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CN116121269B - 调控植物花青素合成的基因TrMYB118及其应用 - Google Patents

调控植物花青素合成的基因TrMYB118及其应用 Download PDF

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CN116121269B CN202310282903.2A CN202310282903A CN116121269B CN 116121269 B CN116121269 B CN 116121269B CN 202310282903 A CN202310282903 A CN 202310282903A CN 116121269 B CN116121269 B CN 116121269B
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trmyb118
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Abstract

本发明公开一种调控植物花青素合成的基因TrMYB118及其应用，所述基因TrMYB118的序列为序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列或互补序列，基因TrMYB118用于培育高花青素植物新品种，特别是白三叶新品种。白三叶草中花青素和原花青素的合成受到严格调控，在叶片中形成复杂的花青素色素沉淀模式。本发明基于全基因组关联分析结合转录组、代谢组测序结果，发现一个正向调控花青素积累基因TrMYB118，其能够通过调控花青素生物合成相关基因的表达，从而提高植物花青素积累，有助于培育高花青素、抗逆的优质植物品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速高品质植物品种的选育。

Description

调控植物花青素合成的基因TrMYB118及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及花青素调控基因，特别涉及白三叶花青素正向调控基因TrMYB118及其表达载体和应用。
背景技术
白三叶(Trifolium repens L.)是世界范围内广泛栽培应用的优质豆科牧草。其具有蛋白质丰富、营养价值高、适口性好等特点。同时由于白三叶适应性强、抗逆性强、耐践踏、恢复快、侵占性强、颜色碧绿均匀、花叶俱美、绿期长，是城市绿化、美化山川的优良草种。白三叶在园林绿化上应用越来越多，建坪面积曾一度占到了我国北方景观草坪面积的15％左右。
花青素和原花青素是类黄酮生物合成途径中的两个终产物，是影响植物外观品质的重要性状。其中花青素也是植物在环境胁迫下的必须防御分子，可以帮助植物抵抗低温、干旱等逆境。此外原花青素还是豆科牧草中抗鼓胀病的主要成分。
提高白三叶草花青素、原花青素的积累和分布，对于园林绿化和农业生产是非常有必要的。白三叶是异花授粉牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能验证较为滞后。
目前有关于白三叶花青素、原花青素生物合成调控研究有限，因此挖掘白三叶花青素、原花青素生物合成调控的候选基因，可为白三叶或其它豆科牧草的品质改良与分子育种提供理论与技术支持。
发明内容
鉴于此，本发明目的之一在于提供一种能够提高植物花青素积累量的基因片段，该基因片段为基因TrMYB118。
本发明目的之二在于提供一种能够提高植物花青素积累量的基因编码的蛋白质。
本发明目的之三在于提供一种用于克隆基因TrMYB118的引物对。
本发明目的之四在于提供一种含有基因TrMYB118的过表达载体。
本发明目的之五在于提供一种含有基因TrMYB118的宿主细胞。
本发明目的之六在于提供一种基因TrMYB118的用途。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种调控植物花青素合成的基因TrMYB118，在豆科植物中表达，以增加花青素积累量，所述基因TrMYB118为下列核苷酸序列中的一组：
A、序列表SeqIDNO.1所示核苷酸序列；
B、与A所述序列互补的核苷酸序列。
进一步地，所述豆科植物为低花青素植物。
进一步地，所述豆科植物包括白三叶。
进一步地，所述花青素包括矢车菊素、天竺葵素、锦葵素、芍药素、飞燕草素、牵牛花素中的一种或多种。
本发明还提供了一种前述基因TrMYB118编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列选自序列表SeqIDNO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种用于克隆根据前述基因TrMYB118的引物对，所述引物对的碱基序列如下：
第一上游引物：5’-ATGGAGAATACCGAAGGATTGAGA-3’；
第一下游引物：5’-CTATGGATCCCAAAGAGAATAGAAATC-3’。
本发明还提供了一种含有前述基因TrMYB118的过表达载体，所述基因TrMYB118被插入载体PHB，其中包含CaMV35S启动子，获得过表达载体PHB-35S-TrMYB118。
本发明还提供了一种含前述过表达载体的宿主细胞，将所述过表达载体PHB-35S-TrMYB118转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。
本发明还提供了一种前述基因TrMYB118的用途，用于培育高花青素植物新品种。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
白三叶草中花青素和原花青素的合成受到严格调控，在叶片中形成复杂的花青素色素沉淀模式。本发明基于全基因组关联分析结合转录组、代谢组测序结果，发现一个正向调控花青素积累基因TrMY B118，其能够通过调控花青素生物合成相关基因的表达，从而提高植物花青素积累，有助于培育高花青素、抗逆的优质植物品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速高品质植物品种的选育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些
附图获得其他相关的附图。
图1是6种花青素在‘紫色’白三叶与‘海法’白三叶中的表达量热图。图1中，HL为海法叶片，PL为紫色叶片，HF为海法花序，PF为紫色花序。
图2是TrMYB118基因在海法和紫色的叶片、花序中的相对表达水平。图2中，**、***分别表示在0.01、0.001水平下紫色与海法相比有显著性差异。
图3是本发明控植物花青素合成基因TrMYB118编码的蛋白亲水性/疏水性预测图。
图4是本发明控植物花青素合成基因TrMYB118编码的蛋白二级结构预测图。
图5是本发明控植物花青素合成基因TrMYB118编码的蛋白三级结构预测图。
图6是T3代TrMYB118过表达拟南芥株系花青素积累情况。图6中，(A)是在1/2MS培养基上生长14天的拟南芥表型，白色箭头指向花青素积累部位；(B)是花青素积累测定结果；*、**、***分别表示在0.05、0.01、0.001水平下转基因植株与WT相比有显著性差异；(C)是TrMYB118、拟南芥花青素生物合成相关基因的表达量水平。
具体实施方式
下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
本实施例中，白三叶TrMYB118基因片段全长723bp，序列如SEQ ID NO.1所示。
TrMYB118基因可编码的蛋白含240个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
本实施例中，用于克隆基因TrMYB118的引物对，第一上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，第一下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
本实施例中，含有基因TrMYB118的过表达载体，所述基因TrMYB118被插入载体PHB，其中包含CaMV35S启动子，获得过表达载体PHB-35S-TrMYB118。
本实施例中，含有所述过表达载体的宿主细胞，将所述过表达载体PHB-35S-TrMYB118转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。
本实施例中，基因TrMYB118用于培育高花青素植物新品种，特别是培育高花青素白三叶新品种。
TrMYB118在不同白三叶材料中的表达分析。
已知天然存在的花色素有250多种，存在于27个科、73个属的植物中，已确定的有20种花青素。
紫色白三叶是一种花青素丰富的白三叶，使用高效液相色谱法LC-ESI-MS/MSsystem(UPLC,Shim-pack UFLC)测定紫色白三叶与绿色白三叶的叶片、花序中花青素的表达差异，结果如图1和图2所示。图1中，HL为海法叶片，PL为紫色叶片，HF为海法花序，PF为紫色花序。如图1，6种花青素(矢车菊素Cyanidin、天竺葵素Pelargonidin、锦葵素Malvidin、芍药素Peonidin、飞燕草素Delphinidin、牵牛花素Petunidin)在‘紫色’白三叶和‘海法’白三叶中的表达都具有显著差异，其中矢车菊素和天竺葵素最为明显。
为进一步检验TrMYB118在这两种花青素积累不同的白三叶材料中的表达差异，我们对‘紫色’和‘海法’白三叶的叶片和花序分别进行RNA提取。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作参考内附说明书进行。
RNA提取后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录选用Monad公司的MonScriptTMRTIII Super Mix with dsDNase(Two-Step)，操作流程参考内附说明书。
以白三叶参考基因组为模板，通过全长CDS序列设计荧光定量引物：
TrMYB118-F：5'-AGGTGGTTTCAGAAGAAG-3'；
TrMYB118-R：5'-TCACTAGGTATTGGGACA-3'；
以Trβ-Actin作为内参基因：
Trβ-Actin-F：5'-TTACAATGAATTGCGTGTTG-3'；
Trβ-Actin-R：5'-AGAGGACAGCCTGAATGG-3'；
利用Monad公司的MonAmpTMFast Green qPCR Mix(No ROX)试剂进行qRT-PCR，反应体系如表1。
表1 qRT-PCR反应体系
扩增反应程序：95℃30s，95℃10s，58℃30s，72℃20s，40个循环。
溶解曲线程序：以每30sec上升0.5℃的速率从55℃升至95℃。
相对表达量的计算：采用Excel 2019进行数据分析，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。
参见图1和图2。从表型来看，‘紫色’白三叶与‘海法’白三叶相比，都有极明显的花青素积累；荧光定量的结果表明，与‘海法’白三叶相比，TrMYB118在‘紫色’白三叶的叶片和花序中表达量都极显著高于‘海法’白三叶，说明TrMYB118可能正向调控‘紫色’白三叶的花青素积累。
白三叶TrMYB118基因克隆与生物信息学分析
实验材料为‘紫色’白三叶，种植于四川农业大学温江校区。取其成熟叶片为材料提取总RNA。RNA的提取及反转录试剂及方法同上。
以白三叶参考基因组为模板，通过全长CDS序列设计第一引物(序列表SeqIDNO.3和SeqIDNO.4)：
第一上游引物：5’-ATGGAGAATACCGAAGGATTGAGA-3’,
第一下游引物：5’-CTATGGATCCCAAAGAGAATAGAAATC-3’。
以‘紫色’白三叶cDNA为模板进行扩增，扩增选用Vazyme公司的2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)试剂盒进行，操作流程参考内附说明书，PCR扩增体系见表2。反应条件为95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃运行5min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
表2PCR扩增体系
紫外灯下切胶，用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收纯化目的片段，具体操作参考内附说明书。用TaKaRa公司的DNAA-Tailing Kit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾。完成后取上述DNA溶液4μl，加入1μl pMD18-T载体和5μlSolution(含连接酶)混匀，在16℃反应30min。反应完成后将上所述溶液加入100μl DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min。将转化好的感受态细胞中加入890μl SOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养，并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功。能通过菌液PCR扩增得到目的条带进行双端测序，测序引物M13，以验证是否克隆成功。
白三叶TrMYB118基因片段全长723bp，序列如SEQ ID NO.1所示，可编码的蛋白含240个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。对所编码氨基酸序列利用ProtParam在线软件分析表明，蛋白分子量为27.80018kD，理论等电点(pI)为6.46。利用ExPASy-ProtScale预测TrMYB118为疏水蛋白。图3是对TrMYB118蛋白亲水性/疏水性预测结果。
蛋白质的二级结构在蛋白质肽链快速折叠成具有特定功能的构象方面有重要意义，蛋白质二级结构的预测不仅有助于了解蛋白质的功能及其作用机制，对于正确预测蛋白质的空间结构更具有非常重要的意义。并且蛋白质二级结构信息广泛应用到蛋白质分子可视化、蛋白质比对以及蛋白质结构预测中。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测白三叶TrMYB118蛋白的二级结构，结果如图4所示，结果表明，该蛋白含约43.75％的α－螺旋，6.67％的延伸主链，7.50％的β-转角结构和42.08％的无规卷曲。
图5进行了三级结构预测。亚细胞预测显示所编码的蛋白质定位在细胞核内。
TrMYB118基因转入拟南芥功能分析。
1.过表达载体构建
以PHB为载体，选择BamHⅠ和PstⅠ两个酶切位点设计TrMYB118特异引物(表3)，以前述从‘紫色’白三叶成熟叶片为材料提取得到的总RNA质粒作为模板，使用高保真酶扩增目的基因，并将产物进行纯化回收。然后使用BamHⅠ和PstⅠ限制性内切酶(NEB)对PHB进行线性化处理，并对产物进行纯化回收。利用EasyGenoDNA重组体系(#VI201-02，天根生物)，将纯化回收的目的片段与线性化的PHB进行连接，连接产物分别转化TreliefTM5αChemicallyCompetent Cell感受态细胞中，涂布于卡那霉素(Kan,50mg/L)的LB琼脂固体培养基中，挑选阳性单菌落使用通用引物93R(表3)进行PCR和测序验证后，正确菌液分别进行重组质粒提取，得到过表达载体PHB-35S-TrMYB118。
表3构建过表达拟南芥植株相关的引物信息
2.过表达载体转化农杆菌
将提取到的PHB-35S-TrMYB118质粒根据说明书转入GV3101 ChemicallyCompetent Cell(上海唯地生物技术有限公司)，将其加入不含抗生素的LB液体培养基培养4h，离心重悬后，涂布于含Kan(50mg/L)和利福平(50mg/L)的LB固体培养基上，倒置于28℃培养箱2-3天。挑选单克隆农杆菌菌落，于含有Kan和利福平的液体LB培养基中，置于28℃，200r/min的摇床中震荡培养24h后，进行菌液PCR检测，将阳性单克隆农杆菌加甘油置于-80℃保存。阳性单克隆农杆菌即为宿主细胞。
3.拟南芥的转化与功能验证
拟南芥种植：将野生型(WT)种子种于1/2MS培养基，春化两天后，放于植物生长室光照时间14h/天，湿度40-60％培养约2周，然后将其移栽至花盆中(9cm×9cm×11cm)，每盆播种4棵。播种以后浇水并覆保鲜膜，在植物生长室培养。
去顶：移栽后隔两天浇一次水，隔一周浇一次霍格兰营养液，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉。
配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬阳性单克隆农杆菌使OD＝0.8。在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.02％(200uL/L)，混匀后在室温放置1h。
浸染：盛花期拟南芥去除结荚花朵后将植株地上部浸泡在阳性单克隆农杆菌悬浮液中20-30s。
暗培养：浸染后将植株套袋并暗培养48h。
浸染后培养：浇水方式同侵染前。
种子收集：角果自然开裂时收种。
转基因种子筛选：在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上培养浸染后所得种子，春化后正常培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子：成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养基上正常生长，非转基因种子不能正常生长；
转基因植株移栽及阳性检验：转基因种子在平板上萌发2周后，将阳性植株转入土壤继续培养，待植株长势良好时取阳性植株叶片进行DNA提取并使用目的基因序列引物进行PCR验证。验证结果如图6所示，过表达TrMYB118的两个拟南芥株系(OE12、OE13)与WT相比，都有非常明显的花青素积累。
对野生型(WT)及T3代转基因拟南芥(OE12、OE13)进行平板表型观察。将消毒后的拟南芥种子种于1/2MS培养基，春化两天后，放于植物生长室光照时间14h/天，湿度40-60％，培养14天进行拍照和取样。拍摄图片如图6中(A)所示，白色箭头指向花青素积累部位。OE12、OE13的茎基部都有明显的花青素积累，而WT却几乎看不到。
使用植物花青素试剂盒(苏州梦犀生物医药科技有限公司)测定花青素积累。拟南芥RNA的提取、反转录以及荧光定量的方法同上，以AtActi2n作为内参基因，所用引物见表4。
见图6中(B)，花青素积累的测定结果与表型一致。
此外，见图6中(C)，与WT相比，OE12、OE13中花青素生物合成相关结构基因的表达模式也是显著提高的，说明TrMYB118的过表达能够显著提高拟南芥花青素的积累，是一个花青素积累的正向调控因子。
表4荧光定量引物信息
引物名 引物序列5’-3’
TrMYB118-F AGGTGGTTTCAGAAGAAG
TrMYB118-R CTATGGATCCCAAAGAGAATAGAAATC
AtDFR-F TATCTGAGGAAGGAAGCTACGATGA
AtDFR-R TTCCATTCACTGTCGGCTTTATCAC
AtLDOX-F TATCAATTTGGCCTAAGACACCAAG
AtLDOX-R ACCAACTTCTTTCTCTAGACGGTCA
AtUF3GT-F ATCGAATGAATCGTCAAGCATGAG
AtUF3GT-R TGAGGGATAGAGATGGTGTGGAAAG
AtActin2-F CTTCCGCTCTTTCTTTCCAA
AtActin2-R CATATGCATCCTTCTGGTTC
Trβ-Actin-F TTACAATGAATTGCGTGTTG
Trβ-Actin-R AGAGGACAGCCTGAATGG
。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种调控植物花青素合成的基因TrMYB118，其特征在于，在豆科植物中表达，以增加花青素积累量，所述基因TrMYB118为下列核苷酸序列中的一组：
A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；
B、与A所述序列互补的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述基因TrMYB118编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列选自序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种用于克隆根据权利要求1所述基因TrMYB118的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如下：
第一上游引物：5’-ATGGAGAATACCGAAGGATTGAGA-3’；
第一下游引物：5’-CTATGGATCCCAAAGAGAATAGAAATC-3’。
4.一种含有权利要求1所述基因TrMYB118的过表达载体，其特征在于，所述基因TrMYB118被插入载体PHB，其中包含CaMV35S启动子，获得过表达载体PHB-35S-TrMYB118。
5.一种含有权利要求4所述过表达载体的宿主细胞，其特征在于，将所述过表达载体PHB-35S-TrMYB118转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。
6.一种权利要求1所述的基因TrMYB118的用途，其特征在于，用于培育高花青素植物新品种。
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