MDSC体外细胞迁移实验(Transwell)：分离B16荷瘤小鼠脾脏制备单细胞悬液并进行抗体标记，流式分选PMN-MDSC细胞(CD45+/CD11b+/Lying6G+)。利用Transwell孔，在上层加入10⁵PMN-MDSC细胞后置于37℃培养箱中培养，培养基中加入1μg/ml终浓度的S100A8/A9抑制剂(Tasquinimod)或DMSO对照；2hr后流式分析下层PMN-MDSC细胞的数量，计算细胞的迁移比例。

6-2)肿瘤模型：将B16细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，在第2天腹腔注射20μg Tasquinimod/只小鼠，每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。第19天取小鼠肿瘤，流失分析免疫细胞比例。

结果：

为进一步探索CD300LD调控PMN-MDSC的分子机制，分离WT和KO小鼠的PMN-MDSC进行RNA-seq差异分析，其中S100A8/A9是KO PMN-MDSCs中下调最为显著的基因(图7A)，并被报道与PMN-MDSC的功能相关。WT荷瘤小鼠血清中的S100A8/A9水平显著高于正常小鼠，而KO荷瘤小鼠中的S100A8/A9水平与正常小鼠没有显著差异(图7B)。同时，CD300LD-KO PMN-MDSC中S100A8和S100A9的表达水平也显著低于WT PMN-MDSC(图7C)。体外迁移实验证明S100A8/A9蛋白能回补KO PMN-MDSCs弱化的迁移能力(图7D)。T细胞抑制实验显示，S100A8/A9抑制剂能够明显降低WT PMN-MDSCs的抑制作用，但对KO PMN-MDSCs则没有显著效果(图7E)。进一步利用肿瘤模型进行测试，结果显示体内注射S100A8/A9抑制剂Tasquinimod能抑制WT小鼠肿瘤生长，却不能进一步抑制KO小鼠中的肿瘤生长，瘤内PMN-MDSC的比例也与肿瘤变化一致(图7F和G)。以上结果证明CD300LD通过S100A8/A9调控PMN-MDSC的迁移和功能，S100A8/A9是CD300LD下游的重要效应分子。

实施例7 CD300LD敲除与PD1抗体具有显著抗肿瘤协同效应

由于CD300LD主要表达在髓系细胞PMN-MDSC上，而PD1主要表达在T细胞上，理论上这两个靶点在抗肿瘤效应上将会产生协同作用。因此，本实施例分析CD300LD敲除与PD1抗体联合的抗肿瘤效果。

材料与方法：

7-1)PD1及其配体PD-L1的表达分析：分离B16小鼠肿瘤制备单细胞悬液，利用PD1抗体和PD-L1抗体进行染色，流式分析肿瘤细胞以及免疫细胞表面PD1和PD-L1的表达。

7-2)肿瘤模型：将B16-F10细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到WT和CD300LD KO小鼠皮下，在接种后第7天，静脉注射PD1抗体，200μg/小鼠，共3次。每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。

结果：

流式分析结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠肿瘤中PD1⁺的CD8⁺T细胞比例升高，肿瘤细胞及PMN-MDSC细胞中PD-L1的表达比例也有升高(图8A)，进一步提示该靶点与PD1将有协同效应。我们在WT和CD300LD-KO小鼠的B16-F10肿瘤模型中，测试PD1抗体的效果。结果显示，PD-1抗体单独处理WT小鼠与CD300LD KO的效果一致，均显著抑制肿瘤的发展，在CD300LD KO的背景下，PD-1抗体能够进一步抑制肿瘤发展并延长小鼠生存时间(图8B和C)。以上结果证明CD300LD敲除和PD-1免疫检查点具有明显的抗肿瘤协同效应。

实施例8 CD300LD敲除不影响小鼠正常发育

为探索靶向CD300LD可能导致的系统性风险，本实施例分析CD300LD敲除对机体发育的影响，对CD300LD靶点的安全性进行初步评估。

材料与方法：

8-1)免疫细胞群体分析：分离小鼠骨髓、脾脏和外周血，制备单细胞悬液，利用流式抗体，分析不同免疫细胞群体的比例，其中包括T细胞(CD3⁺)，B细胞(B220⁺)，髓系细胞(CD11b(Mac1)⁺)，粒细胞(CD11b⁺Gr1⁺)；LSK造血前体细胞(Lin^-Sca1⁺cKit⁺)，LT-HSC(Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD34^-Flt3^-)，MMP(Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD34⁺Flt3⁺)，GMP(Lin^-cKit⁺Sca1^-CD34^HighFcyR^High)，CMP(Lin^-cKit⁺Sca1^-CD34^HighFcyR^Mid)，MEP(Lin^-cKit⁺Sca1^-CD34^LowFcyR^Low)，CLP(Lin^-cKit^MidSca1^MidFlt3^HighIL7R^High)。肿瘤制备单细胞悬液，利用PD1抗体和PD-L1抗体进行染色，流式分析肿瘤细胞以及免疫细胞表面PD1和PD-L1的表达。

8-2)CFU实验：分离小鼠骨髓，制备单细胞悬液，取10⁵细胞培养在纤维素半固体培养基(MethoCult GF M3434，Stem Cell公司)中，培养7天后，显微镜下对BFU-E、CFU-GM，CFU-GEMM克隆进行计数；或者将骨髓细胞培养在纤维素半固体培养基(MethoCult GFM3630，Stem Cell公司)中，培养7天后，显微镜下对Pre-B克隆进行计数。

结果：

CD300LD KO和WT小鼠生长发育正常，无可见行为异常。流式分析结果显示，KO和WT小鼠各免疫和造血器官中，T细胞、B细胞和髓系细胞等比例无显著差异(图9A)；长期和短期造血干细胞(LT-HSC，ST-HSC)、多能造血祖细胞(MPP)无显著差异；其他前体细胞，包括髓系前体细胞CMP、GMP、MEP，和淋系前体细胞CLP也均无显著差异(图9B，C)。进一步分析KO和WT小鼠造血干细胞的克隆形成能力，结果显示二者无显著差别(图9D)。以上结果表明，CD300LD的敲除不影响小鼠正常发育以及造血/免疫系统的发育，靶向CD300LD将具有一定的安全性。

实施例9 CD300LD敲除抑制已建成肿瘤的发展

本实施例进一步分析在已建成肿瘤的情况下，诱导敲除CD300LD是否能够抑制肿瘤的发展。

材料与方法：

诱导敲除CD300LD的肿瘤模型：利用CD300LD^fl/flMx1CRE小鼠，将B16细胞(按1.5×10⁵细胞/小鼠)接种到小鼠皮下，在接种后第7天，注射PolyIC诱导基因敲除，2天一次，共4次。每2-3天测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。

结果：

利用CD300LD^fl/fl小鼠与Mx1CRE小鼠配繁为CD300LD^fl/flMx1CRE小鼠，该小鼠能够在PolyIC药物诱导下对CD300LD进行敲除。利用该小鼠接种B16-F10细胞进行皮下成瘤，在肿瘤长至～100mm³时进行PolyIC处理。结果显示，诱导敲除CD300LD显著抑制已建成肿瘤的发展(图9A)，而未给药的两组同样的小鼠肿瘤生长没有差别(图9B)。以上结果表明在肿瘤已建成的阶段，诱导敲除CD300LD能够显著抑制肿瘤的发展，这也进一步表明CD300LD能够作为肿瘤免疫治疗的有效靶点。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

<120> CD300LD抑制剂在制备预防、诊断或治疗肿瘤产品中的用途

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acattgacca agccccaaaa a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctacatgt tccagtatga ctcc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgagttgt catatttctc gtggt 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcctgagcca taagcacact 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtgggcatc aatggatttg g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acaccatgta ttccgggtca at 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actgctggaa tgaccaatag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttctgcat atggtacacc 20

<210> 11

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctgctgcac ggctcaggat tcagtcacag gtccagagga ggtgagcggt caggagcagg 60

gctccttgac agtgcagtgc agatattcct catactggaa gggttacaag aagtactggt 120

gccgaggagt tcctcagaga tcatgtgata ttcttgttga aaccgataaa tcagagcagc 180

tggtgaagaa gaaccgtgtg tccatcaggg acaaccagag agacttcatc ttcacagtga 240

ccatggagga tctgaggatg agcgatgctg gcatttactg gtgtggaatt acgaaaggtg 300

gacctgatcc catgtttaaa gttaatgtga acattgacca ag 342

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcagattcc acggatctga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgtggcatt cgtgtcactt 20

Claims

1.CD300LD基因作为靶标在制备肿瘤预防、诊断或治疗药物中的用途。

2.CD300LD基因和PD1共同作为靶标在制备肿瘤预防、诊断或治疗药物中的用途。

3.CD300LD抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

1)预防、诊断或治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述CD300LD抑制剂的靶标为CD300LDExon2，和/或，所述CD300LD抑制剂选自核酸分子、蛋白分子或小分子化合物。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为CD300LD过表达的肿瘤；优选的，所述肿瘤选自肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、头颈癌、皮肤癌、肾癌、白血病、宫颈癌、结肠癌，肝细胞肝癌，卵巢浆液性囊腺癌，子宫内膜癌，甲状腺癌，皮肤黑色素瘤，肺腺癌，头颈鳞状细胞癌，多形成性胶质细胞瘤，前列腺癌，胸腺癌，脑低级别胶质瘤，直肠腺癌，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，食管癌，肾透明细胞癌，膀胱尿路上皮癌，肾乳头状细胞癌，胰腺癌，胃癌，肾嫌色细胞癌，乳腺浸润癌，肺鳞癌，肉瘤或急性髓细胞样白血病。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述髓系细胞选自巨噬细胞、M-MDSC或PMN-MDSC。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述调节髓系细胞的活性选自减少髓系细胞的细胞数量，或使髓系细胞上抑制免疫的基因表达下降。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，调节T细胞活性选自以下中的任一项或多项：增加CD4⁺和CD8⁺T细胞的细胞数量；减少Treg的细胞数量；使T细胞杀伤功能相关的基因表达上升；使T细胞募集相关基因表达升高。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，调节CD300LD的下游信号通路包括调节CD300LD下游信号通路中的S100A8/A9基因。

10.一种组合物，所述组合物中包括CD300LD抑制剂，所述组合物用于以下任一种或多种用途：

1)预防、诊断、治疗肿瘤；

2)调节髓系细胞的活性和/或迁移；

3)调节T细胞活性；

4)调节CD300LD的下游信号通路。

11.一种药物体外筛选方法，其特征在于，所述药物体外筛选方法包括以下步骤：将过表达CD300LD的细胞与待筛选的药物混合后，检测细胞的变化情况。