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CN116137862A - 三级淋巴结构在预后疾病进展和治疗癌症中的应用 - Google Patents

三级淋巴结构在预后疾病进展和治疗癌症中的应用 Download PDF

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CN116137862A
CN116137862A CN202180060908.XA CN202180060908A CN116137862A CN 116137862 A CN116137862 A CN 116137862A CN 202180060908 A CN202180060908 A CN 202180060908A CN 116137862 A CN116137862 A CN 116137862A
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cancer
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mature
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CN202180060908.XA
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A·伊塔利亚诺
F·勒洛勒
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Original Assignee
Bergoni Institute
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种用于对患有癌症或处于患癌症风险的患者预后疾病进展的体外方法，所述方法包括以下步骤：在来自所述患者的怀疑包含肿瘤性或癌组织的样本中确定所述样本是否包含三级淋巴样结构(TLS)；以及对疾病进展进行预后，其中所述预后是评估免疫疗法改善患者生存期的可能性和/或更好的临床结果(图4a)。

Description

三级淋巴结构在预后疾病进展和治疗癌症中的应用
技术领域
本申请涉及一种在患有癌症或有患癌症风险的患者中预后疾病进展的体外方法。
背景技术
肿瘤疾病的治疗在现代社会仍然是一个悬而未决的问题。这也适用于确定特定癌症类型的适当治疗方式的工具和方法，以提高患者的存活率和生活质量。
这些和其它问题由本发明的独立权利要求的特征来解决。从属权利要求公开了在特定情况下可能优选的本发明的实施方案。同样，本说明书公开了在特定情况下可能优选的本发明的其它实施方案。
附图说明
图1：用于癌症治疗的免疫检查点抑制的原理。
图2：通过检测PD-L1阴性NSCLC组织中的CD3/CD20进行TLS的免疫组织学检测。图2A：CD3/CD20染色-(CD3，棕色；CD20，紫色)，图2B：PD-L1/CD8染色-(CD8，棕色；PDL1，紫色)。
图3：PD-L1阳性结直肠癌组织中TLS CD3/CD20的免疫组织学检测。图3A：CD3/CD20表达，图3B：PD-L1/CD8染色－(CD8，棕色；PDL1，紫色)。根据CPS评分的PDL1阳性。
图4：NSCLC患者的免疫组织化学分析，以及同一患者的两次CT扫描。在一名呈现TLS+/PD-L1-NSCLC的62岁男性中可显示出持久的部分应答(>29个月)。图4A显示了如CD3/CD20免疫组织化学所示的NSCLC组织中TLS的存在。图4B显示NSCLC组织中不存在PD-L1表达(TPS和CPS阴性)。图4C显示了用PD-L1抑制剂派姆单抗(Pembrolizumab)(2mg/kg，每三周一次)治疗开始时患者上半身CT扫描。在CT扫描中可见较大的肿瘤病灶(箭头所指)。图4D显示了42天后同一患者上半身的CT扫描。肿瘤病灶明显缩小(直径从14mm缩小至8mm)。
图5：A：在低倍率(上图)和高倍率(下图)下基于免疫组织学检测TLS的图示。B：在机器学习和图像分析步骤后获得的突出了TLS和肿瘤区域的组织分割图。肿瘤区域表面为21.2mm2，而TLS计数为4，因此TLS密度为0.19TLS/mm2。
图6：确定一组332名接受免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者中TLS密度的阈值。临床终点为无进展生存期。该图突出显示了0.023TLS/mm2的最佳截止值。
图7-9：具有不同的TPC/CSP评分的不同肿瘤类型(“泛肿瘤”)的中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，取决于TLS密度(高：上曲线，低：下曲线)。TLS密度截止值：0.023TLS/mm2。
图7-12：具有不同的TPC/CSP评分的非小细胞肺癌(NSCLC)的中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，取决于TLS密度(高：上曲线，低：下曲线)。TLS密度截止值：0.023TLS/mm2。
图14-16：具有不同的TPC/CSP评分的不同肿瘤类型(“泛肿瘤”)的中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，取决于TLS密度(高：上曲线，低：下曲线)。成熟TLS密度截止值0.03TLS/mm2。
图17-19：具有不同的TPC/CSP评分的非小细胞肺癌(NSCLC)的中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，取决于TLS密度(高：上曲线，低：下曲线)。成熟TLS密度截止值0.03TLS/mm2。
图7显示Kaplan Meyer曲线，表明无论PDL1表达状态如何，肿瘤中的高密度三级淋巴结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p<0.001和p＝0.003)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算332名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图8显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分<1％的肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.003和0.01)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算261名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图9显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分≥1％的肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.08和0.1)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算71名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图10显示Kaplan Meyer曲线，表明无论PDL1表达状态如何，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后NSCLC患者改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.01和0.02)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算128名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图11显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分<1％的NSCLC肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.16和0.13)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算79名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图12显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分≥1％的NSCLC肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.023TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.02和0.03)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算49名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图13：确定一组332名接受免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者中成熟TLS密度的阈值。临床终点为无进展生存期。图中突出显示了0.03成熟TLS/mm2的最佳截止值。
图14显示Kaplan Meyer曲线，表明无论PDL1表达状态如何，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.01和0.01)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算332名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图15显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分<1％的肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.01和0.03)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算261名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图16显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分≥1％的肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.25和0.18)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算71名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图17显示Kaplan Meyer曲线，表明无论PDL1表达状态如何，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后NSCLC患者改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.09和0.1)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算128名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图18显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分<1％的NSCLC肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.34和0.35)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算79名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图19显示Kaplan Meyer曲线，表明在TPS评分≥1％的NSCLC肿瘤患者中，肿瘤中的高密度三级淋巴样结构(TLS)(即>0.03TLS/mm2)与免疫检查点治疗后改善的无进展生存期和总生存期相关(分别为p＝0.07和0.06)。根据TLS计数与肿瘤病灶表面的比值，计算49名患者的成熟TLS密度；即每平方毫米的成熟TLS数量。
图20显示根据在一泛癌组群(338名患者)中成熟TLS存在与否的Kaplan Meier曲线(PFS&OS)。没有应用截止值。
图21显示了两个独立的临床试验的Kaplan Meier(PFS&OS)，这两个独立的临床试验研究了免疫疗法(派姆单抗，抗PD1)在患者中的益处，所述患者是根据肿瘤样本中TLS的存在(如通过多重免疫组织化学和使用CD3/CD20标记物测定的)选择的(35名患者)或未经选择的(45名患者)。这些结果突出了更可能受益于癌症免疫治疗的STS患者亚群的鉴定。
Figure BDA0004113818410000031
发明详述
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的装置的特定组成部分或所描述的方法的工艺步骤，因为这样的装置和方法可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制。必须注意的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括单数和/或复数指示物，除非上下文另有明确规定。此外应当理解，在给出由数值限定的参数范围的情况下，所述范围被认为包括这些限制值。
还应当理解，本文所公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单独的实施方案。一个实施方案讨论的特征旨在也结合本文所示的其它实施方案来公开。如果在一种情况下，某特定特征未与一个实施方案一起公开，但与另一实施方案一起公开，则本领域技术人员将理解这不一定意味着所述特征不打算与所述另一实施方案一起公开。本领域技术人员将理解，本申请的要点是也针对其它实施方案公开所述特征，但是仅仅为了清楚的目的并且为了使说明书保持在可控篇幅而没有这样做。
此外，本文引用的现有技术文献的内容通过引用并入本文。这尤其适用于公开标准或常规方法的现有技术文件。在这种情况下，通过引用并入的主要目的是提供充分的公开信息，并避免冗长的重复。
根据本发明的一个方面，提供了一种在患有癌症或有患癌症风险的患者中预后疾病进展的体外方法，所述方法包括以下步骤：
·在来自怀疑包含肿瘤或癌组织的所述患者的样本中，确定所述样本是否包含三级淋巴样结构(TLS)，及
·预后疾病进展，
其中所述预后是评估免疫疗法或免疫治疗剂治疗的
·改善患者生存期的可能性，和/或
·更好的临床结果。
三级淋巴结构(TLS)是免疫细胞(主要是B和T细胞)的聚集体，其应答于免疫刺激而产生，并且已被描述为在几种肿瘤类型中与改善的生存期有关。最近表明，TLS的存在可以预测晚期肉瘤患者中对PD1/PDL1轴阻断(axis blockade)的应答(Petitprez etal.Nature 2020)-这一发现在黑色素瘤和肾细胞癌中得到了联合证实(Cabrita etal.Nature2020；Helmink et al.Nature 2020)。
如本文所用，术语“改善的生存期”是指在用本文所述的方法治疗后受试者或患者延长的存活时间段。改善的生存期表示在特定治疗后患有癌症的个体保持免于疾病进展的最大可能性。其还用于描述与对照组相比，在特定时间段后疾病可能保持稳定(未显示进展迹象)的群体中的高百分比个体。其还用于描述与对照组相比，疾病在特定时间段后可能治愈(未显示疾病迹象)的群体中的高百分比个体。这个参数可以通过任何常用的临床终点测量，如“无进展生存期”、“总生存期”和“无病病生存期”，用作特定治疗有效性的指示。
如本文所用，术语“免疫治疗剂”涉及具有主动或被动免疫刺激活性的物质或治疗。这种活性可以是特异性免疫刺激剂或非特异性免疫刺激剂的结果。如本文所用，术语“免疫疗法”涉及可直接或间接引起免疫应答增加或与相对于或与其它疗法相比引起免疫应答增加的治疗。
在一个实施方案中，这种免疫疗法是癌症免疫疗法。在一个实施方案中，这种免疫治疗剂是用于癌症免疫疗法的药剂。
如本文所用，术语“癌症免疫疗法”涵盖以下治疗方式：
Figure BDA0004113818410000041
Figure BDA0004113818410000051
如本文所用，术语“TLS”涉及一种或多种异位淋巴器官，其在慢性炎症部位(包括肿瘤)的非淋巴组织中发育。
这种TLS可位于肿瘤附近，即肿瘤内、肿瘤周围区域和/或肿瘤的侵润前沿。如本文所用，术语“基质”或“肿瘤基质”是指肿瘤的结缔组织框架和非肿瘤细胞。在肿瘤基质中发现的一些非肿瘤细胞的实例是成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞产生肿瘤的总胞外基质(ECM)。有时，肿瘤的ECM和非恶性细胞被定义为“肿瘤基质”。
如本文所用，术语“肿瘤”是指转化细胞团块，其至少部分特征在于包含血管生成脉管系统。转化细胞的特征在于不受控制的肿瘤性细胞增殖，这种增殖是快速的，甚至在启动新生长的刺激停止后仍在继续。
根据本发明的一个实施方案，来自患者的样本是组织切片。在一个实施方案中，来自患者的样本是活组织检查样本。在一个实施方案中，来自患者的样本是涂片样本。在一个实施方案中，来自患者的样本是细针抽吸(FNA)或采样(FNS)样本。
在一个实施方案中，来自患者的样本是新鲜样本。在一个实施方案中，来自患者的样本是冷冻样本。在又一个实施方案中，来自患者的样本是FFPE保存的样本。
根据本发明的一个实施方案，确定样本是否包含三级淋巴结构包括以下至少一项：
·用组织化学染色对所述样本进行染色，和/或
·确定所述样本中是否存在T淋巴细胞和/或B淋巴细胞。
如本文所用，术语“淋巴细胞”涉及免疫系统的一种白细胞。淋巴细胞包括自然杀伤细胞(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)，T细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。T淋巴细胞和/或B淋巴细胞可以指示TLS的存在与否。
在一个实施方案中，所述组织化学染色是苏木精和伊红(H&E)染色。
本文公开的标记物的检测基于蛋白质或mRNA进行。
基于蛋白质检测给定标记物通常涉及包括免疫测定的方法。
基于mRNA检测给定标记物通常涉及包括PCR和/或核酸杂交的方法。
如本文所用，术语“包括免疫测定的方法”涉及一种方法，其中免疫学分子例如抗体或具有相当的靶特异性结合特征的蛋白质被用于检测靶分子的存在。
在一个实施方案中，所述方法包括IHC(免疫组织化学测定)，ICC(免疫细胞化学测定)，IF(免疫荧光测定)或IHF(免疫组织荧光测定)。
所有这些方法可以包括免疫染色和随后的图像分析。在这种组合方法中，将靶通过免疫分子或具有相当的靶特异性结合特征的蛋白质染色，即通过所述分子或蛋白质的直接或间接标记，随后通过视频显微镜或其它成像方式以及随后进行数字图像处理对样本进行分析。
在一个实施方案中，将肿瘤活检组织或FFPE样本切片，相应地处理(例如，脱石蜡、再水化或进行抗原修复)并与相应的抗体温育，用相应的标记抗体标记或染色。用合适的成像方法进行检测。任选将切片复染。图像检测和分析可以包括感兴趣区域的多光谱图像分析定义、将组织分割成肿瘤和基质区域、表型分析、以相应标记物为特征的相应细胞类型的鉴定。样本中给定细胞类型的密度可以使用相应的图像分析软件(例如，Inform软件，AkoyaBioscience，2.4.1版)进行半自动量化。更多细节参见本文别处的实验描述。
如本文所用，术语“包括PCR的方法”涉及其中使用聚合酶链式反应来检测编码靶分子的核酸(DNA或mRNA)的存在与否的方法。
在一个实施方案中，包括PCR和/或核酸杂交的体外方法包括以下至少一种方法：
·原位杂交(ISH)，
·原位PCR，
·实时PCR，和/或
·逆转录PCR/qPCR。
所有这些方法都是本领域技术人员熟知的。虽然前两者提供空间分辨率，因此可用于密度或接近度测量，但后两者则不能，因此仅可用于例如肿瘤组织中的巨噬细胞的浸润测量。
肿瘤样本，无论是新鲜的、冷冻保存的还是FFPE，都可用于通过基于PCR的方法进行RNA提取和基因表达谱分析。在这些方法中，RT-qPCR或RNA测序或Nanostring可用于评估单个和/或一组基因表达，可作为患者纳入的特征。某个基因的高表达或一类基因的富集可以构成预测性生物标记物。特别地，可以评估巨噬细胞相关标记物。
如本文所用，术语“包括核酸杂交的方法”涉及其中使用与待测定的样本中的核酸杂交的核酸探针的方法。
根据本发明的一个实施方案，基于蛋白质或mRNA检测选自CD3、CD4和CD8、CD20、CD19和Pax5的至少一种标记物的表达、存在或不存在。
关于CD3，该分子由三个亚基即CD3γ、CD3δ和CD3ε组成，比例为1:1:2。可以测量三个亚基中的每一个以确定整体CD3的表达、存在或不存在。
例如，这种方法用于检测T淋巴细胞和B淋巴细胞的存在与否。
在一个实施方案中，测定以下标记物的表达、存在或不存在：
·选自CD3、CD4和CD8的至少一种标记物，和
·选自CD20、CD19和Pax5的至少一种标记物。
这些标记物对特别指示TLS的存在。在一个特定的实施方案中，测定了CD3和CD20的表达、存在或不存在。
本发明人惊奇地发现，被三级淋巴结构(TLS)包围、浸润或伴随的肿瘤更可能应答免疫治疗。特别地，基于本文别处讨论的治疗剂和方案，一种或多种三级淋巴样结构的存在与应答于免疫疗法、特别是免疫检查点抑制疗法的患者生存期改善和/或更好的临床效果的高可能性相关。
Sautes Friedman等(2019)中公开了确定TLS存在的方法，其内容通过引用并入本文以用于实现目的。
根据本发明的一个实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同样本中测定TLS密度。
术语“TLS密度”描述了给定样本中单位面积的TLS结构的数目。这可以在组织载玻片中进行，在样本中用至少一种上述标记物或标记物对(例如，CD3和CD20)染色或组织化学染色后，以计数由此染色的结构。对于这样的提议，可以将样本中的肿瘤组织可以用肿瘤标记物复染，如本文别处所公开的。
根据本发明的一个实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同样本中测定TLS的成熟状态和/或成熟TLS的密度。
三级淋巴样结构有待成熟。然而，TLS成熟的动力学至今仍不清楚。通常，可以描述三个连续的TLS成熟阶段，其特征在于滤泡树突细胞和成熟B细胞普遍增加：
[1]早期TLS(E-TLS)，由无滤泡树突细胞(FDCs)的致密淋巴细胞聚集体组成，
[2]初级滤泡样TLS(PFL-TLS)，包含FDCs但无GC反应，以及
[3]次级滤泡样TLS(SFL-TLS)，显示出活性GC反应。
根据本发明的一个实施方案，TLS成熟状态的测定包括在蛋白质或mRNA的基础上检测：
·选自CD35和CD23的至少一种标记物的表达、存在或不存在，或
·DC-Lamp+成熟树突细胞(mDCs)细胞的存在或不存在。
在一个实施方案中，CD23的表达或存在用作存在成熟TLS的指示性标记物。
根据本发明的一个实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同或第二个样本中确定PD-L1(程序性细胞死亡配体1)的表达状态。
根据本发明的一个实施方案，确定PD-L1表达状态包括基于蛋白质或mRNA检测样本中PD-L1的表达、存在或不存在。
根据本发明的一个实施方案，确定PD-L1的表达状态包括确定以下至少一项：
·肿瘤比例评分(TPS)，
·免疫细胞评分(IC)，和/或
·合并阳性评分。
如本文所用，肿瘤比例评分(TPS，也称为TC)涉及所有活肿瘤细胞中PD-L1阳性肿瘤细胞的百分比，例如用包括免疫测定的方法测定(Kulangara等，2019)。
如本文所用，免疫细胞评分(IC)涉及PD-L1阳性免疫细胞面积占活肿瘤细胞(即“浸润免疫细胞”)面积的百分比，例如用包括免疫测定的方法测定。
如本文所用，合并阳性评分(CPS)本质上是TPS和IC的组合，并且涉及PD-L1阳性细胞(其包括来自所有活肿瘤细胞的淋巴细胞和巨噬细胞)的百分比。
优选地，免疫组织化学(IHC)测定用于这些目的。目前批准不同的IHC测定法来确定任何上述评分。
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(DAKO 22C3)是一种使用单克隆小鼠抗PD-L1克隆22C3的IHC测定，是在Autostainer Link 48上使用EnVision FLEX可视化系统检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的非小细胞肺癌(NSCLC)、胃或胃食管交界处(GEJ)腺癌和宫颈癌组织中的PD-L1蛋白。VENTANA PD-L1(SP142)测定是一种使用兔单克隆抗PD-L1克隆SP142的IHC测定，旨在用于评估福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织中肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞中的程序性死亡配体1(PD-L1)蛋白。PD-L1状态的确定是指征特异性的，并且评估是基于任何强度的表达PD-L1的肿瘤浸润免疫细胞占据的肿瘤面积的比例(％IC)或任何强度的表达PD-L1的肿瘤细胞的百分比(％TPS/TC)。
VENTANA PD-L1(SP263)测定是一种使用兔单克隆抗PD-L1克隆SP263的IHC测定，旨在在VENTANA BenchMark ULTRA仪器上评估用OptiView DAB IHC检测试剂盒染色的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的尿路上皮癌组织中的PD-L1蛋白。PD-L1状态通过高于背景的任何膜染色的肿瘤细胞的百分比(TC或TPS)或通过高于背景的任何强度的染色的肿瘤相关免疫细胞的百分比(IC)来确定。
根据本发明的一个实施方案，确定PD-L1表达状态包括使用原位杂交(ISH)。
原位杂交(ISH)是一种杂交类型，其使用标记的互补DNA、RNA或修饰的核酸链(即探针)，将特定的DNA或RNA序列定位在组织的某一部分或切片中(原位)，或者如果组织肽太小(例如，植物种子，果蝇胚胎)，则定位在整个组织中(整体ISH)、细胞以及循环肿瘤细胞(CTC)中。这与免疫组织化学不同，免疫组织化学通常将蛋白质定位在组织切片中。
RNAScope是一种可商购的全自动的ISH测定仪，用于检测多种样本类型(包括福尔马林固定石蜡包埋的组织)中的RNA。RNAScope测定仪通过产生一种色原来产生定量的且因此分析上较不太主观的小点状点来显现RNA。RNAScope已被用于检测PD-L1RNA，并已在包括小细胞肺癌(SCLC)在内的各种适应症中与IHC等其它检测方法进行了比较(Yu等人，2017年)。本研究中将使用RNAScope的阳性定义为每个肿瘤细胞存在4至10个点状点。
将RNAScope阳性与IHC阳性进行比较，IHC阳性定义为使用Dako 28–8和VentanaSP142抗体的肿瘤比例评分(在任何强度下具有部分或完全细胞膜染色的细胞百分比)大于1％。使用RNAScope和IHC测定的PD-L1普遍性相似(15.5％对16.5％)。此外，与IHC相比，RNAISH已被用于回顾性研究临床反应和RNA表达的程度(Yuan等人，2016年)。RNAScope和IHC识别出相似数量的PD-L1阳性患者(分别为33.9％和35.1％)。PD-L1mRNA与PD-L1蛋白表达呈正相关，67.3％的PD-L1 IHC阳性患者样本为PD-L1RNAScope阳性，88.2％的PD-L1 IHC阴性患者样本也为PD-L1 RNAScope阴性。这些数据表明，使用RNAScope进行RNA检测可提供一种替代检测方法来识别适合接受免疫治疗的患者，但是需要进一步优化来定义确定PD-L1高表达的合适阈值或截止值。
先前已经提出了使用RNAScope对PD-L1状态进行评分的算法。例如，每个细胞超过10个点状点(Shi等人，2017)或超过10％的细胞中每个细胞超过10个点被认为是PD-L1高和PD-L1低状态之间的分界线的指示。
下表给出了阈值的概述，以确定样本是否特征在于PD-L1(程序性细胞死亡配体1)的表达不存在、低、中或高表达。
Figure BDA0004113818410000081
Figure BDA0004113818410000091
根据本发明的一个实施方案，确定PD-L1表达状态包括进行原位杂交PCR。
原位聚合酶链式反应(原位PCR)是一种强力的方法，可以检测新鲜、冷冻或石蜡包埋的细胞或组织切片中的罕见或单拷贝数核酸序列，以在细胞内定位这些序列。这种方法的原理包括组织固定(以保持细胞形态)和随后用蛋白酶解消化处理(为PCR试剂提供接近靶DNA的通路)。用这些试剂扩增靶序列，然后用标准免疫细胞化学方法检测。原位PCR结合了PCR或RT-PCR扩增的灵敏度以及对同一样本进行形态学分析的能力。例如，Duncan等(2019)公开了用这种方法评估PD-L1 mRNA，其内容通过引用并入本文。
根据本发明的一个实施方案，在怀疑包含肿瘤性或癌组织的样本中，
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
以上各项被认为是表明应答于免疫治疗：
·患者生存期改善的可能性很高，和/或
·更好的临床结果。
在一个实施方案中，优选确定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
在优选的实施方案中，被认为指示应答于免疫疗法的患者生存期改善的高可能性和/或更好的临床结果的TLS的阈值密度是≥0.005/mm2、≥0.01/mm2、≥0.02/mm2、≥0.03/mm2、≥0.04/mm2、≥0.05/mm2、≥0.06/mm2、0.063/mm2、≥0.07/mm2、≥0.08/mm2、≥0.09/mm2、≥0.1/mm2、≥0.11/mm2、≥0.12/mm2、≥0.13/mm2、≥0.14/mm2、≥0.15/mm2、≥0.16/mm2、≥0.17/mm2、≥0.18/mm2、≥0.19/mm2、≥0.2/mm2、≥0.25/mm2、≥0.3/mm2、≥0.35/mm2、≥0.4/mm2、≥0.45/mm2、≥0.5/mm2、≥0.55/mm2、≥0.6/mm2、≥0.65/mm2、≥0.7/mm2、≥0.75/mm2、≥0.8/mm2、≥0.85/mm2、≥0.9/mm2、≥0.95/mm2、≥1/mm2。
在优选的实施方案中，被认为指示响应于免疫疗法的患者生存期提高的高可能性和/或更好的临床效果的TLS的阈值密度是≥0.023/mm2。
在优选的实施方案中，被认为指示响应于免疫疗法的患者生存期改善的高可能性和/或更好的临床结果的成熟TLS的阈值密度是≥0.005/mm2、≥0.01/mm2、≥0.02/mm2、≥0.03/mm2、≥0.04/mm2、≥0.05/mm2、≥0.06/mm2、0.063/mm2、≥0.07/mm2、≥0.08/mm2、≥0.09/mm2、≥0.1/mm2、≥0.11/mm2、≥0.12/mm2、≥0.13/mm2、≥0.14/mm2、≥0.15/mm2、≥0.16/mm2、≥0.17/mm2、≥0.18/mm2、≥0.19/mm2、≥0.2/mm2、≥0.25/mm2、≥0.3/mm2、≥0.35/mm2、≥0.4/mm2、≥0.45/mm2、≥0.5/mm2、≥0.55/mm2、≥0.6/mm2、≥0.65/mm2、≥0.7/mm2、≥0.75/mm2、≥0.8/mm2、≥0.85/mm2、≥0.9/mm2、≥0.95/mm2、≥1/mm2。
在优选的实施方案中，被认为指示响应于免疫疗法的患者生存期改善的高可能性和/或更好的临床结果的成熟TLS的阈值密度是≥0.03/mm2。
在一个实施方案中，成熟TLS的阈值密度应当高于一般TLS的阈值密度，这是违反直觉的发现。
本文所用的术语“改善的生存期”是指在用本文所述的方法治疗后受试者或患者延长存活的时间段。改善的生存期表示在特定治疗后患有癌症的个体保持免于疾病进展的最大可能性。其还用于描述与对照组相比，在特定时间段后疾病可能保持稳定(未显示进展迹象)的群体中的高百分比个体。其还用于描述与对照组相比，疾病在特定时间段后可能治愈(未显示疾病迹象)的群体中的高百分比个体。该参数可以通过任何常见的临床终点测量，如“无进展生存期”、“总生存期”和“无疾病生存期”，用作特定治疗有效性的指示。
重要的是要理解不同的步骤a)至d)可以
·同时、和/或在同一位置、和/或在相同的责任下进行，和/或
·在相同的样本上、和/或在不同的样本上、和/或在同一样本的不同子样本上进行，和/或
·在不同的时间点、和/或在不同的位置和/或在不同的责任下进行。
如果步骤a)至d)中至少有两个步骤是在不同的责任下进行的，则单独进行其中一个步骤仍属于共同侵权的专利范围。
此外，重要的是理解在一个实施方案中，步骤a)至c)可以在第一样品中进行，并且步骤d)可以在第二样品中进行。
在一些实施方案中，患者患有或有发展风险的癌症是甲状腺癌，胃肠道间质瘤，胆管癌，胰腺癌，肛门癌，宫颈癌，卵巢癌，外阴癌，子宫内膜癌，宫颈癌，卵巢癌，外阴癌，子宫内膜癌，胃癌，非小细胞肺癌，软组织肉瘤，膀胱癌，结肠直肠癌，头颈癌，肾癌和乳腺癌中的至少一种癌症。
根据本发明的一个实施方案，患者患有或有发展风险的癌症是肺癌或消化器官癌症。
在一个实施方案中，所述肺癌是NSCLC。在另一个实施方案中，所述肺癌是SCLC。
在不同的实施方案中，所述消化器官的癌症是选自结肠癌，转移性结肠癌，结肠直肠癌或转移性结肠直肠癌，食道癌，转移性食道癌，胃癌和转移性胃癌中的至少一种癌症。
根据本发明的一个实施方案，免疫疗法是应用免疫检查点抑制剂的疗法。
根据本发明的一个实施方案，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG3、TIM3、OX40、4-1BB和/或TIGIT中的至少一种的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
根据本发明的一个实施方案，所述结合剂、抑制剂或拮抗剂是抗体或其靶结合片段或衍生物。
根据本发明的一个实施方案，所述抗体选自易普利姆玛(Ipilimumab)(抗CTLA-4)，纳武单抗(Nivolumab)(抗PD-1)，派姆单抗(Pembrolizumab)(抗PD-1)，西米普利单抗(Cemiplimab)(抗PD-1)，斯巴达珠单抗(Spartalizumab)(抗PD-1)，阿特朱单抗(Atezolizumab)(抗PD-L1)，阿维单抗(Avelumab)(抗PD-L1)，德瓦鲁单抗(Durvalumab)(抗PD-L1)，依吉利单抗(Etigilimab)(抗TIGIT)，BGB-A1217(抗TIGIT)，BMS-986207(抗TIGIT)，AB154(抗TIGIT)，ASP8374(抗TIGIT)，MK 7684(抗TIGIT)和/或替戈鲁单抗(Tirgolumab)(抗TIGIT)中的至少一种。
在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是阿维单抗(PD-L1)。阿维单抗是靶向蛋白质程序性死亡-配体1(PD-L1)的全人源单克隆抗体。它已被欧洲药品管理局(EMA)认定为用于治疗胃癌的罕见药物。美国食品药品监督管理局(FDA)于2017年3月批准其用于梅克尔细胞癌(Merkel-cell carcinoma)。EMA于2017年9月批准了相同适应症。本发明的发明人已显示阿维单抗对于患有或被诊断为实体瘤并如本文所公开分层的患者的益处。
在其它实施方案中，PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂是阿特朱单抗或德瓦鲁单抗。
在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD1的结合剂、抑制剂或拮抗剂。在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是纳武单抗(PD1)。纳武单抗是靶向PD-1的全人源单克隆抗体。纳武单抗于2014年12月获得FDA批准用于治疗黑色素瘤。2015年4月，欧洲药品管理局人用药委员会建议批准纳武单抗用于转移性黑素瘤的单一疗法。2015年3月，美国FDA批准其用于治疗肺鳞状细胞癌。2015年6月19日，欧洲药品管理局(EMA)批准了整个欧盟有效的上市许可。
在其它实施方案中，PD-1的结合剂、抑制剂或拮抗剂是派姆单抗，西米普利单抗或斯巴达珠单抗。
根据本发明的一个实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
·通过检测肿瘤标记物的存在与否或对样品进行组织化学染色，确定样品中肿瘤组织或病变的存在、体积、面积、大小或轮廓中的至少一项。
这两种方法都可以是定性和定量的方式用于区分肿瘤形成基质和/或TLS。这对于定义和量化肿瘤病变的大小也很有用。
在一个实施方案中，一种这样的肿瘤标记物是角蛋白，优选细胞角蛋白。细胞角蛋白是在上皮组织的胞浆内细胞骨架中发现的角蛋白。它们是中间丝的重要组分，有助于细胞抵抗机械应力。这些细胞角蛋白在上皮细胞中的表达在很大程度上对特定器官或组织是特异性的。它们可用作鉴定肿瘤组织的标记物。在另一个实施方案中，一种这样的肿瘤标记物是PSA(前列腺特异性抗原)或CA19-9。
在一个实施方案中，这可以通过包括免疫测定的方法来完成，例如使用抗角蛋白抗体，优选抗细胞角蛋白抗体。
在一个实施方案中，所述组织化学染色是苏木精和伊红(H&E)染色。
在一个实施方案中，在应用肿瘤标记物或组织化学染色后，使用图像分析系统确定肿瘤组织或肿瘤病变的存在、体积、面积、大小或轮廓。
这有助于通过仅将TLS计数除以肿瘤组织或肿瘤病变的面积大小、面积或体积来确定TLS密度。
根据本发明的一个方面，提供了用于(药物生产以)治疗患有癌症或被诊断患有癌症的患者的免疫检查点抑制剂，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达。
在一个实施方案中，优选测定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
根据本发明的一个方面，提供了一种用免疫检查点抑制剂治疗患有癌症或有患癌症风险的患者的方法，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达。
其中所述方法包括施用至少一种治疗有效剂量的免疫检查点抑制剂。
在一个实施方案中，优选测定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
在优选的实施方案中，TLS的阈值密度是≥0.005/mm2、≥0.01/mm2、≥0.02/mm2、≥0.03/mm2、≥0.04/mm2、≥0.05/mm2、≥0.06/mm2、0.063/mm2、≥0.07/mm2、≥0.08/mm2、≥0.09/mm2、≥0.1/mm2、≥0.11/mm2、≥0.12/mm2、≥0.13/mm2、≥0.14/mm2、≥0.15/mm2、≥0.16/mm2、≥0.17/mm2、≥0.18/mm2、≥0.19/mm2、≥0.2/mm2、≥0.25/mm2、≥0.3/mm2、≥0.35/mm2、≥0.4/mm2、≥0.45/mm2、≥0.5/mm2、≥0.55/mm2、≥0.6/mm2、≥0.65/mm2、≥0.7/mm2、≥0.75/mm2、≥0.8/mm2、≥0.85/mm2、≥0.9/mm2、≥0.95/mm2、≥1/mm2。
在优选实施方案中，TLS的阈值密度是≥0.023/mm2。
在优选的实施方案中，成熟TLS的阈值密度是≥0.005/mm2、≥0.01/mm2、≥0.02/mm2、≥0.03/mm2、≥0.04/mm2、≥0.05/mm2、≥0.06/mm2、0.063/mm2、≥0.07/mm2、≥0.08/mm2、≥0.09/mm2、≥0.1/mm2、≥0.11/mm2、≥0.12/mm2、≥0.13/mm2、≥0.14/mm2、≥0.15/mm2、≥0.16/mm2、≥0.17/mm2、≥0.18/mm2、≥0.19/mm2、≥0.2/mm2、≥0.25/mm2、≥0.3/mm2、≥0.35/mm2、≥0.4/mm2、≥0.45/mm2、≥0.5/mm2、≥0.55/mm2、≥0.6/mm2、≥0.65/mm2、≥0.7/mm2、≥0.75/mm2、≥0.8/mm2、≥0.85/mm2、≥0.9/mm2、≥0.95/mm2、≥1/mm2。
在优选实施方案中，成熟TLS的阈值密度是≥0.03/mm2。
在一个实施方案中，成熟TLS的阈值密度应当高于一般TLS的阈值密度，这是违反直觉的发现。
根据本发明的一个实施方案，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG3、TIM3、OX40、4-1BB和/或TIGIT中的至少一种的结合剂、抑制剂或拮抗剂。根据本发明的一个实施方案，所述结合剂、抑制剂或拮抗剂是抗体或其靶结合片段或其衍生物。
根据本发明的一个实施方案，所述抗体选自易普利姆玛(Ipilimumab)(抗CTLA-4)，纳武单抗(Nivolumab)(抗PD-1)，派姆单抗(Pembrolizumab)(抗PD-1)，西米普利单抗(Cemiplimab)(抗PD-1)，斯巴达珠单抗(Spartalizumab)(抗PD-1)，阿特朱单抗(Atezolizumab)(抗PD-L1)，阿维单抗(Avelumab)(抗PD-L1)，德瓦鲁单抗(Durvalumab)(抗PD-L1)，依吉利单抗(Etigilimab)(抗TIGIT)，BGB-A1217(抗TIGIT)，BMS-986207(抗TIGIT)，AB154(抗TIGIT)，ASP8374(抗TIGIT)，MK 7684(抗TIGIT)和/或替戈鲁单抗(Tirgolumab)(抗TIGIT)中的至少一种。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是双特异性结合剂，例如双特异性抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性结合剂结合CTLA-4和PD-1或PD-L1。
在进一步的实施方案中，这种双特异性结合剂是选自KN046(Alphamab)、AK104(Akeso)、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(Astrazeneca)、MDG019(Macrogenics)、CN104974253A(Shanghai CITIC Guojian Pharmaceutical)中的至少一种。
在一个实施方案中，所述双特异性结合剂结合4-1BB(CD137)和PD-1或PD-L1。
在进一步的实施方案中，这种双特异性结合剂是选自INBRX-105(Inhibrx/Elpiscience Biopharmaceuticals)、MCLA-145(Merus)、FS222(F-star))中的至少一种。
根据本发明的一个方面，提供了一种免疫检查点抑制剂与另一种免疫检查点抑制剂或化疗药物的组合，任选地用于制备药物或用于制备单独的可共同施用的药物，以用于治疗患有癌症或被诊断患有癌症的患者，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
其中所述两种药物的组合同时或连续施用于患者。
在一个实施方案中，优选测定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
如本文所用，术语“同时”是指两种药物以相同或不同的剂量单位同时施用于患者。
如本文所用，术语“连续”是指两种药物在不同时间施用于患者，但仍获得协同或互补作用。
根据本发明的一个方面，提供了一种治疗患有癌症或有患癌症风险的患者的方法，所述方法使用免疫检查点抑制剂与另一种免疫检查点抑制剂或化疗药物的组合，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
其中所述方法包括以至少一种治疗有效剂量施用所述免疫检查点抑制剂和任选的化疗药物。
在一个实施方案中，优选测定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
在一个实施方案中，所述组合包含CTLA-4的结合剂、抑制剂或拮抗剂和PD-1或PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
在一个实施方案中，所述组合包含4-1BB(CD137)的结合剂、抑制剂或拮抗剂和PD-1或PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
关于这些方面，为了避免冗长的重复，与本文别处公开的关于优选免疫检查点抑制剂的考虑相同。
根据本发明的一个实施方案，所述癌症是选自肺癌或消化器官癌的至少一种癌症。关于这个方面，为了避免冗长的重复，与本文别处公开的关于优选类型的肿瘤的考虑相同。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于实施根据上文描述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括用于以下至少一项的方法：
a)确定样品是否包含三级淋巴样结构(TLS)，
b)确定样本中TLS的成熟状态，
c)同样样本中TLS的密度，
d)确定样本中成熟TLS的密度，或
e)确定样本中PD-L1(程序性细胞死亡配体1)的表达状态。
在一个实施方案中，优选测定TLS的密度。
在另一个实施方案中，优选测定成熟TLS的密度。
根据本发明的一个实施方案，所述试剂盒包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含能够与编码PDL1、CD20、CD3、CD23中的至少一种的核酸杂交的核苷酸序列，所述寡核苷酸选自：
·扩增引物，
·标记的探针，和/或
·底物结合的探针，
其中所述杂交发生在严格条件下，即探针或引物与其靶子序列杂交但不与其它序列杂交的条件。
本领域技术人员能够用常规方法，用可自由访问的相应软件来设计用于上述标记物的合适探针和/或引物。作为输入，此类软件需要例如Entrez Gene ID或RefSeq标识符(感兴趣的靶参见表1)，并提供合适的引物或探针序列。NCBI在URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/下提供了一种这样的软件工具。
根据本发明的一个实施方案，所述试剂盒适用于以下至少一项：
·荧光原位杂交(FISH)，
·原位PCR，
·实时PCR，和/或
·逆转录PCR/qPCR。
所有这些方法都是本领域技术人员熟知的。前两者提供空间分辨率，因此可用于密度或接近度测量，而后两者则不然。
根据本发明的一个实施方案，所述试剂盒包含至少一种免疫配体，所述免疫配体能够在免疫测定中结合CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、Pax5、CD21、CD35、CD23、CD8、DC-Lamp或PD-L1中的至少一种。
此外，所述试剂盒可包含至少一种其它免疫配体，所述其它免疫配体能够结合泛角蛋白、CK20、CK7、CK8/18、CK19、PSA、CA19-9、IDO1中的至少一种。
技术人员能够用常规方法从例如Abcam、MerckMillipore或ThermoFisher提供的相应目录中选择上述标记物的免疫配体，例如抗体，或用常规方法如免疫和杂交瘤技术制备这种免疫配体，例如抗体。
表1显示了本文讨论的标记物的进一步特征，以使得技术人员尤其能够制备或选择抗体或设计合适的引物或探针，如本文别处公开的。
根据本发明的一个实施方案，所述免疫测定是选自以下至少一种：
·IHC(免疫组织化学测定)，
·ICC(免疫细胞化学测定)，和/或
·IF(免疫荧光测定)。
根据本发明的一个实施方案，至少一种所述免疫配体是抗体。
这种抗体任选地被标记，例如，用荧光标记、不透射线标记、酶标记(如辣根过氧化物酶)、生物素标记等。
实施例
虽然本发明已在附图和前面的描述中进行了详细说明和描述，但此类说明和描述应被视为说明性或示例性而非限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。通过对附图、公开内容和所附权利要求的研究，本领域技术人员在实践要求保护的发明时可以理解和实现对所公开的实施方案的其它变型。在权利要求中，“包括”一词不排除其它元素或步骤，不定冠词“一”或“一个”不排除复数。某些措施在相互不同的从属权利要求中叙述的事实并不表明这些措施的组合不能被有利地使用。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列以从N-末端到C-末端示出；本文公开的所有核酸序列以5’至3’示出。
TLS定义
如前所述(Petitprez et al,Nature,2020)，TLS被定义为由至少100个细胞的B细胞滤泡组成的淋巴聚集物，并且位于肿瘤块内或侵润边缘(定义为距离肿瘤细胞小于500μm的纤维组织)。当TLS与肿瘤细胞混合时，系统地评估每个TLS的拓扑学并将其分类为“肿瘤内TLS”，当TLS位于边缘内时将其分类为“外周TLS”。当在淋巴器官(即淋巴结，脾，扁桃体)上评估TLS状态时，仅在与肿瘤细胞混合时考虑TLS，如果远离残余实质，则排除预先存在的淋巴滤泡。如果CD21和CD23均为阴性，TLS定义为早期TLS(E-TLS)；如果TLS仅对CD21染色，则定义为初级滤泡样TLS(“PFL-TLS”)；当生发中心至少对CD23或两种标记物成阳性时，则定义为次级滤泡样TLS(“SFL-TLS”)。利用病理学评估方案，当CD23+滤泡树突细胞存在于GC中时，TLS被分类为“成熟的”，或当它们不存在时被分类为“未成熟的”。
切点计算方法
通过使用R包“survminer”(v 0.4.7)中的surv_cutpoint函数，确定了TLS或成熟TLS密度的最佳切点。这个函数使用来自'maxstat'R软件包的最大选择的秩统计。使用Kaplan-Meier方法估算生存率。
从图片导出TLS计数的方法
TLS计数可有两种方法：
1)由解剖病理学专家人工计算，
2)在对载玻片数字处理化后使用图像自动分析。
关于自动图像分析，在图像分析之前-以及在没有使用特定肿瘤标记物(例如角蛋白)的情况下-可以进行人工组织注释，以便将图像划分为组织区域，例如肿瘤与其它区域。这样的注释可以使用包括Phenochart(Akoya)的多种软件(取决于用于图像分析的软件)来完成。可以使用计算机鼠标或交互式笔工具来绘制区域，在理想情况下由专业解剖病理学家执行。一旦定义了肿瘤区域，就可以通过图像分析计算其各自的表面，可以使用包括Inform(Akoya)或Image J在内的软件。
使用基于机器学习的专用软件，其中用户可以训练软件以根据适当的染色(例如成熟TLS的CD3/CD20/CD23染色或TLS的CD3/CD20染色)识别特定的感兴趣区域(例如TLS)，可以自动检测和计数特定结构(见图)。结合TLS计数和肿瘤表面，可以计算TLS的密度。
实施例1：
材料&方法
患者群组：2013年12月至2019年5月在Institut Bergonie(Bordeaux,France)接受iCPI治疗的332名患者(196名男性，136名女性)进入研究。平均年龄为61岁(范围19-88岁)。132例(39.8％)患者患有非小细胞肺癌(39.8％)，47例(14.2％)患者患有肉瘤，31例(9.3％)患者患有膀胱癌，27例(8.1％)患者患有结肠直肠癌，12例(3.6％)患者患有头颈部癌，11例(3.3％)患者患有肾癌和72例(21.7％)患者患有其它实体瘤。198例(59.6％)患者接受了PD1拮抗剂(派姆单抗或纳武单抗)，134例(30.1％)患者接受了PD-L1拮抗剂(阿特朱单抗或德瓦鲁单抗)和32例(10.2％)患者接受了联合免疫检查点抑制剂(瓦鲁单抗+曲美母单抗或纳武单抗+伊匹单抗)。中位随访时间为19.1个月。
方法
我们通过自动免疫组织化学研究了2013年12月至2019年5月期间在InstitutBergonie(Bordeaux,France)接受iCPI治疗的癌症患者的一系列肿瘤标本中TLS和PD-L1状态的存在。TLS定义为与CD3+T细胞并列的CD20+B细胞滤泡。所有病例均由2名病理学家盲审是否存在TLS以及进行PDL1评分(TPS和CPS)。在载玻片数字化处理和由病理学家人工注释之后量化肿瘤表面。
结论
110名患者(33.1％)显示存在TLS，71名患者(21.4％)既不与TPS相关，也不与CPS评分-TPS≥10相关。TLS的存在高度预示着低PD-L1表达(TPS<10)的患者中的客观反应：30.9％对12.8％，p<0.0001，而在高表达(TPS≥10)的患者中未观察到显着差异(53.3对47.5％，p＝0.146)。仅在低PD-L1表达患者中，TLS的存在也与改善的PFS(4.1对2.6个月，p＝0.024)和OS(28对12.6个月，p＝0.001)有关。在对整个群组进行的多变量分析中，TLS的存在与PD-L1表达状态和性能状态一起是PFS和OS的独立预后因子，并且代表了OS的最显著的预测因子。通过仅在NSCLC患者中进行分析获得了类似的结果。总之，我们的结果表明TLS可以代表在常规设置中容易评估的新生物标记物，其可以与PD-L1表达测定组合使用以更好地定制癌症患者中的ICI。
TLS的存在高度预示着低PD-L1表达(TPS<10)的患者中的客观反应：30.9％对12.8％，p<0.0001，而在高表达(TPS≥10)的患者中未观察到显着差异(53.3对47.5％，p＝0.146)。
免疫组织化学分析
免疫组织化学(IHC)分析在自动Ventana Discovery XT染色平台(VentanaMedical Systems)上进行。将载玻片在二甲苯中脱蜡并在系列醇溶液中水合。使用标准CC1(基于tris的缓冲液)pH8(Ventana Medical Systems)通过热诱导表位修复方法进行抗原修复。将载玻片与以下一抗温育：抗CD3(克隆2GV6，Roche，即用型)和抗CD20(克隆L26，Roche，即用型)或抗CD8(克隆C8/144B，Dako，稀释1/25)和抗PDL1(克隆QR1，Dako，稀释1/100)。使用OmniMap抗Ms或Rb HRP与Chromo MAP DAB检测试剂盒或Discovery Purple试剂盒(Ventana Medical Systems)一起检测结合的一抗。将载玻片用苏木精复染并盖上盖玻片。所有病例均由2名病理学家盲审TLS存在与否以及进行PDL1评分(TPS和CPS)。将染色的载玻片在多光谱载玻片分析系统上成像，并在Inform图像分析软件(Perkin Elme，版本2.4.1)中分析，以量化肿瘤表面，然后评估TLS密度以及TLS内CD3和CD20阳性细胞的丰度。然后使用Phenoptr和PhenoptrReports软件包在R软件中计算数据。
免疫组织荧光分析
免疫组织荧光分析(IHF)分析在自动Ventana Discovery XT染色平台(VentanaMedical Systems)上进行。将载玻片在二甲苯中脱蜡并在系列醇溶液中水合。使用标准CC1(基于tris的缓冲液)pH8(Ventana Medical Systems)通过热诱导表位修复方法进行抗原修复。将载玻片与以下一抗温育：抗CD8(克隆C8/144B，Dako，稀释度1/25)，抗CD4(克隆4B12，Dako，稀释度1/100eme)，抗CD20(克隆L26，Roche，即用型)，抗CD21(克隆2G9，Roche，即用型)，抗CD23(克隆SP23，Roche，即用型)。使用OmniMap抗Ms或Rb-HRP与Opal检测试剂盒(Akoya Bioscience)一起检测结合的一抗。将载玻片用Spectral DAPI(Perkin Elmer)复染并盖玻片。将染色的载玻片在多光谱载玻片分析系统(Vectra Polaris，Perkin Elmer)上成像，然后由2名病理学家对图像进行盲审以评估TLS状态——成熟与不成熟。同时，使用Inform图像分析软件(Perkin Elmer，版本2.4.1)分析图像，以便将组织分割成TLS组织和其它组织，并通过量化每个细胞群对TLS进行表型分析。然后使用Phenoptr和PhenoptrReports软件包在R软件中计算TLS的免疫表型。
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表1：
Figure BDA0004113818410000191
表1(续)
Figure BDA0004113818410000201

Claims (34)

1.一种在患有癌症或有处于患癌症风险的患者中预后疾病进展的体外方法，所述方法包括以下步骤：
·在来自怀疑包含肿瘤性或癌组织的所述患者的样本中，确定所述样本是否包含三级淋巴样结构(TLS)，和
·预后疾病进展，
其中所述预后是评估免疫疗法或用免疫治疗剂治疗的·患者生存期改善的可能性，和/或
·更好临床结果。
2.根据权利要求1的体外方法，其中确定所述样本是否包含三级淋巴样结构包括以下至少一项：
·用组织化学染色对所述样本进行染色，和/或
·确定所述样本中是否存在T淋巴细胞和/或B淋巴细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在蛋白质或mRNA基础上检测至少一种选自CD3、CD4、CD8、CD20、CD19和Pax5的标记物的表达、存在或不存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同样本中确定TLS密度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的体外方法，其进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同样本中确定TLS的成熟状态和/或成熟TLS的密度。
6.根据权利要求5的体外方法，其中确定所述TLS的成熟状态包括基于蛋白质或mRNA检测
·至少一种选自CD35和CD23的标记物的表达、存在或不存在，或
·DC-Lamp+成熟树突细胞(mDCs)的存在或不存在。
7.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其进一步包括以下步骤：
·在来自所述患者的相同或第二个样本中确定PD-L1(程序性细胞死亡配体1)的表达状态。
8.根据权利要求7所述的体外方法，其中确定PD-L1表达状态包括基于蛋白质或mRNA检测样本中PD-L1的表达、存在或不存在。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的体外方法，其中确定PD-L1的表达状态包括确定以下至少一项：
·肿瘤比例评分(TPS)，
·免疫细胞评分(IC)，和/或
·合并阳性评分。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的体外方法，其中确定PD-L1表达状态包括进行原位杂交(ISH)。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的体外方法，其中确定PD-L1表达状态包括进行原位PCR。
12.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中在怀疑包含肿瘤性或癌组织的样本中，认为以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
是应答免疫治疗的以下指标的指征：
·患者生存期改善的高可能性，和/或
·更好的临床结果。
13.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中所述患者患有或处于发生风险中的癌症是肺癌或消化器官癌症。
14.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中所述免疫疗法是其中施用免疫检查点抑制剂的疗法。
15.根据权利要求14所述的体外方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG 3、TIM3、OX40、4-1BB和/或TIGIT中的至少一种的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
16.根据权利要求15所述的体外方法，其中所述结合剂、抑制剂或拮抗剂是抗体或其靶结合片段或衍生物。
17.根据权利要求16所述的体外方法，所述抗体是选自易普利姆玛(Ipilimumab)(抗CTLA-4)，纳武单抗(Nivolumab)(抗PD-1)，派姆单抗(Pembrolizumab)(抗PD-1)，西米普利单抗(Cemiplimab)(抗PD-1)，斯巴达珠单抗(Spartalizumab)(抗PD-1)，阿特朱单抗(Atezolizumab)(抗PD-L1)，阿维单抗(Avelumab)(抗PD-L1)，德瓦鲁单抗(Durvalumab)(抗PD-L1)，依吉利单抗(Etigilimab)(抗TIGIT)，BGB-A1217(抗TIGIT)，BMS-986207(抗TIGIT)，AB154(抗TIGIT)，ASP8374(抗TIGIT)，MK 7684(抗TIGIT)和/或替戈鲁单抗(Tirgolumab)(抗TIGIT)中的至少一种抗体。
18.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其进一步包括以下步骤：
·通过检测肿瘤标记物的存在或不存在或对样本进行组织化学染色，确定样本中肿瘤组织或病变的存在、体积、面积、大小或轮廓中的至少一项。
19.一种用于治疗患有癌症或被诊断患有癌症的患者的免疫检查点抑制剂(免疫检查点抑制剂用于制备治疗患有癌症或被诊断患有癌症的患者的药物)，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
20.一种用免疫检查点抑制剂治疗患有癌症或处于患癌症风险的患者的方法，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
其中所述方法包括以至少一个治疗有效剂量施用免疫检查点抑制剂。
21.一种免疫检查点抑制剂与另一种免疫检查点抑制剂或化疗药物的组合，任选地用于制备药物或用于制备分开的可共同施用的药物，以用于治疗患有癌症或被诊断患有癌症的患者，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
其中将所述两种药物的组合同时或连续施用于患者。
22.一种治疗患有癌症或处于患癌症风险的患者的方法，所述方法使用免疫检查点抑制剂与另一种免疫检查点抑制剂或化疗药物的组合，所述癌症的特征在于以下至少一项：
a)样本中TLS的存在，
b)TLS密度≥0.005TLS/mm2，
c)成熟TLS的存在，
d)成熟TLS的密度≥0.005TLS/mm2，和/或
e)PD-L1(程序性细胞死亡配体1)表达的不存在或低表达，
其中所述方法包括以至少一个治疗有效剂量施用免疫检查点抑制剂和任选的化疗药物。
23.根据权利要求21或22所述的组合或方法，其中所述组合包含：
·CTLA-4的结合剂、抑制剂或拮抗剂和PD-1或PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂，或
·4-1BB(CD137)的结合剂、抑制剂或拮抗剂和PD-1或PD-L1的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
24.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫检查点抑制剂或组合或方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG 3、TIM3、OX40、4-1BB和/或TIGIT中的至少一种的结合剂、抑制剂或拮抗剂。
25.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫检查点抑制剂或组合或方法，其中所述结合剂、抑制剂或拮抗剂是抗体，或其靶结合片段或衍生物。
26.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫检查点抑制剂或组合或方法，其中所述抗体是选自易普利姆玛(Ipilimumab)(抗CTLA-4)，纳武单抗(Nivolumab)(抗PD-1)，派姆单抗(Pembrolizumab)(抗PD-1)，西米普利单抗(Cemiplimab)(抗PD-1)，斯巴达珠单抗(Spartalizumab)(抗PD-1)，阿特朱单抗(Atezolizumab)(抗PD-L1)，阿维单抗(Avelumab)(抗PD-L1)，德瓦鲁单抗(Durvalumab)(抗PD-L1)，依吉利单抗(Etigilimab)(抗TIGIT)，BGB-A1217(抗TIGIT)，BMS-986207(抗TIGIT)，AB154(抗TIGIT)，ASP8374(抗TIGIT)，MK7684(抗TIGIT)和/或替戈鲁单抗(Tirgolumab)(抗TIGIT)中的至少一种抗体。
27.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫检查点抑制剂或组合或方法，其中所述免疫检查点抑制剂是双特异性结合剂。
28.根据前述权利要求中任一项所述使用的免疫检查点抑制剂或组合或方法，其特征在于所述癌症是选自肺癌或消化器官的癌症的至少一种。
29.一种用于实施根据前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于以下至少一项的手段：
a)确定样品是否包含三级淋巴样结构(TLS)，
b)确定样本中TLS的成熟状态，
c)确定样本中TLS的密度，
d)确定样本中成熟TLS的密度，或
e)确定样本中PD-L1(程序性细胞死亡配体1)的表达状态。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含能够与编码PDL1、CD20、CD3、CD23中的至少一种的核酸杂交的核苷酸序列，所述寡核苷酸选自：
·扩增引物，
·标记的探针，和/或
·底物结合的探针，
其中所述杂交发生在严格条件下，即探针或引物与其靶子序列杂交但不与其它序列杂交的条件。
31.根据权利要求29或30所述的试剂盒，所述试剂盒适用于以下至少一项：
·荧光原位杂交(FISH)，
·原位PCR，
·实时PCR，和/或
·逆转录PCR/qPCR。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种免疫配体，所述免疫配体能够在免疫测定中结合CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、Pax5、CD21、CD35、CD23、CD8、DC-Lamp或PD-L1中的至少一种。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫测定选自以下至少一项：
·IHC(免疫组织化学测定)，
·ICC(免疫细胞化学测定)，和/或
·IF(免疫荧光测定)。
34.根据权利要求32至33中任一项所述的试剂盒，其中至少一种所述免疫配体是抗体。
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