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CN116134138A - 靶向细胞内诱瘤蛋白的抗体、或其单链可变片段与癌细胞穿透肽的融合蛋白、及其用途 - Google Patents

靶向细胞内诱瘤蛋白的抗体、或其单链可变片段与癌细胞穿透肽的融合蛋白、及其用途 Download PDF

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CN116134138A
CN116134138A CN202180055334.7A CN202180055334A CN116134138A CN 116134138 A CN116134138 A CN 116134138A CN 202180055334 A CN202180055334 A CN 202180055334A CN 116134138 A CN116134138 A CN 116134138A
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CN
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lys
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郑钟平
朴玧贞
李周娟
金德镒
郑义均
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Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
Original Assignee
Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
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Abstract

本发明涉及：靶向作为细胞内诱瘤蛋白的KRAS的突变的抗体；或融合蛋白，其中通过基因表达方法或化学键合方法使癌细胞穿透肽与所述抗体的单链可变片段连接；及其肿瘤治疗用途。如此产生的融合蛋白具有通过有效地侵入肿瘤细胞而最大化靶向细胞内诱瘤蛋白或诱瘤突变蛋白的所述抗体或所述抗体的单链可变片段的抗肿瘤或抗癌作用的益处。

Description

靶向细胞内诱瘤蛋白的抗体、或其单链可变片段与癌细胞穿 透肽的融合蛋白、及其用途
技术领域
本发明涉及包含细胞内致癌蛋白靶向抗体或其单链可变片段和癌细胞穿透肽的融合蛋白及其用途；更具体地，涉及这样的融合蛋白，其中通过基因表达或化学缀合方法将癌细胞穿透肽与靶向细胞内致癌蛋白KRAS中的突变的抗体或其单链可变片段连接；及其用于治疗肿瘤的用途。
背景技术
肿瘤是因由于致癌途径的激活或肿瘤抑制途径的抑制引起的正常细胞中的基因突变而导致的(1)。在各种致癌因子中，RAS突变蛋白是最广为人知的致癌因子，并且在所有癌症患者的约30％中出现。RAS突变蛋白与GTP结合并保持激活，导致肿瘤细胞的增殖和生长。RAS可以分为三类：HRAS、NRAS和KRAS。KRAS突变主要见于非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌，HRAS突变见于膀胱癌、肾癌和甲状腺癌，并且NRAS突变主要见于黑色素瘤、肝细胞癌和血液系统恶性肿瘤(2)。KRAS基因突变占由RAS突变导致的癌症的86％，并且已知其可见于超过98％的胰腺癌、超过53％的直肠癌和超过30％的肺腺癌(3)。
已知KRAS突变与靶向上皮生长因子受体(EGFR)的诸如吉非替尼、厄洛替尼和西妥昔单抗的抗EGFR治疗剂的耐药机制密切相关。即使当使用EGFR抑制性抗癌药时，它们在EGFR下游的KRAS由于其中的突变而保持激活的状态下根本没有作用。实际上，在确定患者没有KRAS突变后，可以在结直肠癌中施用抗EGFR单克隆治疗性抗体。
抗体药物作为抗癌治疗手段已经被广泛研究。例如，曲妥珠单抗是针对Her2蛋白的单克隆抗体并被用作乳腺癌的治疗方法(4)，并且利妥昔单抗是针对CD20的单克隆抗体并被用作B细胞恶性淋巴瘤的治疗方法(5)。抗体对靶标具有优异的抑制作用，但是因为由于其高分子量它们不能穿过细胞膜，因此当抗体的靶标在细胞内时，很难获得抗体的抑制作用。
前列腺癌是世界上第三大最常见的男性癌症，并且在美国，它是最常见的男性癌症且其癌症特异性死亡率仅次于肺癌(7)。局部前列腺癌可以通过手术或放射疗法治愈，但是化学去势主要用作晚期或转移性前列腺癌的标准治疗方法。在证明前列腺癌是睾酮依赖性癌症后，人工去势被确立为晚期或转移性前列腺癌的首要治疗方法，并且各种类型的前列腺癌的去势治疗已经被用于临床实践(8)。在转移性前列腺癌中，去势显示出诸如疾病进展和伴随症状缓解的效果，但是已知只有75％的患者在去势进行超过18个月时始终对治疗有反应。去势在开始时显示出相对良好的反应，但是随着时间的流逝，前列腺癌细胞不会由于雄激素阻断而发生凋亡，而是转化为对激素治疗不再有反应的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)细胞(9)。
CRPC被定义为这样的病症，其中睾丸不产生睾酮，因此血液中的睾酮减少，并且即使在停止施用所有通过雄激素受体起作用的药物后，前列腺特异性抗原(PSA)也没有减少，并且出现PSA或放射学进展的显著增加。如果CRPC不做治疗，则平均生存期不到12个月，并且经过各种治疗，转移性前列腺癌患者的平均生存期不到3年，而在局部浸润性疾病的情况下，平均生存期仅为4.5年(10)。
已知CRPC中的雄激素受体(AR)通过诸如肿瘤中的AR过表达、突变、超敏反应和雄激素合成的各种机制被重新激活(11)。
阿比特龙(一种FDA批准的CRPC治疗药物)是一种雄激素合成抑制剂，并且恩扎鲁胺(MDV3100)(一种第二代雄激素受体拮抗剂)完全抑制雄激素与雄激素受体的结合，从而阻止雄激素受体移动进入细胞核并与靶基因结合。由于大多数在阿比特龙或恩扎鲁胺治疗后复发的前列腺癌呈PSA阳性并且雄激素受体被重新激活，因此对阿比特龙或恩扎鲁胺耐药的CRPC患者需要新的雄激素受体抑制疗法(12)。雄激素受体(类固醇受体超家族的一员)是一种配体依赖性转录因子，其调节受雄激素影响的基因的表达。为了使转录因子进入靶基因，转录因子必须进入细胞核，因此如果转录因子可以仅维持在细胞质中，则可以阻断转录功能。因此，最重要的步骤是控制雄激素受体向细胞核的转运。雄激素敏感性受体在不存在雄激素的情况下留在细胞质中，而在存在雄激素的情况下进入细胞核并激活靶基因。然而，在CRPC细胞中，雄激素受体继续激活靶基因，因为即使在不存在雄激素的情况下，它们仍留在细胞核中(13)。因此，如果任何物质可以抑制雄激素受体向细胞核的转运，则它可以用作CRPC肿瘤的有效治疗药物。
已知诸如KRAS和雄激素受体的致癌蛋白在人类癌症的发展中起重要作用，但是靶向这些致癌蛋白的抗体治疗剂尚未在临床上使用。原因在于针对分布在细胞中的RAS和雄激素受体的抗体因其分子量高而不能穿过细胞膜。已知比抗体小的单链可变片段(scFv)具有比抗体小的分子量并且没有导致免疫排斥的Fc区，因此它可以是一般抗体的替代物。然而，由于scFv本身具有25kDa或更高的分子量，因此与低分子量药物不同，scFv难以自由穿过细胞膜，因此难以获得如预期那样的大的抑制作用。
因此，诸位发明人进行了大量努力来解决现有技术中存在的上述问题，结果已经尝试将针对细胞内致癌蛋白的抗体或其单链可变片段与癌细胞穿透功能肽融合，以便能够穿透癌组织。作为融合方法，使用了基因表达方法或化学缀合方法，并且诸位发明人通过体外实验和动物实验已经发现，通过此方法产生的细胞穿透融合蛋白可以有效地抑制高表达致癌蛋白的癌细胞的增殖和生长，从而完成本发明。
现有技术
非专利文献
(非专利文件1)Zhang J,Chen YH,Lu Q.Pro-oncogenic and anti-oncogenicpathways:opportunities and challenges of cancer therapy.Future Oncol.2010年4月；6(4):587-603。
(非专利文件2)Cox AD,Fesik SW,Kimmelman AC,Luo J,Der CJ.Drugging theundruggable RAS:mission possible？Nat Rev Drug Discov 2014；13:828-51。
(非专利文件3)RAS oncogenes:weaving a tumorigenic web.Pylayeva-GuptaY,Grabocka E,Bar-Sagi D.Nat Rev Cancer.2011年10月13日；11(11):761-74。
(非专利文件4)Trastuzumab(herceptin)for the medical treatment ofbreast cancer.Bayoudh L,Afrit M,Daldoul O,Zarrad M,Boussen H.Tunis Med.2012年1月；90(1):6-12。
(非专利文件5)Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeuticsin oncology.Oflazoglu E,Audoly LP.MAbs.2010年1月-2月；2(1):14-9。
(非专利文件6)Demarest SJ,Glaser SM.Antibody therapeutics,antibodyengineering,and the merits of protein stability.Curr Opin Drug DiscovDevel.2008；11(5):675-687。
(非专利文件7)Jemal A,Clegg LX,Ward E,Ries LA,Wu X,Jamison PM等人Annual report to the nation on the status of cancer,1975-2001,with a specialfeature regarding survival.Cancer 2004；101:3-27。
(非专利文件8)Yagoda A,Petrylak D.Cytotoxic chemotherapy for advancedhormone-resistant prostate cancer.Cancer 1993；71:1098。
(非专利文件9)Rini BI,Small EJ.Hormone-refractory prostate cancer.CurrTreat Opt Oncol 2002；3:437-46。
(非专利文件10)Sella A,Yarom N,Zisman A,Kovel S.Paclitaxel,estramustine and carboplatin combination chemotherapy after initialdocetaxel-based chemotherapy in castration resistant prostate cancer.Oncology2009；76:442。
(非专利文件11)Chen CD,Welsbie DS,Tran C,Baek SH,Chen R,Vessella R等人Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy.Nat Med 2004；10:33-9。
(非专利文件12)Boudadi K,Antonarakis ES.Resistance to novelantiandrogen therapies in metastatic castration-resistant prostatecancer.Clin Med Insights Oncol 2016；10:1-9。
(非专利文件13)Zhang L,Johnson M,Le KH,Sato M,Ilagan R,Iyer M等人Interrogating androgen receptor function in recurrent prostate cancer.CancerRes 2003；63:4552-60。
(非专利文件14)Lars Kober,Christoph Zehe,Juergen Bode,Biotechnologyand Bioengineering,第110卷,第4期,2013年4月,Optimized signal peptides for thedevelopment of high expressing CHO cell lines。
发明内容
本发明的一个目的在于提供肿瘤治疗效果显著改善的融合蛋白。
本发明的另一个目的在于提供用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含所述融合蛋白作为活性成分。
本发明的仍另一个目的在于提供用于预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括施用所述融合蛋白的步骤。
本发明的又另一个目的在于提供所述融合蛋白用于预防或治疗肿瘤的用途。
本发明的仍又另一个目的在于提供所述融合蛋白在制造用于治疗肿瘤的药物中的用途。
为了实现以上目的，本发明提供了一种融合蛋白，其中(i)靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段与(ii)癌细胞穿透肽连接。
本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的核酸。
本发明还提供了一种已经引入所述核酸的重组载体。
本发明还提供了一种已经引入所述重组载体的重组细胞。
本发明还提供了一种用于产生所述融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过培养所述重组细胞表达所述融合蛋白；以及
(b)回收所表达的融合蛋白。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含所述融合蛋白作为活性成分。
本发明还提供了一种用于预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括施用所述融合蛋白。
本发明还提供了所述融合蛋白用于预防或治疗肿瘤的用途。
本发明还提供了所述融合蛋白在制造用于治疗肿瘤的药物中的用途。
附图说明
图1是示出了本发明的概要的示意图。
图2示出了表达载体，每种载体都包含癌细胞穿透KRAS突变体抗体或scFv。
图3示出了在表达和纯化后癌细胞穿透KRAS突变体抗体和scFv的SDS-PAGE和免疫印迹分析的结果。
图4示出了通过化学缀合方法产生的癌细胞穿透KRAS突变体抗体和scFv的SDS-PAGE和免疫印迹分析的结果。
图5示出了评价癌细胞穿透KRAS突变体抗体和scFv的癌细胞特异性杀伤作用的结果。
图6示出了为评价SEQ ID NO:20至23(各自通过GGGGS接头连接)的活性KRAS(突变KRAS)表达抑制活性而进行的免疫印迹分析的结果。
图7示出了为评价SEQ ID NO:90至93(各自通过GGGGSGGGGSGGGGS接头连接)的活性KRAS(突变KRAS)表达抑制活性而进行的免疫印迹分析的结果。
图8示出了分析SEQ ID NO:20至23穿透癌细胞的能力的结果。
图9示出了评价在肿瘤异种移植物动物模型中SEQ ID NO:2和23在癌组织中的分布的结果。
图10示出了肿瘤异种移植物动物模型中癌组织的荧光强度。
图11示出了SEQ ID NO:2和23的肿瘤抑制作用。
图12示出了在安乐死后由H358形成的肿瘤体积的变化和癌组织的图像。
图13示出了为评价通过化学缀合产生的SEQ ID NO:80至83的活性KRAS(突变KRAS)表达抑制活性而进行的免疫印迹分析的结果。
图14示出了评价通过化学缀合产生的SEQ ID NO:80至83的癌细胞特异性杀伤作用的结果。
图15示出了评价通过化学缀合产生的SEQ ID NO:80至83的癌细胞穿透能力的结果。
图16示出了评价在肿瘤异种移植物动物模型中到癌组织的分布的结果。
图17示出了肿瘤异种移植物动物模型中癌组织的荧光强度。
图18示出了SEQ ID NO:3和83的肿瘤抑制作用。
图19示出了在安乐死后由H358形成的肿瘤体积的变化和癌组织的图像。
具体实施方式
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的术语和下面描述的实验方法是本领域熟知且常用的。
诸位发明人注意到以下事实：即使靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段到达癌细胞，它们也不能充分作用于癌细胞。因此，诸位发明人生产了这样的融合蛋白，其中抗体或其单链可变片段与癌细胞穿透肽连接。为了产生融合蛋白，将接头引入靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段的N末端或C末端，并且将癌细胞穿透肽与其连接。通过以下两种不同方法中的任一种产生此融合蛋白：基因表达方法和化学缀合方法。在使用如上所述产生的融合蛋白进行的癌细胞杀伤实验中，证实包含癌细胞穿透肽的融合蛋白展现出比单独的靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段显著更好的癌细胞特异性作用。
因此，在一个方面，本发明涉及这样的融合蛋白，其中(i)靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段与(ii)癌细胞穿透肽连接。
在本发明中，细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白可以是KRAS或雄激素受体，但不限于此。
在本发明中，抗体或其单链可变片段可以选自SEQ ID NO:1至3，但不限于此。
在一个实施方案中，单链可变片段可以是由以下SEQ ID NO:1表示的KRAS突变体scFv。
SEQ ID NO:1
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKAT
LTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSG
GGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQP
PKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGG
TKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
这里，MAWVWTLLFLMAAAQSIQA是信号肽，信号肽后面的氨基酸序列是可变重链(VH)区，GGGGSGKGGSGGGGSGGGGS是接头，并且接头后面的氨基酸序列是可变轻链(VL)区。信号肽也可以被已知序列(如MTRLTVLALLAGLLASSRA或MKWVTFISLLFLFSSAYS)替代。
在另一个实施方案中，单链可变片段可以是由以下SEQ ID NO:2表示的KRAS突变体scFv。
SEQ ID NO:2
MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPG
NGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTT
VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIY
LTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQN
DYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH
MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI是信号肽，信号肽后面的氨基酸序列是可变重链(VH)区，GGGGSGGGGSGGGGS是接头，并且接头后面的氨基酸序列是可变轻链(VL)区。
在另一个实施方案中，单链可变片段可以是由以下SEQ ID NO:3表示的KRAS突变体scFv。
SEQ ID NO:3
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKAT
LTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSG
GGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQP
PKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGG
TKCLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:1相同，不同之处在于在VL后引入了半胱氨酸。
在本发明中，癌细胞穿透肽可以选自CCPP1(H4K)、CCPP2(H4P)、CCPP3(LMWP)和CCPP4(hBD3-3)，但不限于此。癌细胞穿透肽可以选自SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:89，但不限于此。
在本发明中，癌细胞穿透肽可以经由接头与抗体或其单链可变片段的N末端或C末端连接。
在本发明中，接头用于提供这样的空间，使得癌细胞穿透肽和抗体或其单链可变片段当连接在一起时可以单独形成功能结构。接头优选地是包含氨基酸G和S的适当组合的肽接头。这里，更优选地，氨基酸残基G的数量为从3至20，并且氨基酸残基S的数量为从1至5，但是本发明不限于此。最优选地，接头是GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明中，当接头和癌细胞穿透肽连接在一起时，它们可以由SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:11中任一个的氨基酸序列表示，而不限于此。在这种情况下，由SEQ ID NO:4至7的氨基酸序列中的任一个表示的融合肽优选地与单链可变片段的C末端连接，并且由SEQID NO:8至11中任一个的氨基酸序列表示的融合肽优选地与单链可变片段的N末端连接。在另一个实施方案中，由SEQ ID NO:4至11中任一个的氨基酸序列表示的融合肽可以进一步结合至连接抗体的单链片段的重链与轻链的接头。另一方面，当由SEQ ID NO:4至11的氨基酸序列中的任一个表示的融合肽与抗体连接时，它优选地与存在于Fc区中的糖结构连接。
在本发明中，抗体或其单链可变片段与癌细胞穿透肽可以通过化学缀合方法连接在一起。在这种情况下，融合蛋白可以由SEQ ID NO:68至83中任一个的氨基酸序列表示，但不限于此。
在本发明中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中选自SEQ ID NO:86至89的任一个的癌细胞穿透肽经由接头与选自SEQ ID NO:1至3的任一个的单链可变片段的赖氨酸或半胱氨酸残基连接。
在本发明中，接头可以是CGGGGG或CGGGGGSSGGGGG。
在本发明中，抗体或其单链可变片段与癌细胞穿透肽可以通过基因表达方法连接在一起并表达。在这种情况下，融合蛋白可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并且可以由SEQ ID NO:12至27中任一个的氨基酸序列表示，而不限于此。此外，融合蛋白可以在哺乳动物细胞中表达，并且可以由SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:90至SEQ IDNO:93中任一个的氨基酸序列表示，而不限于此。
例如，癌细胞穿透肽和接头可以与靶向KRAS突变蛋白的单链可变片段(SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:3中的任一个)的N末端连接，或者癌细胞穿透肽和接头可以与单链可变片段的N末端连接。在下面的实施例中的表2至表5中具体描述了与之相关的各种实施方案。
在本发明中，融合蛋白可以由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68至SEQID NO:83和SEQ ID NO:90至SEQ ID NO:93的氨基酸序列中的任一个表示。
在本发明中，融合蛋白可以通过基因表达方法或化学缀合方法产生，但是产生方法不限于此。
当通过基因表达方法产生融合蛋白时，可以使用既表达(i)靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段，又表达(ii)癌细胞穿透肽的载体。在这种情况下，用于表达的载体可以进一步含有在抗体或其单链可变片段与癌细胞穿透肽之间的接头序列。可以使用pET载体、pcDNA 3.4、pcDNA3.1、pcDNA3.1-TOPO、pcDNA3.4-TOPO、pSecTag载体等，但是载体不限于此。在本发明中，使用pET载体在大肠杆菌(E.coli)中进行表达，并且使用pcDNA3.1-TOPO或pcDNA3.4-TOPO载体在哺乳动物细胞中进行表达。
因此，在另一个方面，本发明涉及编码融合蛋白的核酸。
本发明还涉及已经引入核酸的重组载体。
本发明还涉及已经引入重组载体的重组细胞。
在本发明中，重组细胞可以是大肠杆菌或哺乳动物细胞，但不限于此。
可以在本发明中使用的优选哺乳动物细胞系的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞(HEK293)等。
本发明还涉及用于产生融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过培养重组细胞表达融合蛋白；以及(b)回收所表达的融合蛋白。
另一方面，在本发明中，可以表达并纯化靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段，然后通过化学缀合方法将癌细胞穿透肽引入其中。
癌细胞穿透肽可以经由接头和交联剂与抗体或其单链可变片段连接。作为接头，可以使用任何接头，只要它可以提供能够形成功能结构的空间即可。例如，接头可以是天然和/或合成来源的肽接头。天然和/或合成来源的肽接头可以包括由1至50个氨基酸组成的氨基酸链，并且可以包含重复氨基酸序列或天然存在的多肽(如具有铰链功能的多肽)的序列。在另一个实施方案中，肽接头氨基酸序列可以是被指定为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成接头氨基酸序列”。这些残基可以以多达五个氨基酸的小重复单元排列，并且小重复单元可以重复以形成多聚体单元。在多聚体单元的氨基末端和/或羧基末端，可以添加多达六个另外的任意天然存在的氨基酸。其他合成肽接头可以由重复10至20次之间的单个氨基酸构成，并且在氨基末端和/或羧基末端可以包含多达六个另外的任意天然存在的氨基酸。另一方面，接头可以呈氨基酸被化学修饰的形式。例如，接头可以呈作为封闭基团的Fmoc-(9-芴基甲氧基羰基)所键合的Fmoc-6-氨基己酸的形式，但是接头不限于此。
在本发明的一些实施方案中，癌细胞穿透肽和接头连接在一起的融合肽可以由SEQ ID NO:60至67中任一个的氨基酸序列表示。在这种情况下，位于癌细胞穿透肽的N末端的半胱氨酸的巯基可以与SEQ ID NO:1的接头部分中的赖氨酸的胺基或三维结构的暴露部分中的赖氨酸的胺基连接。
在这种情况下，可以使用的交联剂的例子包括但不限于1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,11-双-马来酰亚胺基四乙二醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯]](SMCC)及其磺酸酯(磺基-SMCC)、6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)及其磺酸酯(磺基-SPDP)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)及其磺酸酯(磺基-MBS)、[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯](SMPB)及其磺酸酯(磺基-SMPB)等。
此外，在将SEQ ID NO:3的C末端的半胱氨酸的巯基还原后可以与位于由SEQ IDNO:60至67所表示的任何一个氨基酸序列表示的融合肽的N末端的半胱氨酸的巯基连接的交联剂可以是三(2-羧乙基)膦(TCEP)、5,50-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等，但不限于此。
在本发明中，使用化学缀合方法产生融合蛋白的方法包括以下步骤：
(a)用交联剂活化赖氨酸的胺基，所述赖氨酸存在于靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段的接头部分或暴露部分中；
(b)将癌细胞穿透肽与用交联剂活化的抗体或其单链可变片段连接；以及
(c)纯化这样的融合蛋白，其中癌细胞穿透肽与抗体或其单链可变片段连接。
可替代地，以上方法的步骤(a)可以是还原靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段的半胱氨酸残基的巯基的步骤。
通过化学缀合方法产生的融合蛋白可以由SEQ ID NO:68至83中任一个的氨基酸序列表示，但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中癌细胞穿透肽经由交联剂与靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段的赖氨酸或半胱氨酸残基连接。
优选地，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中选自SEQ ID NO:60至67的融合肽通过交联剂化学结合至选自SEQ ID NO:1至3的任何一个单链可变片段的赖氨酸或半胱氨酸残基。
在残基是赖氨酸的情况下，交联剂可以选自1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,11-双-马来酰亚胺基四乙二醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯]](SMCC)及其磺酸酯(磺基-SMCC)、6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)及其磺酸酯(磺基-SPDP)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)及其磺酸酯(磺基-MBS)和[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯](SMPB)及其磺酸酯(磺基-SMPB)。
另一方面，当残基是半胱氨酸时，交联剂可以是三(2-羧乙基)膦(TCEP)或5,50-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
根据本发明的KRAS突变蛋白作为肿瘤发生中的重要因子而已知，其加速癌细胞的生长，但是存在于细胞膜内，因此靶向KRAS突变蛋白的抗体或其单链可变片段对KRAS突变蛋白没有显著的抑制作用。然而，作为评价在其中引入癌细胞穿透肽后KRAS突变体靶向抗体或其单链可变片段的肿瘤生长抑制作用的结果，根据体外实验和动物实验的结果证实，具有癌细胞穿透能力的KRAS突变体靶向抗体或单链可变片段具有显著抑制肿瘤细胞生长的作用。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含融合蛋白作为活性成分。
在本发明中，肿瘤可以是选自以下的至少一种：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、脑瘤、皮肤癌、黑色素瘤、结直肠癌、前列腺癌和血癌，但不限于此。
在本发明中，药物组合物可以被配制成选自以下的任何一种形式：液体配制品(例如，用于注射)(如注射剂、用于口服施用的配制品、水性溶液、混悬剂和乳剂)、胶囊剂、颗粒剂、片剂和用于粘膜施用的配制品，但不限于此。这些配制品可以通过本领域用于配制的常规方法或通过Remington's Pharmaceutical Science(最新版),Mack PublishingCompany,Easton Pa中披露的方法来制备，并且可以根据每种疾病或组分而变化。
另一方面，除了具有穿透癌细胞和靶向KRAS突变蛋白的能力的抗体或其单链可变片段之外，本发明的药物组合物还可以进一步包含至少一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是选自以下的至少一种：盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其组合。
如果需要，本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的佐剂。佐剂可以是选自以下的一种或多种：赋形剂、稀释剂、分散剂、缓冲剂、抗微生物防腐剂、抑菌剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、增稠剂和粘度调节剂，但不限于此。
根据本发明的药物组合物可以根据所需方法口服或肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用，并且其剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、施用时间、施用方式、排泄速率和疾病的严重程度而变化且可以由专家确定。
在本发明的一个实施方案中，肽的单次剂量可以是1μg/kg至100mg/kg、优选5μg/kg至50mg/kg，并且可以每天施用一次或每周施用1至3次，但是剂量和给药频率不限于此
在另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括施用融合蛋白的步骤。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白用于预防或治疗肿瘤的用途。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白在制造用于治疗肿瘤的药物中的用途。
实施例在下文中，将参考实施例更加详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域普通技术人员而言将明显的是，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
实施例1：通过蛋白质表达方法制备穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的scFv
实施例1-1：在大肠杆菌中表达穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的scFv
通过使用特异性引物的PCR方法制备KRAS突变体scFv表达载体，每种载体都包含KRAS突变体scFv和癌细胞穿透肽。在本发明中使用的KRAS突变体scFv是SEQ ID NO:1至3中的任一个。
KRAS突变体scFv(SEQ ID NO:1)：
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKAT
LTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
KRAS突变体scFv(SEQ ID NO:2)：
MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPG
NGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH
KRAS突变体scFv(SEQ ID NO:3)：
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKAT
LTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKCLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
用Nde I和Xho I消化pET 21a(+)DNA，并且也用Nde I和Xho I消化pMX DNA。通过琼脂糖电洗脱方法回收767bp的Kras scFv基因片段。为了将基因片段插入pET 21a(+)载体中，通过PCR扩增该基因。使用正向引物(5'-AAGGAGATATACATATGATGGCATGGGTTTGGAC-3')和反向引物(5'-AGCCCGAAGGGAATTCATTTGCAGATACAAAGTGTTTTTAGAGTTG-3')进行PCR。将每种消化的载体和插入物以0.5μg:1.0μg的比率混合在一起，并且在4℃下使用在包含500mMTris-HCl、100mM MgCl2、200mM DTT和10mM ATP的连接缓冲液中的T4 DNA连接酶连接在一起持续16至18小时。
将重组DNA溶液转化到大肠杆菌DH5a中并铺板在LB+Amp固体培养基上，并且选择转化体。
将用每种质粒转化的大肠杆菌RosettaTM 2(DE3)SinglesTM(Novagen)菌株的单菌落接种到20ml包含10μg/ml氨苄青霉素抗生素的LB中，并且在37℃下培养过夜。在200ml包含相同浓度的抗生素的新鲜LB中稀释1ml培养物。通过以下方式诱导KRAS scFv的表达：在0.8的OD600值下向细胞中添加IPTG至终浓度为1mM，然后培养过夜。通过离心收获细胞，并且将其使用10ml裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl，pH 8.0)裂解。在对细胞进行超声处理后，通过在12,000g和4℃下离心10分钟将蛋白质分离为总部分、可溶性部分和不溶性部分，并且通过SDS-PAGE进行分析(S.I.Choi等人,Protein solubility and foldingenhancement by interaction with RNA,PLoS ONE 3(2008)e2677)。
分离所分离的KRAS scFv，并且通过镍色谱法(HisTrapTM excel试剂盒，GEHealthcare)对其进行纯化。接下来，用缓冲液[50mM NaH2PO4(pH 8.0)、300mM NaCl]平衡镍柱，然后将相同缓冲液中的蛋白质水溶液施加到柱上。在用含有20mM咪唑的以上缓冲液洗涤后，使用含有从50mM逐渐增加到500mM的咪唑的缓冲液分离蛋白质。收集分离的蛋白质，并且使用脱盐柱(PD-10柱，GE Healthcare)对其进行透析。
在本发明中使用的接头和癌细胞穿透肽序列示于下表1中。
[表1]
Figure BDA0004113235070000091
下表2示出了用于大肠杆菌表达的融合蛋白的氨基酸序列，在所述融合蛋白中癌细胞穿透肽和KRAS突变体scFv连接在一起。
[表2]
Figure BDA0004113235070000092
Figure BDA0004113235070000101
Figure BDA0004113235070000111
图3(A)示出了SEQ ID NO:1、2和3的纯化的KRAS突变体靶向抗体或单链可变片段的SDS-PAGE和免疫印迹分析的结果。
实施例1-2：在哺乳动物细胞中表达穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的scFv
通过使用特异性引物的PCR方法构建用于在哺乳动物细胞中使用的KRAS突变体scFv表达载体(各自含有KRAS突变体scFv和癌细胞穿透肽)。
下表3示出了融合蛋白的氨基酸序列，在所述融合蛋白中癌细胞穿透肽与KRAS突变体scFv连接，并且各自被克隆到pcDNA3.4-TOPO载体中用于哺乳动物细胞表达。
[表3]
Figure BDA0004113235070000112
Figure BDA0004113235070000121
Figure BDA0004113235070000131
下表4示出了融合蛋白的氨基酸序列，在所述融合蛋白中癌细胞穿透肽与KRAS突变体scFv连接，并且各自被克隆到pcDNA3.1-TOPO载体中用于哺乳动物细胞表达。
[表4]
Figure BDA0004113235070000141
Figure BDA0004113235070000151
下表5示出了融合蛋白的氨基酸序列，在所述融合蛋白中癌细胞穿透肽与KRAS突变体scFv连接，并且各自被克隆到pcDNA3.4-TOPO中用于哺乳动物细胞表达。
[表5]
Figure BDA0004113235070000161
用EcoR I和BamH I消化pcDNA3.1-TOPO或pcDNA3.4-TOPO。通过琼脂糖电洗脱方法回收900-960bp的KRAS突变体scFv基因片段。为了将基因片段插入pcDNA3.1-TOPO和pcDNA3.4-TOPO载体中，通过PCR扩增该基因，同时合成BamH I和EcoR I限制性酶切位点。将每种消化的载体和插入物以4μl:4μl的比率混合在一起，并且在4℃下使用在含有500mMTris-HCl、100mM MgCl2、200mM DTT和10mM ATP的连接缓冲液中的T4 DNA连接酶连接在一起持续16至18小时。
诸位发明人将制备的载体转化到中国仓鼠卵巢细胞系Expi-CHO-S和人胚肾细胞系Expi-293F中。中国仓鼠卵巢细胞系ExpiCHO-S获自Thermo Fisher Scientific(美国)，并且在ExpiCHO表达培养基(GIBCO，美国)中培养。
接下来，将ExpiCHO-S细胞系(3X 108个细胞)添加到250mL一次性锥形瓶中的50mL培养基中。将160μL在1.84mL Opti-MEM中稀释的ExpiFectamine CHO试剂(Gibco，目录号A20130)添加到2mL含有50μg质粒的Opti-MEM中，然后在室温下孵育5分钟。接下来，将稀释液均匀地滴加到制备的中国仓鼠卵巢细胞中，然后在37℃下在8％ CO2培养箱中孵育18小时，然后向其中添加300μL ExpiCHO增强剂和12mL ExpiCHO饲料并孵育5天。
人胚肾细胞系Expi-293F获自Thermo Fisher Scientific(美国)，并且在Expi293表达培养基(GIBCO，美国)中培养。接下来，将Expi-293F细胞系(1.50X 107个细胞)添加到250mL一次性锥形瓶中的50mL培养基中。将160μL在2.8mL Opti-MEM中稀释的ExpiFectamine 293试剂(Gibco，目录号A14525)(Gibco，目录号A14525)添加到3mL含有50μg质粒的Opti-MEM中，然后在室温下静态孵育20分钟。接下来，将稀释液均匀地滴加到制备的人胚肾细胞中，然后在37℃下在8％ CO2培养箱中孵育18小时，然后向其中添加300μLExpiFectamine 293转染增强剂1和3mL ExpiFectamine 293转染增强剂2并孵育3天。
在转导后六天，收集培养基，将其灭菌，然后使用FPLC纯化。在使用镍色谱柱(HisTrapTM excel，GE Healthcare)分离和纯化后，用缓冲液[20mM磷酸钠、0.5M NaCl，pH7.4]平衡镍柱，然后将培养基施加到柱上。在使用含有25mM咪唑的以上缓冲液洗涤后，通过将咪唑逐渐增加到125mM来分离蛋白质。在通过脱盐除去咪唑后，储存分离的蛋白质。
图3示出了在pcDNA3.4-TOPO(图3(B))和pcDNA3.1-TOPO(图3(C))中表达和纯化的穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的SDS-PAGE和免疫印迹分析的结果。
实施例2：通过化学缀合产生癌细胞穿透肽和抗KRAS突变体单链可变片段(scFv)
实施例2-1：细胞穿透肽的合成
下表6示出了在化学缀合方法中使用的癌细胞穿透肽和接头的氨基酸序列。
[表6]
接头类型 癌细胞穿透肽(CCPP) 接头和癌细胞穿透肽的序列和SEQ ID NO
CGGGGG CCPP1(H4K) 60：CGGGGG-HRRCNKNNKKR
CCPP2(H4P) 61：CGGGGG-HRRCNPNNKKR
CCPP3(LMWP) 62：CGGGGG-VSRRRRRRGGRRRR
CCPP4(hBD3-3) 63：CGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK
CGGGGGSSGGGGG CCPP1(H4K) 64：CGGGGGSSGGGGG-RKKNNKNCRRH
CCPP2(H4P) 65：CGGGGGSSGGGGG-RKKNNPNCRRH
CCPP3(LMWP) 66：CGGGGGSSGGGGG-RRRRGGRRRRRRSV
CCPP4(hBD3-3) 67：CGGGGGSSGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK
用于合成的氨基酸和试剂购自GL Biochem和Sigma-Aldrich。使用反应容器通过F-moc固态化学合成方法从C末端开始合成肽。也就是说，使用作为封闭基团的Fmoc-(9-芴基甲氧基羰基)所结合的Rink酰胺MBHA树脂(0.678mmol/g，100至200目)合成肽。在将1gRink酰胺MBHA树脂置于反应容器中后，用DMF使树脂溶胀，然后使用20％哌啶/DMF溶液除去Fmoc基团。根据从C末端开始的序列，以5当量、10当量和5当量的量分别添加0.5M氨基酸溶液(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)、1.0M DIPEA(溶剂：二甲基甲酰胺和n-甲基吡咯烷酮，DMF和NMP)、0.5M HBTU(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)，并且使其在氮气气氛下反应1至2小时。在每个脱保护和偶联步骤后，用DMF和甲醇洗涤三次。即使在偶联最后一个氨基酸后，也进行脱保护以除去Fmoc基团。
使用茚三酮测试方法确认合成。将通过测试确认完全合成的树脂真空干燥，并且以10ml/g树脂的量向其中添加三氟乙酸(TFA)切割混合物，然后振荡3小时。然后，通过过滤将含有溶解在其中的肽的混合物与树脂分离。通过将过滤的溶液置于冷醚中或将过量的冷醚直接添加到含有溶解在其中的肽的TFA混合物溶液中使肽结晶成固态，并且通过离心收集肽。此时，通过用醚洗涤数次和离心完全除去TFA混合物。将如此获得的肽真空干燥。
通过高效液相色谱法(Shimadzu，日本)分离并纯化合成的肽。使用C18柱(直径：4.6mm)通过以从5％至45％的梯度在1ml/min的流速下运行0.1％ TFA/H2O和0.1％ TFA/乙腈进行分析，并且将UV检测器的波长设置为220nm。在与以上相同的溶剂和检测波长条件下，在50ml/min的流速下使用柱(直径：50mm)纯化。通过质谱法分析纯化的肽的分子量。
实施例2-2：癌细胞穿透肽与KRAS突变体靶向scFv的接头部分的化学缀合以及纯 化
将1.02mg SEQ ID NO:1的KRAS scFv溶解在1mL PBS缓冲液(pH 8.3)中。将2.12mgSPDP(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯，ThermoFisher，21857)溶解在120μL DMSO(二甲亚砜)中。将40μL SPDP溶液添加到KRAS scFv溶液中并允许在遮光条件下反应1小时，并且将此添加和反应过程重复三次。可替代地，将2mg磺基-SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯，ThermoFisher，22322)溶解在PBS中。将40μL磺基-SMCC溶液添加到KRAS scFv溶液中并允许在遮光条件下反应1小时，并且将此添加和反应过程重复三次。
在反应完成后，使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)脱盐，并且获得3.5mL吡啶基二硫醇活化的KRAS scFv。向吡啶基二硫醇活化的KRAS scFv中添加2.5mg Cys-G5-H4K(SEQID NO:60)、Cys-G5-H4P(SEQ ID NO:61)、Cys-G5-LMWP(SEQ ID NO:62)、Cys-G5-hBD3-3(SEQ ID NO:63)、Cys-G5S2G5-H4K(SEQ ID NO:64)、Cys-G5S2G5-H4P(SEQ ID NO:65)、Cys-G5S2G5-LMWP(SEQ ID NO:66)和Cys-G5S2G5-hBD3-3(SEQ ID NO:67)中的每一种在300μL三次蒸馏水中的溶液，并且使用1M tris缓冲液(pH＝9)将每种混合物调节至pH 8.3。允许每种混合物在遮光条件下在4℃下反应过夜。使用肝素柱(HiTrap，GE Healthcare)通过FPLC(Akta Pure，GE Healthcare)纯化其上结合有每种癌细胞穿透肽的KRAS突变体scFv。
将1.02mg SEQ ID NO:1的scFv溶解在1mL PBS缓冲液(pH 7.4)中。将2.98mg磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯，ThermoFisher，目录号22322)溶解在300μL三次蒸馏水中。将100μL磺基-SMCC溶液添加到scFv溶液中并允许在遮光条件下反应30分钟，并且将此添加和反应过程重复三次。在反应完成后，使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare，17-0851-01)脱盐，并且获得3.5mL马来酰亚胺活化的scFv。向马来酰亚胺活化的scFv中添加2.5mg Cys-G5-H4K(SEQ ID NO:60)、Cys-G5-H4P(SEQ ID NO:61)、Cys-G5-LMWP(SEQ ID NO:62)、Cys-G5-hBD3-3(SEQ ID NO:63)、Cys-G5S2G5-H4K(SEQ IDNO:64)、Cys-G5S2G5-H4P(SEQ ID NO:65)、Cys-G5S2G5-LMWP(SEQ ID NO:66)和Cys-G5S2G5-hBD3-3(SEQ ID NO:67)中的每一种在300μLPBS缓冲液(pH 8.3)中的溶液，并且将每种混合物调节至pH 7.0至7.5。允许每种混合物在遮光条件下在4℃下反应过夜。使用肝素柱(HiTrap，GE Healthcare)通过FPLC(Akta Pure，GE healthcare)纯化其上结合有每种癌细胞穿透肽的scFv。
图4示出了通过化学缀合方法产生的穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体或单链可变片段的SDS-PAGE和免疫印迹分析的结果。
SEQ ID NO:1的KRAS突变体scFv的分子量为约30kDa，并且测得其上结合有癌细胞穿透肽的KRAS突变体scFv的分子量为约32kDa。此外，对于SEQ ID NO:1的scFv，测得在免疫印迹中结合至KRAS抗体的条带的分子量为30kDa，并且对于其上结合有癌细胞穿透肽的scFv，测得分子量为约32kDa，表明肽结合至scFv。
实施例2-3：癌细胞穿透肽与KRAS突变体scFv的C末端的化学缀合以及纯化
允许SEQ ID NO:3的KRAS突变体scFv与20摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)在室温下反应3小时以形成游离硫醇基团。将100摩尔当量的5,50-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)添加到KRAS突变体scFv溶液中，并且在室温下反应1小时以便与游离硫醇基团结合。使用肝素柱(HiTrap，GE Healthcare)通过FPLC(Akta Pure，GE healthcare)除去未结合至KRAS突变体scFv的过量DTNB。此后，允许KRAS突变体scFv-DTNB缀合物与10摩尔当量的每种癌细胞穿透肽(SEQ ID NO:60至67)在室温下反应1小时。使用肝素柱(HiTrap，GEHealthcare)通过FPLC(Akta Pure，GE healthcare)纯化其上结合有每种癌细胞穿透肽的scFv。
下表7示出了融合蛋白的氨基酸序列，在所述融合蛋白中癌细胞穿透肽与KRAS突变体scFv连接，并且通过化学缀合法产生。
[表7]
Figure BDA0004113235070000181
Figure BDA0004113235070000191
Figure BDA0004113235070000201
Figure BDA0004113235070000211
实施例3：针对具有不同KRAS突变体表达水平的癌细胞的抑制活性的评价
为了评价根据本发明的穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的癌细胞特异性生长抑制活性，将H358细胞(表达KRAS突变体的癌细胞)或人真皮成纤维细胞(正常细胞)以5x 103个细胞/孔的密度分配到96孔板中，然后在RPMI培养基1640(Gibco)中培养24小时。用浓度为5μM的每种scFv(SEQ ID NO:1和28至35)处理细胞。使用CCK-8(细胞计数试剂盒-8，CK04，Dojindo Lab.)测量细胞毒性。在用每种scFv处理后48小时，除去培养基，并且将100μl CCK-8溶液分配到新鲜RPMI培养基1640中。在1小时30分钟后，测量450nm处的吸光度。
结果，如图5所示，证实SEQ ID NO:28至31、68和69在H358细胞中显示出100至500nM的IC50值(50％细胞被杀死时的浓度)，并且对于SEQ ID NO:1，即使在5μM的浓度下也测量不到IC50值。这被认为是因为SEQ ID NO:1因无法穿透癌细胞而没有显示出癌细胞杀伤作用，但是SEQ ID NO:28至31、68和69因能够穿透癌细胞而展现出细胞毒性。对于作为正常细胞的人真皮成纤维细胞，SEQ ID NO:28至31、68和69在所有浓度下都显示出80％或更高的细胞活力。这意味着穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的scFv缀合物具有癌细胞特异性细胞毒性。
实施例4：穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的活性KRAS(突变KRAS)表达抑制活性的评价
接种1.0x 106个H358细胞(ATCC，CRL-5807)，并且将其在RPMI培养基1640(1X)(Gibco，22400-089)中培养24小时，然后饥饿16小时。将细胞用50ng/mL EGF(上皮生长因子，R&D Systems，236-EG)处理10分钟，并且用1μM的每种变体进行处理。在24小时后，除去培养基，用PBS洗涤每个孔，并且收获细胞并将其以1,500rpm离心3分钟。将150μL 1x裂解缓冲液(1X裂解/结合/洗涤缓冲液，11524S)添加到细胞中并与其混合，并且在冰上保持5分钟。通过在4℃下以16,000rpm离心15分钟分离上清液。通过BCA测定法(ThermoScientific，23227)测量蛋白质浓度。用400μL 1x裂解缓冲液洗涤，并且在6000x g下离心两次，每次15秒。
为了分离突变KRAS，使用活性GTP酶试剂盒(Cell Signaling，11860S)添加80μgGST-Raf1-RBD，并且将500μg蛋白质分配到旋杯中。在4℃下孵育1小时后，在6000x g下离心15秒，然后将柱转移到新鲜管中，并且向其中添加400μL 1x裂解缓冲液。在6000x g下离心15秒后，将柱转移到新鲜管中，并且向其中添加50μL 2x SDS缓冲液(含有200μl 5XSDS样品上样染料和300μl水)并反应2分钟。在6000x g下离心2分钟后，将所得溶液在100℃下保持7分钟。通过11％ SDS-PAGE电泳分离蛋白质(20μl蛋白质上样量/泳道)，并且将其转移到硝酸纤维素膜上。为了测量作为KRAS下游信号的ERK1/2，将30μg蛋白质通过11％ SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上。将膜用T-TBS中的5％脱脂乳封闭1小时，并且与一抗(在T-TBS中以1:1000稀释)在4℃下一起倒置孵育过夜。将膜用T-TBS洗涤3次，每次洗涤10分钟，并且与二抗(在T-TBS中以1:3000稀释)在室温下一起倒置孵育1小时。将膜用T-TBS洗涤3次，每次洗涤10分钟，与ECL化学发光底物(Thermo，34580)一起孵育，并且用Amersham成像仪680(GE)可视化。关于所使用的抗体的信息示于下表8中。
[表8]
编号 抗体名称 制造商 目录号
1 GST Abcam Ab19256
2 活性KRAS Santa Cruz SC-30
3 RAS(E4K9L) Cell Signaling 91054S
4 p-B-Raf(S445) Cell Signaling 2696S
5 p-MEK1/2(S221) Cell Signaling 2338S
6 p-Erk1/2 Santa Cruz SC-7383
7 GAPDH Cell Signaling 2118S
8 山羊抗兔IgG BETHYL A120-101P
9 山羊抗小鼠IgG BETHYL A90-116P
在SEQ ID NO:20至23中，KRAS突变体靶向抗体或scFv与细胞穿透肽之间的接头是GGGGS，并且SEQ ID NO:90至93在中，接头是GGGGSGGGGSGGGGS。
结果，如图6所示，证实与单独用EGF处理相比，SEQ ID NO:20至23都使活性KRAS降低。此外，可以看出，作为KRAS下游信号的pERK1/2也被SEQ ID NO:20至23降低。
如图7所示，证实与单独用EGF处理相比，SEQ ID NO:90至93都使活性KRAS降低。此外，可以看出，作为KRAS下游信号的pERK1/2也被SEQ ID NO:91至92降低。
实施例5：穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的细胞穿透能力的评价
为了测试抗体或scFv的癌细胞穿透能力，接种1x 105个H358细胞，并且在48小时后，向其中以500nM的浓度添加SEQ ID NO:20至23中的每一种，并且将细胞培养30分钟。将细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％ Triton-X100透化10分钟，并且用2％ BSA封闭。使细胞中的KRAS与抗RAS抗体(Origene，cst53270)以1:1,000的稀释比反应，并且与二抗抗兔Alexa Fluor 488(Invitrogen，A27034)以1:2,000的稀释比反应。使SEQ ID NO:20至23中的每一种与V5-Tag抗体(Origene，cst 13202)以1:1,000的稀释比反应，并且与抗小鼠Alexa Fluor 555(Invitrogene，A28180)以1:1,000的稀释比反应。用0.1μg/mL DAPI(Thermofisher，R37606)对细胞核染色。用共聚焦激光扫描显微镜测量穿透细胞的SEQ IDNO:20至23。
结果，如图8所示，可以看出，除SEQ ID NO:2外，SEQ ID NO:20至23全部都穿透细胞。此外，可以看出，SEQ ID NO:20至23与存在于癌细胞中的KRAS共定位。因此，可以看出，SEQ ID NO:20至23可以穿透细胞并与存在于细胞中的KRAS结合。
实施例6：在肿瘤异种移植物动物模型中穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv在癌组织中的分布的评价
将1x 106个H358细胞和100μl基质胶(BD Bioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)的混合物移植到每只5-6周龄雌性Balb/c裸鼠(5-6周龄；Japan SLC Inc.，日本滨松)的大腿中，以形成体积为100mm3的肿瘤。以20μg/小鼠的剂量腹膜内注射Cy5.5标记的SEQIDNO:2、Cy5.5标记的SEQ ID NO:23和Cy5.5中的每一种，并且在24小时后，观察荧光在每种主要器官和癌组织中的分布。
结果，如图9所示，可以看出，SEQ ID NO:23在注射后24小时主要分布在癌组织中，并且其一部分被肾脏排泄。
此外，如图10所示，可以看出，当测量荧光强度时，SEQ ID NO:23在癌组织中具有最高的荧光强度。
实施例7：在肿瘤异种移植物动物模型中穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的肿瘤抑制活性的评价
将1x 106个H358细胞和100μl基质胶(BD Bioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)的混合物移植到每只5-6周龄雌性Balb/c裸鼠(5-6周龄；Japan SLC Inc.，日本滨松)的大腿中，以形成体积为100mm3的肿瘤。以1mg/kg的剂量每周两次腹膜内注射SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:23中的每一种，持续30天。用游标卡尺以3至4天的间隔测量肿瘤的体积，并且在第30天，对小鼠实施安乐死，并且切除肿瘤并拍照。
结果，如图11和12所示，证实SEQ ID NO:2没有肿瘤抑制作用，但是SEQ ID NO:23具有优异的肿瘤抑制作用。这证明穿透癌组织的SEQ ID NO:23有效地抑制肿瘤细胞的生长。
实施例8：通过化学缀合产生的SEQ ID NO:80至83的融合蛋白的作用
实施例8-1：穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的活性KRAS(突变KRAS) 表达抑制活性的评价
接种1.0x 106个H358细胞(ATCC，CRL-5807)，并且将其在RPMI培养基1640(1X)(Gibco，22400-089)中培养24小时，然后饥饿16小时。将细胞用50ng/mL EGF(上皮生长因子，R&D Systems，236-EG)处理10分钟，并且用1μM的每种变体进行处理。将细胞在37℃下培养24小时。在24小时后，除去培养基，用PBS洗涤每个孔，并且收获细胞并将其以1,500rpm离心3分钟。将150μL 1x裂解缓冲液(1X裂解/结合/洗涤缓冲液，11524S)添加到细胞中并与其混合，并且在冰上保持5分钟。通过在4℃下以16,000rpm离心15分钟分离上清液。通过BCA测定法(Thermo Scientific，23227)测量蛋白质浓度。用400μL 1x裂解缓冲液洗涤，并且在6000x g下离心两次，每次15秒。
为了分离突变KRAS，使用活性GTP酶试剂盒(Cell Signaling，11860S)添加80μgGST-Raf1-RBD，并且将500μg蛋白质分配到旋杯中。在4℃下孵育1小时后，在6000x g下离心15秒，然后将柱转移到新鲜管中，并且向其中添加400μL 1x裂解缓冲液。在6000x g下离心15秒后，将柱转移到新鲜管中，并且向其中添加50μL 2x SDS缓冲液(含有200μl 5XSDS样品上样染料和300μl水)并反应2分钟。在6000x g下离心2分钟后，将所得溶液在100℃下加热7分钟。通过11％ SDS-PAGE电泳分离蛋白质(20μl蛋白质上样量/泳道)，并且将其转移到硝酸纤维素膜上。为了测量作为KRAS下游信号的ERK1/2，将30μg蛋白质通过11％ SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上。将膜用T-TBS中的5％脱脂乳封闭1小时，并且与一抗(在T-TBS中以1:1000稀释)在4℃下一起倒置孵育过夜。将膜用T-TBS洗涤3次，每次洗涤10分钟，并且与二抗(在T-TBS中以1:3000稀释)在室温下一起倒置孵育1小时。将膜用T-TBS洗涤3次，每次洗涤10分钟，与ECL化学发光底物(Thermo，34580)一起孵育，并且用Amersham成像仪680(GE)可视化。关于所使用的抗体的信息示于下表9中。
[表9]所使用的抗体
编号 抗体名称 制造商 目录号
1 GST Abcam Ab19256
2 活性KRAS Santa Cruz SC-30
3 RAS(E4K9L) Cell Signaling 91054S
4 p-B-Raf(S445) Cell Signaling 2696S
5 p-MEK1/2(S221) Cell Signaling 2338S
6 p-Erk1/2 Santa Cruz SC-7383
7 GAPDH Cell Signaling 2118S
8 山羊抗兔IgG BETHYL A120-101P
9 山羊抗小鼠IgG BETHYL A90-116P
通过经由化学缀合将细胞穿透肽与KRAS突变体靶向抗体或scFv连接来产生SEQID NO:80至83。结果，如图13所示，证实与单独用EGF处理相比，SEQ ID NO:80至83都使活性KRAS降低。此外，可以看出，作为KRAS下游信号的pERK1/2也被SEQ ID NO:80至83降低。
实施例8-2：穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv针对具有不同KRAS突变 体表达水平的癌细胞的抑制活性的评价
为了评价根据本发明的穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的癌细胞特异性生长抑制活性，将H358细胞(表达KRAS突变体的癌细胞)或人真皮成纤维细胞(正常细胞)以5x 103个细胞/孔的密度分配到96孔板中，然后在RPMI培养基1640(Gibco)中培养24小时。用浓度为0至5μM的每种scFv(SEQ ID NO:3和80至83)处理细胞。使用CCK-8(细胞计数试剂盒-8，CK04，Dojindo Lab.)测量细胞毒性。使用CCK-8(细胞计数试剂盒-8，CK04，Dojindo Lab.)测量细胞毒性。在用每种scFv处理后48小时，除去培养基，并且将100μlCCK-8溶液分配到新鲜RPMI培养基1640中。在1小时30分钟后，测量450nm处的吸光度。
结果，如图14所示，证实SEQ ID NO:80至83在H358细胞中显示出313至1250nM的IC50值(50％细胞被杀死时的浓度)，并且对于SEQ ID NO:3，即使在5μM的浓度下也测量不到IC50值。这被认为是因为SEQ ID NO:3因无法穿透癌细胞而没有显示出癌细胞杀伤作用，但是SEQ ID NO:80至83因能够穿透癌细胞而展现出细胞毒性。作为正常细胞的人真皮成纤维细胞在所有浓度下都显示出80％或更高的细胞活力。这意味着穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的scFv缀合物具有癌细胞特异性细胞毒性。
实施例8-3：穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体和scFv的细胞穿透能力的评价
为了测试抗体或scFv的癌细胞穿透能力，接种1x 105个H358细胞，并且在48小时后，向其中以500nM的浓度添加SEQ ID NO:80至83中的每一种，并且将细胞培养30分钟。将细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％ Triton-X100透化10分钟，并且用2％ BSA封闭。使细胞中的KRAS与抗RAS抗体(Origene，cst53270)以1:1,000的稀释比反应，并且与二抗抗兔Alexa Fluor 488(Invitrogen，A27034)以1:2,000的稀释比反应。使SEQ ID NO:80至83中的每一种与V5-Tag抗体(Origene，cst 13202)以1:1,000的稀释比反应，并且与抗小鼠Alexa Fluor 555(Invitrogene，A28180)以1:1,000的稀释比反应。用0.1μg/mL DAPI(Thermofisher，R37606)对细胞核染色。用共聚焦激光扫描显微镜测量穿透细胞的SEQ IDNO:80至83。
结果，如图15所示，可以看出，除SEQ ID NO:3外，SEQ ID NO:80至83全部都穿透细胞。此外，可以看出，SEQ ID NO:80至83与存在于癌细胞中的KRAS共定位。因此，可以看出，SEQ ID NO:80至83可以穿透细胞并与存在于细胞中的KRAS结合。
实施例8-4：在肿瘤异种移植物动物模型中穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体 和scFv在癌组织中的分布的评价
将1x 106个H358细胞和100μl基质胶(BD Bioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)的混合物移植到每只5-6周龄雌性Balb/c裸鼠(5-6周龄；Japan SLC Inc.，日本滨松)的大腿中，以形成体积为100mm3的肿瘤。以20μg/小鼠的剂量腹膜内注射Cy5.5标记的SEQIDNO:3、Cy5.5标记的SEQ ID NO:83和Cy5.5中的每一种，并且在24小时后，观察所分布的荧光在每种主要器官和癌组织中的分布。
结果，如图16所示，可以看出，SEQ ID NO:83在注射后24小时主要分布在癌组织中，并且其一部分被肾脏排泄。
此外，如图17所示，可以看出，当测量荧光强度时，SEQ ID NO:83在癌组织中具有最高的荧光强度。
实施例8-5：在肿瘤异种移植物动物模型中穿透癌细胞且靶向KRAS突变体的抗体 和scFv的肿瘤抑制活性的评价
将1x 106个H358细胞和100μl基质胶(BD Bioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)的混合物移植到每只5-6周龄雌性Balb/c裸鼠(5-6周龄；Japan SLC Inc.，日本滨松)的大腿中，以形成体积为100mm3的肿瘤。以1mg/kg的剂量每周两次腹膜内注射SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:83中的每一种，持续30天。用游标卡尺以3至4天的间隔测量肿瘤的体积，并且在第30天，对小鼠实施安乐死，并且切除肿瘤并拍照。
结果，如图18和19所示，证实SEQ ID NO:3没有肿瘤抑制作用，但是SEQ ID NO:83具有优异的肿瘤抑制作用。这证明穿透癌组织的SEQ ID NO:83有效地抑制肿瘤细胞的生长。
尽管已经参考具体特征详细地描述了本发明，但对于本领域技术人员而言将清楚的是，此描述仅是本发明的优选实施方案的描述，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同方案限定。
工业实用性
细胞内致癌蛋白或其突变体充当肿瘤发病机制中的重要因子。在本发明中，使用细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白靶向抗体或其单链可变片段，它们通过与其结合来抑制细胞内致癌蛋白或其突变体的功能。为了增强抗体或其单链可变片段对癌细胞的可及性，将癌细胞穿透肽与抗体或其单链可变片段连接。如上所述产生的融合蛋白可以有效地穿透肿瘤细胞，从而最大化靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段的抗肿瘤或抗癌作用。
序列表自由文本
附有电子文件。
　　<110> 纳米智能生物医学工程有限公司
　　<120> 靶向细胞内诱瘤蛋白的抗体、或其单链可变片段与癌细胞穿透肽的融合蛋白、及其用途
　　<130> PP-B2659
　　<160> 93
　　<170> KoPatentIn 3.0
　　<210> 1
　　<211> 271
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> KRAS mutant scfv
　　<400> 1
　　Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
　　1 5 10 15
　　Ile Gln Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
　　 20 25 30
　　Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn
　　 35 40 45
　　Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
　　 50 55 60
　　Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe
　　65 70 75 80
　　Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
　　 85 90 95
　　Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly
　　 100 105 110
　　Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro
　　 115 120 125
　　Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys
　　 130 135 140
　　Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr
　　145 150 155 160
　　Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
　　 165 170 175
　　Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val
　　 180 185 190
　　Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
　　 195 200 205
　　Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
　　 210 215 220
　　Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr
　　225 230 235 240
　　Phe Gln Gly Gly Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
　　 245 250 255
　　Asp Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His
　　 260 265 270
　　<210> 2
　　<211> 254
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> KRAS mutant scfv
　　<400> 2
　　Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
　　1 5 10 15
　　Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr
　　 20 25 30
　　Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
　　 35 40 45
　　Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu
　　 50 55 60
　　Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
　　65 70 75 80
　　Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr
　　 85 90 95
　　Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
　　 100 105 110
　　Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
　　 115 120 125
　　Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
　　 130 135 140
　　Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
　　145 150 155 160
　　Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
　　 165 170 175
　　Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
　　 180 185 190
　　Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp
　　 195 200 205
　　Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
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　　Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
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　　 100 105 110
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　　Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys
　　 130 135 140
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　　Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
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　　 180 185 190
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　　 210 215 220
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　　 275 280 285
　　His
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　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
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　　 195 200 205
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　　 210 215 220
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　　 210 215 220
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　　 245 250 255
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　　 260 265 270
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　　 275 280 285
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　　 35 40 45
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　　 245 250 255
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　　 260 265 270
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　　 275 280 285
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　　 290 295
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　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> fusion peptide
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　　65 70 75 80
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 260 265 270
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　　<223> fusion peptide
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　　 165 170 175
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　　 180 185 190
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　　 195 200 205
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　　 210 215 220
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　　 180 185 190
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　　 195 200 205
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　　Gly Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His
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　　<210> 84
　　<211> 34
　　<212> DNA
　　<213> Artificial Sequence
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　　<223> Primer
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　　<210> 85
　　<211> 46
　　<212> DNA
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> Primer
　　<400> 85
　　agcccgaagg gaattcattt gcagatacaa agtgttttta gagttg 46
　　<210> 86
　　<211> 11
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> H4K
　　<400> 86
　　His Arg Arg Cys Asn Lys Asn Asn Lys Lys Arg
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　　<210> 87
　　<211> 11
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> H4P
　　<400> 87
　　His Arg Arg Cys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Arg
　　1 5 10
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　　<211> 14
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> LMWP
　　<400> 88
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　　1 5 10
　　<210> 89
　　<211> 15
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> hBD3-3
　　<400> 89
　　Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys
　　1 5 10 15
　　<210> 90
　　<211> 280
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> fusion peptide
　　<400> 90
　　Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
　　1 5 10 15
　　Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr
　　 20 25 30
　　Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
　　 35 40 45
　　Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu
　　 50 55 60
　　Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
　　65 70 75 80
　　Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr
　　 85 90 95
　　Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
　　 100 105 110
　　Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
　　 115 120 125
　　Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
　　 130 135 140
　　Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
　　145 150 155 160
　　Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
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　　Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
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　　 195 200 205
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　　 210 215 220
　　Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
　　225 230 235 240
　　Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
　　 245 250 255
　　His Arg Arg Cys Asn Lys Asn Asn Lys Lys Arg Leu Glu Ile Lys Arg
　　 260 265 270
　　Leu Glu His His His His His His
　　 275 280
　　<210> 91
　　<211> 280
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> fusion peptide
　　<400> 91
　　Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
　　1 5 10 15
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　　 20 25 30
　　Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
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　　 100 105 110
　　Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
　　 115 120 125
　　Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
　　 130 135 140
　　Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
　　145 150 155 160
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　　 165 170 175
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　　 180 185 190
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　　 195 200 205
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　　 210 215 220
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　　225 230 235 240
　　Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
　　 245 250 255
　　His Arg Arg Cys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Arg Leu Glu Ile Lys Arg
　　 260 265 270
　　Leu Glu His His His His His His
　　 275 280
　　<210> 92
　　<211> 283
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> fusion peptide
　　<400> 92
　　Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
　　1 5 10 15
　　Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr
　　 20 25 30
　　Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
　　 35 40 45
　　Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu
　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
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　　 100 105 110
　　Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
　　 115 120 125
　　Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
　　 130 135 140
　　Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
　　145 150 155 160
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　　 165 170 175
　　Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
　　 180 185 190
　　Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp
　　 195 200 205
　　Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
　　 210 215 220
　　Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
　　225 230 235 240
　　Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
　　 245 250 255
　　Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Leu Glu
　　 260 265 270
　　Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His
　　 275 280
　　<210> 93
　　<211> 284
　　<212> PRT
　　<213> Artificial Sequence
　　<220>
　　<223> fusion peptide
　　<400> 93
　　Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro
　　1 5 10 15
　　Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr
　　 20 25 30
　　Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
　　 35 40 45
　　Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu
　　 50 55 60
　　Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
　　65 70 75 80
　　Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr
　　 85 90 95
　　Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
　　 100 105 110
　　Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
　　 115 120 125
　　Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
　　 130 135 140
　　Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
　　145 150 155 160
　　Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
　　 165 170 175
　　Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
　　 180 185 190
　　Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp
　　 195 200 205
　　Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
　　 210 215 220
　　Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
　　225 230 235 240
　　Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
　　 245 250 255
　　Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys Leu
　　 260 265 270
　　Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His
　　 275 280

Claims (16)

1.一种融合蛋白，其中(i)靶向细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白的抗体或其单链可变片段与(ii)癌细胞穿透肽连接。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述细胞内致癌蛋白或致癌突变蛋白是KRAS或雄激素受体。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗体或其单链可变片段选自SEQ ID NO:1至3。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述癌细胞穿透肽选自SEQ ID NO:86至SEQID NO:89。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述癌细胞穿透肽经由接头与所述抗体或其单链可变肽的N末端或C末端连接。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述接头是GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其是融合蛋白，其中选自SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:89的任何一种癌细胞穿透肽经由接头与选自SEQ ID NO:1至3的任何一个单链可变片段的赖氨酸或半胱氨酸残基连接。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述接头是CGGGGG或CGGGGGSSGGGGG。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:90至SEQ ID NO:93的氨基酸序列中的任一个表示。
10.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1所述的融合蛋白。
11.一种重组载体，向其中已经引入根据权利要求10所述的核酸。
12.一种重组细胞，向其中已经引入根据权利要求11所述的重组载体。
13.根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述重组细胞是大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞。
14.一种用于产生根据权利要求1所述的融合蛋白的方法，所述包括以下步骤：
(a)通过培养根据权利要求12所述的重组载体表达根据权利要求1所述的融合蛋白；以及
(b)回收所表达的融合蛋白。
15.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白作为活性成分。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述肿瘤是选自以下的至少一种：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、脑瘤、皮肤癌、黑色素瘤、结直肠癌、前列腺癌和血癌。
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