CN116121386A - 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于鼻咽癌的诊断和治疗技术领域，公开了一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物及应用。本发明提供一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物，所述标记物为CRYAB。本发明利用高通路基因转录组学方法，对比鼻咽癌患者治疗后有转移和无转移的基因表达图谱发现CRYAB在鼻咽癌转移样本中较无转移样本存在显著上调；CRYAB基因作为鼻咽癌预后转移标记物，进而作为相关试剂盒和检测方法的检测靶点，可应用于制备用于鼻咽癌的早期诊断、风险评估或预后转移预测的试剂盒或检测试剂中。采用CRYAB基因作为鼻咽癌预后转移标记物，结果判读客观且准确率高。对于鼻咽癌的早期诊断、风险评估、或预后预测具有重要的临床意义。

Description

一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物及应用

技术领域

本发明涉及鼻咽癌的诊断和治疗技术领域，具体涉及一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物及应用。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种常见的头颈部肿瘤之一，好发于鼻咽腔顶部和侧壁，与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染、宿主遗传和环境因素相关的多因素上皮恶性肿瘤。常见临床症状为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。由于鼻咽的解剖部位深，解剖结构复杂，病理主要为非角化型未分化癌以及易出现颈部淋巴结及远处转移，在初诊的患者中，III、IV期鼻咽癌约占总病例的70％左右。鼻咽癌大多对放疗、化疗具有中度敏感性，放疗、化疗是鼻咽癌的主要治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，多辅以手术和其他疗法，如基因治疗。虽然大部分患者对于放化疗敏感，仍然有15％～58％的病例对常规治疗反应不佳，导致临床预后不佳，且放化疗在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常细胞组织造成不同程度的损害，严重影响着患者的生活生存质量。且局部晚期病变治疗效果较差，远处转移是影响鼻咽癌治疗后生存率和预后的重要因素。

研究显示鼻咽癌远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因。随着分子生物学理论创新，肿瘤的病理研究进入分子水平，肿瘤的病因、发生发展、发病机制深入分子或基因水平。分子诊断成为肿瘤病理、诊疗和预后的重要手段。鉴别和使用癌症恶性转移相关的分子标记物，对于及时发现常规治疗后易转移患者，从而有针对性地制定治疗方案，具有重要意义。然而，在临床上鼻咽癌转移相关的分子标志物仍然缺乏并且预测的准确性有待提高，且利用单一分子标记物筛查方法，无法系统地鉴别肿瘤转移相关的分子标记物。而鼻咽癌患者随访时间较长，因此大部分患者没有完整的临床随访数据。现有技术中尚无可以用于临床预测鼻咽癌治疗后转移的分子标记物、相关试剂盒或检测方法。因此，鉴定更高效预测鼻咽癌转移相关分子标志物，有望使得鼻咽癌患者获益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物，所述标记物为CRYAB。所述CRYAB的NCBI登录号为1410。

本发明利用高通路基因转录组学方法，对比鼻咽癌患者治疗后有转移和无转移的基因表达图谱，在对原代培养及组织样本的测序及统计分析中，CRYAB基因在鼻咽癌转移样本中较无转移样本存在显著上调，两组分析中P值均小于0.001(原代培养中为0.000139，组织样本中为0.000813)，错误发现率低于0.05(原代培养中为0.0152，组织样本中为0.0342)；CRYAB基因可作为鼻咽癌预后转移标记物，进而作为相关试剂盒和检测方法的检测靶点。

第二方面，本发明提供一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括检测CRYAB基因或蛋白表达水平的分子。

作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述制剂包括基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述CRYAB基因表达水平的试剂。

作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式，所述检测CRYAB蛋白表达水平的分子为抗体。

优选的，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

第三方面，本发明将所述的标记物在制备用于鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的试剂盒或检测制剂中应用。

采用CRYAB基因作为鼻咽癌预后转移标记物，结果判读客观且准确率高。CRYAB基因用于预测癌转移的ROC曲线分析显示：在原代培养样本AUC为0.6889(95％CI,0.4437-0.9340)，准确率为73.68％；在组织样本中AUC为0.8413(95％CI,0.6301-1.0000)，准确率为87.50％；将两组数据通过VST标准化合并进行检验，AUC为0.7303(95％CI,0.5590-0.9015)，准确率为74.29％。可应用于制备用于鼻咽癌的早期诊断、风险评估或预后转移预测的试剂盒或检测试剂中。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述试剂盒或检测制剂用于患者组织样品的检测。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述检测制剂包括检测CRYAB基因或蛋白表达水平的分子。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用高通路基因转录组学方法，对比鼻咽癌患者治疗后有转移和无转移的基因表达图谱，在原代细胞培养及组织样本测序分析中，发现CRYAB在鼻咽癌转移样本中较无转移样本存在显著上调；CRYAB基因可作为鼻咽癌预后转移标记物，进而作为相关试剂盒和检测方法的检测靶点，可应用于制备用于鼻咽癌的早期诊断、风险评估或预后转移预测的试剂盒或检测试剂中。采用CRYAB基因作为鼻咽癌预后转移标记物，结果判读客观且准确率高。对于鼻咽癌的早期诊断、风险评估、或预后预测具有重要的临床意义。

附图说明

图1为CRYAB在原代细胞培养样本和组织样本中的VST计数；其中，CRYAB在预后发生癌转移的样本(阴影标记)中上调；在原代培养(左)样本中的差异显著性为P＝0.000139，在组织样本(右)中的差异显著性为P＝0.00813。

图2为CRYAB基因用于预测癌转移的ROC曲线(原代细胞培养样本)；其中，在原代培养样本AUC为0.6889(95％CI,0.4437-0.9340)，准确率为73.68％。

图3为CRYAB基因用于预测癌转移的ROC曲线(组织样本)；其中，在组织样本中AUC为0.8413(95％CI,0.6301-1.0000)，准确率为87.50％。

图4为CRYAB基因用于预测癌转移的ROC曲线(原代细胞培养样本和组织样本经VST标准化合并)；其中，将原代细胞培养样本和组织样本数据通过VST标准化合并进行检验，AUC为0.7303(95％CI，0.5590-0.9015)，准确率为74.29％。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

收集了鼻咽癌患者十年完整随访数据，并利用高通路基因转录组学方法，对比患者治疗后有转移和无转移的基因表达图谱，以期找到与转移高度相关的分子标记物。

(1)收集样本

1)组织样本

收集鼻咽癌患者的组织学样本16例，组织样本收集后保存于液氮罐中，并根据分型标准分为Ⅰ型(无复发无转移)；Ⅱ型(有复发无转移)；Ⅲ型(无复发有转移)；Ⅳ型(有复发有转移)，无转移共9例，转移共7例。所有样本均签订样本采集知情同意书，处理好的样本均遵循实验室生物安全操作规范，做好相应记录。

2)原代细胞培养

采集鼻咽癌新鲜标本共19例，转移为9例，无转移为10例。

原代细胞培养步骤为：分别取鼻咽癌新鲜标本置于2×双抗的无血清培养基中，置冰上运输，并尽快作原代培养；取出标本置培养皿内，用2×双抗的无血清培养基反复冲洗，去除血污及坏死组织细胞，标本转移置新皿冲洗，重复二次；用无菌眼科剪把标本剪碎成1mm立方米后，均匀接种至表面经特殊处理的培养瓶里，去除多余液体，静置10min后加入小量无血清特殊培养基。置37℃、5％CO₂培养箱培养。第二天换液，以后按常规培养，等组织周围长出细胞云至1cm直径左右予以标记冻存至液氮罐。

(2)RNA序列文库的制备

从液氮罐中取出的各样本，使用All-Prep DNA/RNA试剂盒(Qiagen)从组织样本中提取RNA。使用Qubit和生物分析仪检测RNA的纯度和完整性。Novogene按照产品说明书的方案制备双端RNA文库并测序。

(3)批量RNA序列数据的质量控制与分析

使用FastQC(v0.11.8)检查原始读取的质量。使用RSeQC1(v2.6.4)和Picard(v2.17.4)研究RNA Seq库的排列质量和链特异性。所有样本的绘图率至少为95％。利用STAR(v2.7.5c)2，使用默认参数将读取结果与参考基因组对齐。参考基因组来自人类基因组(hg38)和EBV基因组(NC_007065)。人类基因组和EBV基因组的基因组注释文件(GTF)分别从GENCODE3(v27)和GeneBank下载。HTSeq4(v0.9.1)用于量化交叉非空模式下基因水平的读取计数。使用DESeq25(v1.30.1)进行文库标准化和差异基因表达分析。方差稳定化变换(VST)用于规范化计算库大小差异和可视化的计数。

统计分析：用R工具包DESeq2对超过29,000个基因进行了差异表达分析。通过Wald检验查找显著特征基因，并根据样本的预后复发/未复发情况进行了批次效应校正。对全部显著表达的编码基因(样本平均VST计数不低于6)，使用本贾米尼和霍赫伯格校正方法来控制错误发现率(需低于0.05)。

在原代细胞培养样本分析中，共找到51个符合所述统计分析筛选条件的特征基因。在组织样本测序分析中，共找到138个符合所述统计分析筛选条件的特征基因。在两组中共同的特征基因有2个(CRYAB和ARL3)。CRYAB在原代细胞培养样本和组织样本中的VST计数如图1所示。在对原代培养及组织样本的测序及统计分析中，CRYAB基因在鼻咽癌转移样本中较无转移样本存在显著上调，两组分析中P值均小于0.001(原代培养中为0.000139，组织样本中为0.000813)，错误发现率低于0.05(原代培养中为0.0152，组织样本中为0.0342)。

将ARL3在转移样本组略微下调19％～31％，其改变幅度较低用于临床检测会比较困难。相比之下，将CRYAB在转移样本中上调81％～124％，更适合临床检测。故最终选取CRYAB作为用于转移诊断及/或预后评估的标记基因。CRYAB的NCBI登录号为1410，GenBank数据库登录号为NM_001885.3。

实施例2

应用MATLAB深度学习工具箱中的rocmetrics函数进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，使用100次抽样的Bootstraps自助算法估计置信区间。曲线周围的阴影区域表示样本数据波动所对应的ROC曲线变化范围。

CRYAB基因用于预测癌转移的ROC曲线如图2～4所示；在原代培养样本AUC为0.6889(95％CI,0.4437-0.9340)，准确率为73.68％；在组织样本中AUC为0.8413(95％CI,0.6301-1.0000)，准确率为87.50％；将两组数据通过VST标准化合并进行检验，AUC为0.7303(95％CI,0.5590-0.9015)，准确率为74.29％。

本发明在原代细胞培养及组织样本测序分析中，发现CRYAB在鼻咽癌转移样本中较无转移样本存在显著上调；CRYAB基因可作为鼻咽癌预后转移标记物，进而作为相关试剂盒和检测方法的检测靶点，可应用于制备用于鼻咽癌的早期诊断、风险评估或预后转移预测的试剂盒或检测试剂中。采用CRYAB基因作为鼻咽癌预后转移标记物，结果判读客观且准确率高。对于鼻咽癌的早期诊断、风险评估、或预后预测具有重要的临床意义。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的标记物，其特征在于，所述标记物为CRYAB。

2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于，所述CRYAB的NCBI登录号为1410。

3.一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测CRYAB基因或蛋白表达水平的分子。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述制剂包括基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述CRYAB基因表达水平的试剂。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测CRYAB蛋白表达水平的分子为抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

7.权利要求1所述的标记物在制备用于鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的试剂盒或检测制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒或检测制剂用于患者组织样品的检测。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述检测制剂包括检测CRYAB基因或蛋白表达水平的分子。

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